JPS6224744B2 - - Google Patents
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Description
本発明はエストラジオール―３―グルクロナイ
ドの免疫学的測定用抗原およびその製造法に関す
るものである。 さらに詳しくは、エストラジオール―３―グル
クロナイドの特異抗血清を得るためのハプテン―
蛋白結合抗原の新規合成法に関する。 エストラジオールはエストロゲンの一種であり
遊離型、抱合型等が知られている。このうち遊離
型は血中には存在するが、尿中には通常出現せ
ず、グルクロン酸抱合型あるいは硫酸抱合型とし
て排せつされる。なかでもグルクロン酸抱合型に
ついては、近時、その生理的意義が注目されるよ
うになり、臨床病理的には、血中および尿中のエ
ストラジオール―３―グルクロナイドとエストラ
ジオール―17―グルクロナイドを分画測定するこ
とにより、排卵の予知、不妊症の薬物療法の指標
に役立つことが指適されている。 従来、体液中のエストラジオールは結合型エス
トラジオールを加水分解して、遊離型とした後、
抽出後、コーバー反応を利用した比色法、または
蛍光法あるいは免疫測定法等を組合せて測定され
てきた。しかしながら水解操作を必要とするこれ
らの測定法は、操作が煩雑であり、総エストラジ
オール量から遊離エストラジオール量を差引くこ
とによつて、抱合型と蛋白結合型の総量と遊離エ
ストラジオールの比率を測定することは可能であ
るが、グルクロン酸抱合型であるエストラジオー
ル―３―グルクロナイドとエストラジオール―17
―グルクロナイドの分画測定はほとんど不可能で
あつた。 本発明は体液中のエストラジオール―３―グル
クロナイドを免疫学的に測定する時に必要となる
特異抗体を作製するためのハプテン―蛋白結合抗
原の新規な合成法に関するものであり、該抗原を
用いて作製された抗体を使用することにより、体
液中のエストラジオール―３―グルクロナイドを
検体中に共存する類似物質の影響を受けることな
く特異的に測定することが可能となる。 近時、体液中のホルモンの測定法として賞用さ
れているラジオイムノアツセイは放射性核種で標
識したホルモンと該ホルモンに対する抗体の結合
比が反応液中に加えられた抗原、すなわち、非標
識ホルモンの量によつて変化することを利用した
方法であり、感度が高く、多数検体の測定が可能
であることから、臨床検査に適した方法となつて
いる。しかしながら、その特異性に関しては議論
の多いところである。すなわち、一般に体液中に
は測定対象物質と類似の構造を有する物質が多数
共存しているので、測定に用いる抗体は測定対象
物質とのみ反応するもの、即ち特異性が高く、交
叉反応性の低いものが要求される。測定対象物質
との結合定数が大で、かつ、特異性の高い抗体が
用意されれば該対象物質を測定するためのラジオ
イムノアツセイは、ほぼ確立したことになる。 前述の如く、体液中のエストラジオールを従来
法で測定する場合、一般的には水解操作が必要に
なるがラジオイムノアツセイにおいては、エスト
ラジオールグルクロナイドと特異的に結合する抗
体が用意されれば、水解操作が不要となり、特異
的、かつ、高感度な測定が可能となるので、今日
ではエストラジオールグルクロナイドに限らず、
各種のステロイドホルモンの抱合体を水解せずに
免疫学的に測定するための特異抗体の製造法、即
ち、特異抗体を製造するための抗原として、どの
ような物質を使用すればよいかという点に免疫学
的な測定法を確立するための研究が進められてい
る。 その一つの例として、エストロゲン―３―グル
クロナイドのカルボキシル基にBSAを結合させ
た、いわゆるハプテン―蛋白結合抗原が合成さ
れ、該抗原を用いて作製された抗体を用いて、エ
ストロゲン―３―グルクロナイドを測定する方法
が報告されているが、該抗体は特異性が低く、遊
離エストロゲンおよびエストロゲン―16―グルク
ロナイド等に対して、交叉反応性を示すので、満
足出来る結果を与えていない。（P.Samarajeewa
et al：Biochem.J.151，369〜376，1975年） また、カルボキシフエニルアゾエストリオール
―16―グルクロナイドのC2位、またはC4位にカ
ーボジイミド法を用いてBSAを結合させた、ハ
プテン―蛋白結合抗原の場合、該抗原を用いて作
製された抗体は、遊離エストロゲンに対し、2.2
％以下という比較的低い交叉反応性を示し、改良
された特異性を示したが、なお不充分であり、こ
の不充分な特異性はベンゾイル基にBSAを結合
させる際に、同時にグルクロン酸部分のカルボン
酸にもBSAが結合するためであると推定されて
いる。（J.R.Soares et al：FEBS Lett，61，263
〜266，1976年） また、エストロンサルフエートのC6位にBSA
