JPH0432840B2

