JPS58194900A - ４−または６−置換アルドステロン類，その製法およびそのイムノアツセイにおける使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 これらの置換アルドステロノ類はラジオイムノアツーｌ
？イ（以下，ＲＩＡと略称することあり）、あるいはエ
ノサイムイムノアソセイ（以下，ＥＩＡと略称すること
あり）によるアルドステロノ（以下，ＡＬＤと略称する
ことあり）の測定に有用なものである。

従来，ＡＬＤの測定はステロイドホルモン測定のうちで
最も困難なものの一っで，公知のイムノアッセイはその
特性において必ずしも充分なものとは言い難かつ１こ。

すなわち、イムノアッセイ法の良否は使用する抗ハプテ
ン抗血清の適否に大きく支配されるが。

この抗血清の特性は，免疫原の構造によって左右される
。抗ハブテン抗血清の場合，その免疫原としての化合物
は官能基が出来る限り遊離の状態のｉ− ものが望ましいと言われている。

これまで報告されてぃろＡＬＤのハプテンとしては，そ
の、２／−ヘミサクシネー＋−．３−（０−カルボキシ
メチル）オキシムおよ０−、７！．、２／−ヒスへミザ
クシネ−１・などが挙げられるが，いずれもＡＬＤ自体
の官能基の一部がフロツタされｆこ形のｔ）ので、必ず
ｔ７も満足なハプテンとは言えない。

上記の状況にかんがみ，本発明者らは，ＡＬＤのすへて
の官能基が遊離の状態にあるハプテンの合成を試み，こ
れｌこ成功１．、　ｉｒ．：。

シｆコがって，本発明の目的は，上記ハプテンのほかそ
れらの製造方法，上記ハプテンを用いｒコ抗ハプテン抗
血清ならびにその製造方法，上記ハプテンを用いｆコ標
識体ならびにその作製方法，これらのものを組合せて使
用するＡＬＤのＲＩＡ法あるいはＥＩＡ法，およびこれ
らのものに加えて標準ＡＬＤを組合せ１こＲＩＡあるい
はＥＩＡ用キットの提供にある。

上記目的を達成する１こめ本発明によれば。

　４　一 （但Ｌ　１式中Ｒ′およびｄのいずれが一部は水素。

Ｒ′が水素のときＦは一Ｓ−（ＣＨ，）、、ＣＯＲ３ま
１こは一〇−Ｃｏ−（ＣＨ，　）、−、ＣＯＲ３で表わ
される基，Ｒ匂水素のとき　Ｈ／は一Ｓ−（ＣＨ．２）
、−、ＣＯＲで表わされる基，ここで　ＲＪはヒドロキ
シ基，ま１こはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラ
ミン残基，チロシン低級アルキルエステル残基，ヒスタ
ミノ残基。

ヒスチジノ残基あるいは７−アミノヘプタノイルチロシ
ン低級アルキルエステル残基をあられす）で表わされろ
置換アルドステロン類がハプテンと１・て提供される。

これらの置換アルドステロン（■）のうち　ＲＪがヒド
ロキシ基のものは，タンパク質１ことえば牛血清アルブ
ミン（ＵＳＡ）と結合させ１．：ものを抗原として、１
ことえばウザキを免疫することにより抗ＡＬＤ抗血清を
得ることができる。ま１こ他のタノバク質すなわち標識
用酵素１ことえばホースラデイシュ・ベルオキシターゼ
、アルツノリポスファタ−ゼ、β−Ｄ−カラクト・レダ
ーゼあるいはグルコシタ−ゼなどと結合させて、ＥＴＡ
用標識体とすることができる。

好適な置換アルド＼ステロノ（１）は、（／／β、／ざ
−ユポキシ＝／ざｒｘ　、　、２／−ジヒドロキシ−３
、，２０−ジオキソ−グープレグネノ−グーチオ）酢酸
、（／／β、／ざ一エポキシー／　、ｌ’　ａ　。

、！／−ジヒドロキジー３．．２０−ジオキソ−ゲープ
レクネンー乙β−イルチオ）酢酸、／／β、／サーエボ
キシ＝／にａ、２／−ジヒドロキシ−３゜ユθ−ジオキ
ソーｌ−プレグネンー乙ａま１こは乙β−イルヘミサク
シネ−１・とじて例示できる。

ま１こ、」−配置換アルドステロン（Ｉ）のうち。

だがヒドロキシ基以外のものは、慣用されているクロラ
ミンＴ法、酵素法などにより放射性ヨウ素。

１ことえば、　　　Ｉ、　　　Ｉによって標識し１こう
えＲ−−−ｒ７−− Ｉ　Ａ　Ｉ’４」標識体とすることができる。

好適なものは次のように例示できる。すなわち。

Ｎ−（ｐ−−−ヒドロキシフェネチル）　２−　（／／
β、７ｇ−エポキシー／ｇｎ　、２／−ジヒドロキシ−
３，ユθ−ジオキソ−グ−プレグネンーゲ−イルチオ）
アセトアミｌ’　、　／　／β、／サ−エボキシ−／ｆ
α、ユ／−ジヒドロキシー３，２θ−ジオキソーグープ
レグオ、ンー乙ａ（ま１こは乙β）−イル−グー（ｐ−
ヒドロキシフェネチルアミノ）−グーオキツブチラー１
・などである。

（化１２１式中Ｒ′およびＲ２は前記と同意義、まｔコ
Ｘはグリコールの保護基を表わす）で表わされる化合物
を脱保護基反応に付することを特徴とする。

（（Ｆ、　Ｌ　、式中Ｒ′およびＲ２は前記と同意義）
で表わされる置換アルドステロン類（■）の製造方法が
提供される。

」二記式中−８−（Ｃ■（２）７−３ＣＯＲ３はツノル
ポキシ、メチルチオ、ツノルボキシェチルチオ、カルホ
キジプロピルチオ基、　−０−ＣＯ−（ＣＨ，２）、　
、ＣＯＲ３はへミマロニルオキシ、ヘミザクシニルオキ
シ、ヘミグルタリルオキシ、ヘミアジポイルオキシ、ヘ
ミアジポイルオキシ基を表オ）す。

上記製造方法を出発物質の合成経路を含めて概括的に式
示すれば次のとおりである： Ｃ以下余白） 　８− （■）　　　　　　　　　　　　　（■）（ここで　Ｒ
／　、　Ｒ，２およびＸは前記と同意義、Ｒ″は低級ア
ルキル基、Ｙはヒドロキシ基まｆこは臭素を表わす） すなわち、先づヘミア十タール型のＡＬＤ、／／β、／
に一エポキシー／Ｋｎ、２／−ジヒドロキシ−ｑ−プレ
グネン−３，２０−ジオン（１）の３位カルボニルをエ
ノールエーテル化し、がっユθ、ｌ／位をアセト出≠ド
保護して、化合物（■）を得る。この化合物（■）をブ
ロム化しｔこ場合Ｙが臭素である化合物（Ｖｌが得られ
る。−万過酸（１ことえば１ｍ−クロル過安息香酸、あ
るいはモノ過フタル酸）処理するとＹがヒドロキシ基で
ある化合物（■）が得られる。

Ｙが臭素である化合物（Ｖ　）（Ｙ＝Ｂｒ）をす）　Ｉ
Ｊウム・メチルチオグリコールと反応させると、対応す
るアセチルチオ誘導体Ｃ■）（Ｒ′、Ｒ′！のいずれか
一方がＨ４他方がＳＣＨ，２ＣＯＯＣＨヨ）が得られる
。

こう１・で得られ１こアセチルチオ誘導体（■）の一つ
を室温・窒素気流中、塩基性条件（含水メタノール中、
炭酸カリウム、／〜乙時間）で加水分解すると対応する
カルボン酸（Ｔ′）　（Ｒ’、　Ｒ’）いずれか−万が
Ｈ９他方がＳＣＨ，Ｃ０ＯＨ）が得られる。

一方Ｙがヒドロキシ基である化合物（Ｖ　）（Ｙ−Ｏ［
に無水コハク酸を塩基性条件（ピリジノ中。

ｌ−ジメチルアミノピリジン触媒存在下、２１１〜乙３
時間）、加温（３θ〜７θ°Ｃ）のもとに反応−１１＝ させると、対応するヘミサクシニル誘導体（［１）（Ｒ
’−Ｈ，Ｒ０ＣＯＣＨ，２ＣＨ，Ｃ００Ｈ）が得られる
。

これらのアセチルチオ誘導体（■）（Ｒ′、Ｒ−２）い
ずれか−万がＨ９他方が５ＣＨ２ＣＯＯＨ）あるいはへ
ミザクシニル誘導体（ＩＩ　）（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ福０ＣＯ
−ＣＨユＣＨ，２ＣＯＯＨ）に、水冷下テトラヒドロフ
ラン中で、チラミン、／−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ルおよびジシクロへキシルカルボジイミドを順次加えて
７〜ユ／時間反応させると、それぞれ対応するチラミン
付加体（■）〔（Ｒ′まＴこはＲ２のいずこれらの化合
物（■）に対し、好ましくは室温。

不活性気流中、酸性条件下に脱保護剤反応を施せば、そ
れぞれ対応する目的化合物（Ｉ　）、　ｊ、：とえば、
（／／β、／ｇ−エポキシー／ｆα、２／−ジヒドロキ
シ−３，２θ−ジオキソーグープレグネンーｔ（ま１こ
は乙β）−イルチオ）酢酸、まＴこは／／β、／サーエ
ポキシー／にα、ユ／−ジヒドロキシー３．．２０−ジ
オキソ−ｌ−プレグネン−乙β（ま１こはＡａ）−イル
ニヘミサクシネ−１・などが得られる。

この脱保護剤反応は、ステロイド一般に関１ノで公知の
、１コとえばＧ　ｒｅｅｎｅ　、　Ｔ、Ｗ、、著“Ｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ
　５ｙｎｔｌｌｅｓｉｓ　”　（／　９ｆ　／　）に記
載の条件で可能である。１ことえば、酸として塩酸、硫
酸。

