JPH0257976A - アルドステロンのイムノアツセイおよびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はアルドステロン（以下、ＡＬＤと略称すること
あり）の測定に有用なイムノアッセイに関し、本発明者
らが先に発明し、特開昭６３−６０９９６号において開
示された、新規な置換アルドステロン類を使用するラジ
オイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと略称することあり）
、あるいはエンザイムイムノアッセイ（以下、ＥＩＡと
略称することあり）に係るものである。

［従来技術とその問題点］ 従ＩＡＬＤの測定はステロイドホルモン測定のうちで最
も困難なものの一つで、公知のイムノアッセイはその特
性において必ずしも充分なものとは言い難かった。

すなわち、イムノアッセイの良否は使用する抗ハプテン
抗血清の適否に大きく支配されるが、この抗血清の特性
は、免疫原の構造によって左右される。抗ハプテン抗血
清の場合、その免疫原としての化合物は官能基が出来る
限り遊離の状態のものが望ましいと言われている。

これまで報告されているＡＬＤのハプテンとしては、そ
の２１−ヘミサクシネート、３−（０−カルボキシメチ
ル）オキシムおよび、１Ｂ、２１−ビスヘミサクシネー
トなどが挙げられるが、いずれもＡＬＤ自体の官能基の
一部がブロックされた形のもので、必ずしも満足なハプ
テンとは言えない。

［問題点を解決するための手段］ 上記の状況にかんがみ、本発明者らは、ＡＬＤのすべて
の官能基が遊離の状態にあるハプテンの合成を試みてこ
れに成功し、上記ハプテンおよびその製造方法、上記ハ
プテンを含有するＡＬＤ検査用試薬を特願昭６２−１１
７５８１号として特許出願し、その内容は特開昭６３−
６０９９６号により開示された。

本発明は、上記ハプテンを使用するＡＬＤのＲＩＡ法あ
るいはＲＩＡ法およびこれらのものに加えて標準ＡＬＤ
を組合せたＲＩＡあるいはＥＩＡ用キットを意図するも
のである。

したがって本発明によれば、式 （但し、式中Ｒ１およびＲ″のいずれか一方は水素、Ｒ
’が水素のときＲ２は−５−（ＣＨｔ）＋−５ｃＯＲ”
または−〇−Ｃｏ−（ＣＨｔ）＋−５ｃＯＲ”で表わさ
れる基、Ｒ１が水素のときＲ’は−５−（ＣＨｔ）＋−
５ｃＯＲ”で表わされる基、ここでＲＪはヒドロキシ基
、またはそれぞれヨウ素化されていてもよいチラミン残
基、チロシン低級アルキルエステル残基、ヒスタミン残
基、ヒスチジン残基あるいは７−アミンヘプタノイルチ
ロシン低級アルキルエステル残基を表わす、またＸはグ
リコールの保護基を表わす）で表わきれる置換アルドス
テロン類のうち少なくとも一つを、抗ハプテン抗血清作
製用ハプテン、あるいは標識用抗原（トレーサー）とし
て使用することを特徴とする血清アルドステロンのイム
ノアッセイが提供される。

また、本発明の別の側面によれば、前記置換ＡＬＤ類の
うち少なくとも一つを標識用抗原あるいは抗血清作製用
ハプテンとして含むことを特徴とする血清アルドステロ
ン・イムノアツセイ用キットが提供きれる。

ＲＩＡの場合、標識用抗原が放射性ヨウ素で標識されて
いることが好ましく、ＥＩＡの場合、標識用抗原が酵素
で標識されていることは言うまでもない。

本イムノアッセイにおいて、これらの置換ＡＬＤ（１）
のうち、Ｒ３が水酸基である化合物（■）（Ｒ”−０Ｈ
）を、タンパク質たとえば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
と結合させたもの（ＢＳＡコンジュゲート）は、これを
抗原（免疫原）として、たとえば家兎を免疫、つまり数
回繰返し注射したのち、その家兎より採血して抗ＡＬＤ
抗血清とする。また他のタンパク質すなわち標識用酵素
たとえばホースラデイシュ・ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼあるいは
グルコシダーゼなどと結合させて、ＥＩＡ用標識体とす
ることができる。

これらのために用いる混酸無水物法は、置換アルドステ
ロン（Ｉ　）　（Ｒ”−Ｈ）を、たとえばジオキサンに
溶かし、之にトリーｎ−ブチルアミンおよびインブチル
クロルカ−ボネート １０°Ｃで３０分間攪拌すると、化合物（　１　）　−
ＣＯＯＣＯＯＣ　、Ｈ　、の活性エステルができる．こ
れにＢＳＡの含水ジオキサン溶液（　ＮａＯＨでｐＨ８
．５に調ｖｉ）を加え、攪拌をつづけると化合物（Ｉ）
のＢＳＡコンジュゲートが得られる方法である。

