JPS6223821B2 - - Google Patents
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Description
本発明はエストラジオール−17β−グルクロナ
イドの免疫学的測定用抗原の製造法に関するもの
である。さらに詳しくはエストラジオール−17β
−グルクロナイドの特異抗血清を得るための蛋白
−ハプテン結合抗原の新規合成法に関するもので
ある。 エストラジオールは卵胞ホルモンであるエスト
ロゲンの一つであり、遊離型（free）、蛋白結合
型（protein−bound）、および結合型
（conjugated）が知られている。この内、遊離型
は血中には存在するが、尿中には通常出現せず、
結合型、すなわちグルクロン酸抱合型、あるいは
硫酸抱合型として排せつされる。なかでもグルク
ロン酸抱合型については、最近になつてその生理
的意義が注目されるようになり、血中および尿中
のエストラジオール−17β−グルクロナイドの簡
便にしてかつ正確な免疫学的測定法の出現が望ま
れていた。 従来、体液中のエストラジオールは検体の中に
含まれる結合型エストラジオールを塩酸加熱水解
またはβ−グルクロニダーゼあるいはスルフアタ
ーゼの如き酵素を用いて水解し、遊離型エストラ
ジオールとしたのち抽出後、コーバー反応
（Kober reac.）を利用した比色法または蛍光
法、あるいは免疫測定法などを組合せて測定され
てきた。しかしながら水解操作を必要とするこれ
らの測定方法は操作が煩雑であり、かつ前述の遊
離型、結合型等の分画測定が不可能である等の欠
点を有している。一方体液中の微量物質測定法と
して注目されつつあるラジオイムノアツセイは放
射性核種で標識したホルモンと、そのホルモンに
対する抗体の結合比が反応液中に加えられた抗
原、すなわち非標識ホルモンの量によつて変化す
ることを利用した方法であり、感度が高く、多数
検体の測定が可能であることから、臨床検査向き
の方法として受けとめられ、各種のホルモンはも
とより、各種薬剤の血中、尿中濃度を測定する方
法として、今日賞用されるに至つている。 このようにラジオイムノアツセイは、特に体液
中のホルモンの定量法として脚光をあびているが
その特異性については議論の多いところである。 すなわち、一般に体液中には測定対象物質と類
似の構造を有する物質が多数共存しているので、
測定に用いる抗体は測定対象物質とのみ反応する
もの、すなわち、交叉反応性のない、特異性の高
いものが要求される。 特定の測定対象物質との結合定数が大で、かつ
特異性の高い抗体を用意することが出来れば、そ
の特定物質を測定するためのラジオイムノアツセ
イは、ほぼ完成されたことになる。 前述の如く、体液中のエストラジオールを従来
法で測定する場合、一般的には水解操作が必要に
なるが、ラジオイムノアツセイにおいては、エス
トラジオールグルクロナイドと特異的に結合する
抗体が用意されれば水解操作が不要となり、簡便
にして、かつ高感度、特異的な測定法が誕生する
ことになるので、今日ではエストラジオールグル
クロナイドに限らず、各種のステロイドホルモン
の抱合体を水解せずに免疫学的に測定するための
特異抗体の製造法、すなわち特異抗体を製造する
ための抗原として、どのような物質を使用するか
ということに、免疫学的測定法を完成させるため
の努力が専門家によつてなされている。 その一つの例として、エストラジオールグルク
ロナイドのグルクロン酸部分のカルボキシル基に
BSAを結合させた、いわゆる蛋白−ハプテン結
合抗原が合成され、該抗原を用いて作製された抗
体を用いてエストラジオールグルクロナイドを測
定する方法が報告されているが、該抗体は特異性
が低く、遊離エストロゲンおよびエストリオール
−16α−グルクロナイドに対して交叉反応性を示
すので、満足出来る結果を与えていない（P.
