KR930000057B1 - 6-치환-에스트리올-3-설페이트 단백질 접합체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

6-치환-에스트리올-3설페이트 단백질의 접합체의 제조방법
제1도는 새파로스 4B에 고정된 항-에스트리올-3-설페이트 항체의 스캐차드 플로트 그래프를 나타내는 것이다.
제2도는 에스트리올-3-설페이트와 혈장 단백질의 비특이성 결합에 대한 각종 물질의 영향을 나타내는 것이다.여기서, ○-○는 물질을 첨가하지 않은 경우,
Figure kpo00001
는 시스테인(0.1몰/ι)을 첨가한 경우, △-△는 글리신(0.2몰/ι)을 첨가한 경우 및
Figure kpo00002
는 글루타민(0.1몰/ι)을 첨가한 경우이다.
제3도는 에스트리올-3-설페이트의 방사성 면역 분석 시함에 의한 검정 곡선을 나타내는 것이다.
제4도는 정상 임신기간 동안의 에스트리올-3-설페이트 및 에스트리올을 혈장 농도를 나타내는 것이다. 여기서,
Figure kpo00003
는 결합된 에스트리올 값 및 △는 비결합된 에스트리올 값이다.
본 발명은 에스트리올-3-설페이트의 면역 분석에 관한 것이다.더욱 특별하게는, 본 발명은 에스트리올-3-설페이트에 특이성을 갖는 항체의 제조용 시약으로 이용되는 6-치환-에스트리올-3-설페이트, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
에스트리올-3-설페이트는 태아에게 있어 에스트리올의 주대사물질이라고 보고었다[U. Goebeιsmann et aι. : Acta Endocrinoι., 50, 273 (1965) aιc
Figure kpo00004
550 (1966)]. 또한, 에스트리올-3-설페이트가 변하지 않은 채로 태아에서 임부에게로 이동될 수 있다는 것이 제안되었다. 임신 또는 태아의 기능적 성장 과정의 태반을 전단하는데 있어서 에스트리올-3-설페이트를 측정은 매우 중요하다. 그러나, 종래의 방법에 의한 에스트리올-3-설페이트의 측정은 가수분해, 가용매분해, 용매추출, 크로마토그래피분리 등과 같은 난이한 공정을 필요로 하며, 에스트리올-3-설페이트를 직접 분석하는 어떤 확실한 방법도 아직 개발되지 않고 있다.
최근, 면역 분석의 높은 민감성 때문에 임상 화학을 포함한 각종분야에서 면역 분석에 대한 많은 관심이 기울어지고 있다. 에스트리올-3-설페이트의 정량분석을 위한 확실한 분석 방법을 개발하기 위해 광범위한 연구가 진행되었으며, 에스트리올-3-설페이트에 높은 특이성을 나타내는 항체가 성공적으로 제조되었다. 이 항체를 표지된 에스트리올-3-설페이트와 결합시켜 사용하면 가수분해, 가용해분해, 용매추출 및 크로마토그래피 분리와 같은 난이한 공정을 거치지 않고도 높은 민감성을 갖는 단순 공정의 에스트리올-3-설페이트의 면역 분석이 수행될 수 있다.
본 발명에서, 특정적인 것은 에스트리올-3-설페이트에 특이성을 갖는 항체를 제조하기 위해 하기 일반식(Ⅰ)의 6-치환-에스트리올-3-설페이트 단백질 접합체(이후 “EAP 접합체”로 약칭한다.)를 이용한다는 것이다.
Figure kpo00005
(상기 식중, A는 =N-O- 또는 -O-CO- 이고, n은 1~4의 정수이며, -NH-P는 아미노형에서 수소원자를 제거한 단백질의 잔기이다) ESP 접합체(Ⅰ)는 신규의 물질이며, 일반식
Figure kpo00006
(식중, A 및 n은 상기에 정의한 바와 같다)의 상응하는 카르복실산을 수성 매질에서 수용성 카르보디이미드와 같은 축합체 존재하에 일반식
H2N-P
(식중, P는 상기에 정의한 바와 같다)의 단백질과 축합시킴으로써 제조될 수 있다.
