JPH05294990A - ジゴキシンの新規誘導体およびそれを用いて調製した抗ジゴキシン抗体 - Google Patents
ジゴキシンの新規誘導体およびそれを用いて調製した抗ジゴキシン抗体Info
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- JPH05294990A JPH05294990A JP12414292A JP12414292A JPH05294990A JP H05294990 A JPH05294990 A JP H05294990A JP 12414292 A JP12414292 A JP 12414292A JP 12414292 A JP12414292 A JP 12414292A JP H05294990 A JPH05294990 A JP H05294990A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ジギトキソースの３′位および３″位にコハ
ク酸がエステル結合したジゴキシン誘導体、およびそれ
らのキャリヤー蛋白結合体の提供。 【構成】 一般式 （Ｒ1およびＲ2は、一方がＨであり、他方が−ＣＯ（Ｃ
Ｈ2）2ＣＯＯＨまたは−ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ−Ｙで
あり、Ｙはキャリヤー蛋白を表す）で示されるジゴキシ
ン誘導体。およびＹがキャリヤー蛋白を表わす該ジゴキ
シン誘導体を動物に免疫することにより得られる抗ジゴ
キシン抗体。 【効果】 上記抗体は免疫測定法によるジゴキシンの定
量に有用である。
ク酸がエステル結合したジゴキシン誘導体、およびそれ
らのキャリヤー蛋白結合体の提供。 【構成】 一般式 （Ｒ1およびＲ2は、一方がＨであり、他方が−ＣＯ（Ｃ
Ｈ2）2ＣＯＯＨまたは−ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ−Ｙで
あり、Ｙはキャリヤー蛋白を表す）で示されるジゴキシ
ン誘導体。およびＹがキャリヤー蛋白を表わす該ジゴキ
シン誘導体を動物に免疫することにより得られる抗ジゴ
キシン抗体。 【効果】 上記抗体は免疫測定法によるジゴキシンの定
量に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジギトキソースの３’
位および３”位にコハク酸がエステル結合したジゴキシ
ンの新規誘導体、およびそれらのキャリヤー蛋白結合体
に関する。更に、このキャリヤー蛋白結合体を抗原物質
として用いて産生したジゴキシン抗体に関するものであ
る。得られたジゴキシン抗体は特異性が極めて高く、免
疫測定法に用いるジゴキシンの定量用試薬として臨床検
査分野で有用である。
位および３”位にコハク酸がエステル結合したジゴキシ
ンの新規誘導体、およびそれらのキャリヤー蛋白結合体
に関する。更に、このキャリヤー蛋白結合体を抗原物質
として用いて産生したジゴキシン抗体に関するものであ
る。得られたジゴキシン抗体は特異性が極めて高く、免
疫測定法に用いるジゴキシンの定量用試薬として臨床検
査分野で有用である。
【０００２】
【従来の技術】強心配糖体の一種であるジゴキシンは強
心薬として心疾患、とくに鬱血性心不全の治療に広く使
われている。しかし、この薬物の有効血中濃度は極めて
低く、且つ狭い治療域のため治療指針として血中のジゴ
キシン濃度を知ることは臨床の場において不可欠であ
る。
心薬として心疾患、とくに鬱血性心不全の治療に広く使
われている。しかし、この薬物の有効血中濃度は極めて
低く、且つ狭い治療域のため治療指針として血中のジゴ
キシン濃度を知ることは臨床の場において不可欠であ
る。
【０００３】ジゴキシンの血中濃度の測定には免疫測定
法が広く利用されているが、用いる抗体の特異性が低い
と、共存する近縁化合物との交叉反応が問題となり正確
な定量ができない。現在、ジゴキシンの測定に使用され
ている免疫測定法においては、主としてジゴキシンの末
端糖とキャリヤー蛋白とを結合させた抗原を用いて抗体
を製造しているため、ジギトキソースが外れたジゴキシ
ン代謝産物との交叉反応が大きな問題である（T.W.Smit
h et al.,Biochemistry, 9, 331(1970);F.I.Marcus et
al.,J. Lab. Clin. Med., 85, 610(1975)）。
法が広く利用されているが、用いる抗体の特異性が低い
と、共存する近縁化合物との交叉反応が問題となり正確
な定量ができない。現在、ジゴキシンの測定に使用され
ている免疫測定法においては、主としてジゴキシンの末
端糖とキャリヤー蛋白とを結合させた抗原を用いて抗体
を製造しているため、ジギトキソースが外れたジゴキシ
ン代謝産物との交叉反応が大きな問題である（T.W.Smit
h et al.,Biochemistry, 9, 331(1970);F.I.Marcus et
al.,J. Lab. Clin. Med., 85, 610(1975)）。
【０００４】一方、ジギトキソースが外れたジゴキシン
代謝産物との交叉反応率の低い抗体の調製に関しては、
ジゴキシンの１２位をキャリヤー蛋白との結合位置とし
た抗原を用いる方法（K. Shimada et al.,Chem. Pharm.