Samarajeewa、et al：Biochemical Journal
151、369〜376、1975年）。 またカルボキシフエニルアゾエストリオール16
−グルクロナイドのC2位またはC4位にBSAを結
合させた蛋白−ハプテン結合抗原の場合、該抗原
を用いて作製された抗体は遊離エストロゲンに対
し、2.2％以下という比較的低い交叉反応性を示
し、改良された特異性を示したが、なお不充分で
あり、この不充分な特異性はベンゾイル基に
BSAを結合させる際に同時にグルクロン酸部分
のカルボン酸にもBSAが結合するためであると
推定されている（J.R.Soares et al：FEBS
Lett.61、263〜266、1976年）。このような観点か
ら、担体蛋白BSAをステロイドＤ環グルクロナ
イドのグルクロン酸部分のカルボキシル基に結合
させないようにすると同時に、担体蛋白BSAを
ステロイドのＤ環から離れた位置にあるステロイ
ドのＡ環に結合させる報告がある（T.Nambara
et al：J.Steroid Biochemistry９、785〜790、
1978年）。 すなわち、ステロイドグルクロナイドのＡ環の
C2またはC4位にBSAを結合させるために２−
アミノエストラジオール−17β−グルクロナイド
とBSAをグルタールアルデヒドで架橋させる方
法、エストラジオール−17β−グルクロナイド
とBSAをホルマリンの存在下、アルカリ性で反
応させて、いわゆるマンニツヒ反応によりハプテ
ン−BSA結合体を合成する方法、およびｐ−
アミノ安息香酸BSAをジメチルホルムアミド中
でジアゾ化した後、エストラジオール−17β−グ
ルクロナイドを反応させて、ハプテン−BSA結
合体を合成する方法が公知となつている。 本発明において、発明者らは、すでに公知とな
つているエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−BSA結合体を用いて作製された抗体より
も、さらに特異性の高い抗体を作製することの有
用性と必要性からハプテン−BSA結合体を鋭意
検索した結果本発明を完成するに至つた。 本発明はエストラジオール−17β−グルクロナ
イドのＤ環グルクロン酸部分にBSAが結合しな
いようにしながら、エストラジオールグルクロナ
イドのＢ環のC6位にBSAを結合させたハプテン
担体蛋白結合体の合成法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち６−オキソ
エストラジオール−17β−グルクロナイド−６−
（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−BSA結合体を用いて作製された抗体に比較
してステロイドのＡ環、Ｄ環の認識性が特に優れ
ており、特異性においてもさらに向上することが
明りようとなり、本発明を発明するに至つたもの
である。 本発明に基づいて作製された抗体はエストラジ
オール−17β−グルクロナイドのラジオイムノア
ツセイ用として特に好適であるがラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはラテツクスを担
体とする凝集反応および凝集阻止反応に用いるこ
とも可能である。 本発明は特許請求の範囲第２項(イ)〜(ホ)に記載し
た工程に基づいて、特許請求の範囲第１項に記載
した物質、６−オキソエストラジオール−17β−
グルクロナイド−６−（ｏ−カルボキシメチル）
オキシム−BSA結合体を合成する方法に関する
ものであるが、本発明のさらに加わつた特徴の一
つとしてエストラジオールグルクロナイドのグル
クロン酸部分の保護基を脱離させる工程、すなわ
ち特許請求の範囲第２項(ホ)に記載した合成工程の
最終段階で脱離させることにある。 本発明のエストラジオール−17β−グルクロナ
イド測定用の抗原として用いられる新規ステロイ
ド化合物は、化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β−
グルクロナイド−６−（カルボキシメチル）オキ
シム−BSA結合体である。 本発明による新規ステロイド化合物は下記の構
成、すなわち、 (イ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−３−
ベンジルエーテルをメチル−１−ブロモ−１−
デオキシ−２・３・４−トリ−ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノウロネートと反応させ、
６−オキソエストラジオール−３−ベンジルエ
ーテル−17β−グルクロナイドアセテートメチ
ルエステルとする工程、 (ロ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−３−
ベンジルエーテル−17β−グルクロナイドアセ
テートメチルエステルをパラジウム炭触媒存在
下、水素ガス還元して６−オキソエストラジオ
ール−17β−グルクロナイドアセテートメチル
エステルとする工程、 (ハ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステルを
酢酸ナトリウムの存在下、ｏ−カルボキシメチ
ルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させて、６
