JP2004538447A - 動力学アッセイ - Google Patents
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Abstract
平衡に近づかない、動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイで使用する、一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚを有するハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートである(式中、Ｘはハプテンであり、Ｗは任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、Ｙは１０個以上の原子長のリンカーであり、Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである)。また、このコンジュゲート、アッセイ方法およびキットを作成する方法も提供される。本発明のコンジュゲート[(５)−ＯＶＡ]を利用した本発明のアッセイは、より短いリンカーを有するコンジュゲート[(２)−ＯＶＡおよび３−ＯＶＡ]を用いた同じアッセイより優れた感度を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、小さいサイズのハプテン、より詳細には固定したまたは可動な免疫反応物質としての他の大分子とのコンジュゲート、および迅速アッセイ、具体的には免疫アッセイ、特にラテラルフロー試験またはストリップ試験、フロースルー形式およびフロー免疫センサーにおけるその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
迅速なラテラルフローストリップ試験またはフロー免疫センサーは、利用しやすい形式であること、通常のＥＬＩＳＡアッセイに比べて試験結果を得るまでの処理時間が比較的短いこと、および長期安定性を含めた多くの利点を有する。またこれらは比較的安価で作成される。
【０００３】
ステロイドや薬物など小さいサイズのハプテンの免疫アッセイには一般的にいわゆる競合技術が必要である。コーティング抗原として、ハプテンは通常、捕獲ドットまたはラインとしてストリップ膜などの固相にコーティングして、色素、酵素または粒子にコンジュゲートした抗体と反応させ；あるいは、色素もしくは他の発色性粒子で標識し、可動な免疫反応物質として使用して、有色ドットを形成し、または免疫複合体を固相上に固定した抗体と結合させる。どちらの構造でも、固相に固定したまたは可動な免疫反応物質としてコーティングした抗原は、限られた数の抗体結合部位において遊離の試料抗原と競合する。したがって、捕獲ライン中のハプテン／抗体結合能力は、検出可能なハプテンの濃度範囲を、したがって免疫アッセイの感度を決定する重要な判断基準である。
【０００４】
小さなハプテンは、サイズが小さいため、ハプテン特異的抗体に対する結合親和性を保持させたままでストリップ膜や粒子など固相上に直接吸着させることは不可能である。したがって、小さなハプテンを固相に固定するためには、タンパク質にコンジュゲートさせなければならない。付着の中間体としても使用できるＮ−ビニルピロリドンコポリマー(米国特許第5,723,344号)や核酸断片(米国特許第5,849,480号)など他の物質もいくつか存在するが、最も広く使用されている固相上の小さいサイズのハプテンの固定化技術は依然として、従来のタンパク質コンジュゲーション、すなわちハプテン−タンパク質コンジュゲートの調製である(Clinica Chimica Acta、162、1987、199〜206)。
【０００５】
反応性、すなわちハプテンに対する抗体の結合特異性に影響を与える最も重要な要素の１つが立体効果であることが一般的に受け入れられている。一部の文献は、伸長した柔軟なストレプトアビジン／ビオチン「架橋」によって(Immunology Letters、13、1986、313〜316およびJ. Immunological Methods、111、1988、271〜275)、あるいは長く伸長したリンカーによって(Bioconjugate Chem.、 7、1996、88〜95)、共有結合で固相にコンジュゲートさせた抗体の結合性が高くなることを報告している。異なるリンカーを介して大きなタンパク質抗原を固体の支持体に付着させた場合にも抗体の抗原捕獲能力が向上した(J. Immunological Methods、55、1982、1〜12)。ハプテン−スペーサー−タンパク質コンジュゲートの概念はいくつかの特許にも現れている。スペーサーすなわちリンカーアームを介してハプテンを免疫原性担体タンパク質に付着させることにより、抗体の調製において免疫応答が改善されるかもしれない(米国特許第5,776,713号および米国特許第5,843,682号)。ハプテンと標識の間に伸長したリンカーを使用して様々な酵素または他のトレーサーで標識したハプテンは、より容易に認識され、ハプテンに対する抗体によってより密接に結合され、また、酵素活性や他のトレーサーの特性をよく保持している(米国特許第5,298,403号、米国特許第5,578,457号および米国特許第5,834,206号)。コンジュゲートの合成におけるこのような目的のためにリンカーグループを有する二官能性試薬も使用した(米国特許第5,595,741号)。リンカーグループを有する薬物ハプテン−担体タンパク質コンジュゲートの構築は、抗体による認識が最適であり、したがって、従来の他の薬物とのより優れた同時療法的な用法を有している(米国特許第5,876,727号)。米国特許第5,876,727号はまた、担体またはタンパク質から十分な距離だけハプテンを移動させて、抗体によるハプテンの最適な認識を可能にする利点を教示している。
【０００６】
従来、プロゲステロンおよび同じ環構造を有する他の類似のステロイドハプテンを、そのｂ環の６位および７位で他の分子に付着させていた(G.Hatzidakis、 A.StefanakisおよびE.Krambovitis、1993、「Comparison of Different Antibody-Conjugate Derivatives for the Development of Sensitivity and Specific Progesteron Assay」、Journal of Reproduction and Fertility、97、ページ557〜561)。
【０００７】
本出願者らは今回、驚くべきことに、比較的短い時間のアッセイで、小さいサイズのハプテンを捕獲するリガンドの能力が、多くの迅速アッセイ、具体的にはラテラルフローストリップ試験やフローイムノセンサーなど免疫アッセイに対して感度を有するように高められることを発見した。これは、ハプテンと、タンパク質などハプテンが付着している大型グループ(large group)との間にリンカーを使用することによる従来のＥＬＩＳＡには、特に適していない。
【０００８】
本発明の目的は、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを利用する迅速アッセイを提供すること、あるいは少なくとも有用な選択肢を社会に提供することである。
【０００９】
（発明の概要）
第１の態様では、本発明は平衡に近づかない動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイで使用する、一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚで表されるハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを提供する。
（式中、
Ｘは、ハプテンであり、
Ｗは、任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、
Ｙは、１０個以上の原子長のリンカーであり、
Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである）
好ましい実施形態では、Ｘは式IのＡ環構造を有する多環の融合環ハプテンである。
【００１０】
【化１】
式中、ＲはＨ、ＣＨ3およびＣＨ2ＯＨを含む群から選択され、破線は隣接するＢ環構造の環員を示し、Ｒ1はリンカーＹの付着点である。
【００１１】
より好ましい実施形態では、Ｘは式IIのハプテンである。
【００１２】
【化２】
式中、
Ｒは、Ｈ、ＣＨ3およびＣＨ2ＯＨを含む群から選択され、
Ｒ1は、リンカーＹの付着点であり、
Ｒ2は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ3は、オキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルキルまたはメチルカルボニルが任意選択でヒドロキシによって置換されている、オキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルキル、ヒドロキシ、およびメチルカルボニルを含む群から選択され、
Ｒ4は、水素またはヒドロキシである。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、
ａ)ハプテンを結合する能力があるリガンドを試験試料と接触させるステップと、
ｂ)ステップａ)のリガンドを、このリガンドに特異的な本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートとさらに接触させるステップと、
ｃ)リガンドに結合した、コンジュゲートしていないハプテンの量を決定するステップと
を含む、試料中のハプテンを検出するための、平衡に近づかない、動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイ法を提供する。
【００１４】
好ましくは、リガンドを接触させる第２ステップ(ｂ)により、過剰の結合していないリガンドのほとんどが接触され結合される。
【００１５】
好ましくは、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは固定されている。
【００１６】
好ましい実施形態では、ステップａ)の混合物をステップｂ)のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの上に流す。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、
ａ)本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを試験試料と混合するステップと、
ｂ)生じた混合物をこのハプテンを結合する能力があるリガンドと接触させるステップと、
ｃ)リガンドに結合したコンジュゲートしていないハプテンの量を決定するステップと
を含む、試料中のハプテンを検出するための、平衡に近づかない動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイ法を提供する。
【００１８】
好ましくは、リガンドは固定されている。
【００１９】
好ましい実施形態では、生じた混合物を固定したリガンドと接触させるステップｂ)は、フローオーバーまたはフロースルーシステムによって行われる。
【００２０】
さらなる態様では本発明は少なくとも
ハプテンに結合するリガンドと、
本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと
を含む、平衡に近づかない動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイのキットを提供する。
【００２１】
好ましくは、このキットは指示薬をさらに含む。一実施形態では、この指示薬はハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに結合している。代替実施形態では、この指示薬はリガンドに結合している。
【００２２】
一般的にキットはフローオーバーまたはフロースルーアッセイキットであってよい。典型的なフロースルーキットは試験ストリップを含む。
【００２３】
別の態様では、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを、コンジュゲート内のハプテンと結合する能力があるリガンドと、反応が平衡に近づかない所定の時間接触させるステップを含む、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートをリガンドに結合させる方法を提供する。
【００２４】
リガンドは固定されていることが好ましい。好ましい実施形態では、このリガンドはタンパク質−ハプテンのコンジュゲートと接触する前にはハプテンに結合していないことが好ましい。
【００２５】
別の態様では本発明は少なくとも
ａ)極性有機溶媒に溶かした活性化されたステロイドハプテンを、1〜10モル等量の異種二官能性水溶性リンカーを含む水溶液と混合するステップと、
ｂ)混合物を反応させるステップと、
ｃ)ステップｂ)のハプテン−リンカー反応生成物の残りの遊離官能性リンカーグループに大型グループを付着させるステップと
を含む、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを生成する方法を提供する。
【００２６】
（図面の簡単な説明）
本発明は広くは上に定義したとおりであるが、それだけに限定されるものではなく、以下の説明によって例が提供される実施形態も含められることは、当業者には理解されよう。さらに、添付の図を参照することによって本発明をより良く理解することができる。
【００２７】
図１は、伸長した長さのリンカーを有する４−プロゲステロン誘導体の合成を示す。
【００２８】
図２は、様々な長さのリンカー(4個、11個、または18個の原子のリンカー)を有する、１つの７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ]および３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡ]の構造を示す。
【００２９】
図３は、類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合曲線を有する、４−および７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡは下の曲線、(３)−ＯＶＡは上の曲線]のどちらもを示す。
【００３０】
図４は、抗体(ＭｏＡｂ)と(３)−ＯＶＡコンジュゲート(上の曲線)および(２)−ＯＶＡコンジュゲート(下の曲線)との標準曲線を示す。
【００３１】
図５は、類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合性能を有する３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]を示す。
【００３２】
図６は、抗体(ＭｏＡｂ)と３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡ、(７)−ＯＶＡ]との、非常に類似した標準曲線を示す。
【００３３】
図７は、免疫金にコンジュゲートした抗体(ＭｏＡｂ)とラテラルフロー試験ストリップ上にコーティングした３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)−ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]との、様々な結合性能を示す。
【００３４】
図８は、図７の走査計測分析(scannometric analysis)[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]の結果を示す。
【００３５】
図９は、固定したモノクローナル抗体と、３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)−ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]の免疫金複合体との、様々な結合性能を示す。
【００３６】
図１０は、小さなハプテン用のバイオドットフロースルー免疫アッセイ形式の２ステップの設計を示す。
【００３７】
図１１は、金表面に固定した抗体または本発明のハプテン−リンカー大型グループのコンジュゲートを使用した、小さなハプテン用の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)フロー免疫センサーの２つの設計を示す。
【００３８】
図１２は、４つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、〜１２ＲＵ；(３)−ＯＶＡ、〜５０ＲＵ；(５)−ＯＶＡ、〜１５０ＲＵ；(７)−ＯＶＡ、〜２２５ＲＵ]と固定したモノクローナル抗プロゲステロン抗体(ＭｏＡｂ)との様々な結合性能を、ＳＰＲバイオセンサーによって示す。
【００３９】
図１３は、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]を固定したバイオセンサー表面を使用した、抗体結合応答を示す。
【００４０】
図１４は、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]バイオセンサー表面を使用した、プロゲステロンの競合免疫アッセイの標準曲線を示す。
【００４１】
図１５は、競合ＳＰＲに基づいた免疫アッセイから得られたプロゲステロンの検出の直線範囲0.1〜10ng.ml-1を示す図である。
【００４２】
図１６は、18個の原子のリンカー有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成方法を示す。
【００４３】
図１７は、様々な長さのポリエチレングリコールリンカーを有するプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成の設計を示す。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明の開示では、「迅速アッセイ」とは、アッセイ成分を混合した場合に、このアッセイから有意義な結果が得られる前に平衡状態に近づく必要がない反応を有するアッセイ成分によって、特徴付けられている。本発明は、アッセイを実行している期間中にアッセイ成分の反応が平衡に近づかない、迅速アッセイに特に適している。このような迅速アッセイは、非平衡の、動力学に基づいたアッセイである。通常、このアッセイは実施に20分未満、より適切には10分未満しかかからないはずである。
【００４５】
「大型グループ」とは、10個の原子長未満のリンカーをリガンドとハプテンの間に挿入した場合に、付着したハプテンのリガンドへの結合に対して有意な立体障害を引き起こすのに十分なサイズのグループである。通常、本発明では、大型グループはタンパク質またはポリペプチドである。あるいは、この大型グループは、蛍光色素、たとえばビリルビンなどの指示薬である。
【００４６】
一実施形態では、コンジュゲートの大型グループはタンパク質である。このタンパク質は、好ましくは安価であり、ハプテンとコンジュゲートするための多数のリジンを含む、容易に入手可能な任意のタンパク質である。当分野の適切なタンパク質の例には、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、卵白アルブミン(ＯＶＡ)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)が含まれる。タンパク質には、酵素、分泌タンパク質、球状タンパク質が含まれ得る。本発明中で使用するための好ましいタンパク質は卵白アルブミン(ＯＶＡ)である。タンパク質が酵素である場合、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アミンを富化した西洋ワサビペルオキシダーゼを含む群から選択されることが好ましい。
【００４７】
「ハプテン」とは、検出するために選択される分子である。最も一般的には、このハプテンは、抗体と特異的に反応し、それ自体では免疫応答を誘発させる能力がないが抗原性の担体と複合体を形成すると免疫原性になる、低分子量有機化合物である。本発明で対象となるハプテンは、それだけには限定されないが、炭化水素、ポリヌクレオチド、ステロイド、ステロイド類似体、ポリペプチド(ペプチドホルモンなど)、薬物および毒素を含む群から選択される。
【００４８】
ハプテンが、プロゲステロンまたはプロゲステロンに類似のＡ環構造を有する分子などステロイドである場合は、ハプテンの結合がＡ環構造の４位で起こることが好ましい。ステロイドプロゲステロンのＣ−４位でのタンパク質コンジュゲート部位が良好なアッセイ感度を有することが見出された。これまでに、文献では、プロゲステロン分子とタンパク質の一般的なコンジュゲート部位のほとんど(３、６β、７αおよび１１α位)が調査され、最も感度の高いＥＩＡアッセイの結果は、ステロイドの６βまたは７α位のどちらかを使用することによってしか得られなかった(Journal of Reproduction and Fertility、97、1993、557〜561)。４−プロゲステロン誘導体は、より簡単に合成され、６βや７α類似体に比べて立体異性体の問題がない。これにより、プロゲステロンの４位、またはプロゲステロンと同じＡ環構造を有する他のステロイドの４位が、６βや７α位に代わる、優れた代替タンパク質コンジュゲート部位となる。しかし他の結合部位の使用も除外されない。