Bull., 32, 2301(1984)）、またジゴキシンのラクトン
環をオゾン分解により開環させ、生じたアルデヒド基と
キャリヤー蛋白のアミノ基を結合させて抗原とする方法
（B. Thong et al.,Clin. Chem., 31, 1625(1985)）等
が報告されている。しかし、これらはジゴキシン代謝産
物として存在量が多く、強心作用が著しく低いジヒドロ
ジゴキシンとの交叉反応率が非常に高いため問題があ
る。
代謝産物との交叉反応率の低い抗体の調製に関しては、
ジゴキシンの１２位をキャリヤー蛋白との結合位置とし
た抗原を用いる方法（K. Shimada et al.,Chem. Pharm.
Bull., 32, 2301(1984)）、またジゴキシンのラクトン
環をオゾン分解により開環させ、生じたアルデヒド基と
キャリヤー蛋白のアミノ基を結合させて抗原とする方法
（B. Thong et al.,Clin. Chem., 31, 1625(1985)）等
が報告されている。しかし、これらはジゴキシン代謝産
物として存在量が多く、強心作用が著しく低いジヒドロ
ジゴキシンとの交叉反応率が非常に高いため問題があ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述したように、これ
までに調製されたジゴキシンに対する抗体は、ジゴキシ
ンの糖鎖部あるいはラクトン環の認識に乏しく、特異性
に欠けていた。そのため、従来の抗体を使用する限りに
おいては、ジゴキシンの血中濃度を正しく把握すること
は困難である。免疫測定法により血中ジゴキシンを正確
に定量するには、特異性の高い抗ジゴキシン抗体を得る
ことが必要である。これに関して、これまで当該技術分
野で強く要望されてきたが、未だ満足し得る抗体は得ら
れていない。
までに調製されたジゴキシンに対する抗体は、ジゴキシ
ンの糖鎖部あるいはラクトン環の認識に乏しく、特異性
に欠けていた。そのため、従来の抗体を使用する限りに
おいては、ジゴキシンの血中濃度を正しく把握すること
は困難である。免疫測定法により血中ジゴキシンを正確
に定量するには、特異性の高い抗ジゴキシン抗体を得る
ことが必要である。これに関して、これまで当該技術分
野で強く要望されてきたが、未だ満足し得る抗体は得ら
れていない。
【０００６】本発明の目的は、ジゴキシンのみに高い特
異性を有する抗体を得るため、ジゴキシンにコハク酸が
結合した新規化合物を合成し、更にキャリヤー蛋白を縮
合させた新規な抗原物質を提供することにある。
異性を有する抗体を得るため、ジゴキシンにコハク酸が
結合した新規化合物を合成し、更にキャリヤー蛋白を縮
合させた新規な抗原物質を提供することにある。
【０００７】本発明の他の目的は、この抗原物質を用い
て抗体を産生させ、ジゴキシンの糖鎖構造およびラクト
ン環の両者を認識する抗体を提供することにある。
て抗体を産生させ、ジゴキシンの糖鎖構造およびラクト
ン環の両者を認識する抗体を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】一般に、特異性に優れた
抗体を得るためには、ハプテンのキャリヤー蛋白との結
合位置が重要である。その結合位置はハプテンの官能基
から離れたところ、つまりハプテンの化学構造上の特徴
が保有されるよう工夫が必要である。本発明者らは、ジ
ゴキシンの代謝産物であるジゴキシゲニンビスジギトキ
シド、ジゴキシゲニンモノジギトキシド、ジゴキシゲニ
ンおよびジヒドロジゴキシンとは交叉反応率が低く、ジ
ゴキシンのみに高い特異性を示す抗体を得るため、結合
位置としてジゴキシンの３’位および３”位に着目し
た。ジゴキシンとキャリヤー蛋白との架橋にはコハク酸
を用い、活性エステル法により抗原を合成した。得られ
た抗原を動物に免疫することにより抗体を調製した。
抗体を得るためには、ハプテンのキャリヤー蛋白との結
合位置が重要である。その結合位置はハプテンの官能基
から離れたところ、つまりハプテンの化学構造上の特徴
が保有されるよう工夫が必要である。本発明者らは、ジ
ゴキシンの代謝産物であるジゴキシゲニンビスジギトキ
シド、ジゴキシゲニンモノジギトキシド、ジゴキシゲニ
ンおよびジヒドロジゴキシンとは交叉反応率が低く、ジ
ゴキシンのみに高い特異性を示す抗体を得るため、結合
位置としてジゴキシンの３’位および３”位に着目し
た。ジゴキシンとキャリヤー蛋白との架橋にはコハク酸
を用い、活性エステル法により抗原を合成した。得られ
た抗原を動物に免疫することにより抗体を調製した。
【０００９】即ち、本発明は下記一般式で表される新規
な化合物である。
な化合物である。
【００１０】
【化１】
【００１１】式中、Ｒ1およびＲ2は次の通りの組み合わ
せであり、Ｙはキャリヤー蛋白を表す。 （I） Ｒ1はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ Ｒ2はＨ （II） Ｒ1はＨ Ｒ2はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ （III） Ｒ1はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨーＹ Ｒ2はＨ （IV） Ｒ1はＨ Ｒ2はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨーＹ
せであり、Ｙはキャリヤー蛋白を表す。 （I） Ｒ1はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ Ｒ2はＨ （II） Ｒ1はＨ Ｒ2はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ （III） Ｒ1はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨーＹ Ｒ2はＨ （IV） Ｒ1はＨ Ｒ2はーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨーＹ
【００１２】本発明の一般式（I）、（II）、（III）、
（IV）で表される化合物は次に示す方法によって製造で
きる。ジゴキシンに無水ピリジン中無水酢酸とギ酸の混
合物を加えて部分的にホルミル化後、精製することなく
無水ピリジン中無水コハク酸にて未反応の水酸基をヘミ
サクシネートに誘導する。ついで、炭酸水素ナトリウム
により保護基のホルミル基を除去し、反応物をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー、更にセファデックスＬＨ
ー２０カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製する
ことによりジゴキシン３’ーヘミサクシネート（I）お
よびジゴキシン３”ーヘミサクシネート（II）を製造で
きる。
（IV）で表される化合物は次に示す方法によって製造で
きる。ジゴキシンに無水ピリジン中無水酢酸とギ酸の混
合物を加えて部分的にホルミル化後、精製することなく
無水ピリジン中無水コハク酸にて未反応の水酸基をヘミ
サクシネートに誘導する。ついで、炭酸水素ナトリウム
により保護基のホルミル基を除去し、反応物をシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー、更にセファデックスＬＨ
ー２０カラムクロマトグラフィーを用いて分離精製する
ことによりジゴキシン３’ーヘミサクシネート（I）お
よびジゴキシン３”ーヘミサクシネート（II）を製造で
きる。
【００１３】（I）および（II）をそれぞれジオキサン
中パラニトロフェノールとカルボジイミドにより活性エ
ステルとし、ウシ血清アルブミンあるいはヒト血清アル
ブミンの如きキャリヤー蛋白と縮合させることにより
（III）および（IV）の抗原を得ることができる。
中パラニトロフェノールとカルボジイミドにより活性エ
ステルとし、ウシ血清アルブミンあるいはヒト血清アル
ブミンの如きキャリヤー蛋白と縮合させることにより
（III）および（IV）の抗原を得ることができる。
【００１４】また、他の発明は抗原（III）および（I
V）を動物に免疫することにより得られる抗ジゴキシン
抗体である。抗原（III）および（IV）をそれぞれアジ
ュバントと混和し、常套手段によってこれらを動物に数
カ月間免疫することにより、動物の血液中に抗ジゴキシ
ン抗体を産生することができる。
V）を動物に免疫することにより得られる抗ジゴキシン
抗体である。抗原（III）および（IV）をそれぞれアジ
ュバントと混和し、常套手段によってこれらを動物に数
カ月間免疫することにより、動物の血液中に抗ジゴキシ
ン抗体を産生することができる。
【００１５】抗原（III）により得られた抗体は、ジゴ
キシゲニンビスジギトキシド（０．６％）、ジゴキシゲ
ニンモノジギトキシド（０．９％）、ジゴキシゲニン
（０．１％）およびジヒドロジゴキシン（２．１％）等
のジゴキシン代謝産物との交叉反応率が極めて低く、ジ
ゴキシンに特異的なものである。
キシゲニンビスジギトキシド（０．６％）、ジゴキシゲ
ニンモノジギトキシド（０．９％）、ジゴキシゲニン
（０．１％）およびジヒドロジゴキシン（２．１％）等
のジゴキシン代謝産物との交叉反応率が極めて低く、ジ
ゴキシンに特異的なものである。
【００１６】一方、抗原（IV）により得られた抗体は、
ジゴキシゲニンビスジギトキシド（８５．６％）、ジゴ
キシゲニンモノジギトキシド（６８．６％）、ジゴキシ
ゲニン（６０．５％）とは高い交叉反応性が見られ、糖
鎖構造の認識に乏しいものであるが、ジヒドロジゴキシ
ン（０．３％）とは交叉反応をほとんど示さない。
ジゴキシゲニンビスジギトキシド（８５．６％）、ジゴ
キシゲニンモノジギトキシド（６８．６％）、ジゴキシ
ゲニン（６０．５％）とは高い交叉反応性が見られ、糖
鎖構造の認識に乏しいものであるが、ジヒドロジゴキシ
ン（０．３％）とは交叉反応をほとんど示さない。
【００１７】
【実施例】以下に本発明の内容を実施例によって更に具
体的に説明するが、これは本発明を何ら限定するもので
ない。
体的に説明するが、これは本発明を何ら限定するもので
ない。
【００１８】実施例１ ジゴキシン３’ーヘミサクシネート（化合物（I））お
よびジゴキシン３”ーヘミサクシネート（化合物（I
I））の製造。ジゴキシン１．０ｇを無水ピリジン１０
