JPS6254318B2 - - Google Patents
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Description
この発明は新規ステロイド化合物、その製造方
法、及びその化合物からなる免疫化学的測定方法
によるエストロンサルフエート測定用の抗体作製
用抗原に関するものである。 放射性物質で標識したホルモンと非標識ホルモ
ンがホルモン抗体に競合して反応することを利用
したラジオイムノアツセイ法、酵素で標識したホ
ルモンと非標識ホルモンがホルモン抗体に競合し
て反応することを利用した酵素抗体法、感作担体
に血球やラテツクスを使用して凝集反応を利用す
る血球凝集反応法やラテツクス凝集反応法等、免
疫化学的測定法によるホルモンの測定方法は生体
試料の測定方法として広く利用されているもので
ある。 これら免疫化学的測定方法によるホルモンの測
定方法においては、抗原抗体反応の平衡定数Ｋが
大なる程感度の優れた測定が可能となるので、そ
の抗体が親和性に優れていなければならないこと
は勿論であるが、感作に用いる抗原の純度が低い
場合にはその中の夾雑物に対する抗体が出来るこ
ととなるので、純度の高い抗原から得られた抗体
を使用しなければならないことも重要なことであ
る。さらに、高純度の抗原で作つた抗体でも、そ
の抗原と類似構造を有する他の物質と反応する所
謂交叉反応（Cross―reaction）の問題から、使
用される抗体はその特異性においても優れている
ことが必要である。 ところで、ホルモンのうちのエストロンサルフ
エートの量の変化を測定することは、予め排卵日
を予測するのに十分効果があるものであるが、こ
のエストロンサルフエートを特異的に測定する方
法に関しては殆んど報告がなく、勿論前述の免疫
化学的測定方法によりエストロンサルフエートを
測定する際に使用する抗体作製用の抗原として利
用できるような化合物についても、未だ何らの提
案もなされていないのが実情である。 本発明者は、排卵日を予測するのに十分に効果
のあるエストロンサルフエートに測定を、前述の
免疫化学的測定方法により測定し得るように、抗
原として使用され得る各種化合物を合成し、これ
から得られた抗体をエストロンサルフエート測定
用の抗体として使用し、その交叉反応の程度を調
査したところ、特許請求の範囲第１項記載の新規
ステロイド化合物、即ち６α―ヒドロキシエスト
ロン―３―サルフエート―６―ヘミサクシネート
―BSA結合化合物を抗原として作製された抗体
が、ラジオイムノアツセイ法、酵素抗体法、血球
凝集反応法、ラテツクス凝集反応法等の免疫化学
的測定方法でエストロンサルフエートを測定する
場合に、近縁ステロイドとの交叉反応を無視し得
る程の極めて高い特異性を呈するものであること
を確認し、本発明を完成するに至つた。 この発明の新規ステロイド化合物は、化学構造
式 （式中―NH―BSAはウシ血清アルブミン残基
を表わす） で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３―
サルフエート―６―ヘミサクシネート―BSA結
合化合物である。 この発明による新規ステロイド化合物〔〕は
特許請求の範囲第２項目に記載した構成、即ち、 (イ) 化学構造式 で表示される公知の化合物６α―ヒドロキシエ
ストラジオール―６―ヘミサクシネートを、例
えばJones試薬と反応させたり、oppenauer酸
化反応に付したり、或るいはクロム酸酸化反応
に付すなどして前記化合物のＤ環の水酸基を酸
化し、６α―ヒドロキシエストロン―６―ヘミ
サクシネートとする工程、 (ロ) (イ)工程で得られた化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―６
―ヘミサクシネートを通常のスルホン化剤、例
えばchlorosulfonic acid，sulfamic acid，
methyl chlorosulfonate，ethyl
chlorosulfonate等のsulfur trioxide complex
とpyridime，あるいはsulfuric acid，又は
pyridine―sulfur trioxide，trimethylamine―
sulfur trioxide， triethylamine―sulfur
trioxide等と反応せしめて、６α―ヒドロキシ
エストロン―３―サルフエート―６―ヘミサク
シネートを製造する工程、 (ハ) (ロ)工程で得られた化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネートに、１
―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩の存在下で、Ｎ―ヒ
ドロキシサクシニミドあるいはｐ―ニトロフエ
ノールを反応させてエステル化を行ない、６α
―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―
６―ヘミサクシネートサクシニミデイルエステ
ル、あるいは６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネート―ｐ―
ニトロフエニルエステルを製造する工程、 (ニ) (ハ)工程で得られた化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネートサクシ
ニミデイルエステル、あるいは同じく化学構造
式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネート―ｐ―
ニトロフエニルエステルと、ウシ血清アルブミ
ンとを反応せしめることによつて製造されるも
のである。 以下本発明の新規ステロイド化合物の具体的な
製造方法、得られた化合物の分析結果、及び得ら
れた化合物を、免疫化学的測定方法によりエスト
ロンサルフエートを測定する際の抗体作製用の抗
原として使用する使用方法等について説明する。 実施例 １ 化学構造式〔〕で表示される公知化合物６α
―ヒドロキシエストラジオール―６―ヘミサクシ
ネート53mgをアセトン７mlに溶解した溶液に、氷
冷下でJones試薬２mlを添加し、２時間放置し
た。メタノール２mlで過剰の試薬を分解した後、
反応混合物を酢酸エチルアセテートで抽出し、得
られた有機層を水洗してから無水Na2SO4で乾燥
し、しかる後に真空乾燥に付した。この残渣をメ
タノールにより再結晶したところ、化学構造式
〔〕に相当する６α―ヒドロキシエストロン―
６―ヘミサクシネートの無色の非結晶物質131mg
を得た。 m.p.174℃ 〔α〕２５ Ｄ＋107.5゜（ｃ＝0.16，メタノール）n.m.r
.