【００４９】
好ましい実施形態では、このハプテンは以下を含む群から選択される。
【００５０】
【化３】
最も好ましくは、このハプテンはプロゲステロンである。
【００５１】
本明細書中で使用する「リガンド」は、抗原を結合する能力を有する任意の分子でよい。好ましくは、これは標的に特異的に結合する能力のある免疫グロブリン分子である。このような抗原標的には上記のハプテンが含まれる。リガンドには、完全な抗体だけでなく、その断片、たとえばＦａｂ、(Ｆａｂ)2、Ｆｖ、単鎖(ＳｃＦｖ)、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変した構造が包含される。代替実施形態ではこのリガンドはＴ細胞受容体でよい。
【００５２】
リンカーは、好ましくは10〜50個の原子長、より好ましくは11〜24個の原子長、最も好ましくは11〜18個の原子長の鎖を含む。当分野で周知の任意の適切なリンカーを使用することができる。リンカーは、ハプテンのリガンドへの結合に対する立体障害が最小限であることを保証するために、ハプテンに近位のかさ高くない基であるべきである。また、この鎖が炭素に基づいたものであることが好ましい。この炭素に基づいた鎖は、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択された１つまたは複数の異種原子を含んでいてもよい。他の側鎖置換基を提供してもよい。
【００５３】
好ましい鎖は、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコール鎖、アルキル、アルケニル、核酸、および多糖を含む群から選択される。異種原子はアミノ基の一部でもよい。この鎖は、１つまたは複数、好ましくは３つ以下の不飽和部位を有することができる。アミノ酸断片を鎖に取り込んでもよい。ホモロゲーションによって複数のアミノ酸断片を提供してもよい。リンカーとしてハイブリッドペプチド−核酸断片を使用することも企図される。
【００５４】
本発明者らは、立体障害を減らすための最適なリンカーの長さは約18個の原子であることを見出した。それ以降は、性能は最小限しか向上されないが、より長いリンカーを組み込むことによって混乱が生じる。明らかに、本発明の実施に18個の原子より長いリンカーを使用してもよいが、これは好ましくない。
【００５５】
好ましい実施形態では本発明のコンジュゲートは式IIIまたは式IVによって表される。
【００５６】
【化４】
【００５７】
【化５】
（式中、ＸおよびＺは上に定義したとおりである）
一実施形態では本発明のコンジュゲートは以下のものである。
【００５８】
【化６】
別の実施形態では、本発明の好ましいコンジュゲートは図２に示す(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡである。
【００５９】
当分野で周知の任意の手段によってこのリンカーをハプテンとタンパク質に付着させることができる。好ましい方法には、(たとえばタンパク質上のアミン、カルボキシルまたはスルフヒドリル基への)共有結合反応、核酸ハイブリダイゼーション、またはリガンド相互作用による方法が含まれる。
【００６０】
ステロイドをリンクグループに共有結合させるためには、多くの場合、チオエーテルまたはエーテルの架橋基、好ましくはチオエーテル基を含むことが必要である。
【００６１】
固相が必要な場合は、リガンドまたはハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを固相に固定することができる。リガンドとハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの量が事前に決定されていることが好ましい。また、リガンドに比べてタンパク質−コンジュゲートが過剰量あることが好ましい。
【００６２】
リガンドおよびハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートのどちらもが、ハプテンを定性分析および定量分析するためのコンジュゲートの迅速な検出を可能にするために、検出システムでの使用に適した指示薬をさらに含むことができる。
【００６３】
本発明での使用に適した多くの検出システムが当分野に存在する。当分野の技術者は、周知の方法を使用してタンパク質の結合を検出することができる。様々な免疫アッセイ手順は、「Immunoassays for the 80's」、 A. Voller.他編、University Park, 1981に記載されている。これには、酵素検出システム、色素(蛍光マーカー、有色イオンや錯体など)、金属または非金属の有色粒子(免疫金や着色ラテックスビーズなど)、および取り込まれた放射性同位元素(たとえばシンチレーション計数によって検出される)が含まれる。
【００６４】
好ましい実施形態では、安価で比較的安定であるので免疫金粒子が使用される。標識した抗体を検出するのに使用してもよい適切な酵素には、それだけには限定されないが、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母菌アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。
【００６５】
抗体を放射標識することにより、放射性免疫アッセイ(ＲＩＡ)を使用してそれを検出することが可能になる(たとえば、Work, T.S.他、「Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology」、North Holland Publishing Company、ニューヨーク、1978参照)。この放射性同位元素は、γ線計数器やシンチレーション計数器の使用、またはオートラジオグラフィーによる手段などによって検出することができる。本発明の目的に特に有用な同位元素は、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉおよび131Ｉである。
【００６６】
蛍光標識は本発明の範囲内にある。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に暴露させた場合、蛍光によってその存在を検出することができる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、ビリルビンがある。
【００６７】
また、この抗体を152Ｅｕなどの蛍光放射金属またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)やエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)など金属キレート化グループを使用してこれらの金属を特定の抗体に付着させることができる。
【００６８】
この抗体はまた化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することができる。その後、化学反応の過程中に生じる発光の存在を検出することによって化学発光で標識した抗体の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００６９】
同様に、生物発光化合物を使用して抗体を標識してもよい。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系内で見つかる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００７０】
抗体の検出は、たとえば検出可能な標識が放射性γ線放射源である場合はシンチレーション計数器によって、あるいは、たとえば標識が蛍光物質である場合は蛍光光度計によって行うことができる。
【００７１】
酵素標識の場合、酵素の基質を使用する比色法によって検出を行うことができる。また、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準と比較する目視比較によって、検出を行うこともできる。
【００７２】
抗体の結合活性は、周知の方法に従って決定することができる。当分野の技術者は、日常的な実験を用いることによって、それぞれの測定(determination)に有効で最適なアッセイ条件を決定することができる。本発明で企図される方法は、動力学に基づくものである。平衡に基づくシステムは、本発明の目的では企図されない。
【００７３】
試験化合物を加えない、陽性対照アッセイを実施してもよい。
【００７４】
一実施形態では、このハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、図２に示したとおりである。
【００７５】
本発明のコンジュゲートは、多くの様々な迅速免疫アッセイでの使用に適している。
【００７６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明のコンジュゲートを、コンジュゲート内のハプテンに特異的なリガンドに結合させる方法を提供する。この結合ステップは一般的に、迅速なフローオーバーまたはフロースルー方式で、固相の表面上で行われる。
【００７７】
固相を使用する場合は、リガンドまたはハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートのどちらかを固定することができる。好ましくは、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを固体の支持体に固定する。本発明の範囲内で使用できる固体の支持体は、それだけには限定されないが、主に、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ポリアクリルアミド、セルロース、硝酸セルロース、架橋デキストラン、フッ化樹脂、アガロース、架橋アガロース、および多糖からなる群から選択される不溶性の高分子物質を含む。
【００７８】
しかし、さらに、ガラス、ガラス繊維、ガラスビーズ、金属、ナイロンメッシュ物質、ナイロン膜、金属、金属ストリップおよび金属ビーズなど他の物質を使用することも考えられる。好ましい固体の支持体は、膜、ビーズ、マイクロプレート固体支持体、試験管、マイクロタイタープレート、ディップスティック、ラテラルフロー装置、樹脂、ＰＶＣ、ラテックスビーズおよびニトロセルロースから選択される。担体の性質は本発明の目的ではある程度可溶性または不溶性とすることができる。支持体の形状は、ビーズのように球状、試験管の内部のように円柱状、または棒の外部表面であってよい。あるいは、表面は、シート、試験ストリップなどのように平坦でもよい。当分野の技術者は、抗体や抗原を結合する多くの他の適切な担体を知っており、または日常的な実験を用いることによってこれを確認することができるであろう。
【００７９】
この固体表面は膜であることがより好ましい。
【００８０】
支持体が金属である場合は、これが、金やプラチナなどバイオセンサーの表面としての使用に適した金属であることが好ましい。
【００８１】
固体の支持体への固定は、受動吸着、共有結合、またはアビジン／ビオチン複合体などリガンドの相互作用を介したものによる固定でよい(たとえば米国特許第4,467,031号、Galati他)。
【００８２】
本出願者らは、予想外なことに、より長いリンカーを有するこれらのハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートが、迅速アッセイにおいて、従来のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに比べて相当の利点を有することを見出した。競合ＥＬＩＳＡタイプのアッセイで使用した場合はこのコンジュゲートの性能は従来のコンジュゲートと同等であるので、これは特に驚くべきことである。
【００８３】
特定の理論に拘泥するものではないが、迅速免疫アッセイにおける従来のタンパク質−ハプテンコンジュゲートの感度の低さは、固定した抗体との免疫複合体を形成する際の立体障害が原因であることが提唱された。したがって、迅速アッセイの感度を上げるためには、結合率に対する立体障害を最小限にするシステムが必要であると思われる。本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートはこの目的を果たしていると思われる。
【００８４】
特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、本発明の実施例で実証された、高められたハプテン抗体結合の動力学は、そこで提示する特定の実施形態の２つの主要な要素によって促進されることを提唱した。
【００８５】
１．リンカーがステロイドＡ環の４位に結合すること；および
２．リンカーの長さが、ハプテンとタンパク質が互いに、迅速なリガンドによるハプテンの認識およびリガンドのハプテンへの結合に対して立体障害がないような長さであること。このハプテンとタンパク質は、互いに対して自由な運動が与えられており、したがって、リガンドのハプテンへの結合の迅速な認識が可能となっていると考えられる。
【００８６】
本発明者らは、免疫アッセイのために、プロゲステロンの６βおよび７α以外の他のコンジュゲーション部位を調査した。本発明者らによって、プロゲステロンのＣ−４位がプロゲステロンの６β位に代わる、優れた代替コンジュゲーション部位であることが見出された。ＥＬＩＳＡでは、プロゲステロン−４−ＯＶＡ(１−ＯＶＡ)およびプロゲステロン−７α−ＯＶＡコンジュゲート(２−ＯＶＡ)のどちらも類似の抗体結合性能を有する。驚くべきことに、ＳＰＲなど動力学に基づいた免疫アッセイでは、プロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートはプロゲステロン−７α−ＯＶＡコンジュゲートより優れた抗体結合を示す。しかし、６β−および７α−プロゲステロン誘導体に比べて、Ｃ−４位のプロゲステロン誘導体の合成はより簡単であり、ステロイドの４，５−二重結合によってＣ−４位ではプロゲステロン誘導体の立体異性体が１つしか提供されないので、立体異性体の問題がない。
【００８７】
最近、伸長した長さの異種二官能性リンカーを使用することによって捕獲抗体とアルカリホスファターゼ標識またはその微小粒子との間の距離が長くなれば抗体結合シグナルが増大することが見出された。この増大は一般的なバイオコンジュゲートの２成分(entity)間の距離が増加した結果と見なされている。本発明者らは、ＥＬＩＳＡでコーティング抗原として使用した場合は、プロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲート内のリンカーの長さ(4、11または18個の原子長)は、その抗体結合性能に有意な効果を及ぼさないことを見出した。短い時間(20分)の抗体結合実験では、長いリンカーを有するコンジュゲート(４−および６−ＯＶＡ)は、短いリンカーを有するＯＶＡ−コンジュゲート(１−ＯＶＡ)に比べてむしろ僅かに悪かった。したがって、異なる長さのリンカー(4〜18個の原子)を有する３つのプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートは、ＥＬＩＳＡでは同じプロゲステロンアッセイ感度を有している。
【００８８】
以前の研究によりシグナルの増大が必ずしもリンカーの長さに比例するとは限らないことが示されている。たとえば、酵素−抗体コンジュゲート中のリンカーの長さを9個の原子から23個の原子に増加した場合はシグナルが64％増加し、30個の原子長のリンカーでは82％増加した。しかし、16個の原子のリンカーを有する同じ酵素−抗体コンジュゲートは、より長いリンカー(23個の原子)を有するコンジュゲートより僅かに優れた抗体結合性能を有していた。これらの結果は、シグナルを増大させるためには、抗体と他の成分との間のリンカーの理想的な長さは、関与する２つの成分のサイズおよびバイオコンジュゲートが形成される方法に依存することを示唆している。従来技術では、２つの大きな成分間で、すなわち抗体と酵素または微小粒子とでバイオコンジュゲートが構築される。リンカーは、抗体を標識する目的のみで使用され、抗体−抗原の結合部位と同じ側には直接関与していなかった。しかし本発明のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートは全く異なっている。これらは、大きなタンパク質(ＯＶＡ)と非常に小さな成分、すなわちプロゲステロン分子(分子量314)を用いて構築される。この抗体／抗原結合部位にはリンカーも直接関与している。したがって、このバイオコンジュゲートは２つの異なるサイズの成分によって形成され、異なる方法で構築されているので、抗体結合性能に対するリンカーの長さの効果は、初期に報告された研究とは異なる可能性がある。本発明者らは、リンカーの長さも、様々なアッセイ形式、特に迅速アッセイにおける抗体結合に影響を与えることを発見した。
【００８９】
本発明を実施するのに、いくつかの異なるアッセイタイプが有用であることが見出された。これらには、本明細書中に記載の試験ストリップアッセイ、ドットブロットアッセイ(ドット試験またはドット免疫結合アッセイとしても知られる)、ＳＰＲバイオセンサーなどフローイムノセンサーが含まれる。
【００９０】
また本発明の免疫アッセイは、20分未満、より好ましくは10分未満、最も好ましくは5分未満で完了することが好ましい。
【００９１】
好ましい試験ストリップイムノアッセイでは、長いリンカーを有する所定量のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、それを固定するための固体支持体の一部に固定されている。固体の支持体は通常、セルロースベースの膜、または少なくとも水ベースの溶媒の毛管移動が可能な支持体である。試験試料を膜支持体に施用し、標識した抗体と混合し、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートによって固定された捕獲ラインに向かって迅速に移動させた。遊離試料ハプテンと結合した後、過剰の抗体は、捕獲ラインでハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと色バンドを形成する。リガンドとしての標識した抗体の量は、捕獲ラインの色強度によって定量的または定性的に決定される。本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと結合する標識した抗体リガンドが少ないほど、試験試料中に多くのハプテンが存在する。
【００９２】
他の試験ストリップを形成することもできる。一実施形態では、試験試料を本発明の標識したタンパク質−ハプテンコンジュゲートと混合する。標識したハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートおよび遊離ハプテンのどちらも、固定した抗体リガンド上の結合部位において競合するために捕獲ラインに向かって移動する。色強度、すなわちハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの量は、試験試料中のハプテンの量に反比例している。
【００９３】
上で論じた任意の標識を使用することができるが、標識したコンジュゲートは肉眼で見えることが好ましい。したがって好ましい標識は可視色素である。
【００９４】
上記のストリップアッセイのどちらでも、本発明のタンパク質コンジュゲートは、短いリンカーを有するコンジュゲートに比べて、捕獲ライン内ではるかに優れた抗体結合性を有する。したがって、長いリンカーを有するコンジュゲートは、捕獲ライン内で比較的低い濃度の抗体を検出し、それによって迅速なストリップアッセイの感度を高めることができる。
【００９５】
本発明の別の実施形態はバイオドットのフロースルー免疫アッセイを提供する。このような免疫アッセイではまず抗体などのリガンドを膜上に固定する。微量濾過装置によって試料ハプテンを膜に貫流させた後、本発明の標識したハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは残った抗体と反応して膜上に有色ドットを形成する。ドットの色強度、すなわちハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの量も、試験試料中のハプテンの量に反比例する。
【００９６】
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)バイオセンサー技術は、抗体−ハプテン相互作用の特徴付けに非常に有用なツールである。これは小さいサイズのハプテンの迅速免疫アッセイ用に設計することもできる。一般的に、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートまたはＳＰＲで使用するリガンドのいずれかを、バイオセンサー表面上に共有結合により固定する。最も一般的には微量流動フローセル中を用いて、遊離試料ハプテン(分析物)と抗体リガンドとの混合物またはハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートとの混合物をバイオセンサー表面上に流して、バイオセンサー表面上の限られた数の抗体結合部位において競合させる。ＳＰＲ検出器はハプテン−抗体複合体形成の会合および解離によって誘発された表面近辺の溶媒層の屈折率の変化をモニターする。ＳＰＲ検出器の感度はその分子量に比例するセンサー表面上の抗体−ハプテン複合体の屈折率に依存している。したがって、抗体とハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートとの結合は、このタンパク質の分子量が大きいために、抗体と小さいサイズのハプテンとの結合による屈折率よりもはるかに高い屈折率によるＳＰＲ応答を与える。