−オキソエストラジオール−17β−グルクロナ
イドアセテートメチルエステル−６−（ｏ−カ
ルボキシメチル）オキシムとする工程、 (ニ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシムをBSA
と反応させて６−オキソエストラジオール−17
β−グルクロナイドアセテートメチルエステル
−６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−
BSA結合体とする工程、 (ホ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA
結合体を部分的に加水分解する工程、以上の
(イ)、(ロ)、(ハ)、(ニ)、(ホ)の各工程を組み合せるこ
と
によつて製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
−オキソエストラジオール−３−ベンジルエーテ
ル200mgをトルエン40mlに溶解後、炭酸カドミウ
ム200mgを加え、ケタール化装置により脱水後、
メチル−１−ブロモ−１−デオキシ−２・３・４
−トリ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノウ
ロネート400mgを加え５時間還流後、反応液をロ
過し、ロ液を濃縮後、分取TLC（ベンゼン／エ
ーテル１：１）に付す。Rf0.8の画分を酢酸エチ
ルで溶出後、溶出物をメタノールから再結晶する
と化合物（）93mgが白色針状結晶として得られ
た。 白色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 104〜108℃ 〔α〕２０ Ｄ −32.3゜（Ｃ＝0.06、CHCl3） 元素分析値 Ｃ：64.94、Ｈ：6.14 化学式C38H44O12に対する計算値 Ｃ：65.03、Ｈ：6.46 IRνＫＢｒ ｎａｘcm-1 1680（６−oxo） 1740（−OCOCH3） NMR（CDCl3） 0.78（3H、ｓ、18−CH3） 2.02（6H、ｓ、−OCOCH3） 2.05（3H、ｓ、−OCOCH3） 3.65（1H、ｍ、17α−Ｈ） 3.74（3H、ｓ、−COOCH3） 4.00（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ） 4.60（1H、ｄ、Ｊ＝７Hz、1′−Ｈ） 4.85〜5.35（3H、ｍ、2′−、3′、4′−Ｈ） 5.05（2H、ｓ、３−OCH2 C6H5） 7.0〜7.8（8H、ｍ、aromaticH） 白色針状結晶性化合物（）130mgをエタノー
ル30mlに溶解し、５％パラジウム炭180mgを加
え、水素ガス気流中、室温で４時間撹忰後、反応
液をロ過し、ロ液を濃縮後、分取TLC（ベンゼ
ン／エーテル１：１）に付す。Rf0.8の画分を酢
酸エチルで溶出し、溶出物をメタノールから再結
晶すると化合物（）73mgが白色針状結晶として
得られた。 白色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 202〜205℃ 〔α〕２０ Ｄ −11.6゜（Ｃ＝0.129、CHCl3） 元素分析値 Ｃ：61.91、Ｈ：6.20 化学式C31H38O12に対する計算値 Ｃ：61.78、Ｈ：6.36 NMR（CDCl3） 0.78（3H、ｓ、18−CH3） 2.02（6H、ｓ、−OCOCH3） 2.05（3H、ｓ、−OCOCH3） 3.65（1H、ｍ、17α−Ｈ） 3.74（3H、ｓ、−COOCH3） 4.00（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ） 4.60（1H、ｄ、Ｊ＝７Hz、1′−Ｈ） 4.85〜5.35（3H、ｍ、2′−、3′、4′−Ｈ） 7.30（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、1H） 7.50（1H、ｄ、Ｊ＝２Hz、4H） 白色針状結晶性化合物（）41mgをエタノール
７mlに溶解し、ｏ−カルボキシメチルヒドロキシ
アミン塩酸塩100mg、6.7％酢酸ナトリウム溶液
1.5mlを加え、35℃で12時間撹拌後、反応液に水
を加え酢酸エチルで抽出する。抽出液の溶媒を留
去後、残査を分取TLC（クロロホルム／メタノ
ール９：１）に付す。Rf0.4の画分を酢酸エチル
で溶出後、溶出物をアセトン−エーテルから再結
晶すると化合物（）23mgが白色粉末として得ら
れた。 白色粉末化合物（）の分析値 m.p. 148〜152℃ 〔α〕２０ Ｄ −38.8゜（Ｃ＝0.16、メタノール） NMR（CDCl3−CD3OD） 0.78（3H、ｓ、18−CH3） 2.02（6H、ｓ、−OCOCH3） 2.05（3H、ｓ、−OCOCH3） 3.60（1H、ｍ、17α−Ｈ） 3.76（3H、ｓ、−COOCH3） 4.05（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ） 4.65（3H、ｍ、1′−Ｈ、＝NOCH2−） 4.85〜5.35（3H、ｍ、2′−、3′、4′−Ｈ） 6.80（1H、dd、Ｊ＝10、２Hz、２−Ｈ） 7.15（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、１−Ｈ） 7.30（1H、ｄ、Ｊ＝２Hz、４−Ｈ） 白色粉末化合物（）80mgをジメチルホルムア