（CD3ODの４％溶液中）δppm： 0.90（3H，ｓ，18―CH3），2.69（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），6.10（1H，ｍ，６β―
Ｈ），6.70（1H，ｄ，Ｊ＝３Hz，４―Ｈ）6.75
（1H，ｑ，Ｊ＝３，９Hz，２―Ｈ），7.25
（1H，ｄ，Ｊ＝９Hz，１―Ｈ） 前記化学構造式〔〕に相当する６α―ヒドロ
キシエストロン―６―ヘミサクシネートをジアゾ
メタンで処理し、次いでメタノールによる再結晶
化を行つたところ、３―メチルエーテル―メチル
エステルの無色の針状結晶物質が得られた。 ｍ・p.137―141℃ 〔α〕１８ Ｄ＋60.0°（ｃ＝0.30，クロロホルム）n.m.
r.（４％CDCl3溶液）δppm： 0.90（3H，ｓ，18―CH3），2.75（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），3.70，380（3H×２，各
ｓ，―COOCH3，３―OCH3），6.10（1H，
ｍ，６β―Ｈ），6.75（1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４
―Ｈ），6.80（1H，ｑ，Ｊ＝９，２Hz，２―
Ｈ），7.20（1H，ｄ，Ｊ＝９Hz，１―Ｈ）， 実験値 Ｃ，69.67；Ｈ，7.03 C24H30O6の計算値 Ｃ，69.54；Ｈ，7.30 前記化学構造式〔〕に相当する６α―ヒドロ
キシエストロン―６―ヘミサクシネート84mgを１
mlのピリジンに溶解させた溶液に、氷冷下でピリ
ジン４mlにクロロスルホン酸0.4mlを溶解させて
ある溶液を添加し、室温にて４時間撹拌した。こ
の反応混合物を1N NaOHで中和してから
Amberlite XAD―２カラム（30cm×１cm内径）
に通し、更に水洗し、メタノールで溶出し、目的
とする前記化学構造式〔〕に相当する物質、６
α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―
６―ヘミサクシネートを得た。 さらに、前記メタノールによる溶出物質を1N
―NH4OHを１滴含むメタノール溶液で析出させ
ることによつて化学構造式〔〕で表示される化
合物のアンモニウム塩68mgを無色の非結晶物質と
して得た。 m.p.264―266℃ 〔α〕２５ Ｄ＋101.3゜（ｃ＝0.30，メタノール）n.m・
r.（４％CD3OD溶液）δppm： 0.99（3H，ｓ，18―CH3），2.75（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），6.17（1H，ｍ，６β―
Ｈ），7.35（3H，ｓ，１―，２―及び４―
Ｈ）， 実験値 Ｃ，50.46；Ｈ，6.02；Ｎ，3.03，
C22H29NO9S・2H2Oの計算値 Ｃ，50.86；Ｈ，6.40；Ｎ，2.70 93％のジオキサン３mlに前述の工程で得られた
化学構造式〔〕に相当する物質、６α―ヒドロ
キシエストロン―３―サルフエート―６―ヘミサ
クシネート30mgを溶解させた溶液に、１―エチル
―３―（３―ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド・塩酸塩80mgとｐ―ニトロフエノール60mg
とを添加し、この溶液を室温にて2.5時間撹拌し
た。次いで、得られた溶液を真空乾燥に付し、残
渣をクロロホルム／メタノール５：１の混合溶媒
を使用した薄層クロマトグラフイーにかけ、スポ
ツト（Rf0.40）に相応する吸着剤をクロロホル
ム／メタノール２：１の混合溶媒で溶出し、化学
構造式〔〕に相当する黄色の非結晶性物質、６
α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―
６―ヘミサクシネート―ｐ―ニトロフエニルエス
テルを得た。 n.m・r.〔４％CD3OD／CDCl3（４：１）溶
液〕δppm： 0.95（3H，ｓ，18―CH3），2.80（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），6.17（1H，ｍ，６β―Ｈ），
7.00（2H，ｄ，Ｊ＝９Hz，
法、及びその化合物からなる免疫化学的測定方法
によるエストロンサルフエート測定用の抗体作製
用抗原に関するものである。 放射性物質で標識したホルモンと非標識ホルモ
ンがホルモン抗体に競合して反応することを利用
したラジオイムノアツセイ法、酵素で標識したホ
ルモンと非標識ホルモンがホルモン抗体に競合し
て反応することを利用した酵素抗体法、感作担体
に血球やラテツクスを使用して凝集反応を利用す
る血球凝集反応法やラテツクス凝集反応法等、免
疫化学的測定法によるホルモンの測定方法は生体
試料の測定方法として広く利用されているもので
ある。 これら免疫化学的測定方法によるホルモンの測
定方法においては、抗原抗体反応の平衡定数Ｋが
大なる程感度の優れた測定が可能となるので、そ
の抗体が親和性に優れていなければならないこと
は勿論であるが、感作に用いる抗原の純度が低い
場合にはその中の夾雑物に対する抗体が出来るこ
ととなるので、純度の高い抗原から得られた抗体
を使用しなければならないことも重要なことであ
る。さらに、高純度の抗原で作つた抗体でも、そ