之に対し、冷水中での透析、ｐＨのｍ整、遠心分離によ
る沈渣の採取、採取した沈渣の重曹溶液による溶解、冷
水中での再透析などの精製操作を施して免疫原とする。

このほか、カルボジイミド法（エチルカルボジイミドま
たはモルホカルボジイミドを用いる）あるいはインキサ
ゾリウム法も用いられる。

また、これらの方法は、次の酵素で標識する場合も全く
同様に利用される。ＢＳＡが酵素とおき代るだけである
。（たとえば鎮目和夫他編［新版ラジオイムノアッセイ
」創意書店１９７７年刊行、および石川栄治他「酵素免
疫測定法」医学書院１９７８年刊行参照） また標識用抗原は、ＥＩＡの場合には、前記化合物（Ｉ
）のうちＲ１が水酸基であるものを、公知の慣用方法、
たとえば活性エステル法によって酵素で標識して作製す
る。

ＲＩＡの場合には、前記化合物（Ｉ）のうちＲｓが水酸
基以外のものをそれ自体公知の慣用手段、たとえばクロ
ラミンＴ法あるいは酵素法などにより放射性ヨウ素（１
！’Ｉまたは”’Ｉ）によって標識して作製する。

標識にはクロラミンＴでヨウ素イオンを酸化するか、過
酸化水素とラクトペルオキシダーゼとの組合せで酸化し
て得た原子状ヨウ素を利用して、たとえばヒドロキシフ
ェニルのメタ位にヨウ素を導入する方法が採用きれる（
前記「新版ラジオイムノアッセイ」参照）。

イムノアッセイ法はそれ自体公知の方法に従って行ない
、ＥＩＡの場合には、たとえば螢光強度測定における、
標準液と被測定血清との測定値を比較することによって
定量する。

ＲＩＡの場合には、たとえばウェル型シンチレーション
・カウンターで測定した標準液と被検血清の放射活性と
の対比によって求める。

本発明によって提供きれるイムノアッセイ用キットには
■標準物質としてのＡＬＤと■化合物（１）の放射化あ
るいは酵素標識物または■化合物（１）より得た抗血清
が含まれる．後二者のうちいずれかは公知のＡＬＤ誘導
体由来のものでもよい。その他所子に応じ、緩衝液、Ｆ
／Ｂ（遊離型／結合型）分離試薬［たとえばＰＥＧある
いは第２抗体（２抗体法で前記■を第１抗体とする場合
）コを含むものであってもよい。

前記したように、本発明によれば、感度、交叉反応性に
おいてすぐれたイムノアッセイを実施しうろことが判明
し、次記実施例の記載において更に詳細に説明するよう
に、本発明の公知技術に対する優位性が裏付けられた。

′ＬＭ３！１１ 置換Ａ　Ｌ　Ｄ　（　Ｉ　）　（Ｒ’＝ＳＣＨ．ＣＯＯ
Ｈ．Ｒ’＝Ｈ）による免疫原および抗血清の作 ）笈斑ス 置換Ａ　Ｌ　Ｄ　（　Ｉ　）　（　Ｒ’＝ＳＣＨＩＣｏ
ｏ１．Ｒ”＝）り　１　８　ｒＩＩｇをジオキサン５０
０μｍに溶かし１０〜１２°Ｃに保ちながらトリブチル
アミン９．３μｍとイソブチルクロルカーボネート４．
９μｍを加え，３０分間攪拌して活性エステル液とする
。　一方，牛血清アルブミン（ＢＳＡ）６９ｍｇを水２
ｍｌに溶かし，ジオキサン２ｍｌを加えで混和したのち
，ＩＮ＝水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調整する。こ
れに、上記エステル液を水冷下に滴下したのち，さらに
ｐＨ８．５に保ちながら４時間攪拌を続けてカップリン
グさせ，水に対して透析し，つづいて凍結乾燥し，標記
化合物（Ｉ）ＢＳＡフンジュゲーｈ５０ｍｇを得た。

担体タンパクに対するハブテンの結合モル比は１５であ
った。

ｉ）扱血遭 前記免疫原２５０μｇを生理食塩液２５０μｍに溶かし
、フロイント・フンブリート・アジュバント２５０μｍ
を加えエマルジョンとする。これを家兎の背部に皮肉注
射し、これを３週間間隔で５回繰返す、最終免疫後１０
日１に全採血して抗血清を得た。

