ES2318639T3 - Un metodo para inmunotransferencia y kit para verde leucomalaquita y verde malaquita. - Google Patents
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Abstract
Un inmunógeno que comprende verde leucomalaquita, acoplado por vía de un reticulador, a un material portador que confiere antigenicidad, el reticulador se extiende desde la posición para, orto o meta del anillo fenilo no sustituido de verde leucomalaquita.
Description
Un método para inmunotransferencia y kit para
verde leucomalaquita y verde malaquita.
La presente invención se relaciona con
inmunógenos, anticuerpos y conjugados novedosos, para uso en
inmunoanálisis para la detección y/o determinación de verde
leucomalaquita y verde malaquita. La presente invención también se
relaciona con un método de inmunoanálisis y kit para detectar o
determinar verde leucomalaquita y verde malaquita. Por
"detectar" significa analizar cualitativamente para la
presencia o ausencia de verde leucomalaquita y/o verde malaquita en
una muestra. Por "determinar" significa analizar
cuantitativamente para la cantidad de verde leucomalaquita y/o verde
malaquita en una muestra.
El verde malaquita es un ectoparasiticida,
fungicida y antiséptico utilizado en piscicultura. Sin embargo,
este es potencialmente carcinogénico, mutagénico y teratogénico. Es
tratamiento ilegal y de salud pública utilizarlo en especies de
peces comestibles, tal como trucha y anguila, como se ha reconocido
desde 1933. Siguiendo la absorción, el verde malaquita se reduce
rápidamente a su metabolito no cromóforo, verde leucomalaquita, que
es el residuo prevalente detectado durante el análisis de residuo de
fármaco de animales acuáticos tratados. El verde malaquita y verde
leucomalaquita tienen las siguientes fórmulas estructurales:
El verde malaquita y verde leucomalaquita ha
adquirido recientemente mucha atención de los analistas de residuo,
como ellos encuentran en salmón Atlántico cultivado y merluza (cf.
Weekly EC Rapid Alert Reports for Food and Feed 2003/2004).
La metodología para la determinación de verde
malaquita y verde leucomalaquita se limita completamente. El verde
malaquita tiene cromóforos en la región visible del espectro (a
580-620 nm), que es una ayuda considerable en este
análisis. El verde leucomalaquita, sin embargo, tiene un
\lambdamáximo a 260-270 nm, haciéndolo difícil
para analizar bajo las mismas condiciones. Un número de enfoques han
sido tomados para eludir este problema. Un método emplea una etapa
de oxidación post-columna, después de la separación
HPLC y antes de la detección, para oxidar el verde leucomalaquita a
verde malaquita, permitiendo la detección en una longitud de onda
mayor. Comúnmente, se ha utilizado óxido de plomo disperso en
Celita (Trade Mark), o en sí mismo, empacado en una columna corta.
En una variación de esto, Klein et al. (E. Klein, M.
Edelhaeuser y R. Lippold, Dtsch. Lebensm.-Rundsch., 1991, 87, 350)
utiliza dióxido de plomo para llevar a cabo una oxidación
pre-columna, que mide el verde malaquita como el
total del padre y el leucometabolito. La oxidación electroquímica se
ha utilizado como una alternativa para el dióxido de plomo. Un
enfoque alternativo para la detección de verde malaquita y verde
leucomalaquita es utilizar LC-MS. Se ha utilizado
haz de partícula LC-MS para la confirmación del
verde malaquita en siluro.
El límite de funcionamiento mínimo exigido
(MRPL), un parámetro de calidad para laboratorios de residuo, se
establece en 2P g/kg para la suma de verde malaquita y verde
leucomalaquita. Recientemente, la espectrometría de
masa-cromatografía de gas (GC-MS) y
otros métodos de cromatografía
líquida-espectrometría de masa en tándem
(LC-MS/MS) se presentan en la quinta edición de la
conferencia de Residuo Euro. Los métodos GC-MS y
LC-MS tienen desarrollos favorables, que aseguran
la detección e identidad de estos residuos en concentraciones más
debajo de las MRPL establecidas.
Las reacciones de unión específicas, tal como
interacciones de anticuerpo-antígeno, se han
utilizado extensivamente en inmunoanálisis para detectar una
variedad de sustancias presentes en extractos de tejido. Así, por
ejemplo, los radioinmunoanálisis (RIA) se pueden utilizar para la
determinación de verde malaquita y verde leucomalaquita. Los
radioinmunoanálisis son muy sensibles, pero requieren los marcadores
de radionucleótidos, por ejemplo ^{125}I y ^{3}H. No se conocen
RIA para verde malaquita y verde leucomalaquita.
Los ensayos inmunoabsorbentes de unión a enzima
(ELISA) son una alternativa no radioactiva que se pueden utilizar
para la determinación cualitativa y cuantitativa de verde malaquita
y verde leucomalaquita. Recientemente, un kit de prueba para verde
malaquita ha llegado a ser comercialmente disponible. Bioo
Scientific produce un Kit de ensayo ELISA para verde malaquita que
se ha diseñado para detectar solamente verde malaquita. Esto
sugiere que el Kit Bioo contiene anticuerpos que se elevan a una
malaquita basado en inmunógeno, diferente de la presente invención
que utiliza una leucomalaquita basada en inmunógeno. Esto se soporta
adicionalmente mediante la información proporcionada por Bioo
Scientific que da una reactividad cruzada de 1% hacia verde
leucomalaquita. Como el verde malaquita se metaboliza rápidamente y
extensivamente a verde leucomalaquita, el inmunoanálisis Bioo
Scientific requiere la incorporación de una etapa de
pre-tratamiento de muestra antes de la unión de
anticuerpo-antígeno, para convertir verde
leucomalaquita a verde malaquita. Esto hace que el inmunoanálisis
consuma más tiempo y más propenso a error experimental a través del
uso de etapas adicionales en el ensayo, comparado con la presente
invención.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un inmunógeno que comprende verde leucomalaquita,
acoplado por vía de un reticulador, a un material portador que
confiere antigenicidad, el reticulador se extiende desde la
posición para, orto o meta del anillo fenilo no sustituido de verde
leucomalaquita. La invención también proporciona anticuerpos
producidos contra tales inmunógenos. En adición, la invención se
relaciona con conjugados que comprenden verde leucomalaquita, unido
covalentemente por vía de un reticulador, a un agente de etiqueta
detectable, el reticulador se extiende de la posición para, orto o
meta del anillo fenilo no sustituido de verde leucomalaquita.