더욱 특별하게는, ESP접합체(Ⅰ)은 예를들어, A가 =N-O-이고, n이 1의 정수이며, -NH-P가 아미노형에서 수소원자를 제거한 소혈청 알부민의 잔기인 경우, 하기의 도식에 나타낸 방법에 의해 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트로부터 제조될 수 있다.
Figure kpo00007
Figure kpo00008
(상기 식중, R은 저급 알카놀(예. 아세틸, 프로피오닐, 부티릴) 또는 벤조일과 같은 아실기이다
상기 방법에서, 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트(Ⅳ)를 먼저 부분 가수분해하여 6-옥소에스트리올-16, 17-디아실레이트(Ⅴ)를 수득한다. 부분 가수분해는 예를들면 수성 매질중에서 무기염기, 특히 알칼리 탄산염(예. 탄산나트륨, 탄산칼륨) 또는 알칼리 중탄산염(예. 중탄산나트륨, 중탄산칼륨)과 같은 염기로 -10~30℃의 온도에서 처리함으로써 수행될 수 있다. 수성 매질은 알카놀(예. 메탄올, 에탄올)과 같은 어떤 불활성 수-혼화성 유기용매를 함유할 수 있다.
생성된 디아실레이트(Ⅴ)를 o-카르복시메틸 히드록실아민과 축합하여 6-옥소에스트리올-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아실레이트(Ⅳ)를 수득한다. 축합은 디아실레이트(Ⅴ)를 불활성용매(예. 메탄올, 에탄올)중에서 -10~30℃의 온도에서 0-카르복시메틸히드록실아민으로 처리함으로써 수행할 수 있다.
생성된 옥심 유도체(Ⅳ)를 실온(0~30℃) 내지 환류 온도에서 유기 염기(예. 피리딘, 트리에틸아민, 디메틸아닐린)와 같은 염기 존재하에 클로로술폰과 반응시켜 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아실레이트(Ⅲ)를 수득한다. 필요하다면 어떤 불활성용매(예. 벤젠, 톨루엔)를 사용할 수도 있다.
이렇게 제조된 3-설페이트-o-카르복시메틸옥심-16, 17-디아실레이트(Ⅲ)를 가수분해하여 상응하는 3-설페이트-o-카르복시메틸옥심(Ⅱ), 즉 6-옥소에스트리올-3-설페이트-o-카르복시메틸옥심을 수득한다. 가수분해는 공지의 방법에 의해, 예를들면 수성 매질 및 실온(0~30℃)에서 무기염기(예. 수산하나트륨, 수산화칼륨)와 같은 염기로 처리함으로써 수행될 수 있다.
수득된 3-설페이트-o-카르복시메틸옥심(Ⅱ)을 수용성 카르보디이미드(예. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드)와 같은 축합제 존재하에 소혈청 알부민과 같은 단백질과 축합시켜 ESP 접합체(Ia)를 수득한다. 축합은 온화한 조건, 예를들면 0~10℃에서 서서히 교반하면서 수행하는 것이 바람직하다. 필요하다면, 어떤 불활성 용매(예. 피리딘, 인산완충액)를 사용할 수도 있다.