この抗血清の力価を、後述のＲＩＡ系で測定したところ
　Ｉｔ＠ｌ標識ＡＬＤ２．２Ｘ１０’ｄｐｍの５０％を
結合させるのに要する抗血清の希釈倍数で表わした値で
、４．６Ｘ１０’倍であった。

（以下余白） 火１１１主 置換Ａ　Ｉ、　Ｄ　（Ｉ　’）　（Ｒ’＝ＳＣＨＩＣＯ
ＮＨＣＨＩＣＨ１（Ｃ，Ｈ４）ＯＨ。

Ｒ’＝Ｈ）の標識 置換Ａ　Ｌ　Ｄ　（Ｉ　）（Ｒ’＝ＳＣＨ＊Ｃ０ＮＨＣ
Ｈ＊ＣＨｓ（ＣａＨａ）ＯＨ。

ＲＩ：Ｈ）　５００Ｈｇ、ジメチルホルムアミド５μｍ
。

０．５Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２５μｍおよび
１ｔＪ−ヨウ化ナトリウム１　ｍｃｉをガラスチューブ
に入れ、これにクロラミンＴ２０μｇを含むリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）５μｍを加え、室温で４５秒間攪拌し
たのち、メタ重亜硫酸ナトリウム１００μｇを含む水溶
液５μｍを加えて反応を停止させた。

これにヨウ化カリウム５００　ｔｔｇを加え、ジクロル
メタン１ｍｌで抽出、硫酸ナトリウムで乾燥後クロマト
グラフィー（セファデックスＬＨ２０，０，７ｃｍｉＸ
２０ｃｍ、ジクロルメタン：メタノール−９：１）を行
ない、１０００−１５００μＣｉ／μｇの標記化合物を
得た。クロマトグラム（溶出曲線）は第１図に示す通り
であった。

叉２１１１１虹二↓ Ｒ’＝Ｈコおよび置換ＡＬＤ（Ｉ　） 前記実施例２前半の記載にしたがって、標記置換ＡＬＤ
（Ｉ　）の標識を行った。標識物は、それぞれクロマト
グラフィ（セファデックスＬＨ−２０，９ｍｍφＸ９０
ｍｍ、エタノールーＭ／１０　クエン酸緩衝液、ｐＨ２
，２）によって精製し、放射活性５００μＣｉ／μｇの
チロシンメチルエステル体および同４００μＣｉ／μｇ
のヒスタミン体を得た。クロマトグラム（溶出曲線）を
、それぞれ第５および６図に示す。

え履ター１ 置換Ａ　Ｌ　Ｄ　（Ｉ　）　［（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ”＝βお
よびα・０ＣＯＣＨ，−ＣＨＩＣｏＯＨ）］による免疫
原および抗血清の作製）１疲１： 標記置換ＡＬＤ（Ｉ　）を１個別に実施例１記載の方法
と同様の方法に従って処理し、それぞれ（１）　（Ｒ’
＝Ｈ，Ｒ’＝β・０ＣＯＣＨ，ＣＨ，Ｃ００Ｈ）　−Ｂ
　Ｓ　Ａおよび（Ｉ　）　（Ｒ’＝ｎ、Ｒ”＝α・０Ｃ
ＯＣＨｘＣＨｎＣＯＯＨ）　−Ｂ　Ｓ　Ａコンジュゲー
トを得た。出発物質１４．５ｍｇから得られたコンジュ
ゲートの量は、それぞれ６５ｍｇ。

６８ｍｇであった。また担体タンパクに対するハブテン
の結合モル比は、それぞれ１１および２０であった。

ｉ）底皇清 前記免疫原を用い実施例１．ｉ）記載と同様の方法で免
疫を行い、抗血清を得た。これらの抗血清の力価を前記
と同一表現で示すと、それぞれ９Ｘ１０１倍および６Ｘ
１０”倍であった。

衷夏透−１ １１１による置換Ａ　Ｌ　Ｄ　（１）　［（Ｒ１＝ｕ、
Ｒ１＝βまたはα・０ＣＯＣＨ＊−ＣＨ，Ｃ０ＮＨＣＨ
，ＣＨｌ　（ＣｓＨ，）ＯＨ）］の標識置換Ａ　Ｌ　Ｄ
　（Ｉ　）　［：（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ”＝βまたはａ　・０
ＣＯ０１＋−ＣＨｓＣＯＮＨＣＨｍＣＨｔ（Ｃｌ３）Ｏ
Ｒ）］　　に実施例２と同様の操作を施して、それぞれ
”’　Ｉ　（Ｉ　）　（Ｒ’＝Ｈ。