を結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.13，1075〜1079，1980年）、エストロゲ
ンＤ環グルクロナイドのC2、またはC4位にBSA
を結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.９，785〜790，1978年）の場合、ハプ
テン―蛋白結合抗原を用いて作製された抗体は、
いずれもハプテンに対して、高い特異性を示すこ
とから、ハプテンとBSAの結合部位から離れて
いるハプテン分子の一部分が抗原性決定部位とな
つていること、抗体の特異性は該抗原性決定部位
に向けられていることが理解される。 このことはエストロゲン―３―グルクロナイド
の場合、Ａ環C3位に近隣するC2、あるいはC4位
に担体蛋白を結合させた抗原よりも、Ｂ環C6位
に担体蛋白を結合させた抗原の方がＡ環の構造を
良好に認識する抗体を産生させる上で有利である
ことを示している。 しかしながら、目下のところ、エストラジオー
ル―３―グルクロナイドのC6位にBSAを結合さ
せることにより、エストラジオール―３―グルク
ロナイドに対する特異抗血清を得るためのハプテ
ン―蛋白結合抗原の合成法についての報告はな
い。 このような観点から、本発明者等は、エストラ
ジオール―３―グルクロナイドを免疫学的に測定
する時に使用出来る特異性の高い抗体を作製する
ことを目的として、ハプテン―BSA結合体を鋭
意検索した結果、本発明を完成するに至つたもの
である。 本発明は、エストラジオール―３―グルクロナ
イドのＡ環グルクロン酸部位にBSAが結合しな
いようにしながらステロイド骨格Ｂ環のC6位に
BSAを結合させたハプテン―BSA結合体の合成
法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち、６―オキ
ソエストラジオール―３―グルクロナイド―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストラジオール―３―グルクロナイド
―BSA結合体を用いて作製された抗体に比較し
て、ステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れて
おり、特異性においても、さらに向上することが
明りようとなり、本発明を完成するに至つた。 本発明に基づいて作製された抗体はエストラジ
オール―３―グルクロナイドのラジオイムノアツ
セイ用として特に好適であるが、ラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはポリスチレンラ
テツクス粒子を担体とする凝集反応および凝集阻
止反応に用いることも可能である。 本発明は、特許請求の範囲第２項イ〜ニに記載
した工程に基づいて６―オキソエストラジオール
―３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメ
チル）オキシム―BSA結合体を合成する方法に
関するものであるが、本発明のさらに加わつた特
徴の一つとしてエストラジオール―３―グルクロ
ナイドのグルクロン酸部分の保護基を合成工程の
最終段階、すなわち、特許請求の範囲第２項ニに
記載した工程において脱離させることにある。 本発明に基づくエストラジオール―３―グルク
ロナイド測定用の抗原として用いられる新規ステ
ロイド化合物は、化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―３―グ
ルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム―BSA結合体である。 本発明に基づく新規ステロイド化合物は、下記
の構成、すなわち、 イ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテートをメチル（２，３，４―トリ―Ｏ―アセ
チル―１α―ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―グルコ
ピラノシド）ウロネートと反応させ、６―オキソ
エストラジオール―17―アセテート―３―グルク
ロナイド―トリアセテートメチルエステル（）
とする工程、 ロ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステルを酢酸ナトリウムの存在下、Ｏ―
カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩と反
応させ６―オキソエストラジオール―17―アセテ
ート―３―グルクロナイド―トリアセテートメチ
ルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキ
シム（）とする工程、 ハ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）