예를들어, A가 -O-CO- 이고, n이 2의 정수이며, -NH-P가 아미노 형에서 수소를 제거한 소혈청 알부민의 잔기일 때, ESP 접합체(Ib)는 다음과 같이 제조할 수 있다.즉, 6-옥소에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트(Ⅵ)를 카르보닐기를 히드록시메틸텐기로 전환시키는 공지 방법에 의해 환원시켜 6-히드록시에스트리올-3, 16, 17-트리아실레이트를 수득하고, 이를 숙신산 무수물과 반응시켜 6-위치에 상응하는 헤미숙시네이트를 수득한다. 헤미숙시네이트를 수성 매질에서 탄산칼륨과 같은 염기로 가수분해함으로써 3-위치의 아실기를 선택적으로 제거한다. 생성된 6-히드록시에스트리올-16, 17-디아실레이트-6-헤미숙시네이를 상기와 같은 방법으로 3-위치의 황산화, 16 및 17- 위치의 가수분해 및 6-측쇄의 아미드화를 수행하여 ESP 접합체 (Ib)를 수득할 수 있다.
일반식 P-NH2로 표시되는 담백질로는 면역 화학의 분야에서 합텐용 담체로서 통상적으로 이용되는 것이 사용될 수 있으며, 그의 특정예로는 알부민, 글로부틴 등이 있다. 특히, 소혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민등을 사용하는 것이 바람직하다.
ESP 접합체를 이용하여 에스트리올-3-설페이트에 대한 항체를 제조하기 위해서는, ESP 접합체를 척추 동물(예. 소, 말, 양, 염소, 토끼, 쥐, 생쥐)중에서 선택된 생체에 비경구 투여하여 생체내에서 항체를 제조한다.그리고, 생체로부터 체액(예. 혈액)을 채취하고 임의로 불순물을 제거한다. 보통, 항체를 함유한 혈청, 즉 항-혈청을 이용한다.
항체와의 결합에 사용되는 표지된 항원으로는 적당히 표지된 에스트리올-3-설페이트가 사용될 수 있다. 표지를 위해 방사성 물질, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 이용된다. 이들 표지물질은 표지된 항원의 면역활성이 남아있는 한 에스트리올-3-설페이트의 어떤 위치에도 도입될 수 있다. 예를들어,3H 또는14C로 표지를 수행할 때, 에스트리올-3-설페이트를 구성하는 원소를 상기 표지로 치환하게 되므로, 표지된 항원의 면역 활성은 에스트리올-3-설페이트의 활성으로부터 변화되지 않는다. 표지를125I 또는131I로 수행할때, 적당히 접합체를 사용하여 에스트리올-3-설페이트에 도입하여, 항체에 대한 그의 친화도가 에스트리올 3-설페이트의 친화도와 다르도록 하므로, 면역 활성의 유지를 위해 주의가 기울어져야 항다.
표지는 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다, 예를들어, 방사성 요오드의 표지는 산화제(예. 클로라민T, 요오다인 클로라이드)를 사용한 방법 또는 효소(예. 락토퍼옥시다제)를 사용한 방법과 같은 직접적 방법, 또는 작용기(예. 카르복실, 아미노, 티올)를 에스트리올-3-설페이트에 도입하고, 작용기를 방사성 동위원소로 표지된 요오드화 화합물(예. 요오드화티라민, 요오드화티로신, 요오드화히스타민, 볼톤-훈터시약)과 결합시키는 간접적방법에 의해 수행될 수 있다. 방사성 요오드로 표지시키는 대표적인 예는 6-옥소 에스트리올-3-설페이트0-카르복시메틸옥심을 수용성 카르보디아미드 존재하에 방사성 요오드 원자로 표지된 요오드화히스타민과 축합하여 목적하는 방사성 요오드-표지항원을 수득하는 것이다. 요오드화히스타민 대신에 벤젠고리가 방사성 요오드 원자로 표지된 베타-(4-히드록시페닐)에틸 아민 또는 베타-(4-히드록시페닐)알라닌 메틸 에스테르를 사용할 수 있다.