Ｒ１＝β・０ＣＯＣＨ＊−ＣＨｓＣＯＮＨＣＨｍＣＨｔ
（Ｃｌ３）ＯＨ）　３３０１１Ｃｉおよび”’　ｒ　（
１）　（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ”＝α・０ＣＯＣＨ＊　−ＣＨｓ
ＣＯＮＨＣＨｍＣＨｔ（Ｃｌ３）Ｏ）Ｉ）　６００μＣ
４を得た。クロマトグラム（溶出曲線）はそれぞれ第２
図および第３図に示す通りであった。

１１■ユ 実施例２および４に記載したＡＬＤ標識化合物のほか、
公知の１１β、１８−エポキシ、１８α、２１−ジヒド
ロキシ−４−プレグネン−３゜２０−ジオン讃３−（０
−［Ｎ−（ｐ−ヒドロキシルフェネチル ）（■）をクロラミンＴ法によりヨウ素化してｔｓｌ−
（ｖｌ）を作製し，その比放射能が６８０Ｃｉ／　ｍｍ
ｏｌであることを確認した。

１）隨１迭 血清１００μｍを試験管に採取し，上記実施例２および
４ならびに参考例１のいずれかによって得た＋８■標識
ＡＬＤ（　２　、　２Ｘ　Ｌ　Ｑ’ｄｐｍ）を含む緩衝
液（０．１％牛血清７−グロプリンを含む０、１Ｍクエ
ン酸緩衝液．ｐｕｓ．ｏ）１ｏｏμｍ。

８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸ｍ液（６　２
　５　ｍｇ／ｍｌ）　４　０　０μｍおよび後記希釈倍
率の各種抗血清溶液（実施例１および３により作製）１
００μｍを加え．４℃で１６時間インキュベーションを
行ったのち，２５％ポリエチレングリコール６０００溶
液１ｍｌを加え，１０秒間振り混ぜ，ついで遠心分離（
２２５０Ｘｇ，２０分間）し、その上澄を吸引除去し，
沈殿の放射活性をウェル型シンチレーション・カウンタ
ーで測定した。

記 ４図に示す通りであった。ここでＢ。は非放射性ＡＬＤ
のないときに得られた抗原・抗体結合物の放射能，Ｂは
非放射性ＡＬＤを加えたときの結合物の放射能である。

３）久蓋区長負： 本発明によって得た各種置換アルドステロンの各種ステ
ロイドとの交差反応性検定試験（方法は上記１）による
結果を次頁の表に総括する。

前記実施例１に記載の操作法に従って，実施例２−１で
得た標識体と，次頁の表中に記載した抗（　１　）　＜
Ｒ’＝ｏ．Ｒ１＝α・ＯＣＯＣＨＩＣＨＩＣＯＯＨ）−
Ｂ　Ｓ　Ａとを用いて作成したＢ　／　Ｂ　ｏ標準曲線
は第７図に示す通りであった。

２）且ヱ皇潰： 上記１）の操作法により，ＡＬＤ標準液（０〜５　０　
０　０ｐｇ／ｍｌ）について作成した標準曲線は第前記
した．置換ＡＬＤのカルボン酸誘導体［（１）（Ｒ’＝
ＳＣＨ，Ｃ０ＯＨ，Ｒ”＝Ｈ）、　　（Ｉ　　）（Ｒ’
＝Ｈ，Ｒ”＝β・５ＣＨＩＣＯＯＨ）、（Ｉ　）　（Ｒ
’＝Ｈ，Ｒ”＝β・０ＣＯＣＨ１ＣＨＩＣＯＯＨ）、（
Ｉ　）　（Ｒ’＝Ｈ，Ｒ３＝α・０ＣＯＣＨｓ　ＣＨ＊
　−ＣＯＯＨ）　　および公知の１１β、１８−エポキ
シ−１８α、２１−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３
，２０−ジオン−３−（０−力ルボキシメチル）オキシ
ム（■）］各６μｍｏｌを個別にジオキサン４００μｍ
に溶かし、トリーｎ−ブチルアミン６．３μｍｏｌを含
むジオキサン５０μｍを加え１０〜１２℃に冷却下イン
ブチル　クロルカーボネート６μｍｏｌを含むジオキサ
ン５０μｍを加え３０分間攪拌し活性エステル液とした
。