ｍｌに溶解し、無水酢酸３ｍｌとギ酸６ｍｌの混液を氷
冷下加え、４時間撹拌した。反応液に水１００ｍｌを加
え、酢酸エチル２００ｍｌで抽出した。酢酸エチル層を
水洗後、減圧下濃縮した。この濃縮物を無水ピリジン２
０ｍｌに溶解し、無水コハク酸３．２ｇを加え、６０〜
７０℃で７３時間加温した。反応液に水１００ｍｌを加
え、酢酸エチル２００ｍｌで抽出した。酢酸エチル層を
水洗後、減圧下濃縮した。
よびジゴキシン３”ーヘミサクシネート（化合物（I
I））の製造。ジゴキシン１．０ｇを無水ピリジン１０
ｍｌに溶解し、無水酢酸３ｍｌとギ酸６ｍｌの混液を氷
冷下加え、４時間撹拌した。反応液に水１００ｍｌを加
え、酢酸エチル２００ｍｌで抽出した。酢酸エチル層を
水洗後、減圧下濃縮した。この濃縮物を無水ピリジン２
０ｍｌに溶解し、無水コハク酸３．２ｇを加え、６０〜
７０℃で７３時間加温した。反応液に水１００ｍｌを加
え、酢酸エチル２００ｍｌで抽出した。酢酸エチル層を
水洗後、減圧下濃縮した。
【００１９】この濃縮物をメタノール１００ｍｌに溶解
し、５％炭酸水素ナトリウム溶液１３０ｍｌを加え、６
０〜７０℃で３時間加温した。反応液中のメタノールを
減圧留去した後、酢酸エチル２００ｍｌで抽出した。酢
酸エチル層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、減
圧下濃縮した。得られた濃縮物１．０ｇをクロロホル
ム：メタノール：酢酸（９０：１０：０．８）の溶媒系
を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８２．
５×１．５ｃｍ，ｉ．ｄ．）に付し、ジゴキシン３’ー
ヘミサクシネート画分およびジゴキシン３”ーヘミサク
シネート画分を得た。
し、５％炭酸水素ナトリウム溶液１３０ｍｌを加え、６
０〜７０℃で３時間加温した。反応液中のメタノールを
減圧留去した後、酢酸エチル２００ｍｌで抽出した。酢
酸エチル層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、減
圧下濃縮した。得られた濃縮物１．０ｇをクロロホル
ム：メタノール：酢酸（９０：１０：０．８）の溶媒系
を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィー（８２．
５×１．５ｃｍ，ｉ．ｄ．）に付し、ジゴキシン３’ー
ヘミサクシネート画分およびジゴキシン３”ーヘミサク
シネート画分を得た。
【００２０】更に、得られたジゴキシン３’ーヘミサク
シネート画分をクロロホルム：メタノール：酢酸（９
０：１０：０．８）の溶媒系を用いるシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．
ｄ．）に再度付して精製し、ジゴキシン３’ーヘミサク
シネートを分画した。溶媒留去後、濃縮物をメタノール
を溶出液とするセファデックスＬＨー２０のカラムクロ
マトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．ｄ．）に
付して純化した。溶出画分を濃縮後、アセトンーヘキサ
ンにより沈殿させ、純粋な無色無晶形物質としてジゴキ
シン３’ーヘミサクシネート（化合物（I），４６．９
ｍｇ）を得た。
シネート画分をクロロホルム：メタノール：酢酸（９
０：１０：０．８）の溶媒系を用いるシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．
ｄ．）に再度付して精製し、ジゴキシン３’ーヘミサク
シネートを分画した。溶媒留去後、濃縮物をメタノール
を溶出液とするセファデックスＬＨー２０のカラムクロ
マトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．ｄ．）に
付して純化した。溶出画分を濃縮後、アセトンーヘキサ
ンにより沈殿させ、純粋な無色無晶形物質としてジゴキ
シン３’ーヘミサクシネート（化合物（I），４６．９
ｍｇ）を得た。
【００２１】得られた化合物（I）は、 融点 １７５〜１７８℃ 旋光度
【記１】 ＋３９．４゜（ｃ＝０．２７，メタノール） 元素分析 計算値（Ｃ45Ｈ68Ｏ17） Ｃ ６１．３５ Ｈ ７．７８ 測定値 Ｃ ６１．４１ Ｈ ７．４８ 紫外吸収
【記２】 ：２１８（１５０００） 核磁気共鳴 1ＨーＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤーＣＤＣｌ3） δ ０．７８（３Ｈ，ｓ，１８ーＣＨ3） δ ０．９４（３Ｈ，ｓ，１９ーＣＨ3） δ １．１６〜１．２５（９Ｈ，ｍ，ｓｕｇａｒーＣＨ
3） δ ２．５２〜２．６４（４Ｈ，ｍ，ーＣＯ（ＣＨ2）2
ＣＯー） δ ４．９４（２Ｈ，ｍ，２１ーＣＨ2） δ ５．９０（１Ｈ，ｓ，２２ーＨ） 質量分析 ＦＡＢーＭＳ（ｍ／ｚ） ９０３（［Ｍ＋Ｎａ］+） ６２１（［Ｍーｔｗｏ ｄｉｇｉｔｏｘｏｓｅｓ＋２
Ｈ］+） であった。
3） δ ２．５２〜２．６４（４Ｈ，ｍ，ーＣＯ（ＣＨ2）2
ＣＯー） δ ４．９４（２Ｈ，ｍ，２１ーＣＨ2） δ ５．９０（１Ｈ，ｓ，２２ーＨ） 質量分析 ＦＡＢーＭＳ（ｍ／ｚ） ９０３（［Ｍ＋Ｎａ］+） ６２１（［Ｍーｔｗｏ ｄｉｇｉｔｏｘｏｓｅｓ＋２