オキシムをBSAと反応させ６―オキソエストラ
ジオール―17―アセテート―３―グルクロナイド
―トリアセテートメチルエステル―６―（Ｏ―カ
ルボキシメチル）オキシム―BSA結合体（Ｖ）
とする工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）
オキシム―BSA結合体（）を部分的に加水分
解する工程、 以上のイ、ロ、ハ、ニの各工程を組合せること
によつて製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
―オキソエストラジオール―17―アセテート500
mgをトルエン５mlに溶解し、炭酸カドミウム600
mgを加え、ケタール化装置にて脱水後、メチル
（２，３，４―トリ―Ｏ―アセチル―１α―ブロ
モ―１―デオキシ―Ｄ―グルコピラノシド）ウロ
ネート１ｇを加えて72時間還流する。次に反応液
をろ過して、触媒をろ去し、ろ液を濃縮後、シリ
カゲルカラムクロマトグラフイーに付し、ベンゼ
ン／酢酸エチル（４：１）溶出画分を濃縮後、ア
セトンにより再結晶すると化合物（）130mgが
得られる。 化合物（）の分析値 m.p. 189゜〜190゜ 〔α〕２０ Ｄ −18.5゜（Ｃ＝0.10，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：60.69，Ｈ：6.19 化学式C33H40O13・１／２H2Oに対する計算値 Ｃ：60.64，Ｈ：6.32 NMR（CDCl3） 0.84 （3H，ｓ，18―CH3） 2.07 （12H，ｓ，17β―，2′―，3′―，
4′OCOCH3） 3.74 （3H，ｓ，COOCH3） 4.02 （1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.72 （1H，ｍ，17α―Ｈ） 5.30 （4H，ｍ，1′―，2′―，3′―，4′―Ｈ） 7.20 （1H，bvs，４―Ｈ） 7.25 （1H，dd，Ｊ＝８，２Hz，２―Ｈ） 7.60 （1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 化合物（）62mgをメタノール／酢酸エチル
（５：２）14mlに溶解し、次にＯ―カルボキシメ
チルヒドロキシルアミン塩酸塩153mgと10％酢酸
ナトリウム1.5mlを加え、35℃で12時間撹拌後、
水を加え、酢酸エチルで抽出する。有機層を水
洗、乾燥後、溶媒を留去する。残渣を分取TLC
（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝
80／20／2.5）に付し、Rf0.7の画分をクロロホル
ム／メタノール（４：１）で溶出する。溶出液の
溶媒を留去後、残渣をエーテルより再結晶すると
化合物（）51mgが得られる。 化合物（）の分析値 m.p. 185゜〜188゜ 〔α〕２０ Ｄ ＋64.3（Ｃ＝0.11，CH3OH） 元素分析値 Ｃ：56.91，Ｈ：5.97，Ｎ：1.81 化学式C35H43O15N・H2Oに対する計算値 Ｃ：57.14，Ｈ：6.16，Ｎ：1.90 NMR（CD3OD／CDCl3） 0.84 （3H，ｓ，18―CH3） 2.06，2.08 （each6H，each ｓ，17―，2′―，
3′―，4′―OCOCH3） 3.74 （3H，ｓ，COOCH3） 4.69 （2H，ｓ，＝NOCH2―） 6.98 （1H，dd，Ｊ＝９，２Hz，２―Ｈ） 7.16 （1H，ｄ，Ｊ＝９Hz，１―Ｈ） 7.54 （1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 化合物（）48mgをジメチルホルムアミド（以
下DMFと略称す）1.5mlに溶解し、氷冷下、トリ
―ｎ―ブチルアミン50μｌおよびイソブチルクロ
ロフオルメート13μｌを加え、30分後、BSA123
mgを含有する含水DMFアルカリ溶液（H2O／
DMF／1N NaOH＝３ml／2.2ml／0.1ml）を加え
PH7.0〜7.5に調整後、室温で12時間撹拌する。反
応液を冷水で24時間透析後、凍結乾燥に付し、化
合物（）166mgを得た。 化合物（）165mgを水50mlに溶解後、5N
NaOHを用いてPH12.0〜12.5に調整し、室温で48
時間撹拌後、冷水で24時間透析する。次いで凍結
乾燥し、化合物（）131mgを得た。 化合物（）、即ち６―オキソエストラジオー
ル―３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシ
メチル）オキシム―BSA結合体のBSA1モル当り
のハプテン結合モル数をUV法により求めたとこ
ろ13.0モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色ウサギ３羽に６―
オキソエストラジオール―３―グルクロナイド―