【００９７】
本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは試験したすべてのアッセイで利点を示した。固体の支持体上にコーティングした抗原としてハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを使用した場合、より長いリンカーを有するコーティングしたコンジュゲートでは、免疫金にコンジュゲートした抗体によって、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートをより低濃度で検出できる。同時に、抗体を固定した場合、より長いリンカーを有するコンジュゲートは、抗体の検出限界がより低濃度である。
【００９８】
ストリップアッセイでは、どちらのアッセイ構造も免疫クロマトグラフィーストリップ試験の感度を高める。より長いリンカーを有するこれら新規のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに基づいて、比較的短い時間内で低濃度(＜10ng／ml)の小さなハプテンを検出できる高感度の免疫クロマトグラフィーストリップアッセイ形式が開発された。本発明の長いリンカーを有するハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、抗体／ハプテンの結合を強く阻害する、乳など脂質の含有量が高い試験試料のストリップアッセイで特に有用である。本発明のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを使用することで、乳中のプロゲステロンの最低検出限界(ＬＤＬ)は、視覚検査によって判断されるように約10ng／mlであり、これは文献値30ng／mlより低いＬＤＬである(Acta Chemica Scandinavica、50、1996、141〜145)。この文献中では、ストリップ試験には、ストリップ試験毎に、正確な、フレッシュな金標識したプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを使用しなければならない。
【００９９】
迅速なＳＰＲ(ＢＩＡｃｏｒｅ)アッセイでは、長いリンカー(18個の原子)を有するハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート(225応答ユニット)は、より短いリンカー(4個の原子)を有するコンジュゲート(50応答ユニットのみ)よりはるかに高い抗体結合性能が得られた。プロゲステロン分子の４−位のコンジュゲート(50応答ユニット)も、ちょうど同じ長さのリンカー(4個の原子)を有するプロゲステロンの７α−位のコンジュゲート(12応答ユニットのみ)より優れた抗体結合を示した。
【０１００】
したがって、本発明は、試験ストリップ、試験ストリップを有するキット、およびハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの反応物質にまで及ぶ。
【０１０１】
本発明のキットは、上記の固定したリガンドを有する固体の支持体、および本発明の標識したハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを含むバイアルまたは容器を含む。
【０１０２】
キットのさらなる実施形態では、キットは、固定した本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを有する固体の支持体、およびハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに対する標識したリガンドを含むバイアルまたは容器を含んでもよい。
【０１０３】
本発明のキットの別の実施形態では、このキットは、上記の固定したリガンドを有する固体の支持体、およびハプテンを本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに変換する変換キットを含む容器のバイアルを含んでもよい。
【０１０４】
最も一般的には、このキットは、試験試料および標識したコンジュゲートを固体の支持体上で移動させるための溶媒、好ましくは水性溶媒をさらに含む。標識したコンジュゲートが肉眼で見えない場合は、標識したコンジュゲートの存在を検出する手段をキット中に提供してもよい。このキットは通常、好ましくは所定の試料および／またはコンジュゲートおよび／またはリガンドの体積を固体の支持体に運ぶための、アプリケーターを含む。
【０１０５】
本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、以下によって生成することができる。
【０１０６】
１．ハプテンを上に定義したリンカーに結合させること。好ましくは、この結合は化学的共有結合反応による、あるいは、リンカーが核酸である場合は、核酸ハイブリダイゼーションによる結合である。
【０１０７】
２．リンカーの遊離末端をタンパク質など大型グループに結合させること。リンカーをタンパク質に結合させる周知の方法は、標準の参考文献(「Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」、Mohammed AslamおよびAlastair Dent編)から選択することができる。
【０１０８】
あるいは、リンカーをまずタンパク質に結合させ、その後同じ方法でハプテンに結合させることも可能である。
【０１０９】
ｄ)極性有機溶媒に溶かした活性化されたステロイドハプテンを、1〜10モル当量の異種二官能性水溶性リンカーを含む水溶液と混合するステップと、
ｅ)混合物を反応させるステップと、
ｆ)ステップｂ)のハプテン−リンカー反応生成物の残りの遊離官能性リンカーグループに大型グループを付着させるステップと
を少なくとも含む、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを生成する方法が提供される。
【０１１０】
この方法は、任意選択でステップｂ)とｃ)の間にハプテン−リンカー−生成物を単離する単離ステップを含んでもよい。
【０１１１】
好ましくは、最終混合物は2〜30％、より好ましくは5〜15％、最も好ましくは約10％の含水率を有する。
【０１１２】
ステップｂ)の反応時間は、好ましくはほぼ24時間程度までの時間、より好ましくは12時間未満、最も好ましくは3時間である。ｂ)の反応は通常室温で起こる。好ましい実施形態ではｂ)の反応は実質的に中性のｐＨで起こる。
【０１１３】
好ましくはステップａ)の水溶液は2〜5モル当量の異種二官能性の水溶性リンカーを含む。
【０１１４】
一実施形態では、活性化されたステロイドはステロイドの活性化されたエステルである。最も好ましい実施形態ではこれはステロイドのスクシンイミドエステルである。
【０１１５】
好ましくは、この異種二官能性リンカーは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシ、アルデヒド、および反応性ハロゲンを含む群から選択された２つの異なる官能基を有する。好ましい実施形態ではこの異種二官能基はカルボキシルおよびアミノである。
【０１１６】
反応性でない任意の極性有機溶媒を反応で使用することができる。この極性有機溶媒は、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトンおよびＴＨＦから都合良く選択することができる。
【０１１７】
（産業上の利用）
したがって、本発明によれば、試験試料中のハプテンを検出するアッセイが提供される。このコンジュゲートは、試験試料中のハプテンが低濃度であるかつ／または脂質含量が高く、従来の免疫アッセイでは十分に、または迅速に検出できない場合に特に有用である。このアッセイは、in situでの試験のために形成した場合に特に有用である。このような商業的な応用の１つは、ウシの妊娠診断および発情の検出に使用できる、ウシの低レベルの乳プロゲステロンを迅速にその場で検出することである。
【０１１８】
以降、本発明を以下の非限定的な実施例に則して例示する。
【０１１９】
（実施例１）
様々な長さのリンカーを有する４つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの合成
(ａ)プロゲステロン４−メルカプトプロピオン酸(１)−および７α−メルカプトプロピオン酸(示さず)。これらの化合物は、文献(Steroids、53、1989、727〜738)の、１１α−ヒドロキシプロゲステロン４−および７αメルカプトプロピオン酸の調製手順に従って調製した。
【０１２０】
(ｂ)スクシンイミジルプロゲステロン４−メルカプトプロピオネート(３)。プロゲステロン４−メルカプトプロピオン酸の無水ＤＭＦ溶液3ml １(434.8mg、1.04mmol)に、1.0mlのＤＭＦのジシクロヘキシルジイミド(235.7mg、1.14mmol)溶液を加え、次いで、1.0mlのＤＭＦのＮ−ヒドロキシスクシンイミド(131.5mg、1.14mmol)溶液を加えた。この溶液を室温で終夜攪拌した。フラッシュカラムクロマトグラフィーの後純粋な生成物(３)が得られた。
【０１２１】
(ｃ)スクシンイミジルプロゲステロン４−メルカプトプロピオネート(５)の合成。プロゲステロン４−スクシンイミジルエステル３(300mg、0.58mmol)を4mlの無水ＤＭＦに溶かした。この溶液に、0.3mlの脱イオン水中のε−６−アミノカプロン酸(229mg、0.91mmol)を加え、この反応混合物を室温で終夜攪拌した。精製後、反応からＴＬＣプレート上の単一スポットとして白色の固体生成物４(収率63.6％)が得られ、これは、さらに精製せずに、そのスクシンイミジルエステル５の調製に直接使用した。化合物５は３の調製に類似の方法で調製した。
【０１２２】
(ｄ)スクシンイミジルプロゲステロン４−メルカプトプロピオネート(７)の合成。３から４を調製する方法と類似の方法で化合物６を調製した。化合物５(157.6mg、0.25mmol)およびε−６−アミノカプロン酸(98.7mg、0.39mmol)を出発物質として、カラムフラッシュクロマトグラフィーの後に化合物６(収率57％)が得られた。５の調製と類似の方法で化合物７も調製した。化合物６(92.1mg、0.14mmol)を出発物質として、カラムフラッシュクロマトグラフィーの後、透明な無色の油として生成物７が得られた。上記の合成したプロゲステロン誘導体(1〜7)すべてを、ＥＳ−ＭＳおよびＮＭＲ分析によって確認した。
【０１２３】
(ｅ)タンパク質コンジュゲーション。一連のプロゲステロン−卵白アルブミンコンジュゲートを、プロゲステロン遊離酸(1を含む)または単離したプロゲステロンスクシンイミジルエステル(3、5および7)のいずれかから、以下のように調製した。
【０１２４】
化合物１(29.5mg、0.07mmol)のＤＭＦ(0.5ml)溶液に、0.1mlのＤＭＦ中のジシクロヘキシルジイミド(16.02mg、0.078mmol)および0.1mlのＤＭＦ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド(8.94mg、0.078mmol)を加えた。この溶液を室温で90分間攪拌し、その後この溶液をＯＶＡ(63.5mg、0.0014mmol)のリン酸緩衝液(7ml、pH7.0)溶液に加えた。このコンジュゲーション反応物を４℃で終夜攪拌した。それから試料をＮａＨＣＯ3水溶液、脱イオン水、およびＰＢＳ／Ｔに対して透析した。ＰＤ−１０カラムを用いてさらに精製した後、これら精製試料中のＢＣＡアッセイで決定されたタンパク質量が、それぞれプロゲステロン−４−ＯＶＡは4.11mg ml-1、プロゲステロン−７α−ＯＶＡは4.02mg ml-1であることが分かった。
【０１２５】
単離した純粋なプロゲステロンスクシンイミジルエステル(3、5、および7)も、タンパク質のコンジュゲーションに直接使用した。0.019mmolのプロゲステロン活性エステル(3、5または7)の、0.2mlのＤＭＦまたはＤＭＳＯ溶液を、卵白アルブミン(17.1mg、0.38×10-3mmol)のリン酸緩衝液(1.5ml、pH7.0)溶液に、ゆっくり攪拌しながら加えた。これら３つのタンパク質コンジュゲートの精製は、既に上記した手順と同じ手順で実施した。同様にＢＣＡタンパク質アッセイで決定したこれらプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲート中のタンパク質量は、それぞれ1.09mg ml-1(4個の原子のリンカー)、3.56mg ml-1(11個の原子のリンカー)、および4.12mg ml-1(18個の原子のリンカー)であった。このプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの平均コンジュゲーション度、すなわちタンパク質あたりのハプテン数は、各コンジュゲートで平均４個であると概算され、これは、MALDI TOF質量分析によって直接決定された。これらプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの構造を図２に示す。
【０１２６】
（実施例２）
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをコーティング抗原として使用した直接または競合ＥＬＩＳＡ
直接ＥＬＩＳＡによって、プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートのＭＡｂに対する結合反応性が決定された。ＮａＨＣＯ3(50mM、pH9.6)中の一連の濃度のプロゲステロン−４−または−７α−ＯＶＡコンジュゲートで、マクロタイタープレートを事前にコーティングした。ＭＡｂのＰＢＳ／Ｔ溶液(5μg ml-1、各ウェル100μl)を加えた。プレートを3時間室温で振盪し、４℃で終夜放置した。その後、プレートにペルオキシダーゼで標識した抗ラットＩｇＧ溶液を加えた。最後に、200μlの基質溶液を各セルに加え、30分後に50μlの1M Ｈ2ＳＯ4を加えることによって酵素反応を停止した。その後、15分後に450nmでプレートを読み取り記録した。４−および７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの抗体結合曲線を図３および５に示す。
【０１２７】
ＮａＨＣＯ3(50mM、pH9.6)中のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをコーティング抗原として(1μg ml-1、各ウェル100μl)、標準曲線を作成した(図４および６参照)。競合ＥＬＩＳＡでは、様々な標準プロゲステロン(0.001〜1000ng ml-1)のＰＢＳ／Ｔ溶液(各ウェル100μl)、およびＭＡｂ(1μg ml-1)のＰＢＳ／Ｔ溶液(各ウェル100μl)を同時にプレートに加えた。他のすべてのＥＬＩＳＡ手順は、直接ＥＬＩＳＡと同じように実施した。
【０１２８】
本発明者らは、異なる長さのリンカーを有し、プロゲステロン上のコンジュゲート部位が異なる(４−または７α)プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートは、従来のＥＬＩＳＡによる抗体結合性能に有意な効果を及ぼさないことを見出した。
【０１２９】
（実施例３）
モノクローナル抗体 ( ＭｏＡｂ ) または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを用いた、免疫金複合体の調製
(ａ)コロイド金粒子(Ｇ４０)の調製。この調製は類似の文献(Analyst、123、1998、2437〜2441)に従って実施した。
【０１３０】
(ｂ)モノクローナル抗体−、または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートでコーティングしたコロイド金の調製。コロイド金(Ｇ４０)溶液をＫ2ＣＯ3(0.02M)でpH=7.7に滴定した後、激しく渦攪拌しながら、ｐＨを調整したコロイド金の溶液(10ml)に抗体(120μg)または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート(60μg)溶液(0.2ml)を加えた。その後、この免疫金溶液を20％ＯＶＡのＰＢＳ溶液(0.15ml)で遮断した。2％ＯＶＡで繰り返し洗浄し、6,000rpmで遠心分離した後、この免疫金溶液を４℃で、0.1％ＮａＮ3を含むホウ酸(ＮａＢ7Ｏ4)緩衝液(2mM、pH=7.2)中で保存した。
【０１３１】
（実施例４）
４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをコーティング抗原として使用した、またはモノクローナル抗体を試験ストリップ上に固定した、免疫クロマトグラフィーストリップ試験
ポリエステルの補助支持体(GL-187、G＆L Precision Die Cutting,Inc.、米国)でラミネートしたニトロセルロース膜(AE100、Schleicher＆Schuell、ドイツ)を切断してストリップ(4または5mm幅)にした。0.01％Ｔｗｅｅｎ−２０水溶液で10分間遮断し、その後40℃で2時間乾燥させた後、このストリップを、抗プロゲステロンＭＡｂ溶液(各ストリップあたり0.5μl)、または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート溶液(各ストリップあたり0.5μl)のいずれかでコーティングし、このストリップを再度40℃で2時間乾燥させた。このストリップは終夜シリカゲルの容器内で保存した。
【０１３２】
(ａ)様々な濃度のＯＶＡ−プロゲステロンコンジュゲート溶液でコーティングしたストリップでは、マイクロウェル中の半分のストリップの処理溶媒は以下のとおりである
15μlの、ＰＢＳ中の１％Ｔｗｅｅｎ−２０
15μlの、ＰＢＳ中の２％ポリビニルピロリジン(ＰＶＰ、分子量44000)
3μlの抗体−免疫金溶液(各ストリップ0.72μgのＭＡｂ)。
【０１３３】
(ｂ)様々な濃度のモノクローナル抗体溶液でコーティングしたストリップでは、マイクロウェル中の処理溶媒は以下のとおりである
20μlの、ＰＢＳ中の2.5％Ｔｗｅｅｎ−２０
20μlの、ＰＢＳ中の2％ポリビニルピロリジン(ＰＶＰ、分子量44000)
5μlの、プロゲステロン−ＯＶＡでコーティングした免疫金(各ストリップ0.3μgのタンパク質)。
【０１３４】
上記の２つの異なる形状における抗体結合性能を、図７および図９に示す。
【０１３５】
(ｃ)走査分析。ストリップを処理した後、以下の手順に従って、意図とは無関係な「Image Tool、バージョン2.00」を使用した走査分析によって図８の様々な試験ストリップの色強度を分析した
１．ストリップを走査ベッドの上に置いた
２．Image Toolを開き、file、acquire、TWAINを選択した
３．設定：スケール ＝３６％
幅 ＝３．３１ｃｍ
高さ ＝３．４９ｃｍ
解像度 ＝４００
４．Previewを押し、終わったらScanを押した
５．カラー画像をＪＰＧファイルとして最高解像度で保存した
６．「Processing」および「Colour to Greyscale」を選択することによって画像を8bppの白黒画像に変換した
７．「Analysis」および「Line Profile」を選択し、線の端が白い面上に来るように、バンドの上に線を引いた(１つのバンドに３回繰り返し、平均値をとる)
８．「Image Tool」により、ストリップの色強度に関係するすべてのピーク高さの値を自動的に記録した。
【０１３６】
（実施例５）
モノクローナル抗体バイオセンサー表面を使用した抗体結合性能の評価
抗体溶液(ＨＢＳ緩衝液中100μg／ml)によるバイオセンサー表面の固定化は、活性化させたＣＭ−５センサーチップに抗体を標準アミン結合させることによって調製した。４つの異なるプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡ、および(７)−ＯＶＡ](ＨＢＳ緩衝液中1mg／mlの濃度)を連続的に、検量したバイオセンサー表面上に10μl／分で3分間流した。各コンジュゲートの結合応答(応答ユニットすなわちＲＵ)を測定し、これを図１２に示す。コンジュゲートの結合親和性の結果により、プロゲステロンの４−位のコンジュゲートが７α−プロゲステロン誘導体より優れており、また長いリンカーを有するコンジュゲートが短いリンカーを有するコンジュゲートよりはるかに優れた抗体結合を与えることが明示された。
【０１３７】
（実施例６）
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートバイオセンサー表面を使用した抗体結合性能の評価
上記３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡおよび(５)−ＯＶＡ]バイオセンサー表面を使用して、抗体結合の研究も評価した。具体的には、６つの濃度のＭｏＡＢ(0から100μg.ml-1)を個別に、ブランクおよび固定したプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの表面上に注入した。またそれぞれのコンジュゲート表面からのデータを、ブランク表面からのセンサーグラムデータから減算することによって補正した。３つの同一の検量を実施し、それぞれの抗体濃度に有意な結合応答変化はなかった。したがって、１−、２−および４−ＯＶＡの３つの検量線はＭｏＡＢのそれぞれの濃度の平均結合応答により得られ、抗体濃度に対してプロットした(図１３)。リンカーの長さを４個の原子から11個の原子のリンカーに増やすと、プロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの抗体結合シグナルが30％増加した。また、このシグナルの増大は、７α−コンジュゲート[(２)−ＯＶＡ]に比べてプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ]で31％向上した。