過塩素酸なとの鉱酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸。

ｐ−トルエンスルホノ酸などの有機酸、その他ＢＣＩ、
などのルイス酸および酸型イオン交換樹脂を利用し１こ
脱アセトニド条件が適用可能である。

さらに具体的には、７θ％酢酸を用いユ〜７．２時作用
させる条件が挙げられ、いずれも有利に化合物（１）を
得られる。

これらは後記方法によって牛血清アルブミンとのコノジ
ュケ−１−を作りこれを免疫原とする抗血　１２− 清の作製に用いられ、ま１コ、酵素で標識し１こうえ。

ＲＩＡ用のトレーサーとして用いられる。

まｊコ、化合物（ＩＩ）（Ｒ’まｆコはＲ′のいずれか
−られｆこ化合物（Ｉ　）（Ｒ−チラミン残基）ｆこと
えば、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェネチル）−，２−（／
／β、／ざ一エポキシー／ざ／２、．２／−ジヒドロキ
シ−３，ユθ−ジオキソーグープレグネンーゲーイルチ
オ）アセトアミド、ま１こは／／β、／サーエポキシー
／ｇ（１（ま１こは／ざβ）、２／−ジヒドロキシ−３
９，２θ−ジオキソ−ｌ−プレグネノ−乙β（マ１こは
乙α）−イル−ｇ−（ｐ−ヒドロキシフェネチルアミノ
）−ケーオキソブチラートは、後記するように放射性ヨ
ウ素で標識してＲＩＡ用のトレーサーとして用いられる
。

さらに１本発明の別の側面によれば、前記した置換ＡＬ
Ｄ類のうち少くとも−っを、抗ハブテノ抗血清作製用ハ
プテノ、あるいは標識用抗原（トレーザー）として使用
する血清Ａ　Ｌ　Ｄのイムノアツセイ法が提供される。

該イムノアッセイ法において使用する抗ハプテン抗血清
は、先づ前記化合物（Ｉ）のうち妃が水酸基である化合
物（■）（Ｒ３−ＯＨ）を、それ自体公知の慣用手段、
Ｔコとえば混酸無水物法によって。

牛血清アルブミンとの結合物（ＵＳＡコンジュゲート）
とし１こ」−１これを免疫原として家兎に数回繰返し注
射し１このち、その家兎より採血Ｉ７て得られるもので
ある。

混酸無水物法は、化合物（Ｉ　）（Ｒ３−Ｈ）を、１こ
°Ｃで３θ分間攪拌すると、化合物（■）　−ＣＯＯＣ
ＯＯ−ＣＩＩＨ，の酸無水物ができる。これにＢＳＡの
含水ジオキサン＼溶液（ＮａＯＨでｏＨＩ３に調整）を
加え、攪拌をつづけると化合物（■）のＢＳＡコンジュ
ゲートが得られる方法である。

之に対し、冷水中での透析、　ｐｕの調整、遠心分離に
よる沈渣の採取、採取し１こ沈渣の重曹溶液による溶解
、冷水中での再透析などの精製操作を施して免疫原とす
る。

このほか、カルボジイミド法（エチルノＪルポジイミド
まｆこはモルホカルポジイミドを用いる）あるいはイソ
キサゾリウム法も用いられる。

ま１コ、これらの方法は１次の酵素で標識する場合も全
く同様に利用される。ＢＳＡが酵素とおき代るだけであ
る。（１コとえば鎮目和夫他編「新版ラジオイムノアッ
セイ」朝食書店７９７７年刊行。

および石川栄治他「酵素免疫測定法−１医学書院７９７
ｇ年刊行参照） まｒコ標識用抗原は、ＥＩＡの場合には、前記化合物（
■）のうちＲ３が水酸基であるものを、公知の慣用方法
、Ｔコとえば活性エステル法によって酵素で標識して作
製する。ＲＩＡの場合には、前記化合物（■）のうちＲ
３が水酸基以外のものをそれ自体公知の慣用手段、１こ
とえばクロラミンＴ法あるいは酵素法などにより放射性
ヨウ素（■　ま１こは／３／■）によって標識Ｌ７て作
製する。

すなわちクロラミンＴでヨウ素イオンを酸化するか、過
酸化水素とラクトペルオキシダーゼとの組合せで酸化し
て得１こ原子状ヨウ素を利用して。

１ことえばヒドロキシフェニルのメタ位にヨウ素を導入
する方法が採用される（前記「新版ラジオイムノアッナ
イ」参照）。

イムノアッセイ法はそれ自体公知の方法に従って行ない
、ＥＩＡの場合には、Ｔコとえば蛍光強度測定における
。標準液と被測定血清との測定値を比較することによっ
て定量する。

ＲＩＡの場合には、ｆことえばウェル型シノチレーショ
ン・カウンターで測定し１こ做禰躍１−ｂ−＋Φ標準液
と被検血清の放射活性−一←−−−醗との対比によって
求める。

本発明によって提供されるイムノアッセイ用キットには
■標準物質としてのＡＬＤと■化合物（■）の放射化あ
るいは酵素標識物ま１こは■化合物（Ｉ）より得Ｔ、＝
抗血清が含まれる。後二者のうちいずれかは公知のＡＬ
Ｄ誘導体由来のものでもよ０゜その他所望に応じ、緩衝
液、　Ｆ／Ｂ　（遊離／結合）分離試薬〔（１ことえば
ＰＥ（１）あるいは第ユ抗体（２抗体法で前記■を第１
抗体とする場合）〕　１６− を含むものであってもよい。

前記し１こように９本発明によれば、感度、交叉反応性
においてすぐれ１こイムノアッセイを実施しうろことが
判明し９次記実施例の記載において更に詳細に説明する
ように１本発明の公知技術に対する優位性が裏付けられ
Ｔコ。

以下の実施例および参考例において、化合物には、原則
として新訳参照番号に準拠し、関連する番号を付し１こ
。なお化合物物性値の記載中、ＮＭＲは、特記しない限
り乙θ■ｈにおけるスペクトルを示し、薄層クロマトグ
ラフィ（ＴＬＣ）のヒ値は。

「プレコーテッド・シリカゲル−乙θ−プレートｔ）ｚ
ｓｔｔｔｍ」（メルク社製）を用いて得られ１こもので
ある。

実施例／ （／／β、／に一エポキシー／ｆα、２／−ジヒドロキ
シ−３，２θ−ジオキソ−グープレグネン−グーイルチ
オ）酢酸（Ｉ　）（Ｒ’＝ＳＣＨユＣ０ＯＨ。

メチル（／／β、／ｇ；／にα、２θβ−ヒスエポキン
ーユθα、ユ／〜イソプロビリデノジオキシー３−オキ
ソ−グープレグネン−ｔ−イルチオ）アセテート（ＩＴ
　）（Ｒ＝ＳＣＩ（ＣＯＯＣＨ３，Ｒ’−λ Ｉｆ、ユθ、、２／、（８）アセトニド）ざ、２■にメ
タノールにｍｌと水１１ｍ１を加えｆこものに窒素ガス
気流中、室温にて炭酸カリウム９０■を加え２時間３θ
分反応させ１こ。

反応混合物を酢酸で中和し、酢酸エチルで抽出し１こ。

抽出物を飽和食塩水で繰返し洗浄し、硫酸すトリウムで
乾燥、ついで減圧下に溶媒を留去してアメ状の（／／β
、　！！　：　／！α、ユθβ−ヒスエポキシー２０（
１，２／−イソブロビリデノジオキシー３−オキソ−グ
ープレグネノ−グーイルチオ）酢酸（ＩＦ５）（Ｒ＝　
ＳＣＨユＣ０ＯＨ，Ｒ＝Ｈ，ユＯ。

ユ／（Ｓ）アセトニド）を得１こ。

（■勺（Ｒ’＝ＳＣＨ２ＣＯＯＨ，Ｒ’−Ｈ，，２θ、
、２．／（Ｓ）アセ１、ニド） ＮＭＲ（ＣＤＣ／３．δ） ３．３１　（−２Ｈ、ｓ　、　　５ＣＨｘＣＯ）３９ユ
該θ３（，２Ｈ，ＡＢ（＋　、　ＪＡＢ＝９Ｈｚ。

シΔＡＢ二乙３Ｈｚ、ユ／−Ｃ１（、−）グｆ７（／Ｈ
，ｄ、、ｒ−乙Ｈ２，／／−Ｈ）３．３３　（／Ｈ，ｓ
　、　／ざ一■）７７２（／Ｈｂｒｏａｄ　　−ＣＯＯ
Ｈ）これをそのまま７ｇ％酢酸溶液３ｍｌに加え、窒素
ガス気流中、室温にて乙時間攪拌しｆ、＝のち氷水を加
え酢酸エチルで抽出Ｌ　ｆコ。抽出物を飽和食塩　　　
　　“□水で洗浄し、硫酸すトリウムで乾燥、ついで減
圧　１９− 下に溶媒を留去１・１こ。残渣をメタノールから再結晶
して無色針状晶の標記化合物（■）（Ｒ＝＝ｓｃｎ、−
ＣＯＯＨ，Ｒ’＝Ｈ）　３４１ｍｇを得１こ。（（■）
からの収率ゲ６７％） 苧、７２７〜７２３°Ｃ 元素分析：　Ｃ，２ＪＨ３ｏ０７Ｓ　（’１３０Ｊ３乙
）として計算値：Ｃ，ｇ／３／ｉＨ，乙７７、Ｓ、７／
、２実験値：Ｃ１乙ＩＩ／　；Ｈ，乙９３±Ｓ、６にｇ
〔α〕ｏ　十／３乙ｌ±１７ （Ｃ−／θ乙ｇ、クロロホルム：メタノール−／：／）
３θオ（２２３０） ＩＲｖ””’　（Ｃａｎ　’）３’１７０　（ｓｈ）、
　３’ｌ／３　、３２３ｇ　。

ａｘ ユ乙乙θ、／７／θ、／乙７２゜ ／３．５θ。

ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ、δ） ／３／、７３オ（３Ｈ，／９−Ｈ） ３ゲゲ（−２Ｈ、ｓ　、Ｓ　ＣＨ２ＣＯ＞３．７０（／
Ｈ，ｍ、乙ａ−Ｈ） ｌＡ３ｇ（／Ｈ，ｄ　、Ｊ＝６Ｈｚ、／／−Ｈ）　２０
− ！；、０．２，３．１ｌ−３（／Ｈ，１ｇ−Ｈ）質量分
析：＋ｒ）／ｚゲ３ユ（Ｍ”−／にく７％）り　　　ゲ
／ゲ（Ｍ４−＝３乙　　−一％）〃　３ゲ、！（Ｗ−°
−／θざグ％） 〃１ｌｌＡ（１００％） ’／　　　ＩＩ　　（９７％） このほか１本品はメチル（／／β、／ｇ；／１α９．２
．θａ−ビスエポキシ−２０β、ユ／−イソプロピリデ
ンジオキシ−３−オキブーケ−プレグネン−ｌ−イルチ
オ）アセテ−１−（ＩＩ　）　（Ｒ’−８ＣＨ，２Ｃ，
０ＯＣＨ３，Ｒ−Ｈ，−〇、２／（Ｒ）アセトニド）を
同様に処理１．、（／／β、７ｆ；／ｇα、２θα−ビ
スエポキシ−２θβ９．２／−イソプロピリデンオキシ
−３−オキソ−グープレグネンーゲーイルチオ）酢酸（
■勺（Ｒ＝ＳＣＨ，Ｃ０ＯＨ，Ｒ’＝Ｈ。