Ｈ］+） であった。
【００２２】化合物（I）中のジゴキシンとコハク酸と
の結合位置は、化合物（I）の上記ＦＡＢーＭＳにより
ジゴキシゲニンモノジギトキシドのヘミサクシネートに
基づくフラグメントイオンピークが観察されたこと、並
びに化合物（I ）の緩和な条件下、０．０５ｍｏｌ／ｌ
塩酸を用いる限定加水分解によりジゴキシゲニンが得ら
れ、ジゴキシゲニン１２ーヘミサクシネートは確認され
なかったことの両者の事実からジキトキソースの３’位
と決定した。
の結合位置は、化合物（I）の上記ＦＡＢーＭＳにより
ジゴキシゲニンモノジギトキシドのヘミサクシネートに
基づくフラグメントイオンピークが観察されたこと、並
びに化合物（I ）の緩和な条件下、０．０５ｍｏｌ／ｌ
塩酸を用いる限定加水分解によりジゴキシゲニンが得ら
れ、ジゴキシゲニン１２ーヘミサクシネートは確認され
なかったことの両者の事実からジキトキソースの３’位
と決定した。
【００２３】前述のシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーにより得られたジゴキシン３”ーヘミサクシネート溶
出画分は、更にクロロホルム：メタノール：酢酸（９
０：１０：０．８）の溶液系を用いるシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．
ｄ．）に再度付して精製し、ジゴキシン３”ーヘミサク
シネートを分画した。溶媒留去後、濃縮物をメタノール
を溶出液とするセファデックスＬＨー２０のカラムクロ
マトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．ｄ．）に
付して純化した。溶出画分を濃縮後、アセトンーヘキサ
ンにより沈殿させ、純粋な無色無晶形物質としてジゴキ
シン３”ーヘミサクシネート（化合物（II），７０．５
ｍｇ）を得た。
ーにより得られたジゴキシン３”ーヘミサクシネート溶
出画分は、更にクロロホルム：メタノール：酢酸（９
０：１０：０．８）の溶液系を用いるシリカゲルカラム
クロマトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．
ｄ．）に再度付して精製し、ジゴキシン３”ーヘミサク
シネートを分画した。溶媒留去後、濃縮物をメタノール
を溶出液とするセファデックスＬＨー２０のカラムクロ
マトグラフィー（８２．５×１．５ｃｍ，ｉ．ｄ．）に
付して純化した。溶出画分を濃縮後、アセトンーヘキサ
ンにより沈殿させ、純粋な無色無晶形物質としてジゴキ
シン３”ーヘミサクシネート（化合物（II），７０．５
ｍｇ）を得た。
【００２４】得られた化合物（II）は、 融点 １７６〜１７９℃ 旋光度
【記１】＋３７．７゜（ｃ＝０．２７，メタノール） 元素分析 計算値（Ｃ45Ｈ68Ｏ17） Ｃ ６１．３５ Ｈ ７．７８ 測定値 Ｃ ６１．０７ Ｈ ８．０１ 紫外吸収
【記２】：２１８（１４７００） 核磁気共鳴 1ＨーＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤーＣＤＣｌ3） δ ０．７８（３Ｈ，ｓ，１８ーＣＨ3） δ ０．９５（３Ｈ，ｓ，１９ーＣＨ3） δ １．１８〜１．２５（９Ｈ，ｍ，ｓｕｇａｒーＣＨ
3） δ ２．５６〜２．６３（４Ｈ，ｍ，ーＣＯ（ＣＨ2）2
ＣＯー） δ ４．９４（２Ｈ，ｍ，２１ーＣＨ2） δ ５．９０（１Ｈ，ｓ，２２ーＨ） 質量分析 ＦＡＢーＭＳ（ｍ／ｚ） ９０３（［Ｍ＋Ｎａ］+） であった。
3） δ ２．５６〜２．６３（４Ｈ，ｍ，ーＣＯ（ＣＨ2）2
ＣＯー） δ ４．９４（２Ｈ，ｍ，２１ーＣＨ2） δ ５．９０（１Ｈ，ｓ，２２ーＨ） 質量分析 ＦＡＢーＭＳ（ｍ／ｚ） ９０３（［Ｍ＋Ｎａ］+） であった。
【００２５】化合物（II）中のジゴキシンとコハク酸と
の結合位置は、化合物（II）の緩和な条件下０．０５ｍ
ｏｌ／ｌ塩酸を用いる限定加水分解によりジゴキシゲニ
ンおよびジゴキシゲニンモノジギトキシドが得られ、ジ
ゴキシゲニンビスジギトキシドは確認されなかったこと
の事実から、ジギトキソースの３”位と決定した。
の結合位置は、化合物（II）の緩和な条件下０．０５ｍ
ｏｌ／ｌ塩酸を用いる限定加水分解によりジゴキシゲニ
ンおよびジゴキシゲニンモノジギトキシドが得られ、ジ
ゴキシゲニンビスジギトキシドは確認されなかったこと
の事実から、ジギトキソースの３”位と決定した。
【００２６】実施例２ ジゴキシン３’ーヘミサクシネートのウシ血清アルブミ
ン結合体（化合物（III））およびジゴキシン３”ーヘ
ミサクシネートのウシ血清アルブミン結合体（化合物
（IV））の製造。ジゴキシン３’ーヘミサクシネート
（化合物（I））８３．４ｍｇをジオキサン１３ｍｌに
溶解し、パラニトロフェノール１２０ｍｇおよびジシク
ロヘキシルカルボジイミド６８ｍｇを加え、室温で４時
間撹拌した。反応液を濃縮後、残留物をクロロホルム：
メタノール（９３：７）の展開溶媒を用いる分取用シリ
カゲル薄層クロマトグラフィーに付した。Ｒｆ値０．０
９〜０．２２の部分をかきとり、クロロホルム：メタノ
ール（９３：７）１００ｍｌで抽出した。
ン結合体（化合物（III））およびジゴキシン３”ーヘ