진단될 인체로부터 수득된 혈청 시료(미지량의 에스트리올-3-설페이트함유)에 다음과 같은 방법에 의해 본 발명의 면역 분석을 수행한다. 즉, 각종 량의 에스트리올 3-설페이트를 혈청에 가하여 표준 용액을 제조한다. 각 표준 용액에, 상술한 바와같이 지정량의 표지된 항원을 가하고, 상술한 항체를 가하여 통상적인 조건하에 항원-항체를 반응을 수행한다. 항원-항체 결합 생성물(B) 및 항체가 결합하지 않은 항원 분획(F)를 전기 영동, 겔 여과, 염석 또는 흡착과 같은 공지의 분리 공정에 의해 분리한다. (B) 및 (F)의 표지 역가를 표지 항원의 제조에 채택된 표지방법에 따라 적당한 분석 방법에 의해 측정하고, 상기와 같은 공정을 더 수행한다. 최종적으로, 혈청 시료에서의 에스트리올-3-설페이트 농도를 검정 곡선을 참고로 결정한다.
본 발명의 실제적이며 바람직한 예는 하기의 실시예에 더욱 상세하게 나타낸다. 이들 실시예에 사용된 유리된 스테로이드, 소혈청 알부민(BSA) 및 소의 감마 글로부린 (BGG)운 시그마 화학사제의 상품이며, 다른 시약은 나까라이 화학사의 제품이다.
[실시예 1]
(A) 6-옥소에스트리올-16, 17-디아세테이트(V : R=COCH3)의 제조 :
메탄올(30mι)에 용해시킨 6-옥소에스트리올-13, 16-17-트리아세테이트 (VI : R=COCH3) (500mg)[첨고, Wright et aι. : Steroids,
Figure kpo00009
755 (1973)]의 용액에 5% 탄산 칼륨 용액(5mι)을 가하고, 생성된 용액을 빙냉하면서 2시간 동안 방치한다. 0.1N 염산을 이용하여 반응 혼합물을 중화하고, 농축시키고 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 물로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 감압하에 농축시킨다. 잔류물을 실리카겔컬럼 크로마토그래피한다[용리액 ; n-헥산 : 에틸 아세테이트 (2 : 1)]. 용출액을 메탄올로 재결정하여 무색 프리즘상의 6-옥소에스트리올-16, 17 -디아세테이트(V : R=COCH3) (248mg)를 수득한다. 융점 236~239℃
IR(KBr) : νmax3420(Ar-OH), 1740(-OCOCH3), 1760(CO).
NMR(CDCι3) :
Figure kpo00010
0.84(3H, s, 18-CH3), 2.06(3H, s, 17-OCOCH3), 2.09 (3H, s, 16-OCOCH3), 4.92(1H, d, J=6Hz, 17-H), 6.98~7.54(3H, m, Ar-H).
(B) 6-옥소에스트리올-0-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(IV : R=COCH3)의 제조 :
메탄올(10mι)에 용해시킨 상기 (A)에서 수득한 6-옥소에스트리올-16, 17 -디아세테이트(V : R=COCH3) (150mg)의 용액에 0-카르복시메틸 히드록실아민 히드로클로라이드(100mg)를 가한다. 1N NaOH 용액을 이용하여 생성된 용액을 중화하고 실온에서 밤새 방치한다. 생성된 용액을 농축시키고 에틸 아세테이트로 추출한다.추출물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피한다.[용리액 : n-헥산 : 에틸 아세테이트(2 : 1)]. 용출액을 메탄올로 재결정하여 무색 프리즘상의 6-옥소에스트리올-0카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(IV : R=COCH) (126mg)倡 수득한다.
융점 : 188~190℃
IR(KBr) : νmax3400(Ar-OH), 1620~1540(C=N-, COOH).
NMR(CDCι3) :
Figure kpo00011
0.76(3H,s, 18-CH3), 2.05(3H, s, 17-OCOCH3), 2.08 (3H, s, 16-OCOCH3), 4.27(2H, s, =NOCH2), 6.82~7.37(3H, m, Ar-H).