ミド2.4ml中に溶解し、氷冷下、トリ−ｎ−ブチ
ルアミン63μおよびイソブチルクロロフオルメ
ート20μを加えてから12分後、氷冷下にて
BSA200mgの含水ジメチルホルムアミドのアルカ
リ溶液（DMF20ml−H2O8ml−1N−NaOH0.2ml）
に加え、PH7.0に調整後、４℃、20時間撹拌し、
得られた反応液を冷水にて48時間透析後、凍結乾
燥に付し、ハプテン−BSA結合体（）277mgを
得た。 ハプテン−BSA結合体（）70mgを水26mlに
溶解し、5MNaOH（0.07ml）を加え、PH12に調整
した液を25℃にて12時間撹拌する。次に72時間透
析後、凍結乾燥し、化合物（）48mgを得た。該
化合物（）、すなわち６−オキソエストラジオ
ール−17β−グルクロナイド−６−（ｏ−カルボ
キシメチル）オキシム−BSA結合体のBSA1モル
当りのハプテン結合モル数をUV法により求めた
ところ、20.0モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色ウサギ３羽に、６
−オキソエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−
BSA結合体抗原を、以下の如く免疫した。 すなわち抗原２mgを減菌等張食塩溶液0.5mlに
溶解させ、これをフロイント・コンプリート・ア
ジユバンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエ
マルジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に
皮下投与した。以下２ケ月にわたつて２週間毎に
同様の投与を行つた。最後の投与（第５回目の投
与）から１週間後に、このウサギの耳静脈から10
mlを採血し、これを3000回転、10分間の遠心分離
にかけ、得られた抗血清を−20℃にて保存した。 使用時においては、上記抗血清を解凍し、
BSA0.06％、牛γ−グロブリン0.05％を含む
0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）を用いて１：3000
の希釈率で希釈し、標準曲線を作成した。 測定操作 エストラジオール−17β−グルクロナイドを含
む試料にエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−６・７、−3H（約7500dpm）および抗血清
0.25mlを添加し、４℃で１時間孵置する。次いで
50％硫酸アンモニア溶液0.25mlを添加し、４℃に
20分間放置後、3000回転で15分間遠心し、得られ
た上澄液0.2mlをとり、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６−オキソエストラジオール−17β−グルクロ
ナイド−６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム
−BSA結合体で免疫したウサギから得られた前
述の抗血清の特異性を調べるために、32種のステ
ロイドを用いてその交又反応性をエストラジオー
ル−17β−グルクロナイド−3Hの本抗血清への
結合量を標準曲線より求めた結果を第１表に示
す。 第１表の交叉反応の欄における数値は非標識エ
ストラジオール−17β−グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種ステロイドの
読みの比率の逆数を百分率で表示したものであ
る。
イドの免疫学的測定用抗原の製造法に関するもの
である。さらに詳しくはエストラジオール−17β
−グルクロナイドの特異抗血清を得るための蛋白
−ハプテン結合抗原の新規合成法に関するもので
ある。 エストラジオールは卵胞ホルモンであるエスト
ロゲンの一つであり、遊離型（free）、蛋白結合
型（protein−bound）、および結合型
（conjugated）が知られている。この内、遊離型
は血中には存在するが、尿中には通常出現せず、
結合型、すなわちグルクロン酸抱合型、あるいは
硫酸抱合型として排せつされる。なかでもグルク
ロン酸抱合型については、最近になつてその生理
的意義が注目されるようになり、血中および尿中
のエストラジオール−17β−グルクロナイドの簡
便にしてかつ正確な免疫学的測定法の出現が望ま
れていた。 従来、体液中のエストラジオールは検体の中に
含まれる結合型エストラジオールを塩酸加熱水解
またはβ−グルクロニダーゼあるいはスルフアタ
ーゼの如き酵素を用いて水解し、遊離型エストラ
ジオールとしたのち抽出後、コーバー反応
（Kober reac.）を利用した比色法または蛍光
法、あるいは免疫測定法などを組合せて測定され
てきた。しかしながら水解操作を必要とするこれ
らの測定方法は操作が煩雑であり、かつ前述の遊
離型、結合型等の分画測定が不可能である等の欠
点を有している。一方体液中の微量物質測定法と
して注目されつつあるラジオイムノアツセイは放
射性核種で標識したホルモンと、そのホルモンに
対する抗体の結合比が反応液中に加えられた抗
原、すなわち非標識ホルモンの量によつて変化す
ることを利用した方法であり、感度が高く、多数
検体の測定が可能であることから、臨床検査向き
の方法として受けとめられ、各種のホルモンはも