６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA
結合体抗原を以下の如く免疫した。 即ち、抗原２mgを滅菌生理食塩液0.5mlに溶解
させ、これをフロイント・コンプリート・アジユ
バンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエマル
ジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に皮下
投与した。以後２ケ月に渡つて２週間毎に同様の
投与を行つた。最後の投与（第５回目の投与）か
ら１週間後に、このウサギの耳静脈から10mlを採
血し、これを3000回転、10分間の遠心分離にか
け、得られた抗血清を−20℃に保存した。 使用時においては、該抗血清を解凍し、
BSA0.06％、牛―γ―グロブリン0.05％を含む
0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）を用いて１：3000
の希釈率で希釈し、標準曲線を作成した。 測定操作 エストラジオール―３―グルクロナイドを含む
試料にエストラジオール―３―グルクロナイド―
６，７― 3H（約7500dpm）および抗血清0.25ml
を添加し、４℃で１時間孵置する。次いで50％硫
安溶液0.25mlを添加し、４℃で20分間放置後、
3000回転で15分間遠心し、得られた上澄液0.2ml
をとり、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６―オキソエストラジオール―３―グルクロナ
イド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体で免疫したウサギから得られた前述
の抗血清の特異性を調べるために32種のステロイ
ドを用いて、その交叉反応性をエストラジオール
―３―グルクロナイド―６，７―3Hの本抗血清
への結合量を標準曲線より求めた結果を第１表に
示す。 第１表の交叉反応の欄における数値は、非標識
エストラジオール―３―グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種のステロイド
の読みの比率の逆数を百分率で表示したものであ
る。
ドの免疫学的測定用抗原およびその製造法に関す
るものである。 さらに詳しくは、エストラジオール―３―グル
クロナイドの特異抗血清を得るためのハプテン―
蛋白結合抗原の新規合成法に関する。 エストラジオールはエストロゲンの一種であり
遊離型、抱合型等が知られている。このうち遊離
型は血中には存在するが、尿中には通常出現せ
ず、グルクロン酸抱合型あるいは硫酸抱合型とし
て排せつされる。なかでもグルクロン酸抱合型に
ついては、近時、その生理的意義が注目されるよ
うになり、臨床病理的には、血中および尿中のエ
ストラジオール―３―グルクロナイドとエストラ
ジオール―17―グルクロナイドを分画測定するこ
とにより、排卵の予知、不妊症の薬物療法の指標
に役立つことが指適されている。 従来、体液中のエストラジオールは結合型エス
トラジオールを加水分解して、遊離型とした後、
抽出後、コーバー反応を利用した比色法、または
蛍光法あるいは免疫測定法等を組合せて測定され
てきた。しかしながら水解操作を必要とするこれ
らの測定法は、操作が煩雑であり、総エストラジ
オール量から遊離エストラジオール量を差引くこ
とによつて、抱合型と蛋白結合型の総量と遊離エ
ストラジオールの比率を測定することは可能であ
るが、グルクロン酸抱合型であるエストラジオー
ル―３―グルクロナイドとエストラジオール―17
―グルクロナイドの分画測定はほとんど不可能で
あつた。 本発明は体液中のエストラジオール―３―グル
クロナイドを免疫学的に測定する時に必要となる
特異抗体を作製するためのハプテン―蛋白結合抗
原の新規な合成法に関するものであり、該抗原を
用いて作製された抗体を使用することにより、体
液中のエストラジオール―３―グルクロナイドを
検体中に共存する類似物質の影響を受けることな
く特異的に測定することが可能となる。 近時、体液中のホルモンの測定法として賞用さ
れているラジオイムノアツセイは放射性核種で標
識したホルモンと該ホルモンに対する抗体の結合
比が反応液中に加えられた抗原、すなわち、非標
識ホルモンの量によつて変化することを利用した
方法であり、感度が高く、多数検体の測定が可能
であることから、臨床検査に適した方法となつて
いる。しかしながら、その特異性に関しては議論
の多いところである。すなわち、一般に体液中に
は測定対象物質と類似の構造を有する物質が多数
共存しているので、測定に用いる抗体は測定対象
物質とのみ反応するもの、即ち特異性が高く、交
叉反応性の低いものが要求される。測定対象物質
との結合定数が大で、かつ、特異性の高い抗体が
