JPH0679027B2 - アルドステロンのイムノアツセイおよびそのためのキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はアルドステロン（以下、ALDと略称することあ
り）の測定に有用な免疫測定方法に関し、本発明者らが
先に発明し、特開昭63−60996号において開示された、
新規な置換アルドステロン類を使用するラジオ免疫測定
方法（以下、RIAと略称することあり）、あるいはエン
ザイム免疫測定方法（以下、EIAと略称することにあ
り）に係るものである。

［従来技術とその問題点］ 従来、ALDの測定はステロイドホルモン測定のうちで最
も困難なものの一つで、公知の免疫測定方法はその特性
において必ずしも充分なものとは言い難かつた。

すなわち、免疫測定方法の良否は使用する抗ハプテン抗
血清の適否に大きく支配されるが、この抗血清の特性
は、免疫原の構造によつて左右される。抗ハプテン抗血
清の場合、その免疫原としての化合物は官能基が出来る
限り遊離の状態のものが望ましいと言われている。

これまで報告されているALDのハプテンとしては、その2
1−ヘキサクシネート、３−（Ｏ−カルボキシメチル）
オキシムおよび、18、21−ビスヘキサクシネートなどが
挙げられるが、いずれもALD自体の官能基の一部がブロ
ツクされた形のもので、必ずしも満足なハプテンとは言
えない。

［問題点を解決するための手段］ 上記の状況にかんがみ、本発明者らは、ALDのすべての
官能基が遊離の状態にあるハプテンの合成を試みてこれ
に成功し、上記ハプテンおよびその製造方法、上記ハプ
テンを含有するALD検査用試薬を特願昭62−117581号と
して特許出願し、その内容は特開昭63−60996号により
開示された。

本発明は、上記ハプテンを使用するALDのRIA法あるいは
EIA法およびこれらのものに加えて標準ALDを組合せたRI
AあるいはEIA用キツトを意図するものである。

したがつて本発明によれば、式 （但し、式中R¹およびR²のいずれか一方は水素、R¹が水
素のときR²は−Ｓ−（CH₂）_1-3COR³または−Ｏ−CO−
（CH₂）_1-5COR³で表わされる基、R²が水素のときR¹は−
Ｓ−（CH₂）_1-3COR³で表わされる基、ここでR³はヒドロ
キシ基、またはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラ
ミン残基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒスタ
ミン残基、ヒスチジン残基あるいは７−アミノヘプタノ
イルチロシン低級アルキルエステル残基を表わす。）で
表わされる置換アルドステロン類のうち少なくとも一つ
を、抗ハプテン抗血清作製用ハプテン、あるいは標識用
抗原（トレーサー）として使用することを特徴とする血
清アルドステロンの免疫測定方法が提供される。

また、本発明の別の側面によれば、前記置換ALD類のう
ち少なくとも一つを標識用抗原あるいは抗血清作製用ハ
プテンとして含むことを特徴とする血清アルドステロン
・免疫測定用キツトが提供される。

RIAの場合、標識用抗原が放射性ヨウ素で標識されてい
ることが好ましく、EIAの場合、標識用抗原が酵素で標
識されていることは言うまでもない。

本免疫測定方法において、これらの置換ALD（Ｉ）のう
ち、R³が水酸基である化合物（Ｉ）（R³＝OH）を、タン
パク質たとえば牛血清アルブミン（BSA）と結合させた
もの（BSAコンジユゲート）は、これを抗原（免疫原）
として、たとえば家兎を免疫、つまり数回繰返し注射し
たのち、その家兎より採血して抗ALD抗血清とする。ま
た他のタンパク質すなわち標識用酵素たとえばホースラ
デイシユ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスフアター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼあるいはグルコシダーゼ
などと結合させて、EIA用標識体とすることができる。