Los inmunógenos y conjugados de la presente
invención cada uno se pueden derivar de haptenos de la siguiente
Fórmula I, en el que el reticulador (el reticulador puede comprender
-X-Y-Z) se extiende desde la
posición para, orto o meta del anillo fenilo no sustituido de verde
leucomalaquita:
en el que X es un primer enlace
bivalente, Y es un segundo enlace bivalente y Z es un grupo reactivo
conjugable con un material portador que confiere antigenicidad (para
producir un inmunógeno) o con un agente de etiqueta detectable (para
producir un
conjugado).
Opcionalmente, el inmunógeno comprende la
estructura de la Fórmula I que comprende un reticulador no acoplado
antes de acoplar al material portador que confiere antigenicidad, en
donde dicho reticulador no acoplado comprende
-X-Y-Z:
en donde X es un primer enlace
bivalente, Y es un segundo enlace bivalente y Z es un grupo reactivo
capaz de acoplar al material portador que confiere
antigenicidad.
Opcionalmente, el conjugado comprende la
estructura de la Fórmula I que comprende un reticulador no acoplado
antes de acoplar al agente de etiqueta detectable, en donde dicho
reticulador no acoplado comprende
-X-Y-Z:
en donde X es un primer enlace
bivalente, Y es un segundo enlace bivalente y Z es un grupo reactivo
capaz de acoplar al agente de etiqueta
detectable.
Preferiblemente, para cada uno de los
inmunógenos y conjugados, el reticulador se extienden desde la
posición para del anillo fenilo no sustituido de verde
leucomalaquita.
Preferiblemente, para cada uno de los
inmunógenos y conjugados, X es un heteroátomo seleccionado de O, S y
N, más preferiblemente X es un átomo O para inmunógenos y X es más
preferiblemente un átomo N para conjugados.
Preferiblemente, para cada uno de los
inmunógenos y conjugados, Y es un C_{1-10}, más
preferiblemente un C_{2-6}, más preferiblemente un
C_{3}, cadena recta sustituida o no sustituida, grupo funcional
alquileno saturado, o un grupo funcional arileno. Un sustituyente
adecuado es carbonilo (C=O).
Ventajosamente, Z (antes de conjugación con un
material portador que confiere antigenicidad (para producir un
inmunógeno) o con un agente de etiqueta detectable (para producir un
conjugado)) se selecciona de un ácido carboxílico, un
ditiopiridilo, una maleimida, un amino, un hidroxilo, un tiol, un
tioéster o un grupo funcional aldehído. En donde Z, antes de
conjugación al material portador que confiere antigenicidad es un
ácido carboxílico (COOH), el oxígeno del grupo hidroxilo se combina
primero con DCC y luego NHS para formar un éster con un grupo
saliente poderoso. El ataque nucleófilo del grupo carbonilo (C=O) de
la funcionalidad éster mediante un grupo amina libre en el material
portador que confiere antigenicidad resulta en una unión amida y la
formación del inmunógeno deseado. En donde Z, antes de conjugación
al reactivo de etiqueta detectable, es un grupo tiol (en el caso de
un tioéster, el tiol se forma a través de hidrólisis bajo
condiciones básicas), una reacción de sustitución nucleófila
involucra el tiol y
BrCH_{2}C(O)NH-HRP resulta en
reemplazo de bromuro por el grupo tiol y la formación del conjugado
deseado. El lector experto se refiere a Bioconjugate Techniques G.
Hermanson, ed., Academic Press, 1996, 785 pp., cuyos contenidos se
incorporan en su totalidad, para detalles de la interacción entre
el grupo reactivo Z y el material portador que confiere
antigenicidad o el agente de etiqueta detectable, en donde Z se
selecciona del resto de un ácido carboxílico, un ditiopiridilo, una
maleimida, un amino, un hidroxilo, un tiol, un tioéster o un grupo
funcional aldehído. Más ventajosamente, Z (antes de conjugación con
un material portador que confiere antigenicidad (para producir un
inmunógeno)) es un grupo funcional carboxi (COOH). Más
ventajosamente, Z (antes de conjugación con un agente de etiqueta
detectable (para producir un conjugado)) es un tiol o un grupo
funcional tioéster.
Más ventajosamente, el hapteno es
p-(3-carboxipropoxi) verde leucomalaquita (Hapteno
A). La Fórmula estructural de hapteno A está presente en la Figura
1. Preferiblemente, el inmunógeno es
p-(3-carboxipropoxi) verde leucomalaquita acoplado
con un material portador que confiere antigenicidad, opcionalmente
seleccionado de albúmina de suero bovino (BSA) y tiroglobulina
bovina (BTG).
Los derivados hapteno de verde malaquita (y los
inmunógenos correspondientes, anticuerpos y conjugados) se pueden
preparar en una forma similar mediante la derivatización de verde
malaquita con reticuladores en las posiciones para, orto o meta,
preferiblemente la posición para, del anillo fenilo no sustituido.
Un tal derivado hapteno de verde malaquita es
p-(3-carboxipropoxi) verde malaquita (hapteno B), la
Fórmula estructural la cual también se ilustra en la Figura 1.
Los inmunógenos se preparan al acoplar un
hapteno (como se describió anteriormente) para un material portador
que confiere antigenicidad modificada o no modificada.
Preferiblemente, el material portador es una proteína, un fragmento
de proteína, un polipéptido sintético o un polipéptido
semisintético. Los inmunógenos obtenidos luego se administran a
anfitriones mamíferos para elicitar la producción de anticuerpos
específicos, opcionalmente anticuerpos policlonales, que luego se
utilizan para desarrollar inmunoanálisis para verde leucomalaquita y
verde malaquita, empleando haptenos conjugados a agentes de etiqueta
como reactivos de detección.