とより、各種薬剤の血中、尿中濃度を測定する方
法として、今日賞用されるに至つている。 このようにラジオイムノアツセイは、特に体液
中のホルモンの定量法として脚光をあびているが
その特異性については議論の多いところである。 すなわち、一般に体液中には測定対象物質と類
似の構造を有する物質が多数共存しているので、
測定に用いる抗体は測定対象物質とのみ反応する
もの、すなわち、交叉反応性のない、特異性の高
いものが要求される。 特定の測定対象物質との結合定数が大で、かつ
特異性の高い抗体を用意することが出来れば、そ
の特定物質を測定するためのラジオイムノアツセ
イは、ほぼ完成されたことになる。 前述の如く、体液中のエストラジオールを従来
法で測定する場合、一般的には水解操作が必要に
なるが、ラジオイムノアツセイにおいては、エス
トラジオールグルクロナイドと特異的に結合する
抗体が用意されれば水解操作が不要となり、簡便
にして、かつ高感度、特異的な測定法が誕生する
ことになるので、今日ではエストラジオールグル
クロナイドに限らず、各種のステロイドホルモン
の抱合体を水解せずに免疫学的に測定するための
特異抗体の製造法、すなわち特異抗体を製造する
ための抗原として、どのような物質を使用するか
ということに、免疫学的測定法を完成させるため
の努力が専門家によつてなされている。 その一つの例として、エストラジオールグルク
ロナイドのグルクロン酸部分のカルボキシル基に
BSAを結合させた、いわゆる蛋白−ハプテン結
合抗原が合成され、該抗原を用いて作製された抗
体を用いてエストラジオールグルクロナイドを測
定する方法が報告されているが、該抗体は特異性
が低く、遊離エストロゲンおよびエストリオール
−16α−グルクロナイドに対して交叉反応性を示
すので、満足出来る結果を与えていない（P.
Samarajeewa、et al：Biochemical Journal
151、369〜376、1975年）。 またカルボキシフエニルアゾエストリオール16
−グルクロナイドのC2位またはC4位にBSAを結
合させた蛋白−ハプテン結合抗原の場合、該抗原
を用いて作製された抗体は遊離エストロゲンに対
し、2.2％以下という比較的低い交叉反応性を示
し、改良された特異性を示したが、なお不充分で
あり、この不充分な特異性はベンゾイル基に
BSAを結合させる際に同時にグルクロン酸部分
のカルボン酸にもBSAが結合するためであると
推定されている（J.R.Soares et al：FEBS
Lett.61、263〜266、1976年）。このような観点か
ら、担体蛋白BSAをステロイドＤ環グルクロナ
イドのグルクロン酸部分のカルボキシル基に結合
させないようにすると同時に、担体蛋白BSAを
ステロイドのＤ環から離れた位置にあるステロイ
ドのＡ環に結合させる報告がある（T.Nambara
et al：J.Steroid Biochemistry９、785〜790、
1978年）。 すなわち、ステロイドグルクロナイドのＡ環の
C2またはC4位にBSAを結合させるために２−
アミノエストラジオール−17β−グルクロナイド
とBSAをグルタールアルデヒドで架橋させる方
法、エストラジオール−17β−グルクロナイド
とBSAをホルマリンの存在下、アルカリ性で反
応させて、いわゆるマンニツヒ反応によりハプテ
ン−BSA結合体を合成する方法、およびｐ−
アミノ安息香酸BSAをジメチルホルムアミド中
でジアゾ化した後、エストラジオール−17β−グ
ルクロナイドを反応させて、ハプテン−BSA結
合体を合成する方法が公知となつている。 本発明において、発明者らは、すでに公知とな
つているエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−BSA結合体を用いて作製された抗体より
も、さらに特異性の高い抗体を作製することの有
用性と必要性からハプテン−BSA結合体を鋭意
検索した結果本発明を完成するに至つた。 本発明はエストラジオール−17β−グルクロナ
イドのＤ環グルクロン酸部分にBSAが結合しな
いようにしながら、エストラジオールグルクロナ
イドのＢ環のC6位にBSAを結合させたハプテン
担体蛋白結合体の合成法に関する。 本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第
１項に記載されている物質、すなわち６−オキソ
エストラジオール−17β−グルクロナイド−６−
（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体
を用いて作製された抗体は、すでに公知の方法で
得られたエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−BSA結合体を用いて作製された抗体に比較
してステロイドのＡ環、Ｄ環の認識性が特に優れ
ており、特異性においてもさらに向上することが
明りようとなり、本発明を発明するに至つたもの
である。 本発明に基づいて作製された抗体はエストラジ
オール−17β−グルクロナイドのラジオイムノア
ツセイ用として特に好適であるがラジオイムノア
ツセイに限らず、羊赤血球またはラテツクスを担
体とする凝集反応および凝集阻止反応に用いるこ
とも可能である。 本発明は特許請求の範囲第２項(イ)〜(ホ)に記載し
た工程に基づいて、特許請求の範囲第１項に記載