これらのために用いる混酸無水物法は、置換アルドステ
ロン（Ｉ）（R³＝Ｈ）を、たとえばジオキサンに溶か
し、之にトリ−ｎ−ブチルアミンおよびイソブチルクロ
ルカーボネートを加え、８〜10℃で30分間撹拌すると、
化合物（Ｉ）−COOCOOC₄H₉の活性エステルができる。こ
れにBSAの含水ジオキサン溶液（NaOHでpH8.5に調整）を
加え、撹拌をつづけると化合物（Ｉ）のBSAコンジユゲ
ートが得られる方法である。

之に対し、冷水中での透析、pHの調整、遠心分離による
沈渣の採取、採取した沈渣の重曹溶液による溶解、冷水
中での再透析などの精製操作を施して免疫原とする。

このほか、カルボジイミド法（エチルカルボジイミドま
たはモルホカルボジイミドを用いる）あるいはイソキサ
ゾリウム法も用いられる。

また、これらの方法は、次の酵素で標識する場合も全く
同様に利用される。BSAが酵素とおき代るだけである。
（たとえば鎮目和夫他編［新版ラジオイムノアツセイ」
朝倉書店1977年刊行、および石川栄治他「酵素免疫測定
法」医学書院1978年刊行参照） また標識用抗原は、EIAの場合には、前記化合物（Ｉ）
のうちR³が水酸基であるものを、公知の慣用方法、たと
えば活性エステル法によつて酵素で標識して作製する。

RIAの場合には、前記化合物（Ｉ）のうちR³が水酸基以
外のものをそれ自体公知の慣用手段、たとえばクロラミ
ンＴ法あるいは酵素法などにより放射性ヨウ素（¹²⁵Iま
たは¹³¹I）によつて標識して作製する。

標識にはクロラミンＴでヨウ素イオンを酸化するか、過
酸化水素とラクトペルオキシダーゼとの組合せで酸化し
て得た原子状ヨウ素を利用して、たとえばヒドロキシフ
エニルのメタ位にヨウ素を導入する方法が採用される
（前記「新版ラジオイムノアツセイ」参照）。

イムノアツセイ法はそれ自体公知の方法に従つて行な
い、EIAの場合には、たとえば螢光強度測定における、
標識液と被測定血清との測定値を比較することによつて
定量する。

RIAの場合には、たとえばウエル型シンチレーシヨン・
カウンターで測定した標準液と被検血清の放射活性との
対比によつて求める。

本発明によつて提供される免疫測定用キツトには標準
物質としてのALDと化合物（Ｉ）の放射化あるいは酵
素標識物または化合物（Ｉ）より得た抗血清が含まれ
る。後二者のうちいずれかは公知のALD誘導体由来のも
のでもよい。その他所望に応じ、緩衝液、F/B（遊離型
／結合型）分離試薬［たとえばPEGあるいは第２抗体
（２抗体法で前記を第１抗体とする場合）］を含むも
のであつてもよい。

前記したように、本発明によれば、感度、交叉反応性に
おいてすぐれた免疫測定方法を実施しうることが判明
し、次記実施例の記載において更に詳細に説明するよう
に、本発明の公知技術に対する優位性が裏付けられた。

実施例１ 置換ALD（Ｉ）（R¹＝SCH₂COOH,R²＝Ｈ）による免疫原お
よび抗血清の作製 ｉ）免疫原 置換ALD（Ｉ）（R¹＝SCH₂COOH,R²＝Ｈ）18mgをジオキサ
ン500μｌに溶かし10〜12℃に保ちながらトリブチルア
ミン9.3μｌとイソブチルクロルカーボネート4.9μｌを
加え,30分間撹拌して活性エステル液とする。一方，牛
血清アルブミン（BSA）69mgを水2mlに溶かし，ジオキサ
ン2mlを加えて混和したのち,1N−水酸化ナトリウムでpH
8.5に調整する。これに，上記エステル液を氷冷下に滴
下したのち，さらにpH8.5に保ちながら４時間撹拌を続
けてカツプリングさせ，水に対して透析し，つづいて凍
結乾燥し，標記化合物（Ｉ）BSAコンジユゲート50mgを
得た。