の抗原と類似構造を有する他の物質と反応する所
謂交叉反応（Cross―reaction）の問題から、使
用される抗体はその特異性においても優れている
ことが必要である。 ところで、ホルモンのうちのエストロンサルフ
エートの量の変化を測定することは、予め排卵日
を予測するのに十分効果があるものであるが、こ
のエストロンサルフエートを特異的に測定する方
法に関しては殆んど報告がなく、勿論前述の免疫
化学的測定方法によりエストロンサルフエートを
測定する際に使用する抗体作製用の抗原として利
用できるような化合物についても、未だ何らの提
案もなされていないのが実情である。 本発明者は、排卵日を予測するのに十分に効果
のあるエストロンサルフエートに測定を、前述の
免疫化学的測定方法により測定し得るように、抗
原として使用され得る各種化合物を合成し、これ
から得られた抗体をエストロンサルフエート測定
用の抗体として使用し、その交叉反応の程度を調
査したところ、特許請求の範囲第１項記載の新規
ステロイド化合物、即ち６α―ヒドロキシエスト
ロン―３―サルフエート―６―ヘミサクシネート
―BSA結合化合物を抗原として作製された抗体
が、ラジオイムノアツセイ法、酵素抗体法、血球
凝集反応法、ラテツクス凝集反応法等の免疫化学
的測定方法でエストロンサルフエートを測定する
場合に、近縁ステロイドとの交叉反応を無視し得
る程の極めて高い特異性を呈するものであること
を確認し、本発明を完成するに至つた。 この発明の新規ステロイド化合物は、化学構造
式 （式中―NH―BSAはウシ血清アルブミン残基
を表わす） で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３―
サルフエート―６―ヘミサクシネート―BSA結
合化合物である。 この発明による新規ステロイド化合物〔〕は
特許請求の範囲第２項目に記載した構成、即ち、 (イ) 化学構造式 で表示される公知の化合物６α―ヒドロキシエ
ストラジオール―６―ヘミサクシネートを、例
えばJones試薬と反応させたり、oppenauer酸
化反応に付したり、或るいはクロム酸酸化反応
に付すなどして前記化合物のＤ環の水酸基を酸
化し、６α―ヒドロキシエストロン―６―ヘミ
サクシネートとする工程、 (ロ) (イ)工程で得られた化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―６
―ヘミサクシネートを通常のスルホン化剤、例
えばchlorosulfonic acid，sulfamic acid，
methyl chlorosulfonate，ethyl
chlorosulfonate等のsulfur trioxide complex
とpyridime，あるいはsulfuric acid，又は
pyridine―sulfur trioxide，trimethylamine―
sulfur trioxide， triethylamine―sulfur
trioxide等と反応せしめて、６α―ヒドロキシ
エストロン―３―サルフエート―６―ヘミサク
シネートを製造する工程、 (ハ) (ロ)工程で得られた化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネートに、１
―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩の存在下で、Ｎ―ヒ
ドロキシサクシニミドあるいはｐ―ニトロフエ
ノールを反応させてエステル化を行ない、６α
―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―
６―ヘミサクシネートサクシニミデイルエステ
ル、あるいは６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネート―ｐ―
ニトロフエニルエステルを製造する工程、 (ニ) (ハ)工程で得られた化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネートサクシ
ニミデイルエステル、あるいは同じく化学構造
式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネート―ｐ―
ニトロフエニルエステルと、ウシ血清アルブミ
ンとを反応せしめることによつて製造されるも
のである。 以下本発明の新規ステロイド化合物の具体的な
製造方法、得られた化合物の分析結果、及び得ら
れた化合物を、免疫化学的測定方法によりエスト
ロンサルフエートを測定する際の抗体作製用の抗
原として使用する使用方法等について説明する。 実施例 １ 化学構造式〔〕で表示される公知化合物６α
―ヒドロキシエストラジオール―６―ヘミサクシ
ネート53mgをアセトン７mlに溶解した溶液に、氷
冷下でJones試薬２mlを添加し、２時間放置し
た。メタノール２mlで過剰の試薬を分解した後、
反応混合物を酢酸エチルアセテートで抽出し、得
られた有機層を水洗してから無水Na2SO4で乾燥
し、しかる後に真空乾燥に付した。この残渣をメ
タノールにより再結晶したところ、化学構造式
〔〕に相当する６α―ヒドロキシエストロン―
６―ヘミサクシネートの無色の非結晶物質131mg
を得た。 m.p.174℃ 〔α〕２５ Ｄ＋107.5゜（ｃ＝0.16，メタノール）n.m.r
.