した物質、６−オキソエストラジオール−17β−
グルクロナイド−６−（ｏ−カルボキシメチル）
オキシム−BSA結合体を合成する方法に関する
ものであるが、本発明のさらに加わつた特徴の一
つとしてエストラジオールグルクロナイドのグル
クロン酸部分の保護基を脱離させる工程、すなわ
ち特許請求の範囲第２項(ホ)に記載した合成工程の
最終段階で脱離させることにある。 本発明のエストラジオール−17β−グルクロナ
イド測定用の抗原として用いられる新規ステロイ
ド化合物は、化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β−
グルクロナイド−６−（カルボキシメチル）オキ
シム−BSA結合体である。 本発明による新規ステロイド化合物は下記の構
成、すなわち、 (イ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−３−
ベンジルエーテルをメチル−１−ブロモ−１−
デオキシ−２・３・４−トリ−ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノウロネートと反応させ、
６−オキソエストラジオール−３−ベンジルエ
ーテル−17β−グルクロナイドアセテートメチ
ルエステルとする工程、 (ロ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−３−
ベンジルエーテル−17β−グルクロナイドアセ
テートメチルエステルをパラジウム炭触媒存在
下、水素ガス還元して６−オキソエストラジオ
ール−17β−グルクロナイドアセテートメチル
エステルとする工程、 (ハ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステルを
酢酸ナトリウムの存在下、ｏ−カルボキシメチ
ルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させて、６
−オキソエストラジオール−17β−グルクロナ
イドアセテートメチルエステル−６−（ｏ−カ
ルボキシメチル）オキシムとする工程、 (ニ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシムをBSA
と反応させて６−オキソエストラジオール−17
β−グルクロナイドアセテートメチルエステル
−６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−
BSA結合体とする工程、 (ホ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA
結合体を部分的に加水分解する工程、以上の
(イ)、(ロ)、(ハ)、(ニ)、(ホ)の各工程を組み合せるこ
と
によつて製造されるものである。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 化学構造式（）で示される市販の化合物、６
−オキソエストラジオール−３−ベンジルエーテ
ル200mgをトルエン40mlに溶解後、炭酸カドミウ
ム200mgを加え、ケタール化装置により脱水後、
メチル−１−ブロモ−１−デオキシ−２・３・４
−トリ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノウ
ロネート400mgを加え５時間還流後、反応液をロ
過し、ロ液を濃縮後、分取TLC（ベンゼン／エ
ーテル１：１）に付す。Rf0.8の画分を酢酸エチ
ルで溶出後、溶出物をメタノールから再結晶する
と化合物（）93mgが白色針状結晶として得られ
た。 白色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 104〜108℃ 〔α〕２０ Ｄ −32.3゜（Ｃ＝0.06、CHCl3） 元素分析値 Ｃ：64.94、Ｈ：6.14 化学式C38H44O12に対する計算値 Ｃ：65.03、Ｈ：6.46 IRνＫＢｒ ｎａｘcm-1 1680（６−oxo） 1740（−OCOCH3） NMR（CDCl3） 0.78（3H、ｓ、18−CH3） 2.02（6H、ｓ、−OCOCH3） 2.05（3H、ｓ、−OCOCH3） 3.65（1H、ｍ、17α−Ｈ） 3.74（3H、ｓ、−COOCH3） 4.00（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ） 4.60（1H、ｄ、Ｊ＝７Hz、1′−Ｈ） 4.85〜5.35（3H、ｍ、2′−、3′、4′−Ｈ） 5.05（2H、ｓ、３−OCH2 C6H5） 7.0〜7.8（8H、ｍ、aromaticH） 白色針状結晶性化合物（）130mgをエタノー
ル30mlに溶解し、５％パラジウム炭180mgを加
え、水素ガス気流中、室温で４時間撹忰後、反応
液をロ過し、ロ液を濃縮後、分取TLC（ベンゼ
ン／エーテル１：１）に付す。Rf0.8の画分を酢
酸エチルで溶出し、溶出物をメタノールから再結
晶すると化合物（）73mgが白色針状結晶として