ミサクシネートのウシ血清アルブミン結合体（化合物
（IV））の製造。ジゴキシン３’ーヘミサクシネート
（化合物（I））８３．４ｍｇをジオキサン１３ｍｌに
溶解し、パラニトロフェノール１２０ｍｇおよびジシク
ロヘキシルカルボジイミド６８ｍｇを加え、室温で４時
間撹拌した。反応液を濃縮後、残留物をクロロホルム：
メタノール（９３：７）の展開溶媒を用いる分取用シリ
カゲル薄層クロマトグラフィーに付した。Ｒｆ値０．０
９〜０．２２の部分をかきとり、クロロホルム：メタノ
ール（９３：７）１００ｍｌで抽出した。
【００２７】抽出溶媒を減圧留去し、油状物質としてジ
ゴキシン３’ーヘミサクシネートのパラニトロフェニル
エステル９０ｍｇを得た。この化合物３３ｍｇをピリジ
ン０．８ｍｌに溶解し、ウシ血清アルブミン４０ｍｇを
０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８
ｍｌに溶かした溶液を加え、室温で７時間撹拌した。反
応液をセロハンチューブに入れ、水を用いて４℃で２４
時間透析した後、凍結乾燥することにより、無色粉末と
してジゴキシン３’ーヘミサクシネートのウシ血清アル
ブミン結合体（化合物（III），４９．２ｍｇ）を得
た。
ゴキシン３’ーヘミサクシネートのパラニトロフェニル
エステル９０ｍｇを得た。この化合物３３ｍｇをピリジ
ン０．８ｍｌに溶解し、ウシ血清アルブミン４０ｍｇを
０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８
ｍｌに溶かした溶液を加え、室温で７時間撹拌した。反
応液をセロハンチューブに入れ、水を用いて４℃で２４
時間透析した後、凍結乾燥することにより、無色粉末と
してジゴキシン３’ーヘミサクシネートのウシ血清アル
ブミン結合体（化合物（III），４９．２ｍｇ）を得
た。
【００２８】ジゴキシン３”ーヘミサクシネート（化合
物（II））６７．１ｍｇをジオキサン１５ｍｌに溶解
し、パラニトロフェノール４５ｍｇおよびジシクロヘキ
シルカルボジイミド６５ｍｇを加え、室温で３時間撹拌
した。反応液を濃縮後、残留物をクロロホルム：メタノ
ール（９３：７）の展開溶媒を用いる分取用シリカゲル
薄層クロマトグラフィーに付した。Ｒｆ値０．１１〜
０．２７の部分をかきとり、クロロホルム：メタノール
（９３：７）１００ｍｌで抽出した。
物（II））６７．１ｍｇをジオキサン１５ｍｌに溶解
し、パラニトロフェノール４５ｍｇおよびジシクロヘキ
シルカルボジイミド６５ｍｇを加え、室温で３時間撹拌
した。反応液を濃縮後、残留物をクロロホルム：メタノ
ール（９３：７）の展開溶媒を用いる分取用シリカゲル
薄層クロマトグラフィーに付した。Ｒｆ値０．１１〜
０．２７の部分をかきとり、クロロホルム：メタノール
（９３：７）１００ｍｌで抽出した。
【００２９】抽出溶媒を減圧留去し、油状物質としてジ
ゴキシン３”ーヘミサクシネートのパラニトロフェニル
エステル６７．５ｍｇを得た。この化合物６５ｍｇをピ
リジン０．７ｍｌに溶解し、ウシ血清アルブミン６７．
５ｍｇを０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）０．７ｍｌに溶かした溶液を加え、室温で７時間撹
拌した。反応液をセロハンチューブに入れ、水を用いて
４℃で２４時間透析した後、凍結乾燥することにより無
色粉末としてジゴキシン３”ーヘミサクシネートのウシ
血清アルブミン結合体（化合物（IV），１０７ｍｇ）を
得た。
ゴキシン３”ーヘミサクシネートのパラニトロフェニル
エステル６７．５ｍｇを得た。この化合物６５ｍｇをピ
リジン０．７ｍｌに溶解し、ウシ血清アルブミン６７．
５ｍｇを０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）０．７ｍｌに溶かした溶液を加え、室温で７時間撹
拌した。反応液をセロハンチューブに入れ、水を用いて
４℃で２４時間透析した後、凍結乾燥することにより無
色粉末としてジゴキシン３”ーヘミサクシネートのウシ
血清アルブミン結合体（化合物（IV），１０７ｍｇ）を
得た。
【００３０】実施例３ 化合物（III）および化合物（IV）の免疫による抗体の
産生。実施例２で得たウシ血清アルブミン結合体（化合
物（III））４ｍｇを生理食塩水１．６ｍｌおよびフロ
インド完全アジュバント２．４ｍｌに乳濁させ、これを
オスの日本白色家兎４羽の背部数十箇所に皮下注射し
た。以後、この操作を２週間おきに７回繰り返した。最
終投与の７日後に家兎より全採血し、１０分間遠心分離
することにより抗血清を得、ジゴキシンに対する抗体を
産生させた。
産生。実施例２で得たウシ血清アルブミン結合体（化合
物（III））４ｍｇを生理食塩水１．６ｍｌおよびフロ
インド完全アジュバント２．４ｍｌに乳濁させ、これを
オスの日本白色家兎４羽の背部数十箇所に皮下注射し
た。以後、この操作を２週間おきに７回繰り返した。最
終投与の７日後に家兎より全採血し、１０分間遠心分離
することにより抗血清を得、ジゴキシンに対する抗体を
産生させた。
【００３１】ウシ血清アルブミン結合体（化合物（I
V））も前述と同様な方法により家兎に免疫し、ジゴキ