一方、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（３０Ｕ／ｍｇ。

ベーリンガー・マンハイム社製）　２　ｍｇヲ１０％ジ
オキサン３．５ｍｌに溶かし、０．ＩＮ−水酸化ナトリ
ウムでｐＨ９，２に調整しておく、これに上記活性エス
テル液を水冷・攪拌下に滴下し、５分後、ｐＨ８，５に
調整した。さらに４℃で４時間攪拌を続けたのち０．０
５％ナトリウムアジドを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）に対して２日間透析し、得られたβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ・ＡＬＤ誘導体・フンシュゲート（被
標識化合物の記載順に従って、それぞれ■ａ、ｂ、ｃ、
ｄまたはｅと指称する）を酵素標識抗原とした。

２）旦１Ａ： ＡＬＤ標準溶液１００μｍを試験管に採り。

０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）ａｏｏμｍおよび
酵素標識抗原希釈液（酵素標識抗原を１０万倍に希釈）
１００μｍを加え混和後、抗血清溶液５０μｍを加え４
℃で５時間静置した。

ついでイムノビード（Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ　：　Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社商社名品名１　ｍｇ／ｍｌ）　１００μｍ
を加え４°Ｃに１時間静置したのち、遠沈しく２０００
Ｘｇ、５分間）、その上澄を吸引除去し、沈殿を０．１
Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で２回洗浄した。

これを、０．１４Ｍ−塩化ナトリウム、０．００１Ｍ・
塩化マグネシウム、Ｏ，ＯＳ％ナトリウムアジド、０．
５％ＢＳＡを含む０．ＯＩＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，
３）に懸濁させ、さらに４−メチルウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトシド溶液（８０μｇ／ｍ１）　４００
　ａｌを加え、３７°Ｃで３０分間インキュベートした
のち、０．１Ｍ−グツシン緩衝液（ｐＨ１０、５）　３
ｍｌを加えて反応を停止移せ、その螢光強度（励起３６
０ｎｍ、螢光４４８ｎｍ）を測定した。

なお、血清中ＡＬＤの測定の場合は、標準溶液１００μ
ｍおよび緩衝液３００μｍの代りに、それぞれ被検血清
１００μｍおよび８−アニリノナフタレン−１−スルホ
ン酸溶液（８００μｇ／ｎ＋１）３００μｍを用い、以
下上記と同様に操作する。

また、用いる酵素標識抗原と抗血清との可能な組合せ（
○印）は次表に示すとおりである。

第 表

【図面の簡単な説明】

第１．２お、ｌ’３［ｉそれぞれ、”’Ｉ−＜Ｉ＞”Ｉ
−（Ｉ）（Ｒ′＝Ｈ，Ｒ”−θ　・０ＣＯＣＨｔＣＨ＊
Ｃ０ＮＨＣＨｔ−のカラムクロマトグラフ溶出曲線であ
る。第７図は、標識物および抗ＡＬＤ抗血清が双方共に
本発明による置換ＡＬＤを用いたＢ／Ｂｏ標準曲線であ
る。 クロマトグラフ溶出曲線である。 また第４図は標識物あるいは抗ＡＬＤ抗血清のいずれか
一方、あるいは双方共に本発明による置換ＡＬＤを用い
て作成したＢ／Ｂｏ標準曲線である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、式中Ｒ＾１およびＲ＾２のいずれか一方は水素
   、Ｒ＾１が水素のときＲ＾２は−Ｓ−（ＣＨ＿２）＿１
   −＿３ＣＯＲ＾２または−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿１
   −＿５ＣＯＲ＾３で表わされる基、Ｒ＾２が水素のとき
   Ｒ＾１は−Ｓ−（ＣＨ＿２）＿１−＿３ＣＯＲ＾３で表
   わされる基、ここでＲ＾３はヒドロキシ基、またはそれ
   ぞれヨウ素化されていてもよいチラミン残基、チロシン
   低級アルキルエステル残基、ヒスタミン残基、ヒスチジ
   ン残基あるいは７−アミノヘプタノイルチロシン低級ア
   ルキルエステル残基を表わす。またＸはグリコールの保
   護基を表わす）で表わされる置換アルドステロン類のう
   ち少なくとも一つを、抗ハプテン抗血清作製用ハプテン
   、あるいは標識用抗原（トレーサー）として使用するこ
   とを特徴とする血清アルドステロンのイムノアツセイ。
2. （２）標識用抗原が放射性ヨウ素で標識されていること
   を特徴とする特許請求の範囲（１）記載のイムノアツセ
   イ。
3. （３）標識用抗原が酵素で標識されていることを特徴と
   する特許請求の範囲（１）記載のイムノアツセイ法。
4. （４）特許請求の範囲（１）記載の置換アルドステロン
   類のうち少なくとも一つを標識用抗原あるいは抗血清作
   製用ハプテンとして含むことを特徴とする血清アルドス
   テロン・イムノアツセイ用キット。