得られた。 白色針状結晶性化合物（）の分析値 m.p. 202〜205℃ 〔α〕２０ Ｄ −11.6゜（Ｃ＝0.129、CHCl3） 元素分析値 Ｃ：61.91、Ｈ：6.20 化学式C31H38O12に対する計算値 Ｃ：61.78、Ｈ：6.36 NMR（CDCl3） 0.78（3H、ｓ、18−CH3） 2.02（6H、ｓ、−OCOCH3） 2.05（3H、ｓ、−OCOCH3） 3.65（1H、ｍ、17α−Ｈ） 3.74（3H、ｓ、−COOCH3） 4.00（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ） 4.60（1H、ｄ、Ｊ＝７Hz、1′−Ｈ） 4.85〜5.35（3H、ｍ、2′−、3′、4′−Ｈ） 7.30（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、1H） 7.50（1H、ｄ、Ｊ＝２Hz、4H） 白色針状結晶性化合物（）41mgをエタノール
７mlに溶解し、ｏ−カルボキシメチルヒドロキシ
アミン塩酸塩100mg、6.7％酢酸ナトリウム溶液
1.5mlを加え、35℃で12時間撹拌後、反応液に水
を加え酢酸エチルで抽出する。抽出液の溶媒を留
去後、残査を分取TLC（クロロホルム／メタノ
ール９：１）に付す。Rf0.4の画分を酢酸エチル
で溶出後、溶出物をアセトン−エーテルから再結
晶すると化合物（）23mgが白色粉末として得ら
れた。 白色粉末化合物（）の分析値 m.p. 148〜152℃ 〔α〕２０ Ｄ −38.8゜（Ｃ＝0.16、メタノール） NMR（CDCl3−CD3OD） 0.78（3H、ｓ、18−CH3） 2.02（6H、ｓ、−OCOCH3） 2.05（3H、ｓ、−OCOCH3） 3.60（1H、ｍ、17α−Ｈ） 3.76（3H、ｓ、−COOCH3） 4.05（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ） 4.65（3H、ｍ、1′−Ｈ、＝NOCH2−） 4.85〜5.35（3H、ｍ、2′−、3′、4′−Ｈ） 6.80（1H、dd、Ｊ＝10、２Hz、２−Ｈ） 7.15（1H、ｄ、Ｊ＝10Hz、１−Ｈ） 7.30（1H、ｄ、Ｊ＝２Hz、４−Ｈ） 白色粉末化合物（）80mgをジメチルホルムア
ミド2.4ml中に溶解し、氷冷下、トリ−ｎ−ブチ
ルアミン63μおよびイソブチルクロロフオルメ
ート20μを加えてから12分後、氷冷下にて
BSA200mgの含水ジメチルホルムアミドのアルカ
リ溶液（DMF20ml−H2O8ml−1N−NaOH0.2ml）
に加え、PH7.0に調整後、４℃、20時間撹拌し、
得られた反応液を冷水にて48時間透析後、凍結乾
燥に付し、ハプテン−BSA結合体（）277mgを
得た。 ハプテン−BSA結合体（）70mgを水26mlに
溶解し、5MNaOH（0.07ml）を加え、PH12に調整
した液を25℃にて12時間撹拌する。次に72時間透
析後、凍結乾燥し、化合物（）48mgを得た。該
化合物（）、すなわち６−オキソエストラジオ
ール−17β−グルクロナイド−６−（ｏ−カルボ
キシメチル）オキシム−BSA結合体のBSA1モル
当りのハプテン結合モル数をUV法により求めた
ところ、20.0モルであつた。 実施例 ２ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重2.5〜3.0Kgの在来種白色ウサギ３羽に、６
−オキソエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−
BSA結合体抗原を、以下の如く免疫した。 すなわち抗原２mgを減菌等張食塩溶液0.5mlに
溶解させ、これをフロイント・コンプリート・ア
ジユバンド0.5mlにてエマルジヨンにし、このエ
マルジヨンをウサギの肩甲部および足蹠数ケ所に
皮下投与した。以下２ケ月にわたつて２週間毎に
同様の投与を行つた。最後の投与（第５回目の投
与）から１週間後に、このウサギの耳静脈から10
mlを採血し、これを3000回転、10分間の遠心分離
にかけ、得られた抗血清を−20℃にて保存した。 使用時においては、上記抗血清を解凍し、
BSA0.06％、牛γ−グロブリン0.05％を含む
0.05Mホウ酸緩衝液（PH8.0）を用いて１：3000
の希釈率で希釈し、標準曲線を作成した。 測定操作 エストラジオール−17β−グルクロナイドを含
む試料にエストラジオール−17β−グルクロナイ
ド−６・７、−3H（約7500dpm）および抗血清
0.25mlを添加し、４℃で１時間孵置する。次いで
50％硫酸アンモニア溶液0.25mlを添加し、４℃に
20分間放置後、3000回転で15分間遠心し、得られ
た上澄液0.2mlをとり、放射活性を計測する。 交叉反応性について ６−オキソエストラジオール−17β−グルクロ
ナイド−６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム
−BSA結合体で免疫したウサギから得られた前
述の抗血清の特異性を調べるために、32種のステ
ロイドを用いてその交又反応性をエストラジオー
ル−17β−グルクロナイド−3Hの本抗血清への
結合量を標準曲線より求めた結果を第１表に示
す。 第１表の交叉反応の欄における数値は非標識エ
ストラジオール−17β−グルクロナイドの50％阻
止量を100とし、これに対する各種ステロイドの
読みの比率の逆数を百分率で表示したものであ
る。
【表】
【表】
第１表の結果より、本発明の新規化合物を利用
した抗原による抗体を使用したもののエストロゲ
ンに対する特異性が他のものに比較してきわめて
高く、交叉反応が低く抑えられていることが明り
ようである。