シンに対する抗体を産生させた。
V））も前述と同様な方法により家兎に免疫し、ジゴキ
シンに対する抗体を産生させた。
【００３２】化合物（III）および化合物（IV）の免疫
により産生した抗体の性質。抗体の性質は、ラジオイム
ノアッセイを用いて検討した。標識化合物としては3Ｈ
ージゴキシン（比放射能２２．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を使
い、ウシガンマグロブリン０．２％を含む０．０１ｍｏ
ｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で測定操作を行っ
た。ジゴキシン標準溶液０．１ｍｌに約１００００ｄｐ
ｍの3Ｈージゴキシン０．１ｍｌおよび希釈抗血清０．
５ｍｌを加え、４℃で１５時間インキュベーションし
た。ついで、デキストラン炭末懸濁液０．３ｍｌを加
え、４℃で１０分間放置し、１７００×Ｇで１０分間遠
心分離して得られた上澄液０．５ｍｌの放射活性を液体
シンチレーションカウンターにより測定した。
により産生した抗体の性質。抗体の性質は、ラジオイム
ノアッセイを用いて検討した。標識化合物としては3Ｈ
ージゴキシン（比放射能２２．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を使
い、ウシガンマグロブリン０．２％を含む０．０１ｍｏ
ｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で測定操作を行っ
た。ジゴキシン標準溶液０．１ｍｌに約１００００ｄｐ
ｍの3Ｈージゴキシン０．１ｍｌおよび希釈抗血清０．
５ｍｌを加え、４℃で１５時間インキュベーションし
た。ついで、デキストラン炭末懸濁液０．３ｍｌを加
え、４℃で１０分間放置し、１７００×Ｇで１０分間遠
心分離して得られた上澄液０．５ｍｌの放射活性を液体
シンチレーションカウンターにより測定した。
【００３３】抗体の特異性は、４種のジゴキシン代謝産
物およびスピロノラクトン、ジギトキソース、プロゲス
テロン、テストステロン、コレステロールを用いて交叉
反応率を調査することによって行った。当該抗体への3
Ｈージゴキシンの結合量を５０％にするジゴキシンの量
と各種化合物の量を求め、その割合を百分率で表示して
交叉反応率とした。また親和定数はＳｃａｔｃｈａｒｄ
プロットより求めた。
物およびスピロノラクトン、ジギトキソース、プロゲス
テロン、テストステロン、コレステロールを用いて交叉
反応率を調査することによって行った。当該抗体への3
Ｈージゴキシンの結合量を５０％にするジゴキシンの量
と各種化合物の量を求め、その割合を百分率で表示して
交叉反応率とした。また親和定数はＳｃａｔｃｈａｒｄ
プロットより求めた。
【００３４】化合物（III）の免疫により産生した抗体
について。 最適な最終希釈倍率 ２１００倍 親和定数 １．８×１０9ｌ／ｍｏｌ 測定範囲 ０．２〜２０ｎｇ／ｍｌのジゴキシン 交叉反応性（交叉反応率％） ジゴキシン １００％ ジゴキシゲニンビスジギトキシド ０．６％ ジゴキシゲニンモノジギトキシド ０．９％ ジゴキシゲニン ０．１％ ジヒドロジゴキシン ２．１％ スピロノラクトン ＜０．０５％ ジギトキソース ＜０．０５％ プロゲステロン ＜０．０５％ テストステロン ＜０．０５％ コレステロール ＜０．０５％ 上記の交叉反応率から明らかな如く、この抗体はジゴキ
シン代謝産物を良く識別し、ジゴキシンに対して極めて
高い反応特異性を示した。
について。 最適な最終希釈倍率 ２１００倍 親和定数 １．８×１０9ｌ／ｍｏｌ 測定範囲 ０．２〜２０ｎｇ／ｍｌのジゴキシン 交叉反応性（交叉反応率％） ジゴキシン １００％ ジゴキシゲニンビスジギトキシド ０．６％ ジゴキシゲニンモノジギトキシド ０．９％ ジゴキシゲニン ０．１％ ジヒドロジゴキシン ２．１％ スピロノラクトン ＜０．０５％ ジギトキソース ＜０．０５％ プロゲステロン ＜０．０５％ テストステロン ＜０．０５％ コレステロール ＜０．０５％ 上記の交叉反応率から明らかな如く、この抗体はジゴキ
シン代謝産物を良く識別し、ジゴキシンに対して極めて
高い反応特異性を示した。
【００３５】化合物（IV）の免疫により産生した抗体に
ついて。 最適な最終希釈倍率 ５３００倍 親和定数 ４．１×１０8ｌ／ｍｏｌ 測定範囲 ０．２〜２０ｎｇ／ｍｌのジゴキシン 交叉反応性（交叉反応率％） ジゴキシン １００％ ジゴキシゲニンビスジギトキシド ８５．６％ ジゴキシゲニンモノジギトキシド ６８．６％ ジゴキシゲニン ６０．５％ ジヒドロジゴキシン ０．３％ スピロノラクトン ＜０．０５％ ジギトキソース ＜０．０５％ プロゲステロン ＜０．０５％ テストステロン ＜０．０５％ コレステロール ＜０．０５％ 上記の交叉反応率から明らかな如く、この抗体はジゴキ
シンの糖鎖構造の認識に欠けているが、ジヒドロジゴキ
シンおよびその他の化合物に対しては良く識別してい
る。