En todavía un aspecto adicional, la presente
invención se relaciona con anticuerpos producidos contra los
inmunógenos de la presente invención, los anticuerpos son capaces de
unirse con por lo menos el epítopo estructural de verde
leucomalaquita y verde malaquita.
Dicho anticuerpo se puede unir con por lo menos
el epítopo estructural de verde leucomalaquita y verde malaquita.
En todavía un aspecto adicional, la presente invención se relaciona
con anticuerpos que tienen especificidad para verde leucomalaquita
caracterizado por tener reactividad cruzada para verde malaquita.
Dicho anticuerpo puede unir específicamente verde leucomalaquita y
comprende reactividad cruzada para verde malaquita. Opcionalmente,
los anticuerpos (y métodos y kits que incluyen aquellos anticuerpos)
tienen reactividad cruzada de más de 10% para verde malaquita.
Adicionalmente opcionalmente, los anticuerpos (y métodos y kits que
incluyen aquellos anticuerpos) tienen reactividad cruzada de más de
20% para verde malaquita. Todavía adicionalmente opcionalmente, los
anticuerpos (y métodos y kits que incluyen aquellos anticuerpos)
tienen reactividad cruzada de más de 25% para verde malaquita. En
cada tal caso, las reactividades cruzadas mínimas opcionales citadas
para verde malaquita están con respecto a 100% de reactividad
cruzada para verde leucomalaquita.
La invención proporciona adicionalmente un
proceso para preparar los anticuerpos, el proceso comprende las
etapas de inmunizar un animal, preferiblemente un animal vertebrado,
más preferiblemente un animal mamífero, mediante repetir la
administración de un inmunógeno de la presente invención, y
recolectar el suero resultante del animal inmunizado.
Preferiblemente, el proceso comprende adicionalmente fijar dichos
anticuerpos de suero a un sustrato de soporte, preferiblemente un
soporte sólido, más preferiblemente un soporte sólido poliestireno.
Preferiblemente, los anticuerpos son policlonales. Alternativamente,
los anticuerpos son monoclonales.
En todavía un aspecto adicional, la presente
invención comprende un conjugado que comprende los haptenos
descritos aquí unidos covalentemente a un agente de etiqueta
detectable. Preferiblemente, el agente de etiqueta se selecciona de
una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia radioactiva, o
su mezcla. Más preferiblemente, el agente de etiqueta es una
enzima, preferiblemente una peroxidasa, más preferiblemente
peroxidasa de rábano (HRP). Alternativamente, o adicionalmente, la
sustancia luminiscente puede ser un material bioluminiscente,
quimioluminiscente o fluorescente.
Preferiblemente, el conjugado es leucomalaquita
p-(3-acetiltiopropanamido) unido covalentemente a un
agente de etiqueta detectable. Un tal agente de etiqueta adecuado es
peroxidasa de rábano.
En todavía un aspecto adicional, la presente
invención comprende un método para detectar o determinar verde
leucomalaquita y verde malaquita en una muestra, el método que
comprende poner en contacto la muestra con por lo menos el
conjugado de la presente invención, y con por lo menos el anticuerpo
de la presente invención; detectar o determinar el conjugado unido;
y deducir de una curva de calibración la presencia de, o la cantidad
de, verde leucomalaquita y verde malaquita, en la muestra. Este es
un método semi-cuantitativo, mientras que el
siguiente método es un método cuantitativo. El método
semi-cuantitativo puede, opcionalmente, detectar o
determinar un analito seleccionado de verde leucomalaquita, verde
malaquita y mezclas de verde leucomalaquita y verde malaquita en
una muestra. Alternativamente, el método comprende poner en contacto
una primera fracción de la muestra con por lo menos el conjugado de
la presente invención, y con por lo menos el anticuerpo de la
presente invención y poner en contacto otra fracción de la muestra
con por lo menos el anticuerpo de la presente invención; determinar
el conjugado unido (para determinar la cantidad combinada de verde
leucomalaquita y verde malaquita) en la primera fracción y
determinar el verde malaquita unido (para determinar la cantidad de
verde malaquita) en la segunda fracción; y deducir de las curvas de
calibración, la cantidad de cada uno de verde leucomalaquita y
verde malaquita en la muestra. Se entenderá que la etapa de
determinar en la primera fracción es una inmunotransferencia
competitiva y la determinación se dispone para determinar la
cantidad combinada de verde leucomalaquita y verde malaquita.
También se entenderá que la etapa de determinar en la segunda
fracción es una inmunotransferenica y la determinación se dispone
para determinar la cantidad de verde malaquita unida. La etapa de
determinación tardía se puede conducir utilizando un método
espectroscópico apropiado. La etapa de deducir en el método
alternativo de la invención se puede llevar a cabo al deducir la
cantidad de verde malaquita unido en la segunda fracción de la
muestra y al deducir la cantidad de verde leucomalaquita y verde
malaquita en la primera fracción de la muestra, seguido por sustraer
la cantidad de verde leucomalaquita y verde malaquita en la primera
fracción de la muestra de la cantidad de verde malaquita unido en la
segunda fracción de la muestra, para producir la cantidad de verde
leucomalaquita en la muestra.
En un aspecto adicional, la invención incluye un
kit para detectar o determinar verde leucomalaquita y verde
malaquita, el kit incluye por lo menos el conjugado de la presente
invención; y por lo menos el anticuerpo de la presente invención.
El kit puede incluir opcionalmente instrucciones para el uso de
dichos conjugados y dichos anticuerpos para detectar verde
leucomalaquita y verde malaquita. Este es un kit
semi-cuantitativo que puede, opcionalmente,
detectar o determinar un analito seleccionado de verde
leucomalaquita, verde malaquita y mezclas de verde leucomalaquita y
verde malaquita en una muestra. Alternativamente, el kit es para
determinar cada uno de verde leucomalaquita y verde malaquita, el
kit incluye por lo menos el conjugado de la presente invención, y
por lo menos el anticuerpo de la presente invención. Tal un kit
puede incluir opcionalmente instrucciones para el uso de dichos
conjugados y dichos anticuerpos para determinar la cantidad de cada
uno de verde leucomalaquita y verde malaquita en una muestra.