（CD3ODの４％溶液中）δppm： 0.90（3H，ｓ，18―CH3），2.69（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），6.10（1H，ｍ，６β―
Ｈ），6.70（1H，ｄ，Ｊ＝３Hz，４―Ｈ）6.75
（1H，ｑ，Ｊ＝３，９Hz，２―Ｈ），7.25
（1H，ｄ，Ｊ＝９Hz，１―Ｈ） 前記化学構造式〔〕に相当する６α―ヒドロ
キシエストロン―６―ヘミサクシネートをジアゾ
メタンで処理し、次いでメタノールによる再結晶
化を行つたところ、３―メチルエーテル―メチル
エステルの無色の針状結晶物質が得られた。 ｍ・p.137―141℃ 〔α〕１８ Ｄ＋60.0°（ｃ＝0.30，クロロホルム）n.m.
r.（４％CDCl3溶液）δppm： 0.90（3H，ｓ，18―CH3），2.75（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），3.70，380（3H×２，各
ｓ，―COOCH3，３―OCH3），6.10（1H，
ｍ，６β―Ｈ），6.75（1H，ｄ，Ｊ＝２Hz，４
―Ｈ），6.80（1H，ｑ，Ｊ＝９，２Hz，２―
Ｈ），7.20（1H，ｄ，Ｊ＝９Hz，１―Ｈ）， 実験値 Ｃ，69.67；Ｈ，7.03 C24H30O6の計算値 Ｃ，69.54；Ｈ，7.30 前記化学構造式〔〕に相当する６α―ヒドロ
キシエストロン―６―ヘミサクシネート84mgを１
mlのピリジンに溶解させた溶液に、氷冷下でピリ
ジン４mlにクロロスルホン酸0.4mlを溶解させて
ある溶液を添加し、室温にて４時間撹拌した。こ
の反応混合物を1N NaOHで中和してから
Amberlite XAD―２カラム（30cm×１cm内径）
に通し、更に水洗し、メタノールで溶出し、目的
とする前記化学構造式〔〕に相当する物質、６
α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―
６―ヘミサクシネートを得た。 さらに、前記メタノールによる溶出物質を1N
―NH4OHを１滴含むメタノール溶液で析出させ
ることによつて化学構造式〔〕で表示される化
合物のアンモニウム塩68mgを無色の非結晶物質と
して得た。 m.p.264―266℃ 〔α〕２５ Ｄ＋101.3゜（ｃ＝0.30，メタノール）n.m・
r.（４％CD3OD溶液）δppm： 0.99（3H，ｓ，18―CH3），2.75（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），6.17（1H，ｍ，６β―
Ｈ），7.35（3H，ｓ，１―，２―及び４―
Ｈ）， 実験値 Ｃ，50.46；Ｈ，6.02；Ｎ，3.03，
C22H29NO9S・2H2Oの計算値 Ｃ，50.86；Ｈ，6.40；Ｎ，2.70 93％のジオキサン３mlに前述の工程で得られた
化学構造式〔〕に相当する物質、６α―ヒドロ
キシエストロン―３―サルフエート―６―ヘミサ
クシネート30mgを溶解させた溶液に、１―エチル
―３―（３―ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド・塩酸塩80mgとｐ―ニトロフエノール60mg
とを添加し、この溶液を室温にて2.5時間撹拌し
た。次いで、得られた溶液を真空乾燥に付し、残
渣をクロロホルム／メタノール５：１の混合溶媒
を使用した薄層クロマトグラフイーにかけ、スポ
ツト（Rf0.40）に相応する吸着剤をクロロホル
ム／メタノール２：１の混合溶媒で溶出し、化学
構造式〔〕に相当する黄色の非結晶性物質、６
α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―
６―ヘミサクシネート―ｐ―ニトロフエニルエス
テルを得た。 n.m・r.〔４％CD3OD／CDCl3（４：１）溶
液〕δppm： 0.95（3H，ｓ，18―CH3），2.80（4H，ｓ，―
CO（CH2）2CO―），6.17（1H，ｍ，６β―Ｈ），
7.00（2H，ｄ，Ｊ＝９Hz，
【式】），
7.35（3H，ｓ，１，２―及び４―Ｈ），8.35
（2H，ｄ，Ｊ＝９Hz，
（2H，ｄ，Ｊ＝９Hz，
【式】），
I.R.νＫＢｒ ｎａｘcm-1：1720（ｃ＝０），1040（―SO
3H） 次いで、ピリジン0.9mlに前記工程で得られた
化学構造式〔〕に相当する物質、６α―ヒドロ
キシエストロン―３―サルフエート―６―ヘミサ
クシネート―ｐ―ニトロフエニルエステル50mgを
溶解させた溶液に、リン酸緩衝液（PH7.0）0.9ml
中にウシ血清アルブミン（BSA）85mgを溶解さ
せた溶液を添加し、これを室温にて一晩撹拌し
た。得られた溶液を４℃の流水にて一晩透析し、
さらに凍結真空乾燥に付し、目的とする前記化学
構造式〔〕で表示されるBSA結合化合物80mg
を綿毛状の粉状体で得た。 濃硫酸による呈色反応を利用し、460nmにおけ
る吸光度を測定した結果、前記BSA結合化合物
におけるステロイドとBSAとのモル比率は20：
１であることが確認された。 他方、93％のジオキサン3.2mlに前述の工程で
得られた化学構造式〔〕に相当する物質、６α
―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―６
―ヘミサクシネート70mgを溶解させた溶液に、１