원소분석 ; C24H29O8N
계산치 : C ; 62.73, H ; 6.36, N ; 3.50
실측치 : C ; 63.75, H ; 7.18, N ; 2.30
(C) 6-옥소에트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(III : R=COCH3)의 제조 :
피리딘(4mι)에 용해시킨 클로로술폰산(200mg)의 용액을 -10℃에서 냉각한 후, 상기 (B)에서 수득한 6-옥소에스트리올-0-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(100mg)를 용해시킨 피리딘(1.5mι) 용액에 가하고, 생선된 혼합물을 37℃에서 2.5시간 동안 교반하여, 6-옥소에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세테이트(III : R=COCH3)를 제조한다.
(D) 6-옥소에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심(II)의 제조 :
(C)에서 수득한 6-옥소에스트리올-3-솔페이트-0-카르복시메틸옥심-16, 17-디아세에이트(III : R=COCH3)를함유하는 반응 혼합물을 0.1N NAOH 용액에 쏟아 붓고 실온에서 밤새 방치한다. 생성된 용액을 물(300mι)로 희석하고 앰버라이트 XAD-2컬럼에 통과시킨 후 물로 세척한다. 메탄올(50mι)로 컬럼을 용출시킨다. 용출액을 감압하 25℃에서 농축시킨다. 잔류물을 박막 크로마토그래피한다(전개액 : 클로로포름 : 메탄올 : 암모니아=15 : 5 : 1 부피비). Rf=0.1에 해당하는 분획을 클로로포름, 메탄올 및 암모니아(15 : 7 : 1 부피)의 혼합물로 용출시켜 무색 무정형 물질인 6-옥소에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸 옥심(II) (78mg)을 수득한다.
융점 : 300℃이상
IR(KBr) : νmax1060(-SO3H).
NMR(CD3OD) :
Figure kpo00012
0.76(3H, s, 18-CH3), 4.52(2H, s, =NOCH2), 7.27(2H, s, 1- 및 2-H), 7.76(1H, s, 4-H)
원소분석 : C20H23O9NS.Na2.2HO
9계산치 : C ; 44.87, H ; 5,08, N ; 2.62
실측치 : C ; 45.19, H ; 4.96, N ; 2.65
(E) 6-옥소에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심-BSA 접합체(Ia : P=소 혈청 알부민(BSA))의 제조 :
0.1M 인산 완충 용액(pH 7.1, 0.5mι)에 용해시킨 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(100mg) 및 소 혈청 알부민(50mg)의 용액을 (D)에서 수득한 6-옥소 에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심(II) (30mg)을 용해시킨 피리딘(0.5mι) 용액에 적가하고, 생성된 혼합물을 4℃에서 밤새 교반한다. 생성된 용액을 투석하고 동결건조하여 6-옥소 에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심-BSA 접합체(Ia : p=BSA) (47mg)를 수득한다.
진한 황산을 이용한 착색 반응에서, 상기 합텐-BSA 접합체(Ia) (6-옥소에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심-BSA 접합체)가 한 분자당 약 14 스테로이드 분자를 갖는 것을 확인할 수 있다.
[실시예 2]
에스트리올-3-설페이트에 대한 항체의 제조 :
3마리의 숫컷 기니아 피그를 면역화에 이용한다. 0.5mg의 6-옥소에스트리올-3-설페이트-0-카르복시메틸옥심-BSA 접합체(Ia)를 멸균된 동장 식염수(0.25mι)에 용해시키고 프로인트의 완전 보조제(0.25mι)로 에멀션화 한다. 에멀션을 각 대퇴 및 견갑골의 하부에 피하 주사한다. 최초 주사 이후 14일 및 28일 후에 피하 주사를 반복하고 그 후로 각각 30일 후에 반복 주사한다. 4번째의 증강 주사를 실시한지 10일 후에 출혈시킨다. 3500rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하고 -25℃에서 보관한다.
[실시예 3]
고정된 항체의 제조 :
허비 등의 방법(Hervey et aι., Cancer Res.