Preferiblemente, la muestra es una solución, tal como un fluido
biológico. Más preferiblemente, la muestra es suero u orina.
En cualquier método individual y kit de la
invención, el hapteno básico utilizado para preparar el conjugado y
el hapteno básico utilizado para preparar el inmunógeno, contra el
que el anticuerpo se produce, pueden ser los mismos o diferentes.
Se prefiere que ellos sean diferentes para así incrementar la
sensibilidad del ensayo. Sin desear estar limitado, se considera
que los analitos objetivo en una muestra son más capaces de
competir para los sitios de unión a anticuerpo con un conjugado que
es estructuralmente aún ligeramente diverso del inmunógeno que
produce el anticuerpo. La mejor sensibilidad resultante así obtenida
se ejemplifica en el Ejemplo 12 aquí adelante. En cualquier método
individual y kit de la invención, el método o kit puede mostrar una
sensibilidad o IC_{50} (ng/ml) de menos de 35 ng/ml, opcionalmente
menos de 30 ng/ml, cada uno para verde leucomalaquita. Si el
hapteno básico utilizado para preparar el conjugado y el hapteno
básico utilizado para preparar el inmunógeno, contra el cual el
anticuerpo se produce, es diferente, el método o kit puede mostrar
una sensibilidad o IC_{50} (ng/ml) de menos de 10 ng/ml,
opcionalmente menos de 7.5 ng/ml, adicionalmente opcionalmente
menos de 5.0 mg/ml, cada uno para verde leucomalaquita. En cualquier
método individual y kit de la invención, el método o kit puede
mostrar una sensibilidad o IC_{50} (ng/ml) de menos de 150 ng/ml,
opcionalmente menos de 125 ng/ml, todavía adicionalmente
opcionalmente menos de 105 ng/ml, cada uno para verde malaquita. Si
el hapteno básico utilizado para preparar el conjugado y el hapteno
básico utilizado para preparar el inmunógeno, contra el cual el
anticuerpo se produce, es diferente, el método o kit puede mostrar
una sensibilidad o IC_{50} (ng/ml) de menos de 35 ng/ml,
opcionalmente menos de 25 ng/ml, adicionalmente opcionalmente menos
de 15 ng/ml, cada uno para verde malaquita.
En un aspecto adicional, la presente invención
involucra el uso de por lo menos el conjugado de acuerdo con la
presente invención, con por lo menos el anticuerpo de acuerdo con la
presente invención, para detectar o determinar verde leucomalaquita
y verde malaquita en muestras tal como fluidos biológicos.
Una modalidad de la invención se describe ahora
por vía de ejemplo y con referencia a los dibujos que acompañan en
los cuales:
Figura 1 muestra las fórmulas estructurales de
p-(3-carboxipropoxi) verde leucomalaquita (Hapteno
A), p-(3-carboxipropoxi) verde malaquita (Hapteno B)
y leucomalaquita p-(3-acetiltiopropanamido) (Hapteno
C).
Figura 2 muestra la preparación de las etapas
del hapteno p-(3-carboxipropoxi) verde
leucomalaquita (Hapteno A) de la Figura 1.
Figura 3 muestra la preparación de la etapa de
hapteno p-(3-carboxipropoxi) verde malaquita
(Hapteno B) de la Figura 1.
Figura 4 muestra la preparación de las etapas
del hapteno leucomalaquita
p-(3-acetiltiopropanamido) (Hapteno C) de la Figura
1.
Figura 5 muestra la RMN que resulta para
p-(3-carboxipropoxi) verde leucomalaquita (Hapteno
A) de la Figura 1.
Figura 6 muestra el MALDI que resulta para
BSA.
Figura 7 muestra MALDI que resulta para el
Inmunógeno I (el hapteno p-(3-carboxipropoxi) verde
leucomalaquita (Hapteno A) de la Figura 1 conjugado a BSA).
Figura 8 muestra una ensayo de placa de
microtítulo ELISA competitivo para el desarrollo de ELISA
competitivas para verde leucomalaquita y verde malaquita.
El p-(3-carboxipropoxi) verde
leucomalaquita, (hapteno A) se prepara en tres etapas de acuerdo con
la Figura 2 de los dibujos que acompañan. Primero, el benzaldehído
4-hidroxi, 1, que se hace reaccionar con
4-bromobutirato de etilo en la presencia de
carbonato de potasio en acetonitrilo en reflujo para dar
p-[3-(etilcarboxi)-propoxi]benzaldehído, 2.
El éster obtenido, 2, se hace reaccionar con N,
N-dimetilanilina en la presencia de ácido sulfúrico
a 120ºC durante 48 horas para proporcionar verde leucomalaquita
p-[3-(etilcarboxi)-propoxi)], 3, en producción
moderada. El hapteno A se obtiene después de la saponificación del
éster de verde leucomalaquita, 3, con hidróxido de sodio en
tetrahidrofurano (THF) y metanol. Se puede obtener
p-(3-carboxipropoxi) verde malaquita, hapteno B,
mediante la oxidación de hapteno A, que conduce a óxido (PbO_{2})
o
2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
(DDQ) (Figura 3).
El hapteno C, leucomalaquita
p-(3-acetiltiopropanamido), se prepara en tres
etapas (Figura 4). Primero, 4-nitrobenzaldehído, 4,
se calienta con N,N-dimetilanilina bajo condiciones
ácidas para dar p-nitroleucomalaquita, 5. Esto se
reduce utilizando Pd/C en la presencia de formato de amonio en
MeOH/THF para dar p-aminoleucomalaquita, 6.