―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド・塩酸塩200mgとＮ―ヒドロキシ
サクシニミド140mgとを添加し、この溶液を室温
にて２時間撹拌し、次いで得られた溶液を真空乾
燥に付し、更に残渣をシリカゲルのカラムクロマ
トにかけ、次いで、クロロホルム／メタノール
８：１の混合溶媒で溶出させて化学構造式〔〕
に相当する無色の非結晶性物質、６α―ヒドロキ
シエストロン―３―サルフエート―６―ヘミサク
シネート―Ｎ―ヒドロキシサクシニミデイルエス
テル31mgを得た。 n.m.r.（４％CD3OD溶液）δppm： 0.92（3H，ｓ，18―CH3），2.60，2.62（4H×
２，各ｓ，―CO（CH2）2CO―），6.10（1H，
ｍ，６β―Ｈ），7.21（3H，ｓ，１，２―及び
４―Ｈ） かくして得られた６α―ヒドロキシエストロン
―３―サルフエート―６―ヘミサクシネート―Ｎ
―ヒドロキシサクシニミデイルエステルを、前記
６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート
―６―ヘミサクシネート―ｐ―ニトロフエニルエ
ステルの代りに使用して、同様の方法でウシ血清
アルブミン（BSA）と反応せしめても、目的と
する前記化学構造式〔〕で表示されるBSA結
合化合物が得られることが確認されている。 実施例 ２ 抗体の作製（ウサギの免疫） 在来種白色雄性家ウサギを、６α―ヒドロキシ
エストロン―３―サルフエート―６―ヘミサクシ
ネート―BSA結合化合物を抗原として、以下の
ごとく免疫した。 即ち、抗原２mgを滅菌した等張食塩溶液0.5ml
に溶解させ、これをFreundコンプリートアジユ
バンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエマル
ジヨンをウサギの肩甲部及び足蹠数個所に皮下注
射した。この操作を２週間に一度の割合で２か月
間、更に１か月に一度の割合で繰り返し行つた。 以上のようにして免疫したウサギの血液を、
3000回転／分で10分間の遠心分離にかけ、得られ
た抗血清をBSA0.06％とウシガンマグロブリン
0.05％を含む0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）で稀釈
して利用する。 アツセイ操作 標準エストロンサルフエート20〜2000pgと、
3K標識エストロンサルフエート77pg（2000d.b.
m.）とを用い標準曲線を作製した。20000倍に稀
釈した抗血清0.25mlを添加し、この混合物を室温
で１時間孵置する。次いで、50％（NH4）2SO4溶
液0.25mlを添加し、懸濁液を室温に15分間放置
後、3000回転／分で10分間の遠心分離にかける。
以上の工程によつて得られたそれぞれの上澄液
0.2mlを用いその放射能を測定した。 交叉反応性について ６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネート―BSA結合化合物で
免疫した前述のウサギから得られた抗血清につい
ての33種の近縁ステロイドとの交叉反応性を試験
した結果を第１表に表示する。
3H） 次いで、ピリジン0.9mlに前記工程で得られた
化学構造式〔〕に相当する物質、６α―ヒドロ
キシエストロン―３―サルフエート―６―ヘミサ
クシネート―ｐ―ニトロフエニルエステル50mgを
溶解させた溶液に、リン酸緩衝液（PH7.0）0.9ml
中にウシ血清アルブミン（BSA）85mgを溶解さ
せた溶液を添加し、これを室温にて一晩撹拌し
た。得られた溶液を４℃の流水にて一晩透析し、
さらに凍結真空乾燥に付し、目的とする前記化学
構造式〔〕で表示されるBSA結合化合物80mg
を綿毛状の粉状体で得た。 濃硫酸による呈色反応を利用し、460nmにおけ
る吸光度を測定した結果、前記BSA結合化合物
におけるステロイドとBSAとのモル比率は20：
１であることが確認された。 他方、93％のジオキサン3.2mlに前述の工程で
得られた化学構造式〔〕に相当する物質、６α
―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート―６
―ヘミサクシネート70mgを溶解させた溶液に、１
―エチル―３―（３―ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド・塩酸塩200mgとＮ―ヒドロキシ
サクシニミド140mgとを添加し、この溶液を室温
にて２時間撹拌し、次いで得られた溶液を真空乾
燥に付し、更に残渣をシリカゲルのカラムクロマ
トにかけ、次いで、クロロホルム／メタノール
８：１の混合溶媒で溶出させて化学構造式〔〕
に相当する無色の非結晶性物質、６α―ヒドロキ
シエストロン―３―サルフエート―６―ヘミサク
シネート―Ｎ―ヒドロキシサクシニミデイルエス
テル31mgを得た。 n.m.r.（４％CD3OD溶液）δppm： 0.92（3H，ｓ，18―CH3），2.60，2.62（4H×
２，各ｓ，―CO（CH2）2CO―），6.10（1H，
ｍ，６β―Ｈ），7.21（3H，ｓ，１，２―及び
４―Ｈ） かくして得られた６α―ヒドロキシエストロン
―３―サルフエート―６―ヘミサクシネート―Ｎ
―ヒドロキシサクシニミデイルエステルを、前記
６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート
―６―ヘミサクシネート―ｐ―ニトロフエニルエ
ステルの代りに使用して、同様の方法でウシ血清
アルブミン（BSA）と反応せしめても、目的と
する前記化学構造式〔〕で表示されるBSA結
合化合物が得られることが確認されている。 実施例 ２ 抗体の作製（ウサギの免疫） 在来種白色雄性家ウサギを、６α―ヒドロキシ
エストロン―３―サルフエート―６―ヘミサクシ
ネート―BSA結合化合物を抗原として、以下の
ごとく免疫した。 即ち、抗原２mgを滅菌した等張食塩溶液0.5ml
に溶解させ、これをFreundコンプリートアジユ
バンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエマル
ジヨンをウサギの肩甲部及び足蹠数個所に皮下注
射した。この操作を２週間に一度の割合で２か月
間、更に１か月に一度の割合で繰り返し行つた。 以上のようにして免疫したウサギの血液を、
3000回転／分で10分間の遠心分離にかけ、得られ
た抗血清をBSA0.06％とウシガンマグロブリン
0.05％を含む0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）で稀釈
して利用する。 アツセイ操作 標準エストロンサルフエート20〜2000pgと、
3K標識エストロンサルフエート77pg（2000d.b.
m.）とを用い標準曲線を作製した。20000倍に稀
釈した抗血清0.25mlを添加し、この混合物を室温
で１時間孵置する。次いで、50％（NH4）2SO4溶
液0.25mlを添加し、懸濁液を室温に15分間放置
後、3000回転／分で10分間の遠心分離にかける。
以上の工程によつて得られたそれぞれの上澄液
0.2mlを用いその放射能を測定した。 交叉反応性について ６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネート―BSA結合化合物で
免疫した前述のウサギから得られた抗血清につい
ての33種の近縁ステロイドとの交叉反応性を試験
した結果を第１表に表示する。
【表】
【表】
第１表の結果より、本発明の新規化合物を使用
した抗原により調製した抗血清は、エストロンサ
ルフエートに対する特異性が極めて高く、近縁ス
テロイドとの交叉反応は低く抑えられていること
が明瞭である。 以上、本発明の新規化合物を、ラジオイムノア
ツセイ法によるエストロサルフエート測定用の抗
体作製用抗原として使用する例を説明したが、同
様にして酵素抗体法、血球凝集反応法、ラテツク
ス凝集反応法等、免疫化学的測定方法等によりエ
ストロンサルフエートの量を測定する際の抗体作
製用抗原としても使用しうるものであることは勿
論である。 次にその代表的な使用方法を説明する。 実施例 ３ ６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネートBSA結合化合物の
感作血球の製造 ホルマリン固定羊血球をPH４の食塩加リン酸緩
衝液（以下PBSと略記する）で遠心洗浄したの
ち、PBSで４％に懸濁させ、更に、これに等量の
0.01％タンニン酸PBS溶液を添加し、56℃で30分
間振盪させた。次いで、これを遠心分離して得ら
れた血球をPBSで洗浄してからPBSによる８％溶
液となし、これに0.1％の６α―ヒドロキシエス
トロン―３―サルフエート―６―ヘミサクシネー
トBSA結合化合物のPBS溶液を等量添加し、56℃
で２時間撹拌した。次いでPBSで遠心洗浄した
後、3.2％正常家ウサギ血清PBS及び５％乳糖含
有PBSで1.5％の懸濁液とし、これを0.1ml宛アン
プルに分注した後、直ちに凍結乾燥し、６α―ヒ
ドロキシエストロン―３―サルフエート―６―ヘ
ミサクシネートBSA結合化合物の感作血球を得
た。 エストロンサルフエートの測定 前記感作血球と抗体との組合わせによつて感度
20nｇ／mlに調製した試薬から得られた標準エス
トロンサルフエートを、生理食塩水及び男子尿に
エストロンサルフエートとして後記第２表に示す
種々の濃度に溶解し、これを試験管に0.1ml宛分
注した後、希釈抗エストロンサルフエート抗血清
0.1mlを混合した。 次いで、前述のアンプル内に凍結乾燥してある
６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート
―６―ヘミサクシネートBSA結合化合物の感作
血球を0.2mlのPBS懸濁液とし、これを前記各試
験管に添加し、良く混合した後、ミラー付スタン
ド上に静置し、２時間後に管底像を観察した。 この試薬の感度測定結果を第２表に示す。
した抗原により調製した抗血清は、エストロンサ
ルフエートに対する特異性が極めて高く、近縁ス
テロイドとの交叉反応は低く抑えられていること
が明瞭である。 以上、本発明の新規化合物を、ラジオイムノア
ツセイ法によるエストロサルフエート測定用の抗
体作製用抗原として使用する例を説明したが、同
様にして酵素抗体法、血球凝集反応法、ラテツク
ス凝集反応法等、免疫化学的測定方法等によりエ
ストロンサルフエートの量を測定する際の抗体作
製用抗原としても使用しうるものであることは勿
論である。 次にその代表的な使用方法を説明する。 実施例 ３ ６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネートBSA結合化合物の