用意されれば該対象物質を測定するためのラジオ
イムノアツセイは、ほぼ確立したことになる。 前述の如く、体液中のエストラジオールを従来
法で測定する場合、一般的には水解操作が必要に
なるがラジオイムノアツセイにおいては、エスト
ラジオールグルクロナイドと特異的に結合する抗
体が用意されれば、水解操作が不要となり、特異
的、かつ、高感度な測定が可能となるので、今日
ではエストラジオールグルクロナイドに限らず、
各種のステロイドホルモンの抱合体を水解せずに
免疫学的に測定するための特異抗体の製造法、即
ち、特異抗体を製造するための抗原として、どの
ような物質を使用すればよいかという点に免疫学
的な測定法を確立するための研究が進められてい
る。 その一つの例として、エストロゲン―３―グル
クロナイドのカルボキシル基にBSAを結合させ
た、いわゆるハプテン―蛋白結合抗原が合成さ
れ、該抗原を用いて作製された抗体を用いて、エ
ストロゲン―３―グルクロナイドを測定する方法
が報告されているが、該抗体は特異性が低く、遊
離エストロゲンおよびエストロゲン―16―グルク
ロナイド等に対して、交叉反応性を示すので、満
足出来る結果を与えていない。（P.Samarajeewa
et al：Biochem.J.151，369〜376，1975年） また、カルボキシフエニルアゾエストリオール
―16―グルクロナイドのC2位、またはC4位にカ
ーボジイミド法を用いてBSAを結合させた、ハ
プテン―蛋白結合抗原の場合、該抗原を用いて作
製された抗体は、遊離エストロゲンに対し、2.2
％以下という比較的低い交叉反応性を示し、改良
された特異性を示したが、なお不充分であり、こ
の不充分な特異性はベンゾイル基にBSAを結合
させる際に、同時にグルクロン酸部分のカルボン
酸にもBSAが結合するためであると推定されて
いる。（J.R.Soares et al：FEBS Lett，61，263
〜266，1976年） また、エストロンサルフエートのC6位にBSA
を結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.13，1075〜1079，1980年）、エストロゲ
ンＤ環グルクロナイドのC2、またはC4位にBSA
を結合させる方法（T.Nambara et al：J.Steroid
Biochem.９，785〜790，1978年）の場合、ハプ
テン―蛋白結合抗原を用いて作製された抗体は、
いずれもハプテンに対して、高い特異性を示すこ
とから、ハプテンとBSAの結合部位から離れて
いるハプテン分子の一部分が抗原性決定部位とな
つていること、抗体の特異性は該抗原性決定部位
に向けられていることが理解される。 このことはエストロゲン―３―グルクロナイド
の場合、Ａ環C3位に近隣するC2、あるいはC4位
に担体蛋白を結合させた抗原よりも、Ｂ環C6位
に担体蛋白を結合させた抗原の方がＡ環の構造を
良好に認識する抗体を産生させる上で有利である
ことを示している。 しかしながら、目下のところ、エストラジオー
ル―３―グルクロナイドのC6位にBSAを結合さ
せることにより、エストラジオール―３―グルク
ロナイドに対する特異抗血清を得るためのハプテ
ン―蛋白結合抗原の合成法についての報告はな
い。 このような観点から、本発明者等は、エストラ
ジオール―３―グルクロナイドを免疫学的に測定
する時に使用出来る特異性の高い抗体を作製する
ことを目的として、ハプテン―BSA結合体を鋭
意検索した結果、本発明を完成するに至つたもの
である。 本発明は、エストラジオール―３―グルクロナ
イドのＡ環グルクロン酸部位にBSAが結合しな
いようにしながらステロイド骨格Ｂ環のC6位に
BSAを結合させたハプテン―BSA結合体の合成
法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち、６―オキ
ソエストラジオール―３―グルクロナイド―６―
（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストラジオール―３―グルクロナイド
―BSA結合体を用いて作製された抗体に比較し
て、ステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れて
おり、特異性においても、さらに向上することが
明りようとなり、本発明を完成するに至つた。 本発明に基づいて作製された抗体はエストラジ
オール―３―グルクロナイドのラジオイムノアツ
セイ用として特に好適であるが、ラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはポリスチレンラ
テツクス粒子を担体とする凝集反応および凝集阻
止反応に用いることも可能である。 本発明は、特許請求の範囲第２項イ〜ニに記載
した工程に基づいて６―オキソエストラジオール
―３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメ
チル）オキシム―BSA結合体を合成する方法に
関するものであるが、本発明のさらに加わつた特
徴の一つとしてエストラジオール―３―グルクロ
ナイドのグルクロン酸部分の保護基を合成工程の
最終段階、すなわち、特許請求の範囲第２項ニに
記載した工程において脱離させることにある。 本発明に基づくエストラジオール―３―グルク
ロナイド測定用の抗原として用いられる新規ステ
ロイド化合物は、化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―３―グ
ルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム―BSA結合体である。 本発明に基づく新規ステロイド化合物は、下記
の構成、すなわち、 イ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテートをメチル（２，３，４―トリ―Ｏ―アセ
チル―１α―ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―グルコ
ピラノシド）ウロネートと反応させ、６―オキソ
エストラジオール―17―アセテート―３―グルク
ロナイド―トリアセテートメチルエステル（）
とする工程、 ロ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステルを酢酸ナトリウムの存在下、Ｏ―
カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩酸塩と反
応させ６―オキソエストラジオール―17―アセテ
ート―３―グルクロナイド―トリアセテートメチ
ルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキ
シム（）とする工程、 ハ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）
オキシムをBSAと反応させ６―オキソエストラ
ジオール―17―アセテート―３―グルクロナイド
―トリアセテートメチルエステル―６―（Ｏ―カ
ルボキシメチル）オキシム―BSA結合体（Ｖ）
とする工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル―６―（Ｏ―カルボキシメチル）
オキシム―BSA結合体（）を部分的に加水分
解する工程、 以上のイ、ロ、ハ、ニの各工程を組合せること
によつて製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
―オキソエストラジオール―17―アセテート500
mgをトルエン５mlに溶解し、炭酸カドミウム600
mgを加え、ケタール化装置にて脱水後、メチル
（２，３，４―トリ―Ｏ―アセチル―１α―ブロ
モ―１―デオキシ―Ｄ―グルコピラノシド）ウロ
ネート１ｇを加えて72時間還流する。次に反応液
をろ過して、触媒をろ去し、ろ液を濃縮後、シリ
カゲルカラムクロマトグラフイーに付し、ベンゼ
ン／酢酸エチル（４：１）溶出画分を濃縮後、ア
セトンにより再結晶すると化合物（）130mgが
得られる。 化合物（）の分析値 m.p. 189゜〜190゜ 〔α〕２０ Ｄ −18.5゜（Ｃ＝0.10，CHCl3） 元素分析値 Ｃ：60.69，Ｈ：6.19 化学式C33H40O13・１／２H2Oに対する計算値 Ｃ：60.64，Ｈ：6.32 NMR（CDCl3） 0.84 （3H，ｓ，18―CH3） 2.07 （12H，ｓ，17β―，2′―，3′―，
4′OCOCH3） 3.74 （3H，ｓ，COOCH3） 4.02 （1H，ｍ，5′―Ｈ） 4.72 （1H，ｍ，17α―Ｈ） 5.30 （4H，ｍ，1′―，2′―，3′―，4′―Ｈ） 7.20 （1H，bvs，４―Ｈ） 7.25 （1H，dd，Ｊ＝８，２Hz，２―Ｈ） 7.60 （1H，ｄ，Ｊ＝８Hz，１―Ｈ） 化合物（）62mgをメタノール／酢酸エチル
（５：２）14mlに溶解し、次にＯ―カルボキシメ
チルヒドロキシルアミン塩酸塩153mgと10％酢酸
ナトリウム1.5mlを加え、35℃で12時間撹拌後、
水を加え、酢酸エチルで抽出する。有機層を水
洗、乾燥後、溶媒を留去する。残渣を分取TLC
（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝
80／20／2.5）に付し、Rf0.7の画分をクロロホル
ム／メタノール（４：１）で溶出する。溶出液の
溶媒を留去後、残渣をエーテルより再結晶すると
化合物（）51mgが得られる。 化合物（）の分析値 m.p. 185゜〜188゜ 〔α〕２０ Ｄ ＋64.3（Ｃ＝0.11，CH3OH） 元素分析値 Ｃ：56.91，Ｈ：5.97，Ｎ：1.81 化学式C35H43O15N・H2Oに対する計算値 Ｃ：57.14，Ｈ：6.16，Ｎ：1.90 NMR（CD3OD／CDCl3） 0.84 （3H，ｓ，18―CH3） 2.06，2.08 （each6H，each ｓ，17―，2′―，