Figure kpo00013
3001~3008, 1975)에 따라 항체를 CNBr-활성화 세파로스-4B(파마시아 파인 케미칼(주) 제품)에 결합시킨다. 항-에스트리올-3-설페이트 항 혈청을 황산 암모늄(500g/ι)과 혼합하고 실온에서 10분간 방치한 후, 2500rpm에서 20분간 원심 분리한다. 침전물을 증류수에(1.0mι)에 용해하고, 붕산 완충액(0.05몰/ι, pH 8.0)에서 투석한다. 용액은 조 “글로불린”분획을 제공한다.CNBr-활성화 세파로스-4B(200mg)를 염산 (10-3몰/ι)(100mι)으로 씻어낸다. 황산 암모늄(500g/ι)으로 처리한 항 혈청(1.0mι)을 NaCι(0.5몰/ι)-함유 NaHCO3완충액(0.1몰/ι, ph 8.0) (5.0mι)으로 희석하고, 겔과 혼합하고 혼합물을 밤새 교반한다. 결합 완충액을 이용하여 비결합 물질을 씻어내고, 남아 있는 활성 기를 에탄올 아민(1몰/ι, pH 8.0)과 1시간 동안 반응시킨다. 비공유적으로 흡착된 단백질을 제거하기 위하여 세 세정회로를 이용하는데, 각 회로에서는 NaCι(1.0몰/ι)-함유 아세테이트 완충액(0.1몰/ι, pH 4.0) (5.0mι)으로 세척한 후 Nac ι(1.0몰/ι)-함유 붕산 완충액(0.1몰/ι, pH 8.0)으로 세척하는 과정을 거친다. 고정된 항체는 4℃에서 매우 안정하며, 수개월 후에도 결합 친화력이 눈에 띄게 변화하지 않는다.
[실시예 4]
표지 항원인 [6,7-3H]-에스트리올-3-설페이트의 제조 :
기니아 피그의 간으로부터 효소 제제를 수득한다[참고. M. Bouthiιιier et aι. : Steroids, 38,523(1981)]. 간 균질화물을 노리트-A로 처리하여 내생 스테로이드를 제거한다. 아데노신 3'-포스테이트 5'-포스포설페이트(1㎍) 및 0.05M트리스-HCι 완충액(pH 7.4) (0.001M MgCι2, 0.025M시스테인 및 0.001M디티오트레이톨을 함유)에 용해시킨 간 균질화물(200㎕)과 함께 [6,7-3H] 에스트리올(100μCi)을 37℃에서 2시간 동안 보온한다. 에탄올을 이용하여 반응 혼합물로부터 단백질을 제거하고 1800rpm에서 15분간 원심 분리한다. 상층액 0.05M 인산 완충액(pH 7.5) (30mι)으로 희석하고 앰버라이트 XAD-2 컬럼(0.5×10cm)에 통과시킨다. 설페이트 분획을 메탄올로 용출시키고 질소 기류하에 증발시키고 예비 박막 크로마토그래피하여 (전개액 ; 클로로포름 : 메탄올 : 암모니아(15 : 5 :1 부피비)의 혼합물) 정제한다.확실한 시료에 해당하는 밴드(Rf=0.32)를 메탄올 및 암모니아(95 : 1 부피비)의 혼합물로 용출한다. 메탄올을 용리액으로 사용하는 세파덱스 ιH-20 컬럼(0.5×15cm) 크로마토그래피하여 용출액을 더 정제하고, 목적 분획을 수거하여 진공 중에서 농축함으로써 [6,7-3H]-에스트리올-3-설페이트(45.3Ci/mmol. 10.9μCi,수율 13.6%)를 수득한다. 방사성 화학 순도는 실리카겔 G를 이용한 박막 크로마토그래피에 의한 98% 보다 높다.