感作血球の製造 ホルマリン固定羊血球をPH４の食塩加リン酸緩
衝液（以下PBSと略記する）で遠心洗浄したの
ち、PBSで４％に懸濁させ、更に、これに等量の
0.01％タンニン酸PBS溶液を添加し、56℃で30分
間振盪させた。次いで、これを遠心分離して得ら
れた血球をPBSで洗浄してからPBSによる８％溶
液となし、これに0.1％の６α―ヒドロキシエス
トロン―３―サルフエート―６―ヘミサクシネー
トBSA結合化合物のPBS溶液を等量添加し、56℃
で２時間撹拌した。次いでPBSで遠心洗浄した
後、3.2％正常家ウサギ血清PBS及び５％乳糖含
有PBSで1.5％の懸濁液とし、これを0.1ml宛アン
プルに分注した後、直ちに凍結乾燥し、６α―ヒ
ドロキシエストロン―３―サルフエート―６―ヘ
ミサクシネートBSA結合化合物の感作血球を得
た。 エストロンサルフエートの測定 前記感作血球と抗体との組合わせによつて感度
20nｇ／mlに調製した試薬から得られた標準エス
トロンサルフエートを、生理食塩水及び男子尿に
エストロンサルフエートとして後記第２表に示す
種々の濃度に溶解し、これを試験管に0.1ml宛分
注した後、希釈抗エストロンサルフエート抗血清
0.1mlを混合した。 次いで、前述のアンプル内に凍結乾燥してある
６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエート
―６―ヘミサクシネートBSA結合化合物の感作
血球を0.2mlのPBS懸濁液とし、これを前記各試
験管に添加し、良く混合した後、ミラー付スタン
ド上に静置し、２時間後に管底像を観察した。 この試薬の感度測定結果を第２表に示す。
【表】
実施例 ４
６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネート―BSA結合化合物
の感作ラテツクス粒子の製造 ６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネート―BSA結合化合物の
0.1％グリシン緩衝液（PH8.6）５mlを、２％ポリ
スチレンラテツクス粒子（粒径0.81μ）懸濁液５
mlに徐々に添加し、37℃で２時間撹拌した。反応
終了後、10000回転／分で50分間の遠心分離にか
け、さらにグリシン緩衝液で遠心洗浄し、残渣を
グリシン緩衝液10mlに再懸濁させ、窒化ナトリウ
ムを添加し、0.1％の窒化ナトリウムを含む懸濁
液となすことにより、６α―ヒドロキシエストロ
ン―３―サルフエート―６―ヘミサクシネートー
BSA結合化合物の感作ラテツクス粒子を得た。 エストロンサルフエートの測定 前記感作ラテツクス粒子と抗体との組み合わせ
により、感度10nｇ／mlに調製した試薬を使用
し、標準エストロンサルフエートを生理食塩水お
よび男子尿にエストロンサルフエートとして後記
第３表に示す種々の濃度に溶解した稀釈液を得
た。 一方、各試験管に希釈抗エストロンサルフエー
ト抗血清0.05ml宛を分注し、これに前記各濃度に
希釈した標準エストロンサルフエート液0.05ml宛
を添加し、良く混合する。 得られた混合液を枠付反応グラス板上に0.05ml
宛移し、次いで前述の感作ラテツクス粒子懸濁液
0.025ml宛を該グラス板上の混合液に加え、グラ
ス板をゆるやかに揺動させ、５分後に凝集像の観
察を行つた結果を第３表に示す。
ト―６―ヘミサクシネート―BSA結合化合物
の感作ラテツクス粒子の製造 ６α―ヒドロキシエストロン―３―サルフエー
ト―６―ヘミサクシネート―BSA結合化合物の
0.1％グリシン緩衝液（PH8.6）５mlを、２％ポリ
スチレンラテツクス粒子（粒径0.81μ）懸濁液５
mlに徐々に添加し、37℃で２時間撹拌した。反応
終了後、10000回転／分で50分間の遠心分離にか
け、さらにグリシン緩衝液で遠心洗浄し、残渣を
グリシン緩衝液10mlに再懸濁させ、窒化ナトリウ
ムを添加し、0.1％の窒化ナトリウムを含む懸濁
液となすことにより、６α―ヒドロキシエストロ
ン―３―サルフエート―６―ヘミサクシネートー
BSA結合化合物の感作ラテツクス粒子を得た。 エストロンサルフエートの測定 前記感作ラテツクス粒子と抗体との組み合わせ
により、感度10nｇ／mlに調製した試薬を使用
し、標準エストロンサルフエートを生理食塩水お
よび男子尿にエストロンサルフエートとして後記
第３表に示す種々の濃度に溶解した稀釈液を得
た。 一方、各試験管に希釈抗エストロンサルフエー
ト抗血清0.05ml宛を分注し、これに前記各濃度に
希釈した標準エストロンサルフエート液0.05ml宛
を添加し、良く混合する。 得られた混合液を枠付反応グラス板上に0.05ml
宛移し、次いで前述の感作ラテツクス粒子懸濁液
0.025ml宛を該グラス板上の混合液に加え、グラ
ス板をゆるやかに揺動させ、５分後に凝集像の観
察を行つた結果を第３表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 化学構造式 （式中―NH―BSAはウシ血清アルブミン残基
を表わす） で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３―
サルフエート―６―ヘミサクシネート―BSA結
合化合物。 ２ (イ) 化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストラジオー
ル―６―ヘミサクシネートのＤ環の水酸基を酸
化することにより、６α―ヒドロキシエストロ
ン―６―ミキサクシネートとする工程、 (ロ) 化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―６
―ヘミサクシネートをスルホン化して６α―ヒ
ドロキシエストロン―３―サルフエート―６―
ヘミサクシネートとする工程 (ハ) 化学構造式 で示される６α―ヒドロキシエストロン―３―
サルフエート―６―ヘミサクシネートに、１―
エチル―３―（３―ジメチルアミノブロピル）
カルボジイミド・塩酸塩の存在下で、Ｎ―ヒド
ロキシサクシニミドあるいはｐ―ニトロフエノ
ールを反応させ、６α―ヒドロキシエストロン
―３―サルフエート―６―ヘミサクシネートサ
クシニミデイルエステル、あるいは６α―ヒド
ロキシエストロン―３―サルフエート―６―ヘ
ミサクシネート―ｐ―ニトロフエニルエステル
とする工程、 (ニ) 化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネートサクシ
ニミデイルエステル、あるいは化学構造式 で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３
―サルフエート―６―ヘミサクシネート―ｐ―
ニトロフエニルエステルをウシ血清アルブミン
と反応せしめることを特徴とする化学構造式 （式中―NH―BSAはウシ血清アルブミン残基
を表わす） で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３―
サルフエート―６―ヘミサクシネート―BSA結
合化合物の製造方法。 ３ 化学構造式 （式中―NH―BSAはウシ血清アルブミン残基
を表わす） で表示される６α―ヒドロキシエストロン―３―
サルフエート―６ヘミサクシネート―BSA結合
化合物からなることを特徴とする免疫化学的測定
方法によるエストロンサルフエート測定用の抗体
作製用抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3597580A JPS56133300A (en) | 1980-03-21 | 1980-03-21 | Novel steroid compound, its preparation, and antigen for preparing antibody for measuring estrone sulfate by immunochemical measurement comprising it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3597580A JPS56133300A (en) | 1980-03-21 | 1980-03-21 | Novel steroid compound, its preparation, and antigen for preparing antibody for measuring estrone sulfate by immunochemical measurement comprising it |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56133300A JPS56133300A (en) | 1981-10-19 |
| JPS6254318B2 true JPS6254318B2 (ja) | 1987-11-13 |
Family
ID=12456903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3597580A Granted JPS56133300A (en) | 1980-03-21 | 1980-03-21 | Novel steroid compound, its preparation, and antigen for preparing antibody for measuring estrone sulfate by immunochemical measurement comprising it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56133300A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61132867A (ja) * | 1984-11-30 | 1986-06-20 | Akiko Kubodera | エストリオ−ル３−サルフエ−トのイムノアツセイ |
| CN112625119B (zh) * | 2020-11-25 | 2021-10-22 | 杭州隆基生物技术有限公司 | 一种雌酮抗原及其制备方法 |
| CN114456224B (zh) * | 2022-04-12 | 2022-08-12 | 北京纳百生物科技有限公司 | 硫酸雌酮半抗原的合成及应用 |
-
1980
- 1980-03-21 JP JP3597580A patent/JPS56133300A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56133300A (en) | 1981-10-19 |
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