Finalmente, p-aminoleucomalaquita se hace
reaccionar con 3-(acetiltio)-propionato de
N-succinimidilo en la presencia de
N,N-diisopropiletilamina en
1,4-dioxano y se agita a temperatura ambiente
durante la noche para producir hapteno C.
Aunque los haptenos descritos aquí proporcionan
epítopos estructurales definidos, ellos mismos no son inmunogénicos
y por lo tanto necesitan ser conjugados a materiales portadores, que
provocarán una respuesta inmunogénica cuando se administra a un
animal anfitrión. Los materiales portadores apropiados contienen
comúnmente segmentos poli-(aminoácido) e incluyen polipéptidos,
proteínas y glicoproteínas. Ejemplos ilustrativos de materiales
portadores útiles son albúmina de suero bovino (BSA), ovalbúmina de
huevos, globulina gama bovina, tiroglobulina bovina (BTG),
hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) etc. Alternativamente,
los poli-(aminoácidos) sintéticos tienen un número suficiente de
grupos amino disponibles, tal como lisina, se puede emplear, como
pueden otros materiales poliméricos naturales o sintéticos ser
grupos funcionales reactivos. En particular, carbohidratos,
levaduras o polisacáridos se pueden conjugar al hapteno para
producir un inmunógeno.
Los haptenos descritos aquí también se pueden
acoplar a un agente de etiqueta detectable tal como una enzima (por
ejemplo, peroxidasa de rábano), una sustancia que tiene propiedades
fluorescentes o una etiqueta radioactiva para la preparación de
conjugados (o reactivos de detección) para uso en las
inmunoanálisis. La sustancia fluorescente puede ser, por ejemplo,
un residuo monovalente de fluoresceína o su derivado.
La formación del Inmunógeno (Ejemplos 7 y 8)
involucra la química de conjugación convencional en la que el
oxígeno del grupo hidroxilo de Hapteno A se combina primero con DCC
y luego NHS para formar un éster con un grupo saliente poderoso.
El ataque nucleófilo en el carbonilo de la
funcionalidad éster mediante un grupo amina libre en la proteína
(BSA o BTG), resulta en una unión amida y la formación de los
inmunógenos objetivo. La formación del conjugado Hapteno
A-HRP sigue un mecanismo similar utilizando EDC y
sulfo-NHS (Ejemplo 9). La hidrólisis de Hapteno C
para formar el derivado tiol, seguido por la sustitución nucleófila
de HRP modificado por el Hapteno C hidrolizado, que resulta en la
formación del conjugado (Ejemplo 10).
Con el fin de confirmar que la conjugación
adecuada del hapteno al material portador se ha logrado, antes de
inmunización, cada inmunógeno se evalúa utilizando espectrometría de
masas con analizador de tiempo de vuelo y desorción mediante láser
asistida por matriz (MALDI-TOF MS). Los inmunógenos
de la presente invención son adecuados para inmunización, con el fin
de producir anticuerpos para la detección de verde leucomalaquita y
verde malaquita.
\vskip1.000000\baselineskip
La espectrometría de masa
MALDI-TOF se desarrolla utilizando un espectrómetro
de masa de desorpción de láser Voyager STR Biospectrometry Research
Station acoplado con extracción retrasada. Una alícuota de cada
muestra para ser analizada se diluye en 0.1% de ácido
trifluroacético acuoso (TFA) para crear 1 mg/ml de soluciones de
muestra. Las alícuotas (1Pl) se analizan utilizando una matriz de
ácido Sinapínico y albúmina de suero bovino (Fluka) se utiliza como
un calibrador externo. La Figura 6 de los dibujos que acompañan
muestra el análisis para el material portador BSA. Como se verá,
una señal principal está presente la cual indica una masa protonada
promedio para esta muestra de m/z 66,400. La señal a m/z 33,203 es
consistente con el componente principal en la forma de doble carga.
Las señales adicionales se observan que incluyen m/z 13,495.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de generar antisuero policlonal, el
inmunógeno de la presente invención se mezcla con adyuvante Freund
y la mezcla se inyecta en un animal anfitrión, tal como conejo,
oveja, ratón conejillo de indias o caballo. Se hacen inyecciones
adicionales (refuerzos) y el suero se le toma muestra para la
evaluación del título de anticuerpo. Cuando el título óptimo se ha
logrado, se sangra el animal anfitrión para producir un volumen
adecuado para el antisuero específico. El grado de purificación de
anticuerpo requerido depende de la aplicación pretendida. Para
muchos propósitos, no se requiere purificación, sin embargo, en
otros casos, tal como en donde el anticuerpo se inmoviliza en un
soporte sólido, las etapas de purificación se pueden tomar para
remover el material indeseado y eliminar la unión no
específica.
específica.
Los anticuerpos específicos preparados en esta
invención son útiles como reactivos en inmunoanálisis para la
detección o determinación de verde leucomalaquita y verde malaquita
en fluidos biológicos. Los anticuerpos de la presente invención son
capaces de unirse con el metabolito de verde leucomalaquita y con el
verde malaquita pariente.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de 4-hidroxi
benzaldehído, 1, (20 g, 164 mMol) y carbonato de potasio (68 g, 492
mMol) en acetonitrilo (300 ml) se agrega
4-bromobutirato de etilo (35.2 ml, 246 mMol). La
mezcla luego se calienta en reflujo durante la noche. Después de
enfriar a temperatura ambiente, el sólido se filtra y el disolvente
se remueve in vacuo. Luego se agrega agua (200 ml) al residuo
y se extrae con acetato de etilo (3 x 200 ml). Las fases orgánicas
combinadas se lavan con solución salina (1 x 200 ml), se secan sobre
sulfato de sodio, se filtran y se evaporan hasta secado. El residuo
así obtenido se purifica mediante cromatografía flash sobre gel de
sílice utilizando 30% acetato de etilo en hexano como eluyente para
dar 2 como un aceite incoloro (27 g, 69.8%).
Espectro IR (película): 1733.7, 1692.5, 1601.2,
1577.9, 1509.8, 1257.7, 1161.1 cm^{-1}.