担体タンパクに対するハプテンの結合モル比は15であつ
た。

ii）抗血清 前記免疫原250μｇを生理食塩液250μｌに溶かし，フロ
イント・コンプリート・アジユバント250μｌを加えエ
マルジヨンとする。これを家兎の背部に皮内注射し，こ
れを３時間間隔で５回繰返す。最終免疫後10日目に全採
血して抗血清を得た。

この抗血清の力価を，後述のRIA系で測定したところ,
¹²⁵I標識ALD2.2×10⁴dpmの50％を結合させるのに要する
抗血清の希釈倍数で表わした値で,4.6×10⁴倍であつ
た。

実施例２ 置換ALD（Ｉ）（R¹＝SCH₂CONHCH₂CH₂（C₆H₄）OH,R²＝
Ｈ）の標識 置換ALD（Ｉ）（R¹＝SCH₂CONHCH₂CH₂（C₆H₄）OH,R²＝
Ｈ）500ng,ジメチルホルムアミド５μl,0.5M−リン酸緩
衝液（pH7.5）25μｌおよび¹²⁵I−ヨウ化ナトリウム1mC
iをガラスチユーブに入れ，ここにクロラミンT20μｇを
含むリン酸緩衝液（pH7.5）５μｌを加え，室温で45秒
間撹拌したのち，メタ重亜硫酸ナトリウム100μｇを含
む水溶液５μｌを加えて反応を停止させた。

これにヨウ化カリウム500μｇを加え，ジクロルメタン1
mlで抽出，硫酸ナトリウムで乾燥後クロマトグラフイー
（セフアデツクスLH−20,0.7cmφ×20cm,ジクロルメタ
ン：メタノール＝9:1）を行ない,1000−1500μCi/μｇ
の標記化合物を得た。クロマトグラム（溶出曲線）は第
１図に示す通りであつた。

実施例２−１ 前記実施例２前半の記載にしたがつて、標記置換ALD
（Ｉ）の標識を行つた。標識物は，それぞれクロマトグ
ラフイ（セフアデツクスLH−20,9mmφ×90mm,エタノー
ル−M/10 クエン酸緩衝液、pH2.2）によつて精製し，
放射活性500μCi/μｇのチロシンメチルエステル体およ
び同400μCi/μｇのヒスタミン体を得た。クロマトグラ
ム（溶出曲線）を，それぞれ第５および６図に示す。

実施例 ３ 置換ALD（Ｉ）［（R¹＝H,R²＝βおよびα・OCOCH₂−CH₂
COOH）］による免疫原および抗血清の作製 ｉ）免疫原： 標記置換ALD（Ｉ）を，個別に実施例１記載の方法と同
様の方法に従つて処理し，それぞれ（Ｉ）（R¹＝H,R²＝
β・OCOCH₂CH₂COOH）−BSAおよび（Ｉ）（R¹＝H,R²＝α
・OCOCH₂−CH₂COOH）−BSAコンジユゲートを得た。出発
物質14.5mgから得られたコンジユゲートの量は，それぞ
れ65mg,68mgであつた。また担体タンパクに対するハプ
テンの結合モル比は，それぞれ11および20であつた。

ii）抗血清 前記免疫原を用いて実施例1,ii）記載と同様の方法で免
疫を行い，抗血清を得た。これらの抗血清の力価を前記
と同一表現で示すと，それぞれ９×10⁴倍および６×10⁴
倍であつた。

実施例 ４¹²⁵ Iによる置換ALD（Ｉ）［（R¹＝H,R²＝βまたはα・O
COCH₂−CH₂CONHCH₂CH₂（C₆H₄）OH）］の標識 置換ALD（Ｉ）［（R¹＝H,R²＝βまたはα・OCOCH₂−CH₂
CONHCH₂CH₂（C₆H₄）OH）］に実施例２と同様の操作を施
して、それぞれ¹²⁵I（Ｉ）（R¹＝H,R²＝β・OCOCH₂−CH
₂CONHCH₂CH₂（C₆H₄）OH）330μCiおよび¹²⁵I（Ｉ）（R¹
＝H,R²＝α・OCOCH₂−CH₂CONHCH₂CH₂（C₆H₄）OH）600μ
Ciを得た。クロマトグラム（溶出曲線）はそれぞれ第２
図および第３図に示す通りであつた。