3′―，4′―OCOCH3） 3.74 （3H，ｓ，COOCH3） 4.69 （2H，ｓ，＝NOCH2―） 6.98 （1H，dd，Ｊ＝９，２Hz，２―Ｈ） 7.16 （1H，ｄ，Ｊ＝９Hz，１―Ｈ） 7.54 （1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４―Ｈ） 化合物（）48mgをジメチルホルムアミド（以
下DMFと略称す）1.5mlに溶解し、氷冷下、トリ
―ｎ―ブチルアミン50μｌおよびイソブチルクロ
ロフオルメート13μｌを加え、30分後、BSA123
mgを含有する含水DMFアルカリ溶液（H2O／
DMF／1N NaOH＝３ml／2.2ml／0.1ml）を加え
PH7.0〜7.5に調整後、室温で12時間撹拌する。反
応液を冷水で24時間透析後、凍結乾燥に付し、化
合物（）166mgを得た。 化合物（）165mgを水50mlに溶解後、5N
NaOHを用いてPH12.0〜12.5に調整し、室温で48
時間撹拌後、冷水で24時間透析する。次いで凍結
乾燥し、化合物（）131mgを得た。 化合物（）、即ち６―オキソエストラジオー
ル―３―グルクロナイド―６―（Ｏ―カルボキシ
メチル）オキシム―BSA結合体のBSA1モル当り
のハプテン結合モル数をUV法により求めたとこ
ろ13.0モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色ウサギ３羽に６―
オキソエストラジオール―３―グルクロナイド―
６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―BSA
結合体抗原を以下の如く免疫した。 即ち、抗原２mgを滅菌生理食塩液0.5mlに溶解
させ、これをフロイント・コンプリート・アジユ
バンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエマル
ジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に皮下
投与した。以後２ケ月に渡つて２週間毎に同様の
投与を行つた。最後の投与（第５回目の投与）か
ら１週間後に、このウサギの耳静脈から10mlを採
血し、これを3000回転、10分間の遠心分離にか
け、得られた抗血清を−20℃に保存した。 使用時においては、該抗血清を解凍し、
BSA0.06％、牛―γ―グロブリン0.05％を含む
0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）を用いて１：3000
の希釈率で希釈し、標準曲線を作成した。 測定操作 エストラジオール―３―グルクロナイドを含む
試料にエストラジオール―３―グルクロナイド―
６，７― 3H（約7500dpm）および抗血清0.25ml
を添加し、４℃で１時間孵置する。次いで50％硫
安溶液0.25mlを添加し、４℃で20分間放置後、
3000回転で15分間遠心し、得られた上澄液0.2ml
をとり、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６―オキソエストラジオール―３―グルクロナ
イド―６―（Ｏ―カルボキシメチル）オキシム―
BSA結合体で免疫したウサギから得られた前述
の抗血清の特異性を調べるために32種のステロイ
ドを用いて、その交叉反応性をエストラジオール
―３―グルクロナイド―６，７―3Hの本抗血清
への結合量を標準曲線より求めた結果を第１表に
示す。 第１表の交叉反応の欄における数値は、非標識
エストラジオール―３―グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種のステロイド
の読みの比率の逆数を百分率で表示したものであ
る。
【表】
【表】
第１表の結果より、本発明の新規化合物を利用
した抗原による抗体を使用したもののエストラジ
オール―３―グルクロナイドに対する特異性が、
他のものに比較して、極めて高く、交叉反応が低
く抑えられていることが明りようである。
した抗原による抗体を使用したもののエストラジ
オール―３―グルクロナイドに対する特異性が、
他のものに比較して、極めて高く、交叉反応が低
く抑えられていることが明りようである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―３―グ
ルクロナイド―６―（ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム―BSA結合体（式中―NH―BSAは牛血清
アルブミン残基を表わし、Ｇは で示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様。） から成るエストラジオール―３―グルクロナイド