【０１３８】
（実施例７）
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートバイオセンサー表面を使用したＳＰＲによる競合プロゲステロン免疫アッセイ
プロゲステロン用の競合ＳＰＲ免疫アッセイの開発では、抗体を固定したバイオセンサー表面に比べてより優れた結合応答を与えるために、プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをバイオセンサー表面上に固定した。様々なプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを抗体バイオセンサー表面に使用したスクリーニング試験(図１２)から、18個の原子のリンカーを有するコンジュゲート[(７)−ＯＶＡ]が最も高い抗体結合シグナル(225ＲＵ)を有していた。これは、競合ＢＩＡｃｏｒｅアッセイの設計における表面上のセンサープローブとして最も優れていると思われる。しかし、このコンジュゲート[(７)−ＯＶＡ]はセンサー表面上に固定されず、本発明者らは、他のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡおよび(５)−ＯＶＡ］のみしか、競合ＢＩＡｃｏｒｅアッセイのセンサー表面上に固定できない。
【０１３９】
固定濃度のＭｏＡＢ(200μg.ml-1)を、ＨＢＳ緩衝液中の一連の濃度の遊離プロゲステロンと混合した後、次いで、各平衡混合物中の残存抗体をプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートのバイオセンサー表面上に注入し、抗体結合応答を測定した。同じ実験を５回繰り返したが、それぞれの濃度のプロゲステロンの再現性は良好であった。抗体のチップ表面への結合は、溶液中の遊離プロゲステロンの量に反比例していた。遊離プロゲステロン濃度を抗体結合の平均応答(ＲＵ)に対してプロットすることにより、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの３つの標準競合曲線が得られた(図１４)。このアッセイは、0から50ng.ml-1の範囲のプロゲステロン濃度で良好な感度を示した。免疫アッセイの感度は通常、検量線の勾配、すなわち単位濃度に対する応答によって決定される。したがって、[(５)−ＯＶＡ]コンジュゲートは、[(２)−ＯＶＡ]コンジュゲートより僅かに感度が高い[(３)−ＯＶＡ]コンジュゲートより優れたアッセイ感度を示した。この結果は、ＳＰＲに基づいた免疫アッセイにおける、コンジュゲートのリンカー、およびステロイド分子のコンジュゲーション部位の効果を明示した。また、このＳＰＲに基づいたアッセイは、0.1〜10ng.ml-1で直線的な検出範囲を示し、この範囲のＲ2値は、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートすべてで0.99を超えることが見出された(図１５)。このＳＰＲに基づいた免疫アッセイは、従来のＥＬＩＳＡ技術に完全に匹敵し、はるかに迅速で簡単である。
【０１４０】
（実施例８）
長いリンカー (18 個の原子 ) を有する４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを使用した免疫クロマトグラフィーストリップ試験による、乳プロゲステロン濃度の決定
本発明の長いリンカー(18個の原子)を有する４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを様々な膜ストリップ上にコーティングすることができる。既に調製した抗体−金コンジュゲートを1〜5％のショ糖水溶液で希釈することができる。様々なコンジュゲートパッドを小さなサイズに切断し、金溶液をシートに染み込ませることによって上記の希釈した免疫金溶液(〜10μl)を各コンジュゲートパッドに施用することができる。この金コンジュゲートパッドを乾燥させ、保管する。
【０１４１】
試料パッドとして低ウィック(lower wick)材料またはガラス繊維を、終夜Tris緩衝液と水中の1〜5％Tween-20とに飽和させ、使用前に乾燥した。すべての試験材料(膜、金コンジュゲートパッド、試料パッドおよび溶媒吸収パッド)を補助プレートに貼り付け、プラスチックの枠(housing)にはめ込むことができる。このすぐに使用できるストリップ試験装置は、乾燥剤一袋の存在下で小袋に密封した場合、比較的安定である。
【０１４２】
この迅速ラテラルフローストリップ試験は、農場の乳プロゲステロン(Ｐ4)を測定するのにうまく応用することができる。このストリップは、従来のＥＬＩＳＡの便利な代替法である。またこれは、ＥＬＩＳＡに基づいた試験よりはるかに速い(10分以下)。これは、農業者がその場で使用するのに特に適している。この試験は、ウシの妊娠診断に使用することができる(プロゲステロン＜10ng／mlでは、強い色バンドによって妊娠の陰性結果を表すが、プロゲステロン＞10ng／mlでは、弱い色バンドまたは色バンドが現れないことによって妊娠の陽性結果を表す)。
【０１４３】
（実施例９）
伸長したリンカーを有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの合成
18個の原子のリンカーを有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの合成、およびそのＯＶＡコンジュゲーションは、ステロイドハプテンとしてプロゲステロンを使用する代わりにテストステロンを使用して、実施例１に示す手順と同じ手順で実施する。テストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートを生成する方法を図１６に示す。
【０１４４】
上記手順は、テストステロン、コルチコステロン、１７α，２０β−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン、１１α−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、２１−ヒドロキシプロゲステロン、１９−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンおよびヒドロコルチゾンなど、プロゲステロン分子と同じＡ環構造を有する他のステロイドに応用することができる。
【０１４５】
（実施例１０）
様々な長さのポリエチレングリコール ( ＰＥＧ ) リンカーを有するプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの合成
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートは、以下のステップで示すようにポリエチレングリコール(PEG)など様々な種類のリンカーを使用して合成することもできる(図１７)。
【０１４６】
(ａ)異種二官能性ＰＥＧリンカー(Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2Ｈ)。アミンの１つが保護されたＰＥＧアミン化合物は、市販のＰＥＧジアミンをジ−tert−ブチルジカルボネートと反応させることによって調製することができる。生じたアミンの１つが保護された生成物を市販の無水ジカルボン酸と反応させ、次いでアミンの保護を外すと、長さが24個の原子であり、リンカーの端の一方にカルボキシル基を有し、他方にアミン基を有する異種二官能性ＰＥＧアミノ酸リンカーがもたらされる。
【０１４７】
(ｂ)様々な長さのリンカーを有するプロゲステロン−ＰＥＧ−ＯＶＡコンジュゲートの合成。実施例１と同じ手順によって、プロゲステロン−４−メルカプトプロピオン酸(１)を活性スクシンイミジルエステルに変換することができる。生じた活性化されたステロイド(３)を上記ＰＥＧアミノ酸リンカー(Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2Ｈ)と反応させて、より長いリンカー(44個の原子長)を有するプロゲステロンＰＥＧ誘導体を形成することができる。実施例１に示したものと類似のタンパク質コンジュゲーションによって、これらプロゲステロンＰＥＧ誘導体(24個および44個の原子のリンカー)をＯＶＡタンパク質に結合させることができる。
【０１４８】
このプロゲステロン−ＰＥＧ−ＯＶＡのコンジュゲートは、単純なアミノカプロン酸鎖を有するコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡ]に比べてはるかに優れた水溶性を有する、長いリンカーを有するタンパク質コンジュゲートを構築するのに特に適している。
【０１４９】
（実施例１１）
サイズ排除クロマトグラフィーによる迅速免疫アッセイ
この実施例は、サイズ排除ゲルカラムクロマトグラフィーによる迅速免疫アッセイを実施する方法を記載する。固相の固定化はない。上記実施例のようにタンパク質を使用する代わりに、伸長したリンカーによってプロゲステロンを蛍光色素とコンジュゲートさせ、式Ｖのプロゲステロン−リンカー−ビリルビンを形成する。
【０１５０】
この迅速免疫アッセイは、以下のように実施すべきである。
【０１５１】
ステップ１：固定量の式Ｖの上記プロゲステロン−リンカー−ビリルビンのコンジュゲートと、所定量の抗プロゲステロン抗体とを、プロゲステロン濃度を決定する試料溶液とよく混合すべきである。この混合物に、免疫複合体を形成させるべきである。
【０１５２】
ステップ２：上記の混合物は素早く短いサイズ排除カラム中を通り、これを、〜450nmのＵＶ検出器を備えたＨＰＬＣでモニターする。ＨＰＬＣクロマトグラムでは、２つの主要なピークが検出される。第１のピークは、そのはるかに大きい質量(＞150,000)により早期に溶出される、抗体とプロゲステロン−リンカー−ビリルビンのコンジュゲートとの免疫複合体を表し、第２のピークは、はるかに低い質量(＜1,000)を有し後に溶出されるプロゲステロン−リンカー−ビリルビンのコンジュゲートを表す。他の種には蛍光色素が付着していないので、クロマトグラム上に他の構成成分は表れない。
【０１５３】
第１のピークは、プロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートと抗体との免疫複合体の量を表す。第２のピークは、免疫複合体に結合していないプロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートの量を表す。
【０１５４】
与えられた試料中の遊離プロゲステロン濃度が高い場合は、限られた数の抗体がプロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートと形成する免疫複合体は、より少なくなる。これにより、第１のピークは第２のピークより小さくなる。対照的に、与えられた試料中の遊離プロゲステロン濃度が低い場合は、限られた抗体がプロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートと形成する免疫複合体は、より多くなる。これにより、第１のピークは第２のピークより大きくなる。したがって、第１のピークの面積、または第１ピークの面積と第２ピークの比は、試料プロゲステロンの濃度に反比例する。
【０１５５】
上記の開示を例としてのみ提供することを、当分野の技術者は理解されよう。本発明の多くの様々な変化を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】伸長した長さのリンカーを有する４−プロゲステロン誘導体の合成を示す図である。
【図２】様々な長さのリンカー(4個、11個、または18個の原子のリンカー)を有する、１つの７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ]および３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡ]の構造を示す図である。
【図３】類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合曲線を有する、４−および７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡは下の曲線、(３)−ＯＶＡは上の曲線]のどちらもを示す図である。
【図４】抗体(ＭｏＡｂ)と(３)−ＯＶＡコンジュゲート(上の曲線)および(２)−ＯＶＡコンジュゲート(下の曲線)との標準曲線を示す図である。
【図５】類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合性能を有する３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]を示す図である。
【図６】抗体(ＭｏＡｂ)と３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡ、(７)−ＯＶＡ]との、非常に類似した標準曲線を示す図である。
【図７】免疫金にコンジュゲートした抗体(ＭｏＡｂ)とラテラルフロー試験ストリップ上にコーティングした３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)０ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]との、様々な結合性能を示す図である。
【図８】図７の走査計測分析(scannometric analysis)[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]の結果を示す図である。
【図９】固定したモノクローナル抗体と、３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)０ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]の免疫金複合体との、様々な結合性能を示す図である。
【図１０】小さなハプテン用のバイオドットフロースルー免疫アッセイ形式の２ステップの設計を示す図である。
【図１１】金表面に固定した抗体または本発明のハプテン−リンカー大型グループのコンジュゲートを使用した、小さなハプテン用の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)フロー免疫センサーの２つの設計を示す図である。
【図１２】４つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、〜１２ＲＵ；(３)−ＯＶＡ、〜５０ＲＵ；(５)−ＯＶＡ、〜１５０ＲＵ；(７)−ＯＶＡ、〜２２５ＲＵ]と固定したモノクローナル抗プロゲステロン抗体(ＭｏＡｂ)との様々な結合性能を、ＳＰＲバイオセンサーによって示す図である。
【図１３】３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]を固定したバイオセンサー表面を使用した、抗体結合応答を示す図である。
【図１４】３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]バイオセンサー表面を使用した、プロゲステロンの競合免疫アッセイの標準曲線を示す図である。
【図１５】競合ＳＰＲに基づいた免疫アッセイから得られたプロゲステロンの検出の直線範囲0.1〜10ng.ml-1を示す図である。
【図１６】18個の原子のリンカー有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成方法を示す図である。
【図１７】様々な長さのポリエチレングリコールリンカーを有するプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成の設計を示す図である。
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、小さいサイズのハプテン、より詳細には固定したまたは可動な免疫反応物質としての他の大分子とのコンジュゲート、および迅速アッセイ、具体的には免疫アッセイ、特にラテラルフロー試験またはストリップ試験、フロースルー形式およびフロー免疫センサーにおけるその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
迅速なラテラルフローストリップ試験またはフロー免疫センサーは、利用しやすい形式であること、通常のＥＬＩＳＡアッセイに比べて試験結果を得るまでの処理時間が比較的短いこと、および長期安定性を含めた多くの利点を有する。またこれらは比較的安価で作成される。
【０００３】
ステロイドや薬物など小さいサイズのハプテンの免疫アッセイには一般的にいわゆる競合技術が必要である。コーティング抗原として、ハプテンは通常、捕獲ドットまたはラインとしてストリップ膜などの固相にコーティングして、色素、酵素または粒子にコンジュゲートした抗体と反応させ；あるいは、色素もしくは他の発色性粒子で標識し、可動な免疫反応物質として使用して、有色ドットを形成し、または免疫複合体を固相上に固定した抗体と結合させる。どちらの構造でも、固相に固定したまたは可動な免疫反応物質としてコーティングした抗原は、限られた数の抗体結合部位において遊離の試料抗原と競合する。したがって、捕獲ライン中のハプテン／抗体結合能力は、検出可能なハプテンの濃度範囲を、したがって免疫アッセイの感度を決定する重要な判断基準である。
【０００４】
小さなハプテンは、サイズが小さいため、ハプテン特異的抗体に対する結合親和性を保持させたままでストリップ膜や粒子など固相上に直接吸着させることは不可能である。したがって、小さなハプテンを固相に固定するためには、タンパク質にコンジュゲートさせなければならない。付着の中間体としても使用できるＮ−ビニルピロリドンコポリマー(米国特許第5,723,344号)や核酸断片(米国特許第5,849,480号)など他の物質もいくつか存在するが、最も広く使用されている固相上の小さいサイズのハプテンの固定化技術は依然として、従来のタンパク質コンジュゲーション、すなわちハプテン−タンパク質コンジュゲートの調製である(Clinica Chimica Acta、162、1987、199〜206)。
【０００５】
反応性、すなわちハプテンに対する抗体の結合特異性に影響を与える最も重要な要素の１つが立体効果であることが一般的に受け入れられている。一部の文献は、伸長した柔軟なストレプトアビジン／ビオチン「架橋」によって(Immunology Letters、13、1986、313〜316およびJ. Immunological Methods、111、1988、271〜275)、あるいは長く伸長したリンカーによって(Bioconjugate Chem.、 7、1996、88〜95)、共有結合で固相にコンジュゲートさせた抗体の結合性が高くなることを報告している。異なるリンカーを介して大きなタンパク質抗原を固体の支持体に付着させた場合にも抗体の抗原捕獲能力が向上した(J. Immunological Methods、55、1982、1〜12)。ハプテン−スペーサー−タンパク質コンジュゲートの概念はいくつかの特許にも現れている。スペーサーすなわちリンカーアームを介してハプテンを免疫原性担体タンパク質に付着させることにより、抗体の調製において免疫応答が改善されるかもしれない(米国特許第5,776,713号および米国特許第5,843,682号)。ハプテンと標識の間に伸長したリンカーを使用して様々な酵素または他のトレーサーで標識したハプテンは、より容易に認識され、ハプテンに対する抗体によってより密接に結合され、また、酵素活性や他のトレーサーの特性をよく保持している(米国特許第5,298,403号、米国特許第5,578,457号および米国特許第5,834,206号)。コンジュゲートの合成におけるこのような目的のためにリンカーグループを有する二官能性試薬も使用した(米国特許第5,595,741号)。リンカーグループを有する薬物ハプテン−担体タンパク質コンジュゲートの構築は、抗体による認識が最適であり、したがって、従来の他の薬物とのより優れた同時療法的な用法を有している(米国特許第5,876,727号)。米国特許第5,876,727号はまた、担体またはタンパク質から十分な距離だけハプテンを移動させて、抗体によるハプテンの最適な認識を可能にする利点を教示している。
【０００６】
従来、プロゲステロンおよび同じ環構造を有する他の類似のステロイドハプテンを、そのｂ環の６位および７位で他の分子に付着させていた(G.Hatzidakis、 A.StefanakisおよびE.Krambovitis、1993、「Comparison of Different Antibody-Conjugate Derivatives for the Development of Sensitivity and Specific Progesteron Assay」、Journal of Reproduction and Fertility、97、ページ557〜561)。
【０００７】