[실시예 5]
에스트리올-3-설페이트의 측정 :
0.05몰/ι의 인산 완충액(pH 7.5, 0.1mι)에 용해시킨 [3H]-에스트리올-3-설페이트(5500rpm)를 인산 완충액(0.05몰/ι, pH 7.50으로 희석한 고정된 항체의 균질 현탁액(1 : 500 부피비) (0.2mι)에 가하고, 실온에서 15분 동안 방치한다. 트리스 -HCι 완충액(0.1몰/ι, pH 8.3)으로 희석한 혈장 시료(0.1mι) (0.1몰/ι의 글루타민 함유)를 가하고, 생성된 용액을 4℃에서 16시간 동안 배양한다. 혼합물을 3500rpm에서 20분 동안 원심 분리한다. 각각의 상층액의 0.2mι를 부분 시료로 취하여 계수 바이알에 넣고 브라이(Bray) 섬광제와, 혼합한 후, 알로카(Aιoka) LSC-673 액체 섬광 분광기 내에서 방사능을 계산한다. 수득된 결과들의 스캐차드 (Scatchar d) 도면은 에스트리올-3-설페이트에 대한 결합 상수(Ka) 4.3×109ι/몰의 높은 친화도를 나타낸다(참고, 첨부된 도면 제1도는 세파로스 4B로 고정시킨 항-에스트리올-3-설페이트 항체의 스캐차드 플로트 그래프를 나타낸다).
[실시예 6]
희석한 혈장 부분 시료에 대한 측정 :
에스트리올-3-설페이트와 혈장의 비-특이성 결합을 감소시키기 의해, 완충액에 용해시킨 특정한 물질을 혈장 시료를 함유하는 항원-항체 혼합물에 가하고, 측정을 수행한다. 즉, 실시예 5에서와 같이 트리스-염산 완충액(0.1몰/ι)으로 희석한 혈장 시료에 글루카민, 시스테인 또는 글리신을 가하고, 실시예 5와 동일한 방법으로 에스트리올-3-설페이트의 검출을 수행한다. 결과는 첨부한 도면 제2도는에 나타내며, 상기 결과는 에스트리올-3-설페이트와 혈장 단백질의 비-특이성 결합에 대한 각종 물질의 영향을 나타내고, ○-○는 물질을 첨가하지 않은 경우,
Figure kpo00014
는 시스테인(0.1몰/ι)을 첨가한 경우, △-△는 글리신(0.2몰/ι)을 첨가한 경우 및
Figure kpo00015
는 글루타민(0.1몰/ι)을 첨가한 경우이다.
[실시예 7]
각종스테로이드의 교차-반응
특이성
고전된-항체에 대한 기타 스테로이드들의 교차반응으로부터 특이성을 평가한다. 교차-반응성은 표지된 에스트리올-3-설페이트와 항체의 결합을 50% 억제시키고자 할 때 필요한 비-표지된 에스트리올-3-설페이트와 각각의 스테로이드의 질량 비율을 계산하여 측정된다. 결과는 하기 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure kpo00016
상기 결과들로부터, 본 발병에 의한 항체가 에스트리올-3-설페이트에 대해 고도로 특이하게 반응하며, 세파로스 4B로 고정시킬 경우 다른 에스트로겐 설페이트와 약간 개선된 교차 반응성을 나타내고, 데히드로에피안드로스테론 설페이트(0.77%), 콜레스테롤 설페이트(0.081%) 및 에스트리올(0.033%)을 제외한 다른 스테로이드 결합체 및 유리 스테로이드들과는 교차-반응하지 않음을 알 수 있다.
[실시예 8]
정밀도 시험 :
(A) 감수성
1 : 500 비율로 희석한 고정된 항체를 사용하여, 희석한 수컷 혈장 시료를 목탄 처리하고 각기 다른 양의에스트리올-3-설페이트를 가함 후 표지된 에스트리올-3-설페이트의 결합 백분율을 도식화하여 검정 곡선이 그려진다(참고, 첨부한 도면 제3도는 에스트리올-3-설페이트의 방사성 면역 분석 시험에 의한 검정 곡선을 나타낸다). 감수성은 15pg로 나타나고, 에스트리올-3-설페이트는 20~1000pg 범위내에서 검출 가능하다.