測定用抗原。 ２ イ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート（）をメチル（２，３，４―トリ―ｏ
―アセチル―１α―ブロモ―１―デオキシ―Ｄ―
グルコピラノシド）ウロネートと反応させ、６―
オキソエストラジオール―17―アセテート―３―
グルクロナイド―トリアセテートメチルエステル
（）とする工程、 ロ 化学構造式 （式中G′は で示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様。） で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル（）を酢酸ナトリウムの存在
下、ｏ―カルボキシメチルヒドロキシルアミン塩
酸塩と反応させ６―オキソエストラジオール―17
―アセテート―３―グルクロナイド―トリアセテ
ートメチルエステル―６―（ｏ―カルボキシメチ
ル）オキシム（）とする工程、 ハ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル―６―（ｏ―カルボキシメチル）
オキシム（）を牛血清アルブミン（以下BSA
と略称す）と反応させ６―オキソエストラジオー
ル―17―アセテート―３―グルクロナイド―トリ
アセテートメチルエステル―６―（ｏ―カルボキ
シメチル）オキシム―BSA結合体（）とする
工程、 ニ 化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―17―ア
セテート―３―グルクロナイド―トリアセテート
メチルエステル―６―（ｏ―カルボキシメチル）
オキシム―BSA結合体（）を部分的に加水分
解することを特徴とする化学構造式 で示される６―オキソエストラジオール―３―グ
ルクロナイド―６―（ｏ―カルボキシメチル）オ
キシム―BSA結合体（）の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16883481A JPS5871460A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | エストラジオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16883481A JPS5871460A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | エストラジオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5871460A JPS5871460A (ja) | 1983-04-28 |
| JPS6224744B2 true JPS6224744B2 (ja) | 1987-05-29 |
Family
ID=15875380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16883481A Granted JPS5871460A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | エストラジオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5871460A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6427031U (ja) * | 1987-08-10 | 1989-02-16 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5854009A (en) * | 1995-09-19 | 1998-12-29 | Immuna Care Corporation | Method of detecting estrogen-sensitive pathologies |
| JP5329994B2 (ja) * | 2009-01-22 | 2013-10-30 | 栄研化学株式会社 | 試料中のエクオールの免疫測定法 |
-
1981
- 1981-10-23 JP JP16883481A patent/JPS5871460A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6427031U (ja) * | 1987-08-10 | 1989-02-16 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5871460A (ja) | 1983-04-28 |
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