A una mezcla de
p-[3-(etilcarboxi)-propoxi]-benzaldehído
2 (10 g, 42.4 mMol) y N,-N-dimetilanilina (12.38 g,
106 mMol) se agrega ácido sulfúrico concentrado (2 ml) y la mezcla
se calienta a 120ºC durante 48 horas. La solución luego se enfría a
temperatura ambiente, se agrega agua (200 ml) y la mezcla se
neutraliza con carbonato de sodio sólido antes de extraer con
acetato de etilo (3 x 100 ml), se lava con solución salina (1 x 100
ml) se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in
vacuo hasta secado. El producto crudo obtenido se purifica
mediante cromatografía sobre gel de sílice utilizando 25% de acetato
de etilo en hexano como eluyente para dar el éster, 3, como un
aceite naranja (6.9 g, 35%).
Espectro IR (película): 1735.3, 1612.2, 1518.3,
1242.6 cm^{-1}.
A una solución del éster, 3, (8.4 g, 18.75 mMol)
en una mezcla de metanol y THF (2:-1, 240 ml) se agrega hidróxido
de sodio (2N, 40 ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente
durante 16 horas. Los disolventes se remueven in vacuo y se
agrega agua (100 ml). La solución se neutraliza a pH 7 mediante la
adición de HCl (2N) y el precipitado resultante obtenido se
recolecta mediante filtración y se seca en un secador sobre
pentóxido fosforoso. El hapteno A se obtiene como un sólido
azul/verde (3.2 g, 40%).
RMN ^{13}C, disolvente
\delta-MeOH (Figura 5): 178.8, 156.9, 148.9,
137.7, 133.6, 130.6, 129.9, 114.1, 112.9, 66.6, 54.2, 40.9, 30.9,
24.6.
A p-nitrobenzaldehído, 4, (12.81
g, 84.77 mMol) y N,-N-dimetilanilina (24.76 g, 204.3
mMol) se agrega ácido sulfúrico (5 ml). Después de calentar durante
48 horas, se agrega agua (200 ml) y la solución se neutraliza
mediante la adición de solución de carbonato de sodio saturada. La
solución se extrae con diclorometano (3 x 200 ml) y acetato de
etilo (3 x 200 ml), se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se
evapora hasta secado. El producto crudo se purifica mediante
cromatografía de columna utilizando (gel de sílice; 20% acetato de
etilo en hexano), para dar p-nitroleucomalaquita, 5,
como un sólido amarillo (3.5 g, 11 %).
RMN ^{13}C, disolvente CDCl_{3}: 153.5,
149.5, 146.2, 131.0, 129.4, 123.4, 113.9, 54.9, 40.9.
A p-nitroleucomalaquita (2.1 g,
5.6 mMol) en una mezcla de metanol y tetrahidrofurano (1:1, 160 ml)
se agrega formato de amonio (1.91 g, 30.29 mMol) y Pd/C (300 mg,
2.83 mMol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 3
horas. El disolvente se remueve in vacuo, se agrega agua (200
ml), y la solución resultante se extrae con acetato de etilo (3 x
200 ml), se seca sobre sulfato de sodio y se evapora hasta secado.
El producto crudo se purifica mediante cromatografía de columna
utilizando (gel de sílice; 10% hexano en acetato de etilo), para dar
p-aminoleucomalaquita, 6, como una cera
púrpura/sólido rojo (2.43 g, 75%).
Se agitan p-Aminoleucomalaquita
(470 mg, 1.36 mMol), N,-N-diisopropiletilamina (350
\mul, 2.04 mMol) y 3-(acetiltio)-propionato de
N-succinimidilo (367 mg, 1.5 mMol) se agitan en
1,4-dioxano (25 ml) a temperatura ambiente durante
la noche. El disolvente se remueve in vacuo. El producto
crudo se purifica mediante cromatografía de columna (gel de sílice;
acetato de etilo: hexano, 1:-5) para dar
p-(3-acetiltiopropanamido) leucomalaquita, hapteno
C, como un aceite púrpura (560 mg, 87%).
Espectro IR (película): 1741, 1692, 1611, 1518,
1353, 1204 cm^{-1}.
A una solución de hapteno A (60 mg, 0.14 mMol)
en DMF (2 ml) se agrega N-hidroxisuccinimida (17.7
mg, 0.154 mMol) y N,-N-diciclohexilcarbodiimida
(DCC) (31.8 mg, 0.154 mMol) y la mezcla se agita a temperatura
ambiente durante la noche. La diciclohexilurea formada se remueve
mediante filtración y el filtrado se agrega en forma de gotas a una
solución de BSA (200 mg) en 0.1M de bicarbonato de sodio (pH 8.5, 9
ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. La
solución se dializa contra 50 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.2
(3 cambios) durante 24 horas a 4ºC y luego se seca en frío. Los
resultados MALDI muestran 47.9 moléculas de hapteno A que se han
conjugado a 1 molécula de BSA (Figura 7).
La conjugación de hapteno A a BTG se lleva a
cabo mediante el mismo método como el Ejemplo 7 al utilizar: Hapteno
A (80 mg), N-hidroxisuccinimida (24 mg), DCC (36 mg)
y BTG (150 mg).
Se disuelve EDC.HCl (10 mg) en agua (0.5 ml) y
se agrega inmediatamente a una solución de hapteno A (2 mg) en DMF
(0.2 ml).Después de mezclar esta solución se agrega en forma de
gotas a una solución de HRP (20 mg) en agua (1 ml). Se agrega
sulfo-NHS (5 mg) y la mezcla de reacción se incuba
en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. El exceso
de hapteno se remueve al desalinar con columnas
PD-10 (Pharmacia) en series, se
pre-equilibra con PBS (solución salina amortiguada
con fosfato) a pH 7.2. El hapteno-conjugado HRP
luego se dializa durante la noche contra 10 L de PBS/pH 7.2 a
4ºC.
Una solución de 1 M de hidróxido de potasio (100
ml) se agrega a una solución de
p-(3-acetiltiopropanamido)-leucomalaquita
(2 mg) en DMF (0.2 ml). Después de incubar durante 10 minutos, se
agrega 0.1 M de amortiguador de fosfato, seguido por 1 M de HCl.