本出願者らは今回、驚くべきことに、比較的短い時間のアッセイで、小さいサイズのハプテンを捕獲するリガンドの能力が、多くの迅速アッセイ、具体的にはラテラルフローストリップ試験やフローイムノセンサーなど免疫アッセイに対して感度を有するように高められることを発見した。これは、ハプテンと、タンパク質などハプテンが付着している大型グループ(large group)との間にリンカーを使用することによる従来のＥＬＩＳＡには、特に適していない。
【０００８】
本発明の目的は、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを利用する迅速アッセイを提供すること、あるいは少なくとも有用な選択肢を社会に提供することである。
【０００９】
（発明の概要）
第１の態様では、本発明は平衡に近づかない動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイで使用する、一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚで表されるハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを提供する。
（式中、
Ｘは、ハプテンであり、
Ｗは、任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、
Ｙは、１０個以上の原子長のリンカーであり、
Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである）
好ましい実施形態では、Ｘは式IのＡ環構造を有する多環の融合環ハプテンである。
【００１０】
【化１】
【００１１】
より好ましい実施形態では、Ｘは式IIのハプテンである。
【００１２】
【化２】
Ｒは、Ｈ、ＣＨ3およびＣＨ2ＯＨを含む群から選択され、
Ｒ1は、リンカーＹの付着点であり、
Ｒ2は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ3は、オキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルキルまたはメチルカルボニルが任意選択でヒドロキシによって置換されている、オキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルキル、ヒドロキシ、およびメチルカルボニルを含む群から選択され、
Ｒ4は、水素またはヒドロキシである。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、
ａ)ハプテンを結合する能力があるリガンドを試験試料と接触させるステップと、
ｂ)ステップａ)のリガンドを、このリガンドに特異的な本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートとさらに接触させるステップと、
ｃ)リガンドに結合した、コンジュゲートしていないハプテンの量を決定するステップと
を含む、試料中のハプテンを検出するための、平衡に近づかない、動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイ法を提供する。
【００１４】
好ましくは、リガンドを接触させる第２ステップ(ｂ)により、過剰の結合していないリガンドのほとんどが接触され結合される。
【００１５】
好ましくは、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは固定されている。
【００１６】
好ましい実施形態では、ステップａ)の混合物をステップｂ)のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの上に流す。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、
ａ)本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを試験試料と混合するステップと、
ｂ)生じた混合物をこのハプテンを結合する能力があるリガンドと接触させるステップと、
ｃ)リガンドに結合したコンジュゲートしていないハプテンの量を決定するステップと
を含む、試料中のハプテンを検出するための、平衡に近づかない動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイ法を提供する。
【００１８】
好ましくは、リガンドは固定されている。
【００１９】
好ましい実施形態では、生じた混合物を固定したリガンドと接触させるステップｂ)は、フローオーバーまたはフロースルーシステムによって行われる。
【００２０】
さらなる態様では本発明は少なくとも
ハプテンに結合するリガンドと、
本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと
を含む、平衡に近づかない動力学に基づいたアッセイである迅速アッセイのキットを提供する。
【００２１】
好ましくは、このキットは指示薬をさらに含む。一実施形態では、この指示薬はハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに結合している。代替実施形態では、この指示薬はリガンドに結合している。
【００２２】
一般的にキットはフローオーバーまたはフロースルーアッセイキットであってよい。典型的なフロースルーキットは試験ストリップを含む。
【００２３】
別の態様では、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを、コンジュゲート内のハプテンと結合する能力があるリガンドと、反応が平衡に近づかない所定の時間接触させるステップを含む、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートをリガンドに結合させる方法を提供する。
【００２４】
リガンドは固定されていることが好ましい。好ましい実施形態では、このリガンドはタンパク質−ハプテンのコンジュゲートと接触する前にはハプテンに結合していないことが好ましい。
【００２５】
別の態様では本発明は少なくとも
ａ)極性有機溶媒に溶かした活性化されたステロイドハプテンを、1〜10モル等量の異種二官能性水溶性リンカーを含む水溶液と混合するステップと、
ｂ)混合物を反応させるステップと、
ｃ)ステップｂ)のハプテン−リンカー反応生成物の残りの遊離官能性リンカーグループに大型グループを付着させるステップと
を含む、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを生成する方法を提供する。
【００２６】
（図面の簡単な説明）
本発明は広くは上に定義したとおりであるが、それだけに限定されるものではなく、以下の説明によって例が提供される実施形態も含められることは、当業者には理解されよう。さらに、添付の図を参照することによって本発明をより良く理解することができる。
【００２７】
図１は、伸長した長さのリンカーを有する４−プロゲステロン誘導体の合成を示す。
【００２８】
図２は、様々な長さのリンカー(4個、11個、または18個の原子のリンカー)を有する、１つの７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ]および３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡ]の構造を示す。
【００２９】
図３は、類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合曲線を有する、４−および７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡは下の曲線、(３)−ＯＶＡは上の曲線]のどちらもを示す。
【００３０】
図４は、抗体(ＭｏＡｂ)と(３)−ＯＶＡコンジュゲート(上の曲線)および(２)−ＯＶＡコンジュゲート(下の曲線)との標準曲線を示す。
【００３１】
図５は、類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合性能を有する３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]を示す。
【００３２】
図６は、抗体(ＭｏＡｂ)と３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡ、(７)−ＯＶＡ]との、非常に類似した標準曲線を示す。
【００３３】
図７は、免疫金にコンジュゲートした抗体(ＭｏＡｂ)とラテラルフロー試験ストリップ上にコーティングした３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)−ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]との、様々な結合性能を示す。
【００３４】
図８は、図７の走査計測分析(scannometric analysis)[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]の結果を示す。
【００３５】
図９は、固定したモノクローナル抗体と、３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)−ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]の免疫金複合体との、様々な結合性能を示す。
【００３６】
図１０は、小さなハプテン用のバイオドットフロースルー免疫アッセイ形式の２ステップの設計を示す。
【００３７】
図１１は、金表面に固定した抗体または本発明のハプテン−リンカー大型グループのコンジュゲートを使用した、小さなハプテン用の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)フロー免疫センサーの２つの設計を示す。
【００３８】
図１２は、４つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、〜１２ＲＵ；(３)−ＯＶＡ、〜５０ＲＵ；(５)−ＯＶＡ、〜１５０ＲＵ；(７)−ＯＶＡ、〜２２５ＲＵ]と固定したモノクローナル抗プロゲステロン抗体(ＭｏＡｂ)との様々な結合性能を、ＳＰＲバイオセンサーによって示す。
【００３９】
図１３は、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]を固定したバイオセンサー表面を使用した、抗体結合応答を示す。
【００４０】
図１４は、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]バイオセンサー表面を使用した、プロゲステロンの競合免疫アッセイの標準曲線を示す。
【００４１】
図１５は、競合ＳＰＲに基づいた免疫アッセイから得られたプロゲステロンの検出の直線範囲0.1〜10ng.ml-1を示す図である。
【００４２】
図１６は、18個の原子のリンカー有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成方法を示す。
【００４３】
図１７は、様々な長さのポリエチレングリコールリンカーを有するプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成の設計を示す。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明の開示では、「迅速アッセイ」とは、アッセイ成分を混合した場合に、このアッセイから有意義な結果が得られる前に平衡状態に近づく必要がない反応を有するアッセイ成分によって、特徴付けられている。本発明は、アッセイを実行している期間中にアッセイ成分の反応が平衡に近づかない、迅速アッセイに特に適している。このような迅速アッセイは、非平衡の、動力学に基づいたアッセイである。通常、このアッセイは実施に20分未満、より適切には10分未満しかかからないはずである。
【００４５】
「大型グループ」とは、10個の原子長未満のリンカーをリガンドとハプテンの間に挿入した場合に、付着したハプテンのリガンドへの結合に対して有意な立体障害を引き起こすのに十分なサイズのグループである。通常、本発明では、大型グループはタンパク質またはポリペプチドである。あるいは、この大型グループは、蛍光色素、たとえばビリルビンなどの指示薬である。
【００４６】
一実施形態では、コンジュゲートの大型グループはタンパク質である。このタンパク質は、好ましくは安価であり、ハプテンとコンジュゲートするための多数のリジンを含む、容易に入手可能な任意のタンパク質である。当分野の適切なタンパク質の例には、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、卵白アルブミン(ＯＶＡ)、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)が含まれる。タンパク質には、酵素、分泌タンパク質、球状タンパク質が含まれ得る。本発明中で使用するための好ましいタンパク質は卵白アルブミン(ＯＶＡ)である。タンパク質が酵素である場合、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アミンを富化した西洋ワサビペルオキシダーゼを含む群から選択されることが好ましい。
【００４７】
「ハプテン」とは、検出するために選択される分子である。最も一般的には、このハプテンは、抗体と特異的に反応し、それ自体では免疫応答を誘発させる能力がないが抗原性の担体と複合体を形成すると免疫原性になる、低分子量有機化合物である。本発明で対象となるハプテンは、それだけには限定されないが、炭化水素、ポリヌクレオチド、ステロイド、ステロイド類似体、ポリペプチド(ペプチドホルモンなど)、薬物および毒素を含む群から選択される。
【００４８】
ハプテンが、プロゲステロンまたはプロゲステロンに類似のＡ環構造を有する分子などステロイドである場合は、ハプテンの結合がＡ環構造の４位で起こることが好ましい。ステロイドプロゲステロンのＣ−４位でのタンパク質コンジュゲート部位が良好なアッセイ感度を有することが見出された。これまでに、文献では、プロゲステロン分子とタンパク質の一般的なコンジュゲート部位のほとんど(３、６β、７αおよび１１α位)が調査され、最も感度の高いＥＩＡアッセイの結果は、ステロイドの６βまたは７α位のどちらかを使用することによってしか得られなかった(Journal of Reproduction and Fertility、97、1993、557〜561)。４−プロゲステロン誘導体は、より簡単に合成され、６βや７α類似体に比べて立体異性体の問題がない。これにより、プロゲステロンの４位、またはプロゲステロンと同じＡ環構造を有する他のステロイドの４位が、６βや７α位に代わる、優れた代替タンパク質コンジュゲート部位となる。しかし他の結合部位の使用も除外されない。
【００４９】
好ましい実施形態では、このハプテンは以下を含む群から選択される。
【００５０】
【化３】
【００５１】
本明細書中で使用する「リガンド」は、抗原を結合する能力を有する任意の分子でよい。好ましくは、これは標的に特異的に結合する能力のある免疫グロブリン分子である。このような抗原標的には上記のハプテンが含まれる。リガンドには、完全な抗体だけでなく、その断片、たとえばＦａｂ、(Ｆａｂ)2、Ｆｖ、単鎖(ＳｃＦｖ)、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変した構造が包含される。代替実施形態ではこのリガンドはＴ細胞受容体でよい。
【００５２】
リンカーは、好ましくは10〜50個の原子長、より好ましくは11〜24個の原子長、最も好ましくは11〜18個の原子長の鎖を含む。当分野で周知の任意の適切なリンカーを使用することができる。リンカーは、ハプテンのリガンドへの結合に対する立体障害が最小限であることを保証するために、ハプテンに近位のかさ高くない基であるべきである。また、この鎖が炭素に基づいたものであることが好ましい。この炭素に基づいた鎖は、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択された１つまたは複数の異種原子を含んでいてもよい。他の側鎖置換基を提供してもよい。
【００５３】
好ましい鎖は、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコール鎖、アルキル、アルケニル、核酸、および多糖を含む群から選択される。異種原子はアミノ基の一部でもよい。この鎖は、１つまたは複数、好ましくは３つ以下の不飽和部位を有することができる。アミノ酸断片を鎖に取り込んでもよい。ホモロゲーションによって複数のアミノ酸断片を提供してもよい。リンカーとしてハイブリッドペプチド−核酸断片を使用することも企図される。
【００５４】
本発明者らは、立体障害を減らすための最適なリンカーの長さは約18個の原子であることを見出した。それ以降は、性能は最小限しか向上されないが、より長いリンカーを組み込むことによって混乱が生じる。明らかに、本発明の実施に18個の原子より長いリンカーを使用してもよいが、これは好ましくない。
【００５５】
好ましい実施形態では本発明のコンジュゲートは式IIIまたは式IVによって表される。
【００５６】
【化４】
【化５】
一実施形態では本発明のコンジュゲートは以下のものである。
【００５８】
【化６】
【００５９】
当分野で周知の任意の手段によってこのリンカーをハプテンとタンパク質に付着させることができる。好ましい方法には、(たとえばタンパク質上のアミン、カルボキシルまたはスルフヒドリル基への)共有結合反応、核酸ハイブリダイゼーション、またはリガンド相互作用による方法が含まれる。
【００６０】
ステロイドをリンクグループに共有結合させるためには、多くの場合、チオエーテルまたはエーテルの架橋基、好ましくはチオエーテル基を含むことが必要である。
【００６１】
固相が必要な場合は、リガンドまたはハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを固相に固定することができる。リガンドとハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの量が事前に決定されていることが好ましい。また、リガンドに比べてタンパク質−コンジュゲートが過剰量あることが好ましい。
【００６２】
リガンドおよびハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートのどちらもが、ハプテンを定性分析および定量分析するためのコンジュゲートの迅速な検出を可能にするために、検出システムでの使用に適した指示薬をさらに含むことができる。
【００６３】
本発明での使用に適した多くの検出システムが当分野に存在する。当分野の技術者は、周知の方法を使用してタンパク質の結合を検出することができる。様々な免疫アッセイ手順は、「Immunoassays for the 80's」、 A. Voller.他編、University Park, 1981に記載されている。これには、酵素検出システム、色素(蛍光マーカー、有色イオンや錯体など)、金属または非金属の有色粒子(免疫金や着色ラテックスビーズなど)、および取り込まれた放射性同位元素(たとえばシンチレーション計数によって検出される)が含まれる。
【００６４】
好ましい実施形態では、安価で比較的安定であるので免疫金粒子が使用される。標識した抗体を検出するのに使用してもよい適切な酵素には、それだけには限定されないが、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母菌アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。
【００６５】
抗体を放射標識することにより、放射性免疫アッセイ(ＲＩＡ)を使用してそれを検出することが可能になる(たとえば、Work, T.S.他、「Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology」、North Holland Publishing Company、ニューヨーク、1978参照)。この放射性同位元素は、γ線計数器やシンチレーション計数器の使用、またはオートラジオグラフィーによる手段などによって検出することができる。本発明の目的に特に有用な同位元素は、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉおよび131Ｉである。
【００６６】
蛍光標識は本発明の範囲内にある。蛍光標識した抗体を適切な波長の光に暴露させた場合、蛍光によってその存在を検出することができる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、ビリルビンがある。
【００６７】
また、この抗体を152Ｅｕなどの蛍光放射金属またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識することもできる。ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)やエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)など金属キレート化グループを使用してこれらの金属を特定の抗体に付着させることができる。
【００６８】
この抗体はまた化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することができる。その後、化学反応の過程中に生じる発光の存在を検出することによって化学発光で標識した抗体の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００６９】