(B) 회수
정상인 수컷 혈장을 노리트(Norit) A로 처리하고 물로 휘석한 후, 희석한 혈장 중에서 0.1mι의 부분 시료를 각각 0, 50, 100 및 400pg의 비-표지된 에스트리올-3-설페이트를 함유하는 용액에 가한다. 희석한 고정된 항체 및 표지된 화합물과 배양한 후, 원심 분리하여 결합된 및 유리된 스테로이드를 분리하고, 이어서 방사능을 검출하여 회수 백분율을 측정한다. 즉, 정상인 수컷 혈장에 첨가한 공지 량의 에스트리올-3-설페이트가 횟되고 측정된다. 결과는 하기 표2에 나타내며, 4단계 모두에서 만족스렁 결과가 나타난다.
[표 2]
Figure kpo00017
*)n=5
(C) 변이 시험
임부 혈청 시료 내의 에스트리올-3-설페이트를 실시예 5에 기재한 방법으로 검출하여 분석내 및 분석간의 변이를 조사한다. 결과는 하기 표 3에 나타낸다.방사 면역 분석내 변이는 검정 곡선 상의3개의 다른 시료들을 사용하여 측정된다. 각각의 점들에서의 계수 변이(CV) 값은 8.3% 이하이다. 분석간의 변이는 3가지 다른 시료들을 분석하여측정된다. CV 값은 8.1% 이하인 것으로 나타났다.
[표 3]
Figure kpo00018
상기 결과들로부터, 본 발명에 의한 에스트리올-3-설페이트의 면역 분석이 고도로 정확함을 알 수 있다.
[실시예 9]
임상시험 :
40마리의 임부의 혈장 시료를 사용하여 임신 후 매 주일마다의 에스트리올-3-설페이트 및 에스트리올의 혈액 농도를 측정한다. 에스트리올-3-설페이트의 검출은 실시예 5의 방법으로 수행하고, 에스트리올의 검출은 하기에 기재한 방법으로 수행한다.
희석한 임부의 혈장(0.2mι)을 에테르(1.0mι)로 추출하고 물(0.1mι)로 세척한다. [3H]-에스트리올(10000rpm)을 가하고, 유기층을 질소 기류하에 건조시킨다 . 상기 시료에 붕산완충액(0.05몰/ι ; pH 8.0)으로 희석한 혈청[1 : 600] (0.25mι) [BGG(0.5g/ι) 및 BSA(0.6g/ι) 함유)]을 가한다. 샐성된 용액을 실온에서 1시간동안 배양하고, 암모늄 설페이트(500g/ι, 0.25mι)와 혼합한 후, 실온에서 15분 동안 방치한다. 배양 혼합물을 3500rpm에서 10분 동안 원심 분리하고, 상층액중에서 0.2mι의 부분 시료를 취하여 검출을 수행한다.
결과는 첨부한 도면 제4도에 나타남다. 상기 결과는 정상 임신 기간 동안의 에스트리올-3-설페이트 및 에스트리올의 혈장 농도를 나타내고,
Figure kpo00019
는 결합된 에스트리올 값 및 △는 비-결합된 에스트리올 값을 나타낸다.

Claims (1)

  1. 하기 일반식(A)의 카르복실산을 수성 매질에서 수용성 카르보디이미드 존재하에 일반식 H2N-P의 단백질과 반응시킴을 특징으로 하는, 하기 일반식(I)의 6-치환-에스트리올-3-설페이트 담백질 접합체의 제조방법.
    Figure kpo00020
    (상기 식중, A는 =N-O- 또는 -O-CO 이고, n은 1-4의 정수이며, -NH-P는 아미노형에서 수소원자가 제거된 단백질의 잔기이다.)
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