Después de mezclar, esta solución se agrega en forma de gotas a una
solución de HRP modificado (20 mg). El exceso de hapteno se remueve
al desalinar con columnas PD-10 (Pharmacia) en
series, se pre-equilibra con PBS (solución salina
amortiguada con fosfato) a pH 7.2. El hapteno -conjugado HRP luego
se dializa durante la noche contra 10 L de PBS/pH 7.2 a 4ºC.
Una solución acuosa del inmunógeno II se formula
con adyuvante completo de Freund (FCA) para formar una emulsión que
consiste de 2 mg/ml de inmunógeno en 50% (v/v) FCA. Tres ovejas se
inmunizan con esta emulsión (1º de inmunización), 0.25 ml se
inyecta intramuscularmente en cada uno de los cuatro sitios en la
cadera de cada animal. Inmunizaciones posteriores (refuerzos)
contienen 1 mg/ml del inmunógeno. Todos los refuerzos se emulsifican
en 50% (v/v) adyuvante incompleto de Freund (FIA) y se administran
de la misma forma como la inmunización 1, en intervalos mensuales
durante 1 año. Se toma muestras de sangre dentro de 7 a 14 días
después de cada refuerzo. Cada muestra se procesa para producir
antisuero, que se purifica adicionalmente mediante ácido caprílico
y precipitación de sulfato de amonio para producir una fracción de
inmunoglobulina (Ig). La fracción Ig se evalúa mediante ensayo de
placa de microtítulo ELISA competitivo, como se describe en el
Ejemplo 12 adelante.
Los pozos de una unión mejorada de placas de
microtítulo de poliestireno de 96 pozos se cubren con la fracción
Ig del antisuero producido por inmunógeno II (hapteno
A-BTG) (Ejemplo 8), se diluye en 10 mM Tris, pH 8.5
(125 \mul/-pozo). El anticuerpo apropiado cubierto con dilución se
determina utilizando técnica de "checkerboard" ELISA estándar.
La placa se incuba durante 2 horas a 37ºC, se lava 4 veces con
solución salina amortiguada con Tris que contiene Tween 20 (TBST) y
se seca tapado. Las soluciones estándar de verde leucomalaquita y
verde malaquita se preparan en TBST a 0, 5, 10, 50, 100, 250, 500 y
1000 ng/ml, y 50 \mul de cada uno se agrega a los pozos apropiados
(Figura 8).
75 \mul del conjugado I (hapteno
A-HRP) (Ejemplo 9), se diluye en amortiguador Tris
(pH 7.2) que contiene EDTA, D-manitol, sacarosa,
timerosal y BSA, se agrega a cada uno de los pozos, como se muestra
en la Figura 8. La dilución apropiada del conjugado también se
determina utilizando técnicas "checkerboard" ELISA estándar.
La placa se incuba a 37ºC durante 2 horas. El exceso del conjugado
unido se remueve mediante lavados de 6 veces durante un periodo de
10 minutos con TBST. Se agrega 125 \mul de solución de sustrato
tetrametilbenzidina (TMB) a cada pozo en la placa que luego se
incuba durante 15 a 20 minutos en la oscuridad a temperatura
ambiente. La reacción se termina mediante la adición de 125 \mul
0.2M H_{2}SO_{4} a cada pozo. La absorbancia luego se mide a
450 nm utilizando un lector de placa de microtítulo. Los datos
generados en el ensayo se presentan en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
75 \mul del conjugado C (hapteno
C-HRP) (Ejemplo 10), se diluye en amortiguador Tris
(pH 7.2) que contiene EDTA, D-manitol, sacarosa,
timerosal y BSA, se agrega a cada uno de los pozos, como se muestra
en la Figura 8. La dilución apropiada del conjugado también de
determina utilizando técnicas "checkerboard" ELISA estándar. La
placa se incuba a 25ºC durante 1 hora. El exceso del conjugado unido
se remueve mediante lavados de 6 veces durante un periodo de
10-15 minutos con TBST.
\newpage
125 \mul de solución sustrato de
tetrametilbenzidina (TMB) se agrega a cada pozo de la placa que
luego se incuba durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura
ambiente. La reacción se termina mediante la adición de 100 \mul
0.2 M H_{2}SO4 a cada pozo. La absorbancia luego se mide a 450 nm
utilizando un lector de placa de microtítulo. Los datos generados en
el ensayo se presentan en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 muestra una sensibilidad o IC_{50}
(ng/ml) de 3.74, mientras que la Tabla 1 muestra una sensibilidad o
IC_{50} (ng/ml) de 27.33, cada uno para verde leucomalaquita. La
Tabla 2 muestra una sensibilidad o IC_{50} (ng/ml) de 13.962,
mientras que la Tabla 1 muestra una sensibilidad o IC_{50} (ng/ml)
de 103.39, cada uno para verde malaquita. Estas diferencias de
sensibilidad se han producido, esto es a través, al utilizar un
conjugado con un grupo reticulado que es diverso estructuralmente
del grupo reticulado del inmunógeno. Sin esperar ser unido por la
teoría, esto es a través de los analitos en el ensayo que son
capaces de competir con el conjugado para los sitios de unión del
anticuerpo, por lo tanto se incrementa la sensibilidad del ensayo
mientras que retiene su perfil de especificidad.
Claims (23)
1. Un inmunógeno que comprende verde
leucomalaquita, acoplado por vía de un reticulador, a un material
portador que confiere antigenicidad, el reticulador se extiende
desde la posición para, orto o meta del anillo fenilo no sustituido
de verde leucomalaquita.
2. Un inmunógeno de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el reticulador comprende
-X-Y-Z:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que X es un primer enlace
bivalente, Y es un segundo enlace bivalente y Z es un grupo reactivo
capaz de acoplar al material portador que confiere
antigenicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un inmunógeno como se reivindica en la
reivindicación 1 o 2, en el que el reticulador se extiende desde la
posición para del anillo fenilo no sustituido de verde
leucomalaquita.