同様に、生物発光化合物を使用して抗体を標識してもよい。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系内で見つかる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００７０】
抗体の検出は、たとえば検出可能な標識が放射性γ線放射源である場合はシンチレーション計数器によって、あるいは、たとえば標識が蛍光物質である場合は蛍光光度計によって行うことができる。
【００７１】
酵素標識の場合、酵素の基質を使用する比色法によって検出を行うことができる。また、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準と比較する目視比較によって、検出を行うこともできる。
【００７２】
抗体の結合活性は、周知の方法に従って決定することができる。当分野の技術者は、日常的な実験を用いることによって、それぞれの測定(determination)に有効で最適なアッセイ条件を決定することができる。本発明で企図される方法は、動力学に基づくものである。平衡に基づくシステムは、本発明の目的では企図されない。
【００７３】
試験化合物を加えない、陽性対照アッセイを実施してもよい。
【００７４】
一実施形態では、このハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、図２に示したとおりである。
【００７５】
本発明のコンジュゲートは、多くの様々な迅速免疫アッセイでの使用に適している。
【００７６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明のコンジュゲートを、コンジュゲート内のハプテンに特異的なリガンドに結合させる方法を提供する。この結合ステップは一般的に、迅速なフローオーバーまたはフロースルー方式で、固相の表面上で行われる。
【００７７】
固相を使用する場合は、リガンドまたはハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートのどちらかを固定することができる。好ましくは、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを固体の支持体に固定する。本発明の範囲内で使用できる固体の支持体は、それだけには限定されないが、主に、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ポリアクリルアミド、セルロース、硝酸セルロース、架橋デキストラン、フッ化樹脂、アガロース、架橋アガロース、および多糖からなる群から選択される不溶性の高分子物質を含む。
【００７８】
しかし、さらに、ガラス、ガラス繊維、ガラスビーズ、金属、ナイロンメッシュ物質、ナイロン膜、金属、金属ストリップおよび金属ビーズなど他の物質を使用することも考えられる。好ましい固体の支持体は、膜、ビーズ、マイクロプレート固体支持体、試験管、マイクロタイタープレート、ディップスティック、ラテラルフロー装置、樹脂、ＰＶＣ、ラテックスビーズおよびニトロセルロースから選択される。担体の性質は本発明の目的ではある程度可溶性または不溶性とすることができる。支持体の形状は、ビーズのように球状、試験管の内部のように円柱状、または棒の外部表面であってよい。あるいは、表面は、シート、試験ストリップなどのように平坦でもよい。当分野の技術者は、抗体や抗原を結合する多くの他の適切な担体を知っており、または日常的な実験を用いることによってこれを確認することができるであろう。
【００７９】
この固体表面は膜であることがより好ましい。
【００８０】
支持体が金属である場合は、これが、金やプラチナなどバイオセンサーの表面としての使用に適した金属であることが好ましい。
【００８１】
固体の支持体への固定は、受動吸着、共有結合、またはアビジン／ビオチン複合体などリガンドの相互作用を介したものによる固定でよい(たとえば米国特許第4,467,031号、Galati他)。
【００８２】
本出願者らは、予想外なことに、より長いリンカーを有するこれらのハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートが、迅速アッセイにおいて、従来のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに比べて相当の利点を有することを見出した。競合ＥＬＩＳＡタイプのアッセイで使用した場合はこのコンジュゲートの性能は従来のコンジュゲートと同等であるので、これは特に驚くべきことである。
【００８３】
特定の理論に拘泥するものではないが、迅速免疫アッセイにおける従来のタンパク質−ハプテンコンジュゲートの感度の低さは、固定した抗体との免疫複合体を形成する際の立体障害が原因であることが提唱された。したがって、迅速アッセイの感度を上げるためには、結合率に対する立体障害を最小限にするシステムが必要であると思われる。本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートはこの目的を果たしていると思われる。
【００８４】
特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、本発明の実施例で実証された、高められたハプテン抗体結合の動力学は、そこで提示する特定の実施形態の２つの主要な要素によって促進されることを提唱した。
【００８５】
１．リンカーがステロイドＡ環の４位に結合すること；および
２．リンカーの長さが、ハプテンとタンパク質が互いに、迅速なリガンドによるハプテンの認識およびリガンドのハプテンへの結合に対して立体障害がないような長さであること。このハプテンとタンパク質は、互いに対して自由な運動が与えられており、したがって、リガンドのハプテンへの結合の迅速な認識が可能となっていると考えられる。
【００８６】
本発明者らは、免疫アッセイのために、プロゲステロンの６βおよび７α以外の他のコンジュゲーション部位を調査した。本発明者らによって、プロゲステロンのＣ−４位がプロゲステロンの６β位に代わる、優れた代替コンジュゲーション部位であることが見出された。ＥＬＩＳＡでは、プロゲステロン−４−ＯＶＡ(１−ＯＶＡ)およびプロゲステロン−７α−ＯＶＡコンジュゲート(２−ＯＶＡ)のどちらも類似の抗体結合性能を有する。驚くべきことに、ＳＰＲなど動力学に基づいた免疫アッセイでは、プロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートはプロゲステロン−７α−ＯＶＡコンジュゲートより優れた抗体結合を示す。しかし、６β−および７α−プロゲステロン誘導体に比べて、Ｃ−４位のプロゲステロン誘導体の合成はより簡単であり、ステロイドの４，５−二重結合によってＣ−４位ではプロゲステロン誘導体の立体異性体が１つしか提供されないので、立体異性体の問題がない。
【００８７】
最近、伸長した長さの異種二官能性リンカーを使用することによって捕獲抗体とアルカリホスファターゼ標識またはその微小粒子との間の距離が長くなれば抗体結合シグナルが増大することが見出された。この増大は一般的なバイオコンジュゲートの２成分(entity)間の距離が増加した結果と見なされている。本発明者らは、ＥＬＩＳＡでコーティング抗原として使用した場合は、プロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲート内のリンカーの長さ(4、11または18個の原子長)は、その抗体結合性能に有意な効果を及ぼさないことを見出した。短い時間(20分)の抗体結合実験では、長いリンカーを有するコンジュゲート(４−および６−ＯＶＡ)は、短いリンカーを有するＯＶＡ−コンジュゲート(１−ＯＶＡ)に比べてむしろ僅かに悪かった。したがって、異なる長さのリンカー(4〜18個の原子)を有する３つのプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートは、ＥＬＩＳＡでは同じプロゲステロンアッセイ感度を有している。
【００８８】
以前の研究によりシグナルの増大が必ずしもリンカーの長さに比例するとは限らないことが示されている。たとえば、酵素−抗体コンジュゲート中のリンカーの長さを9個の原子から23個の原子に増加した場合はシグナルが64％増加し、30個の原子長のリンカーでは82％増加した。しかし、16個の原子のリンカーを有する同じ酵素−抗体コンジュゲートは、より長いリンカー(23個の原子)を有するコンジュゲートより僅かに優れた抗体結合性能を有していた。これらの結果は、シグナルを増大させるためには、抗体と他の成分との間のリンカーの理想的な長さは、関与する２つの成分のサイズおよびバイオコンジュゲートが形成される方法に依存することを示唆している。従来技術では、２つの大きな成分間で、すなわち抗体と酵素または微小粒子とでバイオコンジュゲートが構築される。リンカーは、抗体を標識する目的のみで使用され、抗体−抗原の結合部位と同じ側には直接関与していなかった。しかし本発明のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートは全く異なっている。これらは、大きなタンパク質(ＯＶＡ)と非常に小さな成分、すなわちプロゲステロン分子(分子量314)を用いて構築される。この抗体／抗原結合部位にはリンカーも直接関与している。したがって、このバイオコンジュゲートは２つの異なるサイズの成分によって形成され、異なる方法で構築されているので、抗体結合性能に対するリンカーの長さの効果は、初期に報告された研究とは異なる可能性がある。本発明者らは、リンカーの長さも、様々なアッセイ形式、特に迅速アッセイにおける抗体結合に影響を与えることを発見した。
【００８９】
本発明を実施するのに、いくつかの異なるアッセイタイプが有用であることが見出された。これらには、本明細書中に記載の試験ストリップアッセイ、ドットブロットアッセイ(ドット試験またはドット免疫結合アッセイとしても知られる)、ＳＰＲバイオセンサーなどフローイムノセンサーが含まれる。
【００９０】
また本発明の免疫アッセイは、20分未満、より好ましくは10分未満、最も好ましくは5分未満で完了することが好ましい。
【００９１】
好ましい試験ストリップイムノアッセイでは、長いリンカーを有する所定量のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、それを固定するための固体支持体の一部に固定されている。固体の支持体は通常、セルロースベースの膜、または少なくとも水ベースの溶媒の毛管移動が可能な支持体である。試験試料を膜支持体に施用し、標識した抗体と混合し、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートによって固定された捕獲ラインに向かって迅速に移動させた。遊離試料ハプテンと結合した後、過剰の抗体は、捕獲ラインでハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと色バンドを形成する。リガンドとしての標識した抗体の量は、捕獲ラインの色強度によって定量的または定性的に決定される。本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと結合する標識した抗体リガンドが少ないほど、試験試料中に多くのハプテンが存在する。
【００９２】
他の試験ストリップを形成することもできる。一実施形態では、試験試料を本発明の標識したタンパク質−ハプテンコンジュゲートと混合する。標識したハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートおよび遊離ハプテンのどちらも、固定した抗体リガンド上の結合部位において競合するために捕獲ラインに向かって移動する。色強度、すなわちハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの量は、試験試料中のハプテンの量に反比例している。
【００９３】
上で論じた任意の標識を使用することができるが、標識したコンジュゲートは肉眼で見えることが好ましい。したがって好ましい標識は可視色素である。
【００９４】
上記のストリップアッセイのどちらでも、本発明のタンパク質コンジュゲートは、短いリンカーを有するコンジュゲートに比べて、捕獲ライン内ではるかに優れた抗体結合性を有する。したがって、長いリンカーを有するコンジュゲートは、捕獲ライン内で比較的低い濃度の抗体を検出し、それによって迅速なストリップアッセイの感度を高めることができる。
【００９５】
本発明の別の実施形態はバイオドットのフロースルー免疫アッセイを提供する。このような免疫アッセイではまず抗体などのリガンドを膜上に固定する。微量濾過装置によって試料ハプテンを膜に貫流させた後、本発明の標識したハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは残った抗体と反応して膜上に有色ドットを形成する。ドットの色強度、すなわちハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの量も、試験試料中のハプテンの量に反比例する。
【００９６】
表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)バイオセンサー技術は、抗体−ハプテン相互作用の特徴付けに非常に有用なツールである。これは小さいサイズのハプテンの迅速免疫アッセイ用に設計することもできる。一般的に、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートまたはＳＰＲで使用するリガンドのいずれかを、バイオセンサー表面上に共有結合により固定する。最も一般的には微量流動フローセル中を用いて、遊離試料ハプテン(分析物)と抗体リガンドとの混合物またはハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートとの混合物をバイオセンサー表面上に流して、バイオセンサー表面上の限られた数の抗体結合部位において競合させる。ＳＰＲ検出器はハプテン−抗体複合体形成の会合および解離によって誘発された表面近辺の溶媒層の屈折率の変化をモニターする。ＳＰＲ検出器の感度はその分子量に比例するセンサー表面上の抗体−ハプテン複合体の屈折率に依存している。したがって、抗体とハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートとの結合は、このタンパク質の分子量が大きいために、抗体と小さいサイズのハプテンとの結合による屈折率よりもはるかに高い屈折率によるＳＰＲ応答を与える。
【００９７】
本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは試験したすべてのアッセイで利点を示した。固体の支持体上にコーティングした抗原としてハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを使用した場合、より長いリンカーを有するコーティングしたコンジュゲートでは、免疫金にコンジュゲートした抗体によって、ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートをより低濃度で検出できる。同時に、抗体を固定した場合、より長いリンカーを有するコンジュゲートは、抗体の検出限界がより低濃度である。
【００９８】
ストリップアッセイでは、どちらのアッセイ構造も免疫クロマトグラフィーストリップ試験の感度を高める。より長いリンカーを有するこれら新規のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに基づいて、比較的短い時間内で低濃度(＜10ng／ml)の小さなハプテンを検出できる高感度の免疫クロマトグラフィーストリップアッセイ形式が開発された。本発明の長いリンカーを有するハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、抗体／ハプテンの結合を強く阻害する、乳など脂質の含有量が高い試験試料のストリップアッセイで特に有用である。本発明のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを使用することで、乳中のプロゲステロンの最低検出限界(ＬＤＬ)は、視覚検査によって判断されるように約10ng／mlであり、これは文献値30ng／mlより低いＬＤＬである(Acta Chemica Scandinavica、50、1996、141〜145)。この文献中では、ストリップ試験には、ストリップ試験毎に、正確な、フレッシュな金標識したプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを使用しなければならない。
【００９９】
迅速なＳＰＲ(ＢＩＡｃｏｒｅ)アッセイでは、長いリンカー(18個の原子)を有するハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート(225応答ユニット)は、より短いリンカー(4個の原子)を有するコンジュゲート(50応答ユニットのみ)よりはるかに高い抗体結合性能が得られた。プロゲステロン分子の４−位のコンジュゲート(50応答ユニット)も、ちょうど同じ長さのリンカー(4個の原子)を有するプロゲステロンの７α−位のコンジュゲート(12応答ユニットのみ)より優れた抗体結合を示した。
【０１００】
したがって、本発明は、試験ストリップ、試験ストリップを有するキット、およびハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの反応物質にまで及ぶ。
【０１０１】
本発明のキットは、上記の固定したリガンドを有する固体の支持体、および本発明の標識したハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを含むバイアルまたは容器を含む。
【０１０２】
キットのさらなる実施形態では、キットは、固定した本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを有する固体の支持体、およびハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに対する標識したリガンドを含むバイアルまたは容器を含んでもよい。
【０１０３】
本発明のキットの別の実施形態では、このキットは、上記の固定したリガンドを有する固体の支持体、およびハプテンを本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに変換する変換キットを含む容器のバイアルを含んでもよい。
【０１０４】
最も一般的には、このキットは、試験試料および標識したコンジュゲートを固体の支持体上で移動させるための溶媒、好ましくは水性溶媒をさらに含む。標識したコンジュゲートが肉眼で見えない場合は、標識したコンジュゲートの存在を検出する手段をキット中に提供してもよい。このキットは通常、好ましくは所定の試料および／またはコンジュゲートおよび／またはリガンドの体積を固体の支持体に運ぶための、アプリケーターを含む。
【０１０５】
本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートは、以下によって生成することができる。
【０１０６】
１．ハプテンを上に定義したリンカーに結合させること。好ましくは、この結合は化学的共有結合反応による、あるいは、リンカーが核酸である場合は、核酸ハイブリダイゼーションによる結合である。
【０１０７】
２．リンカーの遊離末端をタンパク質など大型グループに結合させること。リンカーをタンパク質に結合させる周知の方法は、標準の参考文献(「Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」、Mohammed AslamおよびAlastair Dent編)から選択することができる。
【０１０８】
あるいは、リンカーをまずタンパク質に結合させ、その後同じ方法でハプテンに結合させることも可能である。
【０１０９】
ｄ)極性有機溶媒に溶かした活性化されたステロイドハプテンを、1〜10モル当量の異種二官能性水溶性リンカーを含む水溶液と混合するステップと、
ｅ)混合物を反応させるステップと、
ｆ)ステップｂ)のハプテン−リンカー反応生成物の残りの遊離官能性リンカーグループに大型グループを付着させるステップと
を少なくとも含む、本発明のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを生成する方法が提供される。
【０１１０】
この方法は、任意選択でステップｂ)とｃ)の間にハプテン−リンカー−生成物を単離する単離ステップを含んでもよい。
【０１１１】
好ましくは、最終混合物は2〜30％、より好ましくは5〜15％、最も好ましくは約10％の含水率を有する。
【０１１２】
ステップｂ)の反応時間は、好ましくはほぼ24時間程度までの時間、より好ましくは12時間未満、最も好ましくは3時間である。ｂ)の反応は通常室温で起こる。好ましい実施形態ではｂ)の反応は実質的に中性のｐＨで起こる。
【０１１３】
好ましくはステップａ)の水溶液は2〜5モル当量の異種二官能性の水溶性リンカーを含む。
【０１１４】
一実施形態では、活性化されたステロイドはステロイドの活性化されたエステルである。最も好ましい実施形態ではこれはステロイドのスクシンイミドエステルである。
【０１１５】
好ましくは、この異種二官能性リンカーは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシ、アルデヒド、および反応性ハロゲンを含む群から選択された２つの異なる官能基を有する。好ましい実施形態ではこの異種二官能基はカルボキシルおよびアミノである。