２０．２／（Ｒ）アセトニド）を得て得られＴこ。

（参考物性値） （］Ｔ’）　（Ｒ＝ＳＣＩ（、Ｃ０ＯＨ，Ｒ＝Ｈ，：２
０，２／（Ｒ）アセトニド）望、／乙に〜／７θ°Ｃ 元素分析：Ｃ，２６Ｈ３１ＩＯ□Ｓ　（’１９０Ｊ９ｇ
）とじて計算値：Ｃ，ｌ、３乙３　；　Ｈ、、！ｌ、ヲ
ソ；Ｓ、乙５ゲ実験イ直：Ｃ９乙３７．２　；　Ｔ（、
乙Ｉオ；Ｓ、乙乙グ〔α〕＋ＩＯ’Ａ、だ二！ゲＣｃ−
１００クロロホルム）３．３７　（−２１（、ｓ　、　
ｓｃｎ、２ｃｏ　１３．１？　、’１．７！（２Ｈ，Ａ
Ｂｑ、　ＪＡＢ＝２１（ｚ。

ｖΔＡＢ−／　７１（ｚ　、　２　／−ＣＨ，２−）４
１、ｇ３（／１（、ｄ、Ｊ−乙ＩＴｚ、／／−Ｈ）ｊ３
θ（／Ｈ，ｓ　、１ｇ−ＩＮ ３９θ（／　Ｈ、ｂｒｏａｄ　、　−ＣＯＯ１Ｉｎ質量
分析：　ｍ／ｚ　’１１９（Ｍ”　　／、　　／乙％）
〃　　ゲ７／（Ｍ”−／９．　７％） 〃　　ゲ０θ（Ｍ＋゛−９０，２０％）／／　　　　１
１３（７００％） 実施例ユ （／／β、／ｇ−エポキシー／ｇｒｘ、２／−ジヒドロ
キシ−３，２θ−ジオキソーグーブレク゛ネノー乙β−
イルチオ）酢酸、（乙β−力Ｊレホキシの製造 （■）（■［勺 ５ＣＪ（、Ｃ００Ｈ （Ｉ　）（Ｒ＝Ｈ，Ｒ−β・５ＣＨ２ＣＯＯＨ）実施例
／と同様な操作をメチル（／／β、ｉｇ電／にα、ユθ
β−ビスエポキシー２０ａ、２／−イソプロピリデンジ
オキシ−３−オキソ−グープレグネン−６β−イルチオ
）アセテ−１−（ｌＩ）（Ｒ’−Ｉ−１，Ｒ’−β・Ｓ
ＣＨ，２ＣＯＯＣＨ３，スθ、２／（Ｓ）アセト二１・
）に施し、（／／β、７ｇテ／ざα９．２．θβ−ビス
エポキシーユθ／２．，２／−イソプロピリデンジオキ
シ−３−オキソーグープレグネノーＺβ−イルチオ）酢
酸（ＩＴ′）（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’−β・ＳＣＨ，２−Ｃ０
ＯＨ，，２０，２，／（Ｓ　）アセトニド）を経て、標
記化合物（Ｔ　）（Ｒ’−Ｈ，Ｒ２二β・ＳＣＨ，２Ｃ
ＯＯＨ）を得１こ。

（物性値） （ＩＴ”ｌ　（Ｒ＝Ｈ、Ｒ−β・ＳＣＨ，ＣＯＯＨ、２
０、，２バＳ）アセトニド）望、ユ／θ〜ユ／３”Ｃ： ＮＭＲ：（ＣＤ３０Ｄ、δ） ５’ＡＩ　（／Ｈ，ｓ　、　／に−Ｈ）３７乙（／Ｈ，
ｓ、グーＨ） （Ｉ　）（Ｒ’−Ｈ、Ｒ’−β・ＳＣＨ，２ＣＯＯＨ）
、１／’、　／乙ゲ〜／乙乙°Ｃ 元素分析：　Ｃ２，３Ｈ３ｏＯ７Ｓ　（１１３θ３３乙
）Ｈ，Ｏとして計算値：　Ｃ、３１９，！；　；　Ｈ，
６，ｌｒ、！；　；　Ｓ　、　Ａ、、ｒ＆実実験面直ｃ
、３ざ３７　；　Ｈ，乙、乙５；Ｓ、乙３／質量分析：
　ｍ／ｚ　’ｌ／’ｇ（Ｍ”　３乙〈７％）〃　　ゲゲ
（ゲ３％） ’／　　　７ｆ（／θ弗） 本島はこのほか、メチルＣ／／β、／１．／ｇａｔＸθ
ａ−ビスエボキシ−−２０β−イソプロピリデン−３−
オキソ−グープレグネンー乙β−イルチオ）アセテ−１
−（ＩＴ　）（Ｒ＝Ｈ，Ｒ’−β・ＳＣＨ，−ＣＯＯＣ
Ｈ３，，２θ、２／（Ｒ）ア±１・ニド）を同様に処理
し、（／／β、／ｆ：／ｇｒｔ、、２θα−ヒスエポキ
シ−，２０β−イソプロピリデン−３−オキソーグープ
レグネンー乙β−イルチオ）酢酸（■′）（Ｒ’−Ｈ，
Ｒ−β・ＳＣＨ，２Ｃ０ＯＩＩ　、　、２θ、λ／（Ｒ
）アセトニド）を経て得られＴこ。

（参考物性値） （■勺（Ｒ’−Ｈ、Ｒ’−β・５ｃｒ−ｒ、２ｃ６ｏｎ
、、：ｚθ、２／（Ｒ）　ア士トニド）、苧、／乙ゲ〜
／乙乙°Ｃ 元素分析：　Ｃ，２，Ｈ３，、Ｏ□５ＩＩ（ｌ１９０．
ｆ９ｇ）として計算値：Ｃ９〆３乙３；　ｉ　Ｔ（、乙
９９；Ｓ、乙５ゲ実験値：　Ｃ，１，３９０；Ｈ，１，
，７ｔ；Ｓ、６．ｌｌｌ。

〔α〕Ｄ　＋／＆！乙士／θ（ｃ＝ｌθ１０．クロロホ
ルム）Ｎｌｌｏ　Ｉ　　　−／ ＩＲ：　ｖ　　Ｊｏ（ｃｍ　　）３３００〜３０００’
、２Ａ、２Ｋ　。

／７３θ、／７２−２．／乙ゲ９．／！；９９．／θ乙
３゜ざｇ乙。

ＮＭＲ（ＣＤＣ／ヨ、δ） Ｈｚ、、２／　　ｃＨ，） ％Ｊ’／（／Ｈ，ｄ、Ｊ−ＩＨｚ、／／−Ｈ）ま３／（
／Ｈ，Ｓ　、／ｆ−Ｈ） ５ｇ／（／Ｈ，ａ、グーＨ） 質量分析：　ｒｒｙ’ｚ　４ｔ７２　（Ｍ”　／ざ　７
％）「Ｖ′ｚ　ゲ／ゲ（Ｍ＋’−７乙　７％）Ｉｖ／ｚ
　　ゲゲ（１００％） 参考例／（実施例／、、２．粗原料の製造）上記実施例
／およびユにおいて出発′原料として用い１こ化合物（
ＩＴ　）Ｃ（Ｒ’−８ＣＨ，２ＣＯＯＣＨ３，Ｒ’＝）
Ｔ。

ユθ、２／（Ｓ）および（Ｒ）アセトニド）および（Ｒ
／−Ｈ，Ｒ’−β−ＳＣＨ，２ＣＯＯＣＨ３，２０，２
７（Ｓ　）　７−ｂ　ト＝ド）〕はそれぞれ次のように
して得られ１こものである。

Ｃ以下余白） （■）　　　　　　　　　　　　　（■ｆ）すなわち、
先ずジメチルホルムアミド中テ、ヘミアセタール型のＡ
ＬＤ、すなわち／／β、／サーエポキシー／ざα、２／
−ジヒドロキシ−グープレグネン−３，２θ−ジオン（
１１１）にｐ−トルエノスルホン酸の存在のもとに２．
２−ジメトキシプロパンを作用させることにより／／β
、／す；／ｆａ、スθβ−ビスエポキシーユθα、ユ／
−イソプロピリデンジオキシ−３−メトキシ−ニオ−プ
レグナジェン（■）（）、０．１．／（Ｓ　）アセトニ
ーＺ／− ドおよび／／β、／ｇ；／ｇα、２θａ−ビスエポキシ
ーユθα、２／−イソプロピリデンオキシ−３−メトキ
シ−３，３−プレグナジェン（■）（ユθ、２／（Ｒ）
アセトニド）とし１こ。

次に、これらの化合物（■）〔（ユθ、２／（Ｓ）アセ
トニド）および（２θ、　、２／　（Ｒ１ア士トニド）
〕に個別にＮ−プロモア士ドアミドを反応させ、それぞ
れ乙β−ブロモ−／／β、／ざ；／ざα９．２θβ−ビ
スエポキシーユ０α、２／−イソプロピリデンジオキシ
−ｇ−プレグネン−３−オン（Ｖ’）（Ｒ’−Ｉ（、Ｒ
−β・Ｂｒ、、Ｑθ、、２／（Ｓ）アセトニド）ま１こ
は乙α−ブロモ−／／β、／ざ：／ｆａ、ユθβ−ビス
エポキシーユθα９．２／−イソプロビリデンジオキシ
ーグープレグネン−３−オン（■）（Ｒ’−Ｈ，Ｒ−ｒ
ｚ−Ｂｒ、ｊθ、２／（Ｓ　）アセトニド）あるいは、
乙β−ブロモ−／／β、／ざ±／ざα。

ユθα−ビスエポキシーユθβ、ユ／−イソプロビリデ
ンジオキシーグープレグネン−３−オン（Ｖｌ（Ｒ＝Ｈ
，Ｒ−β・Ｂｒ　、　、：ｌθ、２／（ｆｔ）アセトニ
ド）まｔこは乙ａ−ブロモ−／／β、／ｆ±／Ｉα−ビ
ー　２８」□ スエポキシーユθβ、２／−イソブロビリデ−ンジオキ
シーグープレグネンー３−オン（Ｖｌ（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ２
−ａ−Ｂｒ、−２，θ、２／（Ｒ）？−ｋ　）ニド）と
し１こ。