ついて。 最適な最終希釈倍率 ５３００倍 親和定数 ４．１×１０8ｌ／ｍｏｌ 測定範囲 ０．２〜２０ｎｇ／ｍｌのジゴキシン 交叉反応性（交叉反応率％） ジゴキシン １００％ ジゴキシゲニンビスジギトキシド ８５．６％ ジゴキシゲニンモノジギトキシド ６８．６％ ジゴキシゲニン ６０．５％ ジヒドロジゴキシン ０．３％ スピロノラクトン ＜０．０５％ ジギトキソース ＜０．０５％ プロゲステロン ＜０．０５％ テストステロン ＜０．０５％ コレステロール ＜０．０５％ 上記の交叉反応率から明らかな如く、この抗体はジゴキ
シンの糖鎖構造の認識に欠けているが、ジヒドロジゴキ
シンおよびその他の化合物に対しては良く識別してい
る。
【００３６】
【発明の効果】上記実施例からも明らかなように、合成
した新規化合物のジゴキシン３’ーヘミサクシネートお
よびジゴキシン３”ーヘミサクシネートから誘導した抗
原を用いて、抗ジゴキシン抗体を産生できた。これらの
抗体は、免疫測定法によるジゴキシンの定量に有用であ
り、本発明は産業上極めて有意義なものである。特に、
ジゴキシン３’ーヘミサクシネートのキャリヤー蛋白結
合体から得られた抗体は、従来の抗体より特異性が格段
に優れており、臨床検査試薬として非常に期待される。
した新規化合物のジゴキシン３’ーヘミサクシネートお
よびジゴキシン３”ーヘミサクシネートから誘導した抗
原を用いて、抗ジゴキシン抗体を産生できた。これらの
抗体は、免疫測定法によるジゴキシンの定量に有用であ
り、本発明は産業上極めて有意義なものである。特に、
ジゴキシン３’ーヘミサクシネートのキャリヤー蛋白結
合体から得られた抗体は、従来の抗体より特異性が格段
に優れており、臨床検査試薬として非常に期待される。
Claims (3)
- 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、Ｒ1およびＲ2は、一方がＨであり、他方がーＣ
Ｏ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨを表す）で示されるジゴキシン誘
導体。 - 【請求項２】 Ｒ1およびＲ2は、一方がＨであり、他方
がーＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＮＨーＹであり、Ｙはキャリヤ
ー蛋白を表す請求項１記載のジゴキシン誘導体。 - 【請求項３】 請求項２のジゴキシン誘導体を動物に免
疫することにより得られる抗ジゴキシン抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12414292A JPH05294990A (ja) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | ジゴキシンの新規誘導体およびそれを用いて調製した抗ジゴキシン抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12414292A JPH05294990A (ja) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | ジゴキシンの新規誘導体およびそれを用いて調製した抗ジゴキシン抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05294990A true JPH05294990A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=14877970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12414292A Pending JPH05294990A (ja) | 1992-04-16 | 1992-04-16 | ジゴキシンの新規誘導体およびそれを用いて調製した抗ジゴキシン抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05294990A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112552367A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-26 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种地高辛衍生物及其制备方法 |
-
1992
- 1992-04-16 JP JP12414292A patent/JPH05294990A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112552367A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-26 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种地高辛衍生物及其制备方法 |
| CN112552367B (zh) * | 2020-12-11 | 2023-06-06 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种地高辛衍生物及其制备方法 |
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