【０１１６】
反応性でない任意の極性有機溶媒を反応で使用することができる。この極性有機溶媒は、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトンおよびＴＨＦから都合良く選択することができる。
【０１１７】
（産業上の利用）
したがって、本発明によれば、試験試料中のハプテンを検出するアッセイが提供される。このコンジュゲートは、試験試料中のハプテンが低濃度であるかつ／または脂質含量が高く、従来の免疫アッセイでは十分に、または迅速に検出できない場合に特に有用である。このアッセイは、in situでの試験のために形成した場合に特に有用である。このような商業的な応用の１つは、ウシの妊娠診断および発情の検出に使用できる、ウシの低レベルの乳プロゲステロンを迅速にその場で検出することである。
【０１１８】
以降、本発明を以下の非限定的な実施例に則して例示する。
【０１１９】
（実施例１）
様々な長さのリンカーを有する４つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの合成
(ａ)プロゲステロン４−メルカプトプロピオン酸(１)−および７α−メルカプトプロピオン酸(示さず)。これらの化合物は、文献(Steroids、53、1989、727〜738)の、１１α−ヒドロキシプロゲステロン４−および７αメルカプトプロピオン酸の調製手順に従って調製した。
【０１２０】
(ｂ)スクシンイミジルプロゲステロン４−メルカプトプロピオネート(３)。プロゲステロン４−メルカプトプロピオン酸の無水ＤＭＦ溶液3ml １(434.8mg、1.04mmol)に、1.0mlのＤＭＦのジシクロヘキシルジイミド(235.7mg、1.14mmol)溶液を加え、次いで、1.0mlのＤＭＦのＮ−ヒドロキシスクシンイミド(131.5mg、1.14mmol)溶液を加えた。この溶液を室温で終夜攪拌した。フラッシュカラムクロマトグラフィーの後純粋な生成物(３)が得られた。
【０１２１】
(ｃ)スクシンイミジルプロゲステロン４−メルカプトプロピオネート(５)の合成。プロゲステロン４−スクシンイミジルエステル３(300mg、0.58mmol)を4mlの無水ＤＭＦに溶かした。この溶液に、0.3mlの脱イオン水中のε−６−アミノカプロン酸(229mg、0.91mmol)を加え、この反応混合物を室温で終夜攪拌した。精製後、反応からＴＬＣプレート上の単一スポットとして白色の固体生成物４(収率63.6％)が得られ、これは、さらに精製せずに、そのスクシンイミジルエステル５の調製に直接使用した。化合物５は３の調製に類似の方法で調製した。
【０１２２】
(ｄ)スクシンイミジルプロゲステロン４−メルカプトプロピオネート(７)の合成。３から４を調製する方法と類似の方法で化合物６を調製した。化合物５(157.6mg、0.25mmol)およびε−６−アミノカプロン酸(98.7mg、0.39mmol)を出発物質として、カラムフラッシュクロマトグラフィーの後に化合物６(収率57％)が得られた。５の調製と類似の方法で化合物７も調製した。化合物６(92.1mg、0.14mmol)を出発物質として、カラムフラッシュクロマトグラフィーの後、透明な無色の油として生成物７が得られた。上記の合成したプロゲステロン誘導体(1〜7)すべてを、ＥＳ−ＭＳおよびＮＭＲ分析によって確認した。
【０１２３】
(ｅ)タンパク質コンジュゲーション。一連のプロゲステロン−卵白アルブミンコンジュゲートを、プロゲステロン遊離酸(1を含む)または単離したプロゲステロンスクシンイミジルエステル(3、5および7)のいずれかから、以下のように調製した。
【０１２４】
化合物１(29.5mg、0.07mmol)のＤＭＦ(0.5ml)溶液に、0.1mlのＤＭＦ中のジシクロヘキシルジイミド(16.02mg、0.078mmol)および0.1mlのＤＭＦ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド(8.94mg、0.078mmol)を加えた。この溶液を室温で90分間攪拌し、その後この溶液をＯＶＡ(63.5mg、0.0014mmol)のリン酸緩衝液(7ml、pH7.0)溶液に加えた。このコンジュゲーション反応物を４℃で終夜攪拌した。それから試料をＮａＨＣＯ3水溶液、脱イオン水、およびＰＢＳ／Ｔに対して透析した。ＰＤ−１０カラムを用いてさらに精製した後、これら精製試料中のＢＣＡアッセイで決定されたタンパク質量が、それぞれプロゲステロン−４−ＯＶＡは4.11mg ml-1、プロゲステロン−７α−ＯＶＡは4.02mg ml-1であることが分かった。
【０１２５】
単離した純粋なプロゲステロンスクシンイミジルエステル(3、5、および7)も、タンパク質のコンジュゲーションに直接使用した。0.019mmolのプロゲステロン活性エステル(3、5または7)の、0.2mlのＤＭＦまたはＤＭＳＯ溶液を、卵白アルブミン(17.1mg、0.38×10-3mmol)のリン酸緩衝液(1.5ml、pH7.0)溶液に、ゆっくり攪拌しながら加えた。これら３つのタンパク質コンジュゲートの精製は、既に上記した手順と同じ手順で実施した。同様にＢＣＡタンパク質アッセイで決定したこれらプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲート中のタンパク質量は、それぞれ1.09mg ml-1(4個の原子のリンカー)、3.56mg ml-1(11個の原子のリンカー)、および4.12mg ml-1(18個の原子のリンカー)であった。このプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの平均コンジュゲーション度、すなわちタンパク質あたりのハプテン数は、各コンジュゲートで平均４個であると概算され、これは、MALDI TOF質量分析によって直接決定された。これらプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの構造を図２に示す。
【０１２６】
（実施例２）
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをコーティング抗原として使用した直接または競合ＥＬＩＳＡ
直接ＥＬＩＳＡによって、プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートのＭＡｂに対する結合反応性が決定された。ＮａＨＣＯ3(50mM、pH9.6)中の一連の濃度のプロゲステロン−４−または−７α−ＯＶＡコンジュゲートで、マクロタイタープレートを事前にコーティングした。ＭＡｂのＰＢＳ／Ｔ溶液(5μg ml-1、各ウェル100μl)を加えた。プレートを3時間室温で振盪し、４℃で終夜放置した。その後、プレートにペルオキシダーゼで標識した抗ラットＩｇＧ溶液を加えた。最後に、200μlの基質溶液を各セルに加え、30分後に50μlの1M Ｈ2ＳＯ4を加えることによって酵素反応を停止した。その後、15分後に450nmでプレートを読み取り記録した。４−および７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの抗体結合曲線を図３および５に示す。
【０１２７】
ＮａＨＣＯ3(50mM、pH9.6)中のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをコーティング抗原として(1μg ml-1、各ウェル100μl)、標準曲線を作成した(図４および６参照)。競合ＥＬＩＳＡでは、様々な標準プロゲステロン(0.001〜1000ng ml-1)のＰＢＳ／Ｔ溶液(各ウェル100μl)、およびＭＡｂ(1μg ml-1)のＰＢＳ／Ｔ溶液(各ウェル100μl)を同時にプレートに加えた。他のすべてのＥＬＩＳＡ手順は、直接ＥＬＩＳＡと同じように実施した。
【０１２８】
本発明者らは、異なる長さのリンカーを有し、プロゲステロン上のコンジュゲート部位が異なる(４−または７α)プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートは、従来のＥＬＩＳＡによる抗体結合性能に有意な効果を及ぼさないことを見出した。
【０１２９】
（実施例３）
モノクローナル抗体 ( ＭｏＡｂ ) または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを用いた、免疫金複合体の調製
(ａ)コロイド金粒子(Ｇ４０)の調製。この調製は類似の文献(Analyst、123、1998、2437〜2441)に従って実施した。
【０１３０】
(ｂ)モノクローナル抗体−、または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートでコーティングしたコロイド金の調製。コロイド金(Ｇ４０)溶液をＫ2ＣＯ3(0.02M)でpH=7.7に滴定した後、激しく渦攪拌しながら、ｐＨを調整したコロイド金の溶液(10ml)に抗体(120μg)または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート(60μg)溶液(0.2ml)を加えた。その後、この免疫金溶液を20％ＯＶＡのＰＢＳ溶液(0.15ml)で遮断した。2％ＯＶＡで繰り返し洗浄し、6,000rpmで遠心分離した後、この免疫金溶液を４℃で、0.1％ＮａＮ3を含むホウ酸(ＮａＢ7Ｏ4)緩衝液(2mM、pH=7.2)中で保存した。
【０１３１】
（実施例４）
４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをコーティング抗原として使用した、またはモノクローナル抗体を試験ストリップ上に固定した、免疫クロマトグラフィーストリップ試験
ポリエステルの補助支持体(GL-187、G＆L Precision Die Cutting,Inc.、米国)でラミネートしたニトロセルロース膜(AE100、Schleicher＆Schuell、ドイツ)を切断してストリップ(4または5mm幅)にした。0.01％Ｔｗｅｅｎ−２０水溶液で10分間遮断し、その後40℃で2時間乾燥させた後、このストリップを、抗プロゲステロンＭＡｂ溶液(各ストリップあたり0.5μl)、または４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート溶液(各ストリップあたり0.5μl)のいずれかでコーティングし、このストリップを再度40℃で2時間乾燥させた。このストリップは終夜シリカゲルの容器内で保存した。
【０１３２】
(ａ)様々な濃度のＯＶＡ−プロゲステロンコンジュゲート溶液でコーティングしたストリップでは、マイクロウェル中の半分のストリップの処理溶媒は以下のとおりである
15μlの、ＰＢＳ中の１％Ｔｗｅｅｎ−２０
15μlの、ＰＢＳ中の２％ポリビニルピロリジン(ＰＶＰ、分子量44000)
3μlの抗体−免疫金溶液(各ストリップ0.72μgのＭＡｂ)。
【０１３３】
(ｂ)様々な濃度のモノクローナル抗体溶液でコーティングしたストリップでは、マイクロウェル中の処理溶媒は以下のとおりである
20μlの、ＰＢＳ中の2.5％Ｔｗｅｅｎ−２０
20μlの、ＰＢＳ中の2％ポリビニルピロリジン(ＰＶＰ、分子量44000)
5μlの、プロゲステロン−ＯＶＡでコーティングした免疫金(各ストリップ0.3μgのタンパク質)。
【０１３４】
上記の２つの異なる形状における抗体結合性能を、図７および図９に示す。
【０１３５】
(ｃ)走査分析。ストリップを処理した後、以下の手順に従って、意図とは無関係な「Image Tool、バージョン2.00」を使用した走査分析によって図８の様々な試験ストリップの色強度を分析した
１．ストリップを走査ベッドの上に置いた
２．Image Toolを開き、file、acquire、TWAINを選択した
３．設定：スケール ＝３６％
幅 ＝３．３１ｃｍ
高さ ＝３．４９ｃｍ
解像度 ＝４００
４．Previewを押し、終わったらScanを押した
５．カラー画像をＪＰＧファイルとして最高解像度で保存した
６．「Processing」および「Colour to Greyscale」を選択することによって画像を8bppの白黒画像に変換した
７．「Analysis」および「Line Profile」を選択し、線の端が白い面上に来るように、バンドの上に線を引いた(１つのバンドに３回繰り返し、平均値をとる)
８．「Image Tool」により、ストリップの色強度に関係するすべてのピーク高さの値を自動的に記録した。
【０１３６】
（実施例５）
モノクローナル抗体バイオセンサー表面を使用した抗体結合性能の評価
抗体溶液(ＨＢＳ緩衝液中100μg／ml)によるバイオセンサー表面の固定化は、活性化させたＣＭ−５センサーチップに抗体を標準アミン結合させることによって調製した。４つの異なるプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡ、および(７)−ＯＶＡ](ＨＢＳ緩衝液中1mg／mlの濃度)を連続的に、検量したバイオセンサー表面上に10μl／分で3分間流した。各コンジュゲートの結合応答(応答ユニットすなわちＲＵ)を測定し、これを図１２に示す。コンジュゲートの結合親和性の結果により、プロゲステロンの４−位のコンジュゲートが７α−プロゲステロン誘導体より優れており、また長いリンカーを有するコンジュゲートが短いリンカーを有するコンジュゲートよりはるかに優れた抗体結合を与えることが明示された。
【０１３７】
（実施例６）
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートバイオセンサー表面を使用した抗体結合性能の評価
上記３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡおよび(５)−ＯＶＡ]バイオセンサー表面を使用して、抗体結合の研究も評価した。具体的には、６つの濃度のＭｏＡＢ(0から100μg.ml-1)を個別に、ブランクおよび固定したプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの表面上に注入した。またそれぞれのコンジュゲート表面からのデータを、ブランク表面からのセンサーグラムデータから減算することによって補正した。３つの同一の検量を実施し、それぞれの抗体濃度に有意な結合応答変化はなかった。したがって、１−、２−および４−ＯＶＡの３つの検量線はＭｏＡＢのそれぞれの濃度の平均結合応答により得られ、抗体濃度に対してプロットした(図１３)。リンカーの長さを４個の原子から11個の原子のリンカーに増やすと、プロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの抗体結合シグナルが30％増加した。また、このシグナルの増大は、７α−コンジュゲート[(２)−ＯＶＡ]に比べてプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ]で31％向上した。
【０１３８】
（実施例７）
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートバイオセンサー表面を使用したＳＰＲによる競合プロゲステロン免疫アッセイ
プロゲステロン用の競合ＳＰＲ免疫アッセイの開発では、抗体を固定したバイオセンサー表面に比べてより優れた結合応答を与えるために、プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートをバイオセンサー表面上に固定した。様々なプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを抗体バイオセンサー表面に使用したスクリーニング試験(図１２)から、18個の原子のリンカーを有するコンジュゲート[(７)−ＯＶＡ]が最も高い抗体結合シグナル(225ＲＵ)を有していた。これは、競合ＢＩＡｃｏｒｅアッセイの設計における表面上のセンサープローブとして最も優れていると思われる。しかし、このコンジュゲート[(７)−ＯＶＡ]はセンサー表面上に固定されず、本発明者らは、他のプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡおよび(５)−ＯＶＡ］のみしか、競合ＢＩＡｃｏｒｅアッセイのセンサー表面上に固定できない。
【０１３９】
固定濃度のＭｏＡＢ(200μg.ml-1)を、ＨＢＳ緩衝液中の一連の濃度の遊離プロゲステロンと混合した後、次いで、各平衡混合物中の残存抗体をプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートのバイオセンサー表面上に注入し、抗体結合応答を測定した。同じ実験を５回繰り返したが、それぞれの濃度のプロゲステロンの再現性は良好であった。抗体のチップ表面への結合は、溶液中の遊離プロゲステロンの量に反比例していた。遊離プロゲステロン濃度を抗体結合の平均応答(ＲＵ)に対してプロットすることにより、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの３つの標準競合曲線が得られた(図１４)。このアッセイは、0から50ng.ml-1の範囲のプロゲステロン濃度で良好な感度を示した。免疫アッセイの感度は通常、検量線の勾配、すなわち単位濃度に対する応答によって決定される。したがって、[(５)−ＯＶＡ]コンジュゲートは、[(２)−ＯＶＡ]コンジュゲートより僅かに感度が高い[(３)−ＯＶＡ]コンジュゲートより優れたアッセイ感度を示した。この結果は、ＳＰＲに基づいた免疫アッセイにおける、コンジュゲートのリンカー、およびステロイド分子のコンジュゲーション部位の効果を明示した。また、このＳＰＲに基づいたアッセイは、0.1〜10ng.ml-1で直線的な検出範囲を示し、この範囲のＲ2値は、３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートすべてで0.99を超えることが見出された(図１５)。このＳＰＲに基づいた免疫アッセイは、従来のＥＬＩＳＡ技術に完全に匹敵し、はるかに迅速で簡単である。
【０１４０】
（実施例８）
長いリンカー (18 個の原子 ) を有する４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを使用した免疫クロマトグラフィーストリップ試験による、乳プロゲステロン濃度の決定
本発明の長いリンカー(18個の原子)を有する４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートを様々な膜ストリップ上にコーティングすることができる。既に調製した抗体−金コンジュゲートを1〜5％のショ糖水溶液で希釈することができる。様々なコンジュゲートパッドを小さなサイズに切断し、金溶液をシートに染み込ませることによって上記の希釈した免疫金溶液(〜10μl)を各コンジュゲートパッドに施用することができる。この金コンジュゲートパッドを乾燥させ、保管する。
【０１４１】
試料パッドとして低ウィック(lower wick)材料またはガラス繊維を、終夜Tris緩衝液と水中の1〜5％Tween-20とに飽和させ、使用前に乾燥した。すべての試験材料(膜、金コンジュゲートパッド、試料パッドおよび溶媒吸収パッド)を補助プレートに貼り付け、プラスチックの枠(housing)にはめ込むことができる。このすぐに使用できるストリップ試験装置は、乾燥剤一袋の存在下で小袋に密封した場合、比較的安定である。
【０１４２】
この迅速ラテラルフローストリップ試験は、農場の乳プロゲステロン(Ｐ4)を測定するのにうまく応用することができる。このストリップは、従来のＥＬＩＳＡの便利な代替法である。またこれは、ＥＬＩＳＡに基づいた試験よりはるかに速い(10分以下)。これは、農業者がその場で使用するのに特に適している。この試験は、ウシの妊娠診断に使用することができる(プロゲステロン＜10ng／mlでは、強い色バンドによって妊娠の陰性結果を表すが、プロゲステロン＞10ng／mlでは、弱い色バンドまたは色バンドが現れないことによって妊娠の陽性結果を表す)。
【０１４３】
（実施例９）
伸長したリンカーを有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの合成
18個の原子のリンカーを有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの合成、およびそのＯＶＡコンジュゲーションは、ステロイドハプテンとしてプロゲステロンを使用する代わりにテストステロンを使用して、実施例１に示す手順と同じ手順で実施する。テストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートを生成する方法を図１６に示す。
【０１４４】
上記手順は、テストステロン、コルチコステロン、１７α，２０β−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン、１１α−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、２１−ヒドロキシプロゲステロン、１９−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンおよびヒドロコルチゾンなど、プロゲステロン分子と同じＡ環構造を有する他のステロイドに応用することができる。
【０１４５】
（実施例１０）
様々な長さのポリエチレングリコール ( ＰＥＧ ) リンカーを有するプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートの合成
プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲートは、以下のステップで示すようにポリエチレングリコール(PEG)など様々な種類のリンカーを使用して合成することもできる(図１７)。
【０１４６】
(ａ)異種二官能性ＰＥＧリンカー(Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2Ｈ)。アミンの１つが保護されたＰＥＧアミン化合物は、市販のＰＥＧジアミンをジ−tert−ブチルジカルボネートと反応させることによって調製することができる。生じたアミンの１つが保護された生成物を市販の無水ジカルボン酸と反応させ、次いでアミンの保護を外すと、長さが24個の原子であり、リンカーの端の一方にカルボキシル基を有し、他方にアミン基を有する異種二官能性ＰＥＧアミノ酸リンカーがもたらされる。
【０１４７】
(ｂ)様々な長さのリンカーを有するプロゲステロン−ＰＥＧ−ＯＶＡコンジュゲートの合成。実施例１と同じ手順によって、プロゲステロン−４−メルカプトプロピオン酸(１)を活性スクシンイミジルエステルに変換することができる。生じた活性化されたステロイド(３)を上記ＰＥＧアミノ酸リンカー(Ｈ2Ｎ−ＰＥＧ−ＣＯ2Ｈ)と反応させて、より長いリンカー(44個の原子長)を有するプロゲステロンＰＥＧ誘導体を形成することができる。実施例１に示したものと類似のタンパク質コンジュゲーションによって、これらプロゲステロンＰＥＧ誘導体(24個および44個の原子のリンカー)をＯＶＡタンパク質に結合させることができる。
【０１４８】
このプロゲステロン−ＰＥＧ−ＯＶＡのコンジュゲートは、単純なアミノカプロン酸鎖を有するコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡ]に比べてはるかに優れた水溶性を有する、長いリンカーを有するタンパク質コンジュゲートを構築するのに特に適している。
【０１４９】
（実施例１１）
サイズ排除クロマトグラフィーによる迅速免疫アッセイ
この実施例は、サイズ排除ゲルカラムクロマトグラフィーによる迅速免疫アッセイを実施する方法を記載する。固相の固定化はない。上記実施例のようにタンパク質を使用する代わりに、伸長したリンカーによってプロゲステロンを蛍光色素とコンジュゲートさせ、式Ｖのプロゲステロン−リンカー−ビリルビンを形成する。
【０１５０】
この迅速免疫アッセイは、以下のように実施すべきである。
【０１５１】
ステップ１：固定量の式Ｖの上記プロゲステロン−リンカー−ビリルビンのコンジュゲートと、所定量の抗プロゲステロン抗体とを、プロゲステロン濃度を決定する試料溶液とよく混合すべきである。この混合物に、免疫複合体を形成させるべきである。
【０１５２】
ステップ２：上記の混合物は素早く短いサイズ排除カラム中を通り、これを、〜450nmのＵＶ検出器を備えたＨＰＬＣでモニターする。ＨＰＬＣクロマトグラムでは、２つの主要なピークが検出される。第１のピークは、そのはるかに大きい質量(＞150,000)により早期に溶出される、抗体とプロゲステロン−リンカー−ビリルビンのコンジュゲートとの免疫複合体を表し、第２のピークは、はるかに低い質量(＜1,000)を有し後に溶出されるプロゲステロン−リンカー−ビリルビンのコンジュゲートを表す。他の種には蛍光色素が付着していないので、クロマトグラム上に他の構成成分は表れない。
【０１５３】
第１のピークは、プロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートと抗体との免疫複合体の量を表す。第２のピークは、免疫複合体に結合していないプロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートの量を表す。
【０１５４】
与えられた試料中の遊離プロゲステロン濃度が高い場合は、限られた数の抗体がプロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートと形成する免疫複合体は、より少なくなる。これにより、第１のピークは第２のピークより小さくなる。対照的に、与えられた試料中の遊離プロゲステロン濃度が低い場合は、限られた抗体がプロゲステロン−ビリルビンのコンジュゲートと形成する免疫複合体は、より多くなる。これにより、第１のピークは第２のピークより大きくなる。したがって、第１のピークの面積、または第１ピークの面積と第２ピークの比は、試料プロゲステロンの濃度に反比例する。
【０１５５】
上記の開示を例としてのみ提供することを、当分野の技術者は理解されよう。本発明の多くの様々な変化を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】伸長した長さのリンカーを有する４−プロゲステロン誘導体の合成を示す図である。
【図２】様々な長さのリンカー(4個、11個、または18個の原子のリンカー)を有する、１つの７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ]および３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡおよび(７)−ＯＶＡ]の構造を示す図である。
【図３】類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合曲線を有する、４−および７α−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡは下の曲線、(３)−ＯＶＡは上の曲線]のどちらもを示す図である。
【図４】抗体(ＭｏＡｂ)と(３)−ＯＶＡコンジュゲート(上の曲線)および(２)−ＯＶＡコンジュゲート(下の曲線)との標準曲線を示す図である。
【図５】類似の抗体(ＭｏＡｂ)結合性能を有する３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]を示す図である。
【図６】抗体(ＭｏＡｂ)と３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡ、(５)−ＯＶＡ、(７)−ＯＶＡ]との、非常に類似した標準曲線を示す図である。
【図７】免疫金にコンジュゲートした抗体(ＭｏＡｂ)とラテラルフロー試験ストリップ上にコーティングした３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)０ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]との、様々な結合性能を示す図である。
【図８】図７の走査計測分析(scannometric analysis)[(３)−ＯＶＡは下の曲線、(５)−ＯＶＡは真中の曲線、(７)−ＯＶＡは上の曲線]の結果を示す図である。
【図９】固定したモノクローナル抗体と、３つの４−プロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(３)−ＯＶＡは上段のストリップ、(５)０ＯＶＡは中段のストリップ、(７)−ＯＶＡは下段のストリップ]の免疫金複合体との、様々な結合性能を示す図である。
【図１０】小さなハプテン用のバイオドットフロースルー免疫アッセイ形式の２ステップの設計を示す図である。
【図１１】金表面に固定した抗体または本発明のハプテン−リンカー大型グループのコンジュゲートを使用した、小さなハプテン用の表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)フロー免疫センサーの２つの設計を示す図である。
【図１２】４つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、〜１２ＲＵ；(３)−ＯＶＡ、〜５０ＲＵ；(５)−ＯＶＡ、〜１５０ＲＵ；(７)−ＯＶＡ、〜２２５ＲＵ]と固定したモノクローナル抗プロゲステロン抗体(ＭｏＡｂ)との様々な結合性能を、ＳＰＲバイオセンサーによって示す図である。
【図１３】３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]を固定したバイオセンサー表面を使用した、抗体結合応答を示す図である。
【図１４】３つのプロゲステロン−ＯＶＡコンジュゲート[(２)−ＯＶＡ、(３)−ＯＶＡ、および(５)−ＯＶＡ]バイオセンサー表面を使用した、プロゲステロンの競合免疫アッセイの標準曲線を示す図である。
【図１５】競合ＳＰＲに基づいた免疫アッセイから得られたプロゲステロンの検出の直線範囲0.1〜10ng.ml-1を示す図である。
【図１６】18個の原子のリンカー有するテストステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成方法を示す図である。
【図１７】様々な長さのポリエチレングリコールリンカーを有するプロゲステロン−４−ＯＶＡコンジュゲートの生成の設計を示す図である。
Claims (56)
- 迅速アッセイで使用する、一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚを有するハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
（式中、
Ｘは、式ＩのＡ環構造を有する多環の融合環ステロイドハプテンであり、
Ｗは、任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、
Ｙは、１０個以上の原子長のリンカーであり、
Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである） - Ｗがチオエーテル架橋である、請求項１のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｙが１０個以上５０個以下の原子長である、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｙが１１個以上２４個以下の原子長である、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｙが１１個以上１８個以下の原子長である、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
-
である、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。 - Ｚがタンパク質またはポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｚが卵白アルブミンである、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｚが指示薬グループである、請求項１から６のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｚがビリルビンである、請求項１から６および９のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｘが式ＩＩのハプテンである、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
Ｒは、Ｈ、ＣＨ3およびＣＨ2ＯＨを含む群から選択され、
Ｒ1は、リンカーＹの付着点であり、
Ｒ2は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ3は、オキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルキルまたはメチルカルボニルが任意選択でヒドロキシによって置換されている、オキシ、Ｃ1〜Ｃ2アルキル、ヒドロキシ、およびメチルカルボニルを含む群から選択され、
Ｒ4は、水素またはヒドロキシである） - Ｘが以下を含む群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- Ｘがプロゲステロンである、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
-
-
である、請求項１から９および請求項１１から１３のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。 -
である、請求項１から９および請求項１１から１３のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。 - リガンドが免疫グロブリン分子である、前記請求項のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- リガンドが抗体または抗体断片である、請求項１６に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- ａ）ハプテンを結合する能力があるリガンドを試験試料と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）のリガンドを一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚのハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート
（式中、
Ｘは、ハプテンであり、
Ｗは、任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、
Ｙは、１０個以上の原子長のリンカーであり、
Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである）
とさらに接触させるステップと、
ｃ）反応が実質的に平衡に達する前にリガンドに結合したコンジュゲートしていないハプテンの量を決定するステップと
を含む、試料中のハプテンを検出するための迅速アッセイ法。 - リガンドを接触させる第２ステップ（ｂ）により、過剰の結合していないリガンドのほとんどが接触され結合される、請求項１９に記載の迅速アッセイ法。
- ハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートが固定されている、請求項１９または請求項２０に記載の迅速アッセイ法。
- ステップａ）の混合物をステップｂ）のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートの上に流す、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- ハプテンがステロイドである、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- ハプテンがプロゲステロンである、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- リガンドが抗体である、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- ａ）試験試料を一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚのハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート
（式中、
Ｘは、ハプテンであり、
Ｗは、任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、
Ｙは、１０個以上の原子長のリンカーであり、
Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである）
と混合するステップと、
ｂ）生じた混合物を、このハプテンを結合する能力があるリガンドと接触させるステップと、
ｃ）反応混合物が実質的に平衡に達する前にリガンドに結合したコンジュゲートしていないハプテンの量を決定するステップと
を含む、試料中のハプテンを検出するための迅速アッセイ。 - リガンドが固定されている、請求項２６に記載の迅速アッセイ。
- 生じた混合物を固定したリガンドと接触させるステップｂ）が、フローオーバーまたはフロースルーシステムによって行われる、請求項２６または請求項２７に記載の迅速アッセイ。
- ハプテンがステロイドである、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- ハプテンがプロゲステロンである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- リガンドが抗体である、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の迅速アッセイ法。
- ａ）ハプテンに結合するリガンドと、
ｂ）請求項１から１８のいずれか一項に記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと
を少なくとも含む、迅速アッセイのキット。 - キットがさらに指示薬を含む、請求項３２に記載の迅速アッセイのキット。
- 指示薬がハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートに結合している、請求項３３に記載の迅速アッセイのキット。
- 指示薬がリガンドに結合している、請求項３３に記載の迅速アッセイのキット。
- フローオーバーキットである、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の迅速アッセイのキット。
- 試験ストリップである、請求項３６に記載の迅速アッセイのキット。
- フロースルーキットである、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の迅速アッセイのキット。
- コンジュゲートを、コンジュゲート内のハプテンを結合する能力があるリガンドと、反応が実質的に平衡に達しない所定の時間接触させるステップを含む、一般式Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｚのハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート
（式中、
Ｘは、ハプテンであり、
Ｗは、任意選択でチオエーテルまたはエーテル基であり、
Ｙは、１０個以上の原子長のリンカーであり、
Ｚは、Ｙが存在しない場合にＸのリガンドへの結合に対して立体障害を与えるのに十分なサイズの大型グループである）
を結合させる方法。 - リガンドが固定されている、請求項３８に記載の方法。
- リガンドをハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと接触させる前にハプテンと接触させる、請求項３８または請求項４０に記載の方法。
- リガンドをハプテンと接触させる前にまたは同時にハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートと接触させる、請求項３８または請求項４０に記載の方法。
- リガンドが免疫グロブリン分子である、前記請求項のいずれかに記載のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲート。
- ａ）極性有機溶媒に溶かした活性化されたステロイドハプテンを、１〜１０モル等量の異種二官能性水溶性リンカーを含む水溶液と混合するステップと、
ｂ）混合物を反応させるステップと、
ｃ）ステップｂ）のハプテン−リンカー反応生成物の残りの遊離官能性リンカーグループに大型グループを付着させるステップと
を少なくとも含む、請求項１から１８に記載のいずれか一項のハプテン−リンカー−大型グループのコンジュゲートを生成する方法を提供する。 - ステップｂ）とｃ）の間にハプテン−リンカー生成物を単離する単離ステップを含む、請求項４４に記載の方法。
- 最終混合物が２〜３０％の含水率を有する、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
- 最終混合物が５〜１５％の含水率を有する、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の方法。
- 最終混合物が約１０％の含水率を有する、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の方法。
- ステップｂ）の反応時間がほぼ２４時間程度までの時間である、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
- ｂ）の反応が室温で起こる、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の方法。
- ｂ）の反応が実質的に中性のｐＨで起こる、請求項４４から５０のいずれか一項に記載の方法。
- ステップａ）の水溶液が、活性化されたステロイドに比べて２〜５モル等量の異種二官能性の水溶性リンカーを含む、請求項４４から５１のいずれか一項に記載の方法。
- 活性化されたステロイドがステロイドの活性化されたエステルである、請求項４４から５２のいずれか一項に記載の方法。
- 活性化されたステロイドがステロイドのスクシンイミドエステルである、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の方法。
- 異種二官能性リンカーの端の一方がカルボキシルであり、他方がアミノである、請求項４４から５４のいずれか一項に記載の方法。
- 極性有機溶媒が、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトンおよびＴＨＦを含む群から選択される、請求項４４から５５のいずれか一項に記載の方法。
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