参考例１ 実施例２および４に記載したALD標識化合物のほか，公
知の11β,18−エポキシ,18α,21−ジヒドロキシ−４−
プレグネン−3,20−ジオン＝３−｛Ｏ−［Ｎ−（ｐ−ヒ
ドロキシフエネチル）カルバモイルメチル］オキシム｝
（VI）をクロラミンＴ法によりヨウ素化して¹²⁵I−（V
I）を作製し，その比放射能が680Ci/mmolであることを
確認した。

実施例５ 血清ALDのRIA １）操作法 血清100μｌを試験管に採取し，上記実施例２および４
ならびに参考例１のいずれかによつて得た¹²⁵I標識ALD
（2.2×10⁴dpm）を含む緩衝液（0.1％牛血清γ−グロブ
リンを含む0.1Mクエン酸緩衝液,pH5.0）100μl,8−アニ
リノナフタレン−１−スルホン酸溶液（625mg/ml）400
μｌおよび後記希釈倍率の各種抗血清溶液（実施例１お
よび３により作製）100μｌを加え,4℃で16時間インキ
ユベーシヨンを行つたのち,25％ポリエチレングリコー
ル6000溶液1mlを加え,10秒間振り混ぜ，ついで遠心分離
（2250×g,20分間）し，その上澄を吸引除去し，沈殿の
放射活性をウエル型シンチレーシヨン・カウンターで測
定した。

２）標準曲線： 上記１）の操作法により,ALD標準液（０〜5000pg/ml）
について作成した標準曲線は第４図に示す通りであつ
た。ここでB₀は非放射性ALDのないときに得られた抗原
・抗体結合物の放射能,Bは非放射性ALDを加えたときの
結合物の放射能である。

３）交差反応性： 本発明によつて得た各種置換アルドステロンの各種ステ
ロイドとの交差反応性検定試験（方法は上記１）による
結果を次頁の表に総括する。

実施例５−１ 血清ALDのRIA 前記実施例１に記載の操作法に従つて，実施例２−１で
得た標識体と，次頁の表中に記載した抗（Ｉ）（R¹＝H,
R²＝α・OCOCH₂CH₂COOH）−BSAとを用いて作成したB/B₀
標準曲線は第７図に示す通りであつた。

実施例６ 血清ALDのEIA １）酵素標識抗原の作製： 前記した，置換ALDのカルボン酸誘導体 ［（Ｉ）（R¹＝SCH₂COOH,R²H）、（Ｉ）（R¹＝H,R²＝β
・SCH₂COOH）、（Ｉ）（R¹＝H,R²＝β・OCOCH₂CH₂COO
H）、（Ｉ）（R¹＝H,R²＝α・OCOCH₂CH₂−COOH）および
公知の11β,18−エポキシ−18α,21−ジヒドロキシ−４
−プレグネン−3,20−ジオン＝３−（Ｏ−カルボキシメ
チル）オキシム（VI）］各６μmolを個別にジオキサン4
00μｌに溶かし，トリ−ｎ−ブチルアミン6.3μmolを含
むジオキサン50μｌを加え10〜12℃に冷却下イソブチル
クロルカーボネート６μmolを含むジオキサン50μｌ
を加え30分間撹拌し活性エステル液とした。

一方、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（30U/mg,ベーリンガ
ー・マイハイム社製）2mgを10％ジオキサン3.5mlに溶か
し,0.1N−水酸化ナトリウムでpH9.2に調整しておく。こ
れに上記活性エステル液を氷冷・撹拌下に滴下し,5分
後,pH8.5に調整した。さらに４℃で４時間撹拌を続けた
のち0.05％ナトリウムアジドを含む0.01Mリン酸緩衝液
（pH7.4）に対して２日間透析し，得られたβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ・ALD誘導体・コンジユゲート（被標識
化合物の記載順に従つて，それぞれVIIa,b,c,dまたはｅ
と指称する）を酵素標識抗原とした。