これらは単離することなくメチルチオグリコール酸ナト
リウムと室温下に反応させ１こ結果、それぞコ れ主生成物として（ＩＩ　’）　Ｃ（Ｒ＝ＳＣＨ，ＣＯ
ＯＣＨ３，Ｒ＝Ｈ１２θ、２／（８）および（Ｒ）アセ
トニド）〕が得られ、同時に少量の（Ｔ　）Ｃ（Ｒ’−
Ｈ，Ｒ’−β・ＳＣＨ，２−ＣＯＯＣＨ３，２θ、２／
（Ｓ）および（Ｒ）アセトニド）〕を得１こ。なお、後
者はいずれも乙β体で乙α体は得られなかつ１こ。

以下、これら中間体の物性値を記載する。

（■）（２θ、ユ／Ｃ８）アセトニド）　望６　／乙グ
〜／ｌ、ｆ′ｃ（アナトン／ヘキサンより再結晶）元素
分析：Ｃ２オＨ３１ＩＯ，（ゲ／但ｉユ）として計算値
：Ｃ，７２，、’１３；Ｈ，ざ２７実験値：　Ｃ，７２
，３９ｉＨ、ざ３／ＩＲ：　ｖ”ｊ０’　（ｃｍ　’）
　／Ａ３０．／１−２３　、／２’ｌＡ　。

ａｘ Ｋ２３に、／／乙♂、／θグざ。

／θユθ、９９乙 ＮＭＲ（ＣＤＣ１Ｊ、δ） ３３　Ｊ’　（、ｊ’　Ｈ、ｓ　、　　０ＣＨＪ　）３
、ｇｆ、’ＡＯゲ（−２Ｈ、ＡＢ　ｑ　、　ＪＡＢ　二
９　Ｈｚ　。

シΔＡＢ−６３Ｈｚ、−２／　　ＣＨ，２）≠９θ（／
Ｈ，ｄ　、Ｊ＝ＪＨｚ、／／−Ｈ）３、／４ｔ（ユＨ，
ｇ−Ｈおよびｔ−■■）３．３３（／Ｈ，ｓ　、　／ざ
−Ｈ） （■）（ユθ、２／（Ｒ）アセトニド）　望、　７２３
〜７２９°Ｃ（ジクミルメタン／メタノールよす）元素
分析：　Ｃ，２，Ｈ３，Ｏ，（ｔＡ／ｌｌＪユニ）とし
て計算値：Ｃ，７２，’ｔ３；Ｈ，にニア実験値：Ｃ，
７２，３ざ士Ｈ，１２７ ／／ｆθ、／／乙ざ、／θ７／、／θｊ３゜９ｆ９，７
２３ ３．３９　（３Ｈ、ａ　、０ＣＨ３） ３９θ、　’１．−１０　（２Ｈ、ＡＢｑ　、　ＪＡＢ
＝９　Ｈｚ　。

１’　、ｊＡＢ”７７９Ｈｚ　、　２／　−ＣＨ，２−
’）４４９０（／Ｈ，ｄ、Ｊ＝ｉ！ｌ；Ｈｚ、／／　　
Ｈ）、５′１（，２Ｈ，４ｔ−Ｈおよび乙−■）、５：
３θ（／Ｈ，ｓ、／♂−■） （１’））　（Ｒ二ＳＣＨユＣＯＯＣＨ３，Ｒ＝Ｈ，ユ
Ｏ，ユ／（Ｓ）アセトニド）ｔｐ、／／Ｉ〜／、２θ’
Ｃ（アセトン／ヘキサンより） 元素分析：　Ｃ，７Ｈ，０７Ｓ　（Ｊ−θ殆−ｔ）とＫ
７て計算値：Ｃ１乙ｔユｔ　；Ｈ，７／９　；　Ｓ　、
ｌ、、３に実験値：Ｃ１乙久θ９；Ｈ，７０７，Ｓ、乙
θ７ｔＯＨ Ｕ■：λ　　　　（ｎｍ、Ｅ　）２１１２（／／！；７
θ）３０３　（，２に！；０　’） ／２ユ乙、／／９ユ、／θ３０゜ １０／２，９９０．Ｋ１．！；ｌ／３ ８１− ＮＭＲ（ＣＤＣら、δ）／θθ■ｈ ３３乙、３グユ（−２Ｈ、ＡＢ　ｑ　、Ｊ　ＡＢ−／　
’ｌ　Ｈｚ　。

シ進Ｂ−琢Ｈ・・−８ＣＨ２Ｃ’０−）３乙’Ａ（ＪＨ
，ｓ　、　　０ＣＨＪ　）３９０．４４０−２　（−２
Ｈ、ＡＢ　ｑ　、　ＪＡＢ　＝９　Ｈｚ　。

シΔ靜＝／ユＨｚ、ユ／　−Ｃ’Ｈ，−）ｌｌｔｉ乙（
／Ｈ，ｄ　、Ｊ＝ＡＨｚ、／／　−Ｈ’）ｊ３θ（／Ｈ
，ｓ、／に−Ｈ） 質量分析： ｍ／ｚオθ＆（Ｍ”２９％） ｍ／ｚ　ＩＩＩＩＡ（Ｍ″−−ｊざ、３７％）ｍ／ｚ　
　’４３（１００％） （：［）（ＲＨ，Ｒ−β・ＳＣＨ，２ＣＯＯＣＨ３，２
θ、２バＳ）アセトニド）望、２θ７！；〜２θざ°Ｃ
（アセトン／ヘキサンより再結晶） 元素分析：　Ｃ，２７Ｈ，，０７Ｓ　（！；θｌＡ乙２
グ）として計算値：Ｃ９乙１２乙ｊＨ，７／９±Ｓ、乙
、３ｊ実験値：Ｃ９乙ＩＡ９０プＨ，７３７ｉ　Ｓ　、
　７／！；〔ａ〕Ｄ＋−２１０３±３．．１（ｃ＝０７
１７．クロロホルム）＝　８２　Ｊ Ｎｕ’ｌ　　　−／ 工Ｒニジ　Ｊｏ（■）　Ｋ７３２．　Ｋ６ざユ、／乙θ
ｊ。

ａｘ ／θｊ／、／θユ、ｒ、９９？ ＮＭＲ（ＣＤＣｊ？３．δ）１０％ＭＨ２（サンプル中
にジエチルエーテル混入） ３、／’ＡＣ２Ｈ，−８ＣＨ，Ｃ０） ３７ユ（３Ｈ、ｓ　、　　０ＣＲ３） ３．９２．ＩＩ、Ｃ３（−２Ｈ、Ａ　Ｂ　ｑ　、　Ｊ　
ＡＢ−９Ｈｚ　。

シΔＡＢ二／／Ｈｚ、−２／　　ＣＨ，２＞４ｔ、Ｋ３
（／Ｈ，ｄ　、Ｊ−ＩＨｚ、／／　〜Ｈ）１３１１（／
Ｈ，ｓ、ＩＩ−Ｈ） ｊ７θ（／Ｈ，ｓ、グー■） 質量分析： ｒｒｖ’ｚ　３θＩＭ”、ｌｒθ％） ｍ／ｚ　　’ｌ’Ａ乙（Ｍ＋°二３ｇ、７Ｊ％）ｍ／ｚ
　　ゲ３（７００％） （■）（Ｒ’−８ＣＨ，ＣＯＯＣＨ３，Ｒ’＝、、Ｈ，
，２０，２／　（Ｒ）７セトニド）”Ｐ、１１１０〜７
４２°Ｃ（アセトン／ヘキサンより） 元素分析：Ｃ２□Ｈ３ｔＯ７Ｓ　（オθ４ｔ、乙ニゲ）
と１７て計算イ直：　Ｃ１乙ｊ２乙；Ｈ１７／９±Ｓ、
乙３ｊ実験値：Ｃ１乙グ３グ暮Ｔ（，７，２ゲ士Ｓ、乙
３ユｔＯＨ ＵＶ　：ン、　　　　　　（ｎｍ、　　Ｅ　）　２４ｔ
Ｌ≦７（／／’７．４０）ａＸ ３０３　（ユ３１ｔＯ） ＩＲニジＮ１１Ｊ０１　（ａｔ′）／７４Ｚ９．／り３
０　、／７ｔ２ハ／ｊオ乙、／２θ２．／／ゲ乙、１０
乙ｌ。

１０３θ、／θユ０．９９７．、ｒざユＮＭＲ（Ｃｍ（
１，、、ｌ　１００ＭＨｚ３３乙、３’ｌ　−２（−２
Ｈ、ＡＪ３ｑ　、　Ｊ　ＡＢ　−／　４’　Ｈｚ　。

・Δ朋＝６／Ｈ・・−８ＣＨ，２Ｃｏ〜）３６３　（３
Ｈ、ｓ　、−□ＣＨＪ　）３、ｇｆ、’ＡＩ乙（２Ｈ、
ＡＢ　ｑ　、　ＪＡＢ””　９　Ｈ２。

νΔＡＢ　＝２　Ｊ’■Ｔｚ　、　、２　／　−ＣＨ，
２−）ｌＡｆ３（ＺＨ，ｄ、Ｊ−乙Ｈ２，／／−Ｈ’）
左ユに（ＺＨ，ｓ　、／ｇ７Ｈ） 質量分析： ｍ／ｚ　　３０４１　（Ｍ、　　　Ａ２形）Ｉ工ｌ／Ｚ
　７．２　（／θθ％） （旧（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ：２−β・ＳＣＨ，ＣＯＯＣＨ３，
，２０、：！、／　（Ｒ）アセ１〜ニド）ｍＰ、　　７
９２〜７９４°Ｃ（アセトン／ヘキザンより） 元素分析：Ｃユ、Ｉ（３，，０７Ｓ　（３θｌＡ乙ニゲ
）として計算値：Ｃ２乙娼侶；）Ｔ、７／９；Ｓ、乙３
３実験値：Ｃ９乙グ３３ｉＨ，７／９；Ｓ、６乙／〔ａ
　”Ｊ　Ｄ十／　３θ／±７９（ｃ＝０９９７．クロロ
ホルム）　ｔ　０Ｈ ＵＶ：λ　　　（ｎｍ、　ε）２’ｌｉ、！；　（／３
３θ０）ＩＩＩ　ａ　Ｘ Ｎｕｊｏｌ　　　−／ ＩＲ：　ｖ　　　　　（Ｃｎｒ　　）／７２乙、／乙と
２．／乙θ７゜／／乙乙　、１０７７．１０乙３，１０
−２３ＮＭＲ（１０−２３Ｎ、δ）／θθＭＨｚ３／θ
、ｊ’、／　９　（−ＺＨ、ＡＢｑ　、　ＪＡＢ−／　
５Ｈｚ　。