4. Un inmunógeno como se reivindica en la
reivindicación 2 o 3, en el que X es un heteroátomo seleccionado de
O, S y N, en el que X es más preferiblemente un átomo O.
5. Un inmunógeno como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que Y es un
C_{1-10}, más preferiblemente un
C_{2-6}, más preferiblemente un C_{3}, cadena
recta sustituida o no sustituida, grupo funcional alquileno
saturado, o un grupo funcional arileno.
6. Un inmunógeno como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que Z (antes de
conjugación con el material portador que confiere antigenicidad) se
selecciona de un carboxi, un ditiopiridilo, una maleimida, un amino,
un hidroxilo, un tiol, un tioéster o un grupo funcional aldehído, en
el que Z (antes de conjugación con el material portador que confiere
antigenicidad) es, opcionalmente, un grupo funcional carboxi
(COOH).
7. Un inmunógeno que comprende
p-(3-carboxipropoxi) verde leucomalaquita acoplado
con un material portador que confiere antigenicidad.
8. El inmunógeno de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el material portador se selecciona
de una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético
o un polipéptido semisintético.
9. Un anticuerpo producido contra el inmunógeno
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el anticuerpo es
capaz de unirse con por lo menos el epítopo estructural de verde
leucomalaquita y verde malaquita.
10. Un anticuerpo producido contra el inmunógeno
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el anticuerpo tiene
especificidad para verde leucomalaquita caracterizado por
tener reactividad cruzada para verde malaquita, en el que los
anticuerpos tienen opcionalmente reactividad cruzada de más de 10%
para verde malaquita.
11. Un conjugado que comprende verde
leucomalaquita, unido covalentemente, por vía de un reticulador, a
un agente de etiqueta detectable, el reticulador se extiende desde
la posición para, orto o meta del anillo fenilo no sustituido de
verde leucomalaquita.
\newpage
12. El conjugado de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el reticulador comprende
-X-Y-Z:
en la que X es un primer enlace
bivalente, Y es un segundo enlace bivalente y Z es un grupo reactivo
capaz de acoplar al agente de etiqueta
detectable.
\vskip1.000000\baselineskip
13. El conjugado como se reivindica en la
reivindicación 11 o 12, en el que el reticulador se extiende desde
la posición para del anillo fenilo no sustituido de verde
leucomalaquita.
14. El conjugado como se reivindica en la
reivindicación 12 o 13, en el que X es un heteroátomo seleccionado
de O, S y N, en el que X es más preferiblemente un átomo N.
15. El conjugado como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que Y es un
C_{1-10}, más preferiblemente a
C_{2-6}, más preferiblemente a C_{3}, cadena
recta sustituida o no sustituida, grupo funcional alquileno
saturado, o un grupo funcional arileno.
16. El conjugado como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que Z (antes de
conjugación con el agente de etiqueta detectable) se selecciona de
un carboxi, un ditiopiridilo, una maleimida, un amino, un hidroxilo,
un tiol, un tioéster o un grupo funcional aldehído.
17. El conjugado como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que Z (antes de
conjugación con el agente de etiqueta detectable) es un tiol o un
tioéster.
18. Un conjugado que comprende
p-(3-tiopropanamido) leucomalaquita acoplado a un
agente de etiqueta detectable.
19. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 18, en el que el agente de etiqueta
detectable se selecciona de una enzima, una sustancia luminiscente y
una sustancia radioactiva.
20. Un método para detectar o determinar verde
leucomalaquita y verde malaquita en una muestra, el método comprende
poner en contacto la muestra con por lo menos el conjugado de una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 y con por lo menos el
anticuerpo de la reivindicación 9 o 10; detectar el conjugado unido;
y deducir de una curva de calibración la presencia de, o la cantidad
de, verde leucomalaquita y verde malaquita en la muestra.
21. Un método para determinar la cantidad de
cada analito en una muestra, en la que los analitos comprenden verde
leucomalaquita y verde malaquita, el método comprende poner en
contacto la muestra con por lo menos el conjugado de una cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 19, y con por lo menos el anticuerpo de
la reivindicación 9 o 10 y determinar el conjugado unido; poner en
contacto la muestra con por lo menos el anticuerpo de la
reivindicación 9 o 10 y determinar el verde malaquita unido; y
deducir de las curvas de calibración, la cantidad de cada uno de
verde leucomalaquita y verde malaquita en la muestra.
22. Un kit para detectar o determinar verde
leucomalaquita y verde malaquita, el kit incluye por lo menos el
conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19; y por
lo menos el anticuerpo de la reivindicación 9 o 10.
23. Uso de por lo menos el conjugado de una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 con por lo menos el
anticuerpo de la reivindicación 9 o 10 para detectar o determinar
verde leucomalaquita y verde malaquita en muestras tal como fluidos
biológicos.
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Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3739000A (en) * | 1970-09-25 | 1973-06-12 | Eastman Kodak Co | Process for preparing aminotriphenylmethane leuco bases |
| AU670108B2 (en) * | 1992-09-11 | 1996-07-04 | Becton Dickinson & Company | Improved antibodies to plasmodium falciparum |
| US5605616A (en) * | 1995-11-06 | 1997-02-25 | Versicor, Inc. | Reversible charge-based sequestration on solid support |
| EP0934986A1 (de) * | 1997-12-17 | 1999-08-11 | Roche Diagnostics GmbH | Farbstoff-Polyaccharid- bzw. Cyclosaccharid-Konjugate und deren Verwendung als Diagnostikum |
| US6437099B1 (en) * | 1998-01-07 | 2002-08-20 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescene—activating antisera and IgG fraction therefrom |
| EP1312923B1 (en) * | 2001-11-16 | 2007-03-28 | Randox Laboratories Ltd. | Method and kit for detecting, or determining the quantity of, metabolites of fentanyl and metabolites of fentanyl analogs |
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- 2008-07-11 HK HK08107676.8A patent/HK1113199A1/xx not_active IP Right Cessation
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