２）EIA: ALD標準溶液100μｌを試験管に採り,0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.4）300μｌおよび酵素標識抗原希釈液（酵素標識
抗原を10万倍に希釈）100μｌを加え混和後，抗血清溶
液50μｌを加え４℃で５時間静置した。

ついでイムノビード（Immunobead;Bio-Red社商品名,1mg
/ml）100μｌを加え４℃に１時間静置したのち、遠沈し
（2000×g,5分間），その上澄を吸引除去し，沈殿を0.1
M−リン酸緩衝液（pH7.4）で２回洗浄した。

これを,0.14M−塩化ナトリウム、0.001M・塩化マグネシ
ウム,0.05％ナトリウムアジド,0.5％BSAを含む0.01M−
リン酸緩衝液（pH7.3）に懸濁させ，さらに４−メチル
ウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液（80μg/
ml）400μｌを加え,37℃で30分間インキユベートしたの
ち,0.1M−グリシン緩衝液（pH10.5）3mlを加えて反応を
停止させ，その螢光強度（励起360nm,螢光448nm）を測
定した。

なお，血清中ALDの測定の場合は，標準溶液100μｌおよ
び緩衝液300μｌの代りに，それぞれ被検血清100μｌお
よび８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸溶液（80
0μg/ml）300μｌを用い，以下上記と同様に操作する。
また，用いる酵素標識抗原と抗血清との可能な組合せ
（○印）は次表に示すとおりである。

【図面の簡単な説明】 第1,2および３図はそれぞれ,¹²⁵I−（Ｉ） ¹²⁵I−（Ｉ） および¹²⁵I−（Ｉ） のカラムクロマトグラフ溶出曲線である。 また第４図は標識物あるいは抗ALD抗血清のいずれか一
方，あるいは双方共に本発明による置換ALDを用いて作
成したB/B₀標準曲線である。 第５および第６図は，それぞれ¹²⁵I−（Ｉ） および のカラムクロマトグラフ溶出曲線である。第７図は，標
識物および抗ALD抗血清が双方共に本発明による置換ALD
を用いたB/B₀標準曲線である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 （但し、式中R¹およびR²のいずれか一方は水素、R¹が水
   素のときR²は−Ｓ−（CH₂）_1-3COR³または−Ｏ−CO−
   （CH₂）_1-5COR³で表わされる基、R²が水素のときR¹は−
   Ｓ−（CH₂）_1-3COR³で表わされる基、ここでR³はヒドロ
   キシ基、またはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラ
   ミン残基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒスタ
   ミン残基、ヒスチジン残基あるいは７−アミノヘプタノ
   イルチロシン低級アルキルエステル残基を表わす。）で
   表わされる置換アルドステロン類のうち少なくとも一つ
   を、抗ハプテン抗血清作製用ハプテン、あるいは標識用
   抗原（トレーサー）として使用することを特徴とする血
   清アルドステロンの免疫測定方法。
2. 【請求項２】標識用抗原が放射性ヨウ素で標識されてい
   ることを特徴とする特許請求の範囲（１）記載の免疫測
   定方法。
3. 【請求項３】標識用抗原が酵素で標識されていることを
   特徴とする特許請求の範囲（１）記載の免疫測定方法。
4. 【請求項４】式 （但し、式中R¹およびR²のいずれか一方は水素、R¹が水
   素のときR²は−Ｓ−（CH₂）_1-3COR³または−Ｏ−CO−
   （CH₂）_1-5COR³で表わされる基、R²が水素のときR¹は−
   Ｓ−（CH₂）_1-3COR³で表わされる基、ここでR³はヒドロ
   キシ基、またはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラ
   ミン残基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒスタ
   ミン残基、ヒスチジン残基あるいは７−アミノヘプタノ
   イルチロシン低級アルキルエステル残基を表わす。）で
   表わされる置換アルドステロン類のうち少なくとも一つ
   を標識用抗原あるいは抗血清作製用ハプテンとして含む
   ことを特徴とする血清アルドステロン免疫測定用キッ
   ト。