シΔＡＢ＝５！／Ｈｚ、−８ＣＨ，２Ｃ〇−）３．７３
（３Ｈ、ｓ　、　　ＯＣＨ３）３ｇ乙、り／乙（−２Ｈ
，ＡＢｑ、ＪＡＢ””９Ｈ２゜シΔＡＢ−、２Ｊ’Ｈｚ
　、　、２／−ＣＨ，２−）４＜Ｊ’／（ＺＨ，ａ、Ｊ
−乙Ｈｚ　、　／　／　−Ｈ）３．３０　（ＺＨ、ｓ　
、　／Ｉｒ−Ｈ）＝　８５− ３．７／（ＺＨ，ａ、グーＨ） ｃ以下余白） 　８６− 実施例３ Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェネチル）−２−（／／β、／
トーエポキシー／ｆα、２／−ジヒドロキシ−３，２θ
−ジオキソ−グープレグネン−ｔ−イルチオ）アセトア
ミド（１） （Ｉｔ） （１） Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェネチル）−２−（／／β、／
ざ；／ｆα、２θβ−ビスエポキシー記θα、２／−イ
ソプロピリチンジオキシ−３−オキソ−グープレグネン
−グーイルチオ）アー＋！トアミ素ガス気流中、室温に
おいて５時間反応させた。

反応混合物に氷水を加え酢酸エチルで抽出し１食塩水中
で繰返し洗浄し、硫酸すｌ・リウムで乾燥したのち、減
圧下に溶媒を留去する。残渣をメタノ−Ｊｌ／に溶かし
て活性産米で処理し、これにエーテルＮＭＲ（ｒｌ、−
アセトン、δ） ７２２．７３θ、／３夕（３Ｈ、／　９−Ｉ（）ｌＡｊ
！、’Ａ７．！ｒ（／Ｈ各、ｄ、Ｊ＝乙１−１ｚ、／／
　　Ｈ）ｊθ乙、ｊ１１ｔθ（／Ｈ各、Ｓ、／ざ−Ｈ）
ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ　、δ） −８９＝ ／２３．７３１７−Ｃ３Ｈ，／？−Ｈ）５０３、ｊグ５
（／ＪＴ各、　Ｓ　、　／Ｉ−’Ｉ（）ＬＣ Ｒｆ二θ３２（ジクロルメタン：アセトン＝／：／）ま
すこ化合物（１）は、　Ｎ　−（ｐ−ヒドロキシフェネ
チル）−ノー（／／β、／ざ；／ざα、スＯβ−ビスエ
ポキシー２０α、２／−イソプロピリチンジオキシ−３
−オキソ−７−プレグネン−グーイルチオ）アセトアミ
ド（１）　（Ｒ’＝ＳＣＨＣ０ＮＨＣＴ（，２−様に処
理することによっても得られた。

参考例２（実施例３の出発原料の製造）上記実施例３の
出発原料（１）　（（ＲＳＣＨ，２ＣＯＮ）Ｔ−アセト
ニド〕は前記参考例／に記載の化合物（ｌｌ）で、チラ
ミン、／−ヒドロキシベンゾトリアシー４０　　Ａ ルおよびジシクロへキシルカルボジイミドを順次加えて
反応ｃＮ、ＫｉＳ　ｎ　ｉ　ｇ　、ら：　Ｃ１＋ｅｍ、
　Ｂｅｒ、　１０３　。

７♂ざ（／９７θ）参照）させたのち精製して得られる
。

まｊこは（Ｒ）アセトニＦ〕 （以下余白） 実施例グ ｉ）免疫原 実施例／記載の化合物（１）　（Ｒ＝ＳＣＨ，２ＣＯＯ
Ｈ，Ｒ’−’Ｈ）／ＩＱをジオキサンタθＯμｌに溶か
し１０〜／２°Ｃに保ちなからｌ・リブチルアミンｃ？
、３１１１とイソブチルクロルカーボネーｌ−ｌＡ？　
ｔｔ＃を加え、３θ分間攪拌して活性エステル液とする
。

一方、牛血清アルブミン（Ｂ　ＳＡ　）乙９〜を水２ｙ
ｓｌに溶かし、ジオキサン２ｍｌを加えて混和したのち
、／Ｎ−水酸化すトリウノ・でｐＨＪ’？５に調整する
。これに、上記エステル液を水冷下に滴下したのち、さ
らにｐＨＩ！；に保ちながらｔ時間攪拌を続けてカップ
リングさせ、水を用いて透析し、つづいて凍結乾燥し、
標記化合物（１）ＢＳＡコンジュゲ−１〜ｊＯ〜を得た
。

担体タンパクに対するハプテンの結合モル比は／ｊであ
った。

ｉｉ）抗血清 前記免疫原２ｊθＨを生理食塩水２ｊθμに溶かし、フ
ロイント・コンプリート・アジュバント２ｊθμを加え
エマルジョンとする。これを家兎　４３− の背部に皮肉注射し、これを３週間間隔で５回繰返す。

最終免疫後ｉｏ日目に全採血して抗血清を得た。

この抗血清の力価を、後述のＲＩＡ系で測定したところ
　／２′■標識Ａ　Ｌ　Ｄ　２．２　Ｘ　１０”　ｄ）
］ｒｎのｊθチを結合させるのに要する抗血清の希釈倍
数で表わした値で、ｌＩ乙×／θ′倍であった。

実施例ｊ 実施例３に記載した方法に従って調製した化合ｎ９　、
ジメチルホルムアミドｊｐ！、０．ｆＭ−リン酸緩衝液
ＣｐＨ７３）２３ｐｌおよび　　ニーヨウ化ナトリウム
／ｍＣｉ：をガラスチューブに入れ、これにクロラミン
Ｔ２θＲを含むリン酸緩衝液（ｐＨ０）ｊμを加え、室
温で＋１秒間攪拌したのち、メタ重亜硫酸ナトリウムｌ
θｏｐｙを含む水溶液ｊメを４４− タン／ｙｇｌで抽出、硫酸すトリウムで乾燥後クロマト
グラフィー（セファテックスＬｍ−２０．θ７ｍφ×λ
θｃＩ！ｔＩジクロルメクン：メタノール−９：／）を
行ない、ｌθθθ−７３００１１６１７７１ｇの標記化
合物を得た。クロマＩ・ダラム（溶出曲線）は第１図に
示す通りであった。

実施例乙 ／／β、／ざ＝エポキシー／ざα、２／−ジヒドロキシ
ー３，２θ−ジオキソ−弘−プレグネンー乙β−イル−
ヘミサクシネー）　（１）（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’−β・／／
β、／ｆ、／ざα、２０β−ビスエポキシー２０（１，
２／−イソプロピリデンジオキシ−３−オキソ−クープ
１／グネンー乙β−イル−ヘミサクシネー１−　（ＩＩ
）（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’−ρ・ＱＣＱＣＴ（、ＣＨ２Ｃ０Ｏ
Ｉ（）　３５〜を７θチ酢酸’１ｍｌに溶かし、窒素ガ
ス気流中。

室温にて／６時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢
酸エチルで抽出し、飽和食塩水で繰返し洗浄、硫酸すト
リウノ・で乾燥したのち減圧下で溶媒を留去した。得ら
れた残渣をメタノールに溶かし活性炊米で処理した。

収率グワ乙係。

また化合物（１）　（Ｒ’＝Ｔ（、Ｒ２−β・０ＣＯＣ
Ｈ２ＣＩ（，２ＣＯＯＴ（。

２θ、、２／（Ｓ）アセトニド）の代りに同（ＩＩ）（
Ｒ’＝Ｈ，Ｒ仁β・０ＣＯＣＩ（，２ＣＩ（，２ＣＯＯ
ＴＴ、　２θ、２／（Ｒ）アセトニド）７９■を同様に
処理し標記化合物（１）３１１ｔｆｆ＆を得た。

（１）　（Ｒ’−Ｈ、Ｒｒ−β・ＯＣＯＣＨ２ＣＭ、Ｃ
００Ｈ）／ 元素分析：ＣおＨ，ユＯ，ツＨ，Ｏ（グざ３；、３／グ
）として。

計算値：Ｃ９乙／、５＞グ、Ｈ９乙１３実験値：Ｃ２乙
ス、θ９．Ｈ，７３θ 質量分析： ｍ／ｚ　’Ｉ！；Ｉ　（Ｍ”　−／Ｊ’　、　２　％　
）　、　ｍ／ｚ　’１２９ＣＭ”−’１７　、　／　／
％　）＋ｎ／ｚ　　３３ｇＣＭ＋−／／、８°、３７’
Ｆ）、ｍＡ　　／’１９（１００％）Ｎ　Ｍ　ＲＣＣＤ
Ｃｌ３．δ）： ３．３３Ｃ／Ｈ，Ｓ　、　／ざ−Ｈ） ３、Ｉｌ！；　（／　Ｈ、Ｗ””Ｊ’Ｈｚ、乙α−Ｈ）
３．９４’Ｃ／Ｈ，ｓ　、グーＨ） ＴＬＣＲｆ＝θ／７ （酢酸エチル：シクロヘキサン：酢酸：エタノールース
θ：／θ：／：２） 実施例７ ／／β、／ざ一エポキシー／ｆα、２／−ジヒー　４７
＝ 〇Ｃ０ＣＨ，ｌＣＨ２ＣＯＯ■■ 実施例贋こ記載したものと同様な操作を、／／β、／ｆ
、／♂α、２０β−ビスエポキシ−２０α、２／−イソ
プロピリチンジオキシ−３−オキソ−グープレグネン−
乙α−イルニヘミサクシネート（…）　（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ
’＝ａ　−０ＣＯＣＨ，２ＣＨ，２ＣＯＯＨ，２θ、２
／（Ｓ）アナト＼ニド）２３〜に施して標記化合物（Ｉ
）（Ｒ＝Ｈ，Ｒ＝α・０ＣＯＣＨ，ＩＣＨ，２ＣＯＯＨ
）　／　ＯＱヲ得た。収率グアフチ。

水晶は、また／／ρ、／ざｒ／ｆα、２θα−ビスエポ
キシ−λθβ、２／−イソプロピリデンジオキシ−３−
オキソ−グープレグネン−乙ａ−−４８＝ イルーヘミサクシネー）　（ｆｌ）（Ｒ’＝ｎ、Ｒ２−
α・０ＣＯＣＨ，−ＣＨ，Ｃ００）Ｔ、　２０　、２／
　（Ｒ）アセトニド）７９〜を同様に処理しても２６〜
得られた。

（１）　（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’＝（ｚ　、　０ＣＯＣＨ２Ｃ
Ｈ，Ｃ００Ｔ（）元素分析”　、２ｊＨｊ２０７・２Ｈ
，２０Ｃ３／２．３３ｇ＞として計算値：Ｃ１３と３ｆ
、Ｈ，７θと 実験値：　Ｃ，ｓｙ、ｑｑ、Ｈ，４７ざ質量分析’　ｍ
／ｚ　’Ｂｌ（Ｍ”＝　７ｇ、＜／％）ｒｎ／ｚ　’１
２９ｃＭ″−’−４７．２０％）ｍ／ｚ　３３ｆＣＭ”
　’−／／１．　！；７％）ｍ／ｚ　　２１ｒＣＩθθ
係） ＮＭＲ（ＣＤＣら、δ） 盈３２（／Ｈ，Ｓ、／ざ−Ｈ） ３９１Ｉ（／Ｈ，ｄ　、　Ｊ＝、２Ｈｚ、　’ｌ　Ｈ）
ＴＬＣＲｆ−θ１７ （酢酸エチル：シクロヘキサン：エタノール：：酢酸＝
２θ：１０：２：／＞ 」二記実施例乙および７の出発原料である化合物（Ｈ）
　（（Ｒ’　＝Ｈ、Ｒ’二β・０ＣＯＣＨユＣＩ（、Ｃ
ＯＯＨ）　、スθ、２／（Ｓ）まｔこは（Ｒ）アセトニ
ド、および（Ｒ’、＝Ｈ、Ｒ：２−α・０ＣＯＣＨ２Ｃ
Ｈ，２ＣＯＯＨ）　、　、２０　、２／　（Ｓ　）また
は（Ｒ）アセトニド〕は先述の参考例／に記載された化
合物（■）〔）θ、、２／（Ｓ）または（Ｒ）アセ１−
二ド〕より。

それぞれ次のようにして得られる。

先ず、化合物（ＴＶ）（，２０，２／Ｃ８）または（Ｒ
）アセトニド〕をそれぞれ、／θ係含水テトラヒドロフ
ランに溶かし、水冷攪拌下にｍ−クロル過安息香酸を加
えて反応させたのち、クロマトグラフィ分画を施せば、
それぞれ／／β、／ｇ、＃α、２θβ−ヒスエポキシ−
乙β−ヒドロキシ−２０ａ。

２／−イソプロピリチンジオキシ−グープレグネン−３
−オン（Ｖ）（Ｒ＝Ｈ，Ｒ−β・０Ｈ１２θ、、２／（
Ｓ）アセト二Ｆ）と／／β、／ｆ：／ざα、２θβ−ビ
スエポキシー乙α−ヒドロキシ−λθα、２／−イソプ
ロピリチンジオキシ−グープレグネン−３−オン（Ｖ）
（Ｒ’−Ｈ，Ｒ’−α・０Ｈ９２θ、、２／（Ｓ）ア十
トニド）、および／／β、ｌと、／ｇσ９．２０α−ヒ
゛スエボキシー乙β−ヒドロキシースθβ、２／−イソ
プロピリテンジオキシーグープレグネンー３−オン（Ｖ
　）　（Ｒ’−Ｉ−Ｔ　、　Ｒ’−β・０Ｈ９２θ、２
／　（Ｒ）アセトニド）と／／β、／ざ；／とα、２θ
α−ビスエポキシー乙α−ヒドロキシースθβ、２／−
イソプロピリチンジオキシ−グープレグネン−３−オン
（Ｖ）（Ｒ’−Ｈ，Ｒ’＝／Ｚ−ＯＨ，２０，２／　（
Ｒ）　ｙ　セＩ−＝ド）が得られる。

次に、こわらの化合物（Ｖ）を個別にピリジンに溶かし
、無水コハク酸とゲージメチルアミノピリジンを加え、
加温（β−ＯＨ体は乙７°Ｃ、ａ−ＯＨ体は３♂°Ｃ）
して反応させ、それぞれ対応する化合物（ＩＩ）〔（Ｒ
＝ｎ、Ｒ−β・０ＣＯＣＨ，ＣＭ、Ｃ００Ｈ）　、　２
０　、２／（Ｓ）または（Ｒ）アセト二１・、おＪ：び
（Ｒ’−Ｈ，Ｒ″２−ａ−ＯＣＯＣＨ，２ＣＨ，２Ｃｏ
ｏ■）、２θ、、２／（Ｓ）マタハ（Ｒ）アセトニド−
１を得た。

、　　　　　　　　　　（以下余白） 　５４　一 実施例ｇ 化合物（１）（（Ｒ＝Ｈ，Ｒ−βおよびａ　’０ＣＯＣ
Ｈ２ＣＩ−Ｔ、−ＣＯＯＨ））による免疫原および抗血
清の作製１）免疫原： 実施例乙および７記載の方法によって製造した標記化合
物（１）を２個別に実施例ゲ記載の方法と同様の方法に
従って処理し、それぞれ（１）（Ｒ−Ｈ，Ｒ−２−β、
ｏｃｏｃＨ，２ｃｎ、２ｃｏｏＨ）−ＢＳＡ　オＪ：　
ｏ：　＜　０　（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ福α・０ＣＯＣＨ，２Ｃ
Ｈ，２ＣＯＯＨ）−ＢＳＡ　コンシュケートを得た。出
発物質／　ｌＡ３　＃！ダから得られたコンジュゲート
の量は、それぞれ乙ｊ〜、乙ざ〜であつｔこ。

また担体タンパクに対するハプテンの結合モル比は、そ
れぞれ／／および２θであった。

（以下余白） 　５５− ｉｉ）抗血清 前記免疫原を用い実施例ｇ、ｉｉ）記載と同様の方法で
免疫を行い、抗血清を得た。これらの抗血清の力価を前
記と同一表現で示すと、それぞれヲ×／θ７倍および乙
×１０３倍であった。

実施例９ ／／β、／Ｉ−エポキシー／ざα、２／−ジヒドロキシ
ー３，２θ−ジオキソ−グープレグネン−乙β−イル−
’１−（ｐ−ヒドロキシフェネチルアミノ）−グーオキ
ツブチラー＋−（Ｊ）（Ｒ’−Ｈ，Ｒ’−β、ｌど一エ
ポキシー１ｆｔ１．２／−ジヒドロキシーヱ２０−ジオ
キソ−弘−ブレグオ、ンー乙α−イルー’ｌ　−（ｐ−
ヒドロキシフェネチルアミノ）（以下余白） ／／β、／１．／ｆ（Ｌ　、２０β−ビスエポキシ−２
θα、２／−イソプロピリデンジオキシ−３−オキソ−
グープレグネン−６β−イル−＋−（ｐ−ヒドロキシフ
ェネチルアミノ）−り一オキソブチレー）（ＩＸＲ’二
Ｈ，Ｒ福β・０ＣＯＣＨ，ＣＨ，２ＣＯＮ［（ＣＨ２−
よびｌ／β、／ざ、ｉｇａ　、ｘｏａ−ビスエポキシ−
２θａ、２／−イソプロピリデンジオキシ−３−オキソ
−グープレグネン−乙β−イル＝グー（ｐ−ヒドロキシ
フェネチルアミノ）−グーオキソブチレ−１〜（Ｎ　）
　（Ｒ’−Ｈ，Ｒ福β・０ＣＯＣＨ，ＣＨ，２−ス気流
中、室温にて／６時間攪拌したのち、氷水を加え酢酸エ
チルで抽出した。これを飽和食塩水にて繰返し洗浄した
のち、硫酸すｌ・リウムで乾燥し、減圧下に溶媒を留去
した。

残渣をメタノールに溶かして活性炭未処理を施し、油状
物として標記化合物（１）　（Ｒ’−Ｈ，Ｒ’−β・同
様にして／／β、／ざ；ｌざα、２θβ−ビスエポキシ
ー２θα、２／−イソプロピリデンジオキシ−３−オキ
ソ−グープレグネン−乙α−イル＝＋−（ｐ−ヒドロキ
シフェネチルアミノ）−グーオキソブチレート（１）　
（Ｒ’−Ｈ，Ｒ福α・ｏｃｏ−ニド）６〜および／／β
、ｌざ；ｌざα、２θα　５７− 一ヒスエポキシー２θβ、２／−イソプロピリチンジオ
キシ−３−オキソ−グープレグネン−乙α−イル＝！−
（ｐ−ヒドロキシフェネチルアミノ）−クーオキソ＼ブ
チレート（ＩＩ）（Ｒ’＝ｎ、Ｒ’＝ａ。

アセトニド）ざ〜より標記化合物（ｒ　）　（Ｒ’−Ｈ
，Ｒ’−α・５８− 参考例ψ（実施例９川原料の製造） 上記実施例９の出発原料である化合物（Ｉ　）〔（Ｒ’
＝Ｈ）（Ｒ’−βまたはα・０ＣＯＣＨ，２ＣＨ，Ｃ０
ＮＨ＠　ＯＨ）　２θ。

２／（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド〕は、参考例３によ
って製造された化合物（…）　（（Ｒ’−Ｈ）　（Ｒ’
−βまたは（２，０ＣＯＣＨ，ＣＨ，２ＣＯＯＨ）、２
θ、２／（Ｓ）または（Ｒ）アセトニド〕をそれぞれジ
シクロヘキシルカルボジイミド・ｌ−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール法（参考例λに記載と同様の方法）によっ
てチラミンと結合させて製造した。

（１） （以下余白） 実施例／θ ′工による化合物（Ｉ）（Ｒ’−Ｉ（、Ｒ’−βまたは
ａ−実施例９の記載の方法に従って調製した化合物（１
）（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’−βまたはα・ＱＣＯＣＴ（２ＣＨ
ユＣ０ＮＨＣＨニーＣＨユ＠ＯＨ）に実施例ｊと同様の
操作を施して。

それぞれ′２’Ｉ−（Ｉ）（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’−β・０Ｃ
ＯＣＨ，２ＣＨ，２−ＣＯＮＨＣＨ，２ＣＨ，＠ＯＨ）
　３３０　／ｌＣｉ　オヨヒ”’Ｉ　−（１）（Ｒ＝Ｈ
，Ｒ−α、　０ＣＯＣＨユＣＨ，Ｃ０ＮＨＣＨ，２ＣＨ
２■ＯＨ）乙θθμＣｉ　　を得た。ウロマトグラム（
溶出曲線）はそれぞれ第２図および第３図に示す通りで
あった。

参考例夕 実施例ｊおよび１０に記載したＡＬＤ標識化合物のほか
、公知の／ｌβ、／ｆ−エポキシ、／トσ、２／−ジヒ
ドロキシーゲープレグネン−３゜２０−ジオン＝３−（
Ｃ）−ＣＮ−（ｐ−ヒドロキシルフェネチル）カルバモ
イルメチル〕＼オキシム）（■）をクロラミンＴ法によ
りヨウ素化して／２３■（Ｖｌ）を作製し、その比放射
能が乙ｆＯｃＶｒｒｒｎｏｌ　であることを確認した。

実施例／／ 血清ＡＬＤのＲＩＡ ／）操作法 血清／θθｐｌを試験管に採取し、上記実施例ｊおよび
／θ、および参考例ｊのいずれかによ−）て得た″′Ｉ
標識ｋＬＤ（２，２×１０″ｄ　ｐｍ　）　／θＱ　／
ＩＩンー／−スルホン酸溶液（乙２５■Ａｓｌ　）グＯ
θ／ｉｌおよび後記希釈倍率の各種抗血清溶液（実施例
グおよびざにより作製）／θθμノを加え、ｖ’Ｃで／
６時間インキュベーションを行ったのち、２３％ポリエ
チレングリコール乙０θθ溶液／ｍｔを加え。

７０秒間振り混ぜ、ついで遠心分離（２２ｊθ×ｇ、２
０分間）シ、その」−澄を吸引除去し、沈澱の放射活性
をウェル型シンチレーション・カウンターで測定した。

（以下余白） 　６４− 記 ２）標準曲線： 上記ｌ）の操作法によｌ）、ＡＬＤ標準液（θ〜ｊθθ
θｐ９Ａｌ）について作成した標準曲線は第を図に示す
通りであった。ここでＢ。は非放射性ＡＬＤのないとき
に得られた抗原・抗体結合物の放射能。

Ｂは非放射性Ａ　Ｌ　Ｄを加えたときの結合物の放射能
である。

３）交差反応性： 本発明によって得た各種置換アルドステロンの各種ステ
ロイドとの交差反応性検定試験（方法は上記ハによる結
果を次表に総括する。

６５− 実施例／、２ 前記した。ＡＬＤのカルボン酸誘導体〔実施例／に示し
た（　１）　（Ｒ’、＝ＳＣＨ，Ｃ０ＯＨ，Ｒ２，，Ｈ
）、実施例２　。

に示した（１）（Ｒ＝Ｈ，Ｒ−β・ＳＣＨ，Ｃ００Ｈ）
　、実施例乙に示した（　Ｉ　）　（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ２−
β・０ＣＯＣＨユＣＨ，Ｃ００Ｈ）　、実施例７に示し
た（１）（Ｒ’−Ｈ，Ｒ’−α・０ＣＯＣＨ，ＣＨ，−
＝３−（０−カルボキシメチル）オキシム（Ｖｌ）　）
各乙μｍｏｌ　を個別にジオキサンａｏｏＩｉｌに溶か
し。

トリーｎ−ブチルシアミン乙３μｍｏｌ　　を含むジオ
キサンｊθμを加え１０〜／２°Ｃに冷却下イソブチル
　クロルシカ−ボネート乙１１ｍｏ　ｌ　を含むジオキ
サン３０ｐｌを加え３０分間攪拌し活性エステル液とし
た。

一方、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（３０ＵＡ’　。

ベーリンガー・マンハイムａ［）２〜を１０％ジオキサ
ン３．３　ｙｔｔｌに溶かし、０７Ｎ−水酸化ナトリ　
６７− ラムでｐＨ９２に調整しておく。こ第１に−に記活性エ
ステル液を水冷・攪拌下に滴下し、３分後、ｐＨＪ：ｊ
に調整した。さらにグ°Ｃでグ時間攪拌を続けたのちθ
θ３チナトリウムアシドを含む００７Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７１１ｔ）に対して記日間透析し、得られたβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ・ＡＬＤ誘導体・：］　ンシュ’ｙ
”−ｌ・（被標識化合物の記載順に従って。

それぞれ■ａ　、　ｌ：＋　、　ｃ　、　ｄまたはｅと
指称する）を酵素標識抗原とした。

、２）ＥＩＡ： ＡＬＤ標準溶液／θ０μを試験管に採り、０７Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）３θ０μおよび酵素標識抗原希釈
液（酵素標識抗原を／θ万倍に希釈）１０θμを加え混
和後、抗血清溶液ｊθθμを加えグ°Ｃで５時間静置し
た。

ライてイム／ヒート（Ｉｍｍｕｎｏ）〕Ｏａｄ　；　Ｂ
ｉ　ｏ−Ｒａｄ社商社名品名／　＊／Ａｔ　）　／θ０
／ｉｌを加えグ°Ｃに７時間静置したのち、遠沈しく２
０θＯ×９．３分間）。

え。」、□□１．去５，１□ｏ７ボづ、緩衝液（ｐＨ７
１）で２回洗浄した。

これを、０／グＭ−食塩、θθθ／Ｍ・塩化マグネシウ
ム、０θｊ％ナトリウム＼アジド、０３％ＢＳＡを含む
θ０／Ｍ−リン酸緩衝液（１）Ｒ７３）に懸濁させ、さ
らにグーメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド溶液（ざＯｐｙ／ｍｅ　）グθθｔｔｌｌを加え、３
７°Ｃで３θ分間インキュベートしたのち、θ／Ｍ−グ
リシン緩衝液（ｐＨ／θ３）３渭ｔを加えて反応を停止
させ、その蛍光強度（励起３乙Ｑ　ｎｍ　、蛍光４’４
’Ｊ’ｎｒｎ）を測定した。

なお、血清中Ａ　Ｌ　Ｄの測定の場合は、標準溶液ｌθ
θμおよび緩衝液３θθμの代りに、それぞれ被検血清
／θＯｔｄおよびざ−アニリノナフタレンーｌ−スルホ
ン酸溶液（とθθ雁／ｍ１）３θθμを用い、以下」コ
ノと同様に操作する。また、用いる酵素標識抗原と抗血
清との可能な組合せ（○印）は第１表に示すとおりであ
る。

（以下余白） 第　　　／　　　表

【図面の簡単な説明】

第７，２および３図はそれぞれ　／２′ｘ　　（１）（
Ｒ’＝ＳＣＨ，２ＣＯＮＴ（ＣＨ，２ＣＨ，２■ＯＨ，
Ｒ２：Ｈ）、　”’Ｉ　−（））　（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ’−
Ｊ、０ＣＯＣＨ２ＣＨ，２ＣＯＮＨＣＨ，ＣＨ，０−０
Ｈ）および’　２′Ｉ　−（１）　（Ｒ’−Ｈ，Ｒ’−
α・０ＣＯＣＨＣＨ−２，２ ＣＯＮＨＣＨ，２ＣＨ２■ＯＨ）のカラムクロマトグラ
フ溶出曲線である。 また第を図は標識物あるいは抗ＡＬＤ抗血清ののいずれ
か一方、あるいは双方共に本発明による置換ＡＬＤを用
いて作成したＢ／Ｂ、標準曲線である。 　７１− 第７図 アルドステロン（ｐｇ／チューブ） 手竺補正書 特許庁長官　殿 ／　事件の表示 昭和５７年特許願第７ｇ了り７号 λ　発明の名称 グーまたは乙−置換アルドステロン類、その製法および
そのイムノアッセイにおける使用法３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 塩野義製薬株式会社特許部 −゛　　　　−畔→←−÷← ５補正の対象 ｌ）明細書の［３発明の詳細な説明−１および［を図面
の簡単な説明１の欄。 ２）図面。 乙補正の内容 ｌ）明細書第７０頁第７３行「沈澱させた。−１の後に
「／　／＋〜／／７°Ｃにて軟化。−１を挿入する。 ２）同第１１１頁、第を行と第５行との間に９次の文を
挿入する。 ｔＯＨ 「Ｕ■：λ　　　Ｃｎｍ、　ε）、２２！；、３Ｃ／３
１θ０）ｎａｘ ２１１２　（（５＞ワθθ） ２７９（３０θθ） ２ｆ３ＪＣ３θθθ） ２９９Ｃ２３θθ）　」 ３）同頁第１３行と第１ｇ行との間に１次の文を挿入す
る。 ［ 実施例３−／ Ｎ−（ｐ−ヒドロキシ−α−メトキシカルボニルフェネ
チル）−２−（／／−β、ｌざ一エポキシー／ざα、２
／−ジヒドロキシー！２θ−シオキソーゲープレグネン
ーグーイルチオ）アセトアーコー Ｎ−（ｐ−ヒドロキシ−α−メトキシカルボニルフエネ
チ＃　）　−、；ｌ　−（／　／β、ｉｇ、１ｇａ。 ２θβ−ビスエポキシ−２θ−ａ　、　２／−イソプロ
ピリチンオキシ−３−オキソ−グープレグネン−グーイ
ルチオ）アセ１〜アミド（Ｉｔ）　（２θ、、２／（Ｒ
）アセトニド）、２７〜に７θ係酢酸２ｔｘｔを加え。 窒素ガス気流中、室温において７時間反応させた。 反応混合物に氷水を加え、酢酸エチルで抽出し。 飽和食塩水中で繰返し洗浄し、硫酸すトリウムで乾燥さ
せたのち、減圧下に溶媒を留去した。残査ヲ、逆相クロ
マ］・グラフ（メルク社製ローバーカラム、ＲＰ−ｆ、
サイズＢ；溶離液、含水乙３チメタノール）に付し、得
られた主画分にエーテルを加えて粉末状の標記化合物（
１）　／ｇ■を得た。 収率、７θ９チ。 ＮＭＲ（（ｌＡ−アセトン、δ） ／、２３，１３３（３Ｈ９１９−Ｈ） ３３　／　（２Ｈ、ｓ　、　−８ＣＨユＣ０）３乙５（
３Ｈ，ｓ　、　　Ｃ００ＣＨｉ）’Ａ！；　／　（／Ｈ
、ｍ　、　ＮＨＣＨＣＯ峡）ｌＡ夕乙、４４７７（／Ｈ
各、　　ｄ　　、　　／／−Ｔ（）ｊθ乙、３．’ＩＯ
（／Ｈ各、ｓ、／７−Ｈ）Ｚ乙３（７Ｔ（、ｄ、Ｊ＝７
４Ｈｚ　、−ＣＯＮＨ）質量分析： ｆｆ！／Ｚ　　１，２７　（Ｍｌ”　１．２％　）ｔｔ
　　／７Ｊ’（／θθチ） ＴＬＣ： Ｒｆ、θノ９（クロロホルム：アセトン＝／：／）Ｒ、
θ３３（クロロホルム：メタノール−９：ｌ）実施例３
−２ Ｎ−（λ−（／Ｈ−イミダゾール−グーイル）エチルコ
ース−（／／β、／ざ一エポキシー／ＩＬ１．２／−ジ
ヒドロキシ−３，２θ−ジオキソ−グープレグネン−グ
ーイルチオ）アセトアミド（１）Ｎ−（ノー（／Ｈ−イ
ミダゾール−グーイル）エチルコース−（／／β、ｌざ
；）ざα、２θβ−ビスエポキシーユθ−α、２／−イ
ソプロピリデンオキシ−３−オキソ−ｑ−プレグネン−
グーイルチオ）アセトアミド（２θ、　２　／　（Ｒ）
アセト３− ニド）（１）、／、２＃に７θ係酢酸／　ｙｓｌを加え
、窒素ガス気流中、室温において乙ｊ時間反応させた。 反応混合物を前記実施例３−／と同様に処理して粉末状
（、！ｒ７°Ｃにて軟化）の標記化合物（１）乙〜を得
た。収率、３；３．７％。 ＮＭＲ（ｄ、−アー＋！トン、δ） １２２．１３３ｃ３Ｈ，ノ９−Ｈ） ’ＩＪ！；、’Ａ７７（／Ｈ各、ｄ、／／−Ｈ）ｊθ乙
、ｊゲ／Ｃ／Ｈ各、Ｓ　、ノー−■）質量分析： ｍ／ｚ　　３グ３（虻°ｌチ） 〃　　９グ（１００％） ＴＬＣ： Ｒｆ、θ／９（クロロホルム：メタノール−３：／）　
　　　−１グ）明細書第１Ｉ３頁表のあとに次の文を挿
入する。 ［ （２θ、　２　／　（Ｒ）アセトニド）−６− 質量分析： ｍ／ｚ　　　乙θ９（Ｍ”　　３％） ／／　　！；９’ｌＣＭ”　−／！；　３係）／／　　
／２θ（ｌθθ係） ＴＬＣ： Ｒｆθ３θ（酢酸エチル：ベンゼン−１／）０’ｌｌ（
クロロホルム：アセトン−３：ｌ）また、上記実施例３
−／の出発原料（１）　（Ｒ−または（Ｒ）アセトニド
〕は前記参考例１に記載の化合物（１）　（（Ｒ、＝Ｓ
ＣＨ，ＣＯＯＣＨ３，Ｒ’司（）、２θ、２／（Ｓ）ま
たはの）アセトニド〕を前記と同様に処理して得られる
。（Ｒ）アセトニドの場合、エステル３５〜より、粉末
状（軟化点ｌθざ０　）の標記化合物が２にり得られた
。収率乙θ５チ （２θ、、２／（Ｒ）アセ１−ニド） ３．２６（２，Ｈ、ｓ　、　　Ｓ　ＣＨ，２ＣＯ）３．
１！；、’Ａ／３Ｃ１２Ｈ、ＡＢ　ｑ　、Ｊ　ＡＢ＝９
Ｈｚ　、ν進Ｂ＝／乙、乙。 、２／−ＣＨ，−） ＩＡＡｓ２ｌＩ■訓、−ｍ−■荘Ｃ００ＣＴＴ、　）’
Ａ７１（／Ｈ，ｄ　、Ｊ＝乙乙ｚ　、／／”Ｈ）、、５
：、２４’（／Ｈ，ｓ、／ざＨ）７乙！（／Ｈ，、ｄ、
Ｊ＝７３Ｈｚ、−ＣＯＮＨ−）ＩＲνＣ，ＨＣ］３　（
ｉ’）、、グ、３２１０（ブロード）／７’／−！；、
／乙７．２．／乙／３．ノ！；９’ｌ。 質量分析： ｍ／Ｚ　　　６乙７（Ｍ”　　２係） ／／　　１０７Ｃ／θθチ） ＴＬＣ： Ｒｆθクハクロロポルム：アセトン−３：／’）上記実
施例３−２の出発原料（１）〔Ｒ＝ＳＣＨ２ＣＯＮＨア
セトニド〕は、前記参考例１に記載の化合物〔（Ｒ’＝
ＳＣＩ（、ＣＯＯＣＨ３，Ｒ’＝Ｈ）　２θ、ユ／（Ｓ
）まｔ＝は（Ｒ）アセトニド〕を前記と同様に処理して
得られる。但し、中間で得たカルボン酸（対応メチルエ
ステル２２ｍ９より得た量）はテトラヒドロフランでな
く、ジメチルポルムアミド２ｍｌに溶し、氷？６下にヒ
スタミン塩酸ｍ９ｍ９（１１モル）、Ｎ−メチルモルホ
リン１３．ｌｉｐ、ｌ　（３，！；モル）およびｌ−ヒ
ドロキシベンツトリア゛フール乙３’９Ｃ１１モル）、
続いてジシクロへキシルカルボジイミド／／、７１９（
１３モル）を順次加え、／７時間反応させた。反応完了
後、減圧下に溶媒を留去し、残査をクロマトグラフィ（
メルク社製ローバーカラム、サイズＡ）にて処理し、得
られた主画分にエーテルを加え粉末状（軟化点、／２２
〜／、２１Ｉ’Ｃ）の標記化合物（Ｉｌ）／　３１１９
を得た。収率３１／％。 （２θ、２／（Ｒ）アセトニド） ３ざ７　、ｌＡ／３（２Ｈ９ＡＢｑ　、ＪＡＢ−？Ｈ７
゜＝ヲー νΔＡＢ”／　ｌ’−ざＨ２，−２／　　ＣＨ，２）４
ｔざＯ（／Ｈ，ｄ、Ｊ−乙Ｈｚ　、／／−Ｈ）３．２７
Ｃ／Ｈ，ｓ　、／ざＨ） 質量分析： ｍ／ｚ　　３１３ＣＭ”　／％） 〃　　９グ（ｌθθチ） Ｔ！、Ｃ： Ｒｆ０３９Ｃクロロホルム：メタノール」 ｊ）明細書簡グ乙頁第乙行と第７行との間に次の文を挿
入する。 ［ 実施例３−／ 前記実施例！前半の記載に従って，実施例３−−ｌθ− ｌおよび３−２で得た標記化合物（１）の標識を行った
。標識物は．それぞれクロマトグラフィ（セファテック
スＬＨー，ｌθ，９１ψ×ソθジ１エタノール−Ｍ／／
θ　クエン酸緩衝液）によって精製し。 放射ｌａ性３θθμＣｉ／ＩＮのチロシンメチルエステ
ル体および同１１０θμＣ　ｉ　／ｌ＃ｇのヒスタミン
体を得た。クロマトグラフィ ｊおよび６図に示す。 」 乙）明細書第５７頁第２行の式（１）を次の通り書き換
える ７）同第６７頁と第６ざ頁との間に次の文を挿入する。 実施例／　／　−／ 前記実施例ノに記載の操作法に従って、実施例３−／で
得た標識体と、実施例／／、ノ）表中に記載した抗（１
）　（Ｒ’−Ｈ，Ｒ２−α・０ＣＯＣＨ２ＣＨ，Ｃ００
Ｈ）−ＢＳＡとを用いて作成しｆコＢ／Ｂｏ標準曲線は
第７図に示す通りであった。 」 ざ）同第７２頁第３行と第を行の間に次の文をを挿入す
る。 ［第５および第３図は、それぞれ　ＩイＩ）（Ｒ−のカ
ラムクロマトグラフ溶出曲線である。第７図は、標識物
わよび抗ＡＬＤ抗血清が双方共に本発明による置換ＡＬ
Ｄを用いてＢＩＢｏ標準曲線であ°　る。」 ９）添付の第５．乙および７図を補充する。 Ｚ添付書類の目録 図面（第５．乙および７図）　　　　１通以上 −／　　ｊ　　− ］チ） 溶出液画分Ｃｍｌ＞− 一７グー 第７図 ２、ｊ／θ　　≠θ　　ノ乙θ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （但し２式中　Ｈ／および−のいずれか一万は水素。 Ｒ′が水素のとき−は−５−（ＣＨ，２）７ヨＣＯＲ３
   まＴこは−０−ＣＯ−（ＣＨ，）、　、ＣＯＲで表わさ
   れる基、Ｒ２が水素のときＲ′は−８−（ＣＨ，２）、
   　、ＣＯＲ３で表わされる基。 ここでＲ８はヒドロキシ基、ま１こはそれぞれヨウ素化
   されていてもよいチラミン残基、チロシン低級アルキル
   エステル残基、ヒスタミン残基、ヒスチジン残基あるい
   は７−アミツヘブタノイルチロシン低級アルキルエステ
   ル残基をあられす）であられされた置換アルドステロン
   類。 （但し９式中Ｒ′およびＲ’（７）いずれか一方は水素
   。 Ｒ′が水素のときＲ２は−５−（ＣＨ，２）７−３ＣＯ
   Ｒ３ま１こは一〇−Ｃｏ−（ＣＨ，）、　、ＣＯＲ蝉表
   わされる基　ＲＪが水素のときＲ′は−８−（ＣＨ，）
   、　、ＣＯＲ外表わされる基、ここで１はヒドロキシ基
   、ま１こはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラミン
   残基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒスタミン
   残基、ヒスチジン残基するいは７−アミツヘブタノイル
   チロシン低級アルキルエステル残基を表わす。ま１こＸ
   はグリコールの保護基を表わす）で表わされる化合物を
   脱保護系反応に付することを特徴とする特 （但し１式中Ｒ′およびビは前記と同意義）で表イっさ
   れる置換アルドステロン類の製造方法。 （３）特許請求の範囲（１）記載の置換アルドステロン
   類のうち少なくとも一つを、抗ハプテン抗血清作製用ハ
   プテン、あるいは標識用抗原（トレーサー）として使用
   することを特徴とする血清アルドステロノのイムノアッ
   セイ法。 （４）標識用抗原が放射性ヨウ素で標識されていること
   を特徴とする特許請求の範囲（３）記載のイムノアッセ
   イ法。 （５）標識用抗原が酵素で標識されていることを特徴と
   する特許請求の範囲（３）記載のイムノアッセイ法。 （６）特許請求の範囲（１）記載の置換アルドステロン
   類のうち少なくとも一つを標識用抗原あるいは抗血清作
   製用ハ方ンとして含むことを特徴とする血清アルドステ
   ロン・イムノアッセイ用キッ１−６