した抗原による抗体を使用したもののエストロゲ
ンに対する特異性が他のものに比較してきわめて
高く、交叉反応が低く抑えられていることが明り
ようである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β−
グルクロナイド−６−（ｏ−カルボキシメチル）
オキシム−BSA結合体（式中−NH−BSAは牛血
清アルブミン残基を表わし、Ｇは で示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様。）から成るエストラジオール−17β−グルク
ロナイド測定用抗原。 ２ (イ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−３−
ベンジルエーテルをメチル−１−ブロモ−１−
デオキシ−２・３・４−トリ−ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノウロネートと反応させ、
６−オキソエストラジオール−３−ベンジルエ
ーテル−17β−グルクロナイドアセテートメチ
ルエステルとする工程、 (ロ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−３−
ベンジルエーテル−17β−グルクロナイドアセ
テートメチルエステル（式中G′は で示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様。）をパラジウム炭触媒存在下、水素ガス還
元して６−オキソエストラジオール−17β−グ
ルクロナイドアセテートメチルエステルとする
工程、 (ハ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステルを
酢酸ナトリウムの存在下、ｏ−カルボキシメチ
ルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ６−オ
キソエストラジオール−17β−グルクロナイド
アセテートメチルエステル−６−（ｏ−カルボ
キシメチル）オキシムとする工程、 (ニ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシムを牛血
清アルブミン（以下BSAと略す）と反応させ
て６−オキソエストラジオール−17β−グルク
ロナイドアセテートメチルエステル−６−（ｏ
−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体
とする工程、 (ホ) 化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイドアセテートメチルエステル−
６−（ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA
結合体を部分的に加水分解することを特徴とす
る化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−17β
−グルクロナイド−６−（ｏ−カルボキシメチ
ル）オキシム−BSA結合体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56125945A JPS5828664A (ja) | 1981-08-13 | 1981-08-13 | エストラジオ−ル−１７β−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56125945A JPS5828664A (ja) | 1981-08-13 | 1981-08-13 | エストラジオ−ル−１７β−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5828664A JPS5828664A (ja) | 1983-02-19 |
| JPS6223821B2 true JPS6223821B2 (ja) | 1987-05-25 |
Family
ID=14922856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56125945A Granted JPS5828664A (ja) | 1981-08-13 | 1981-08-13 | エストラジオ−ル−１７β−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5828664A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1625854B1 (en) * | 2004-08-09 | 2008-10-15 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Albumin conjugates containing a glucuronic linker |
-
1981
- 1981-08-13 JP JP56125945A patent/JPS5828664A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5828664A (ja) | 1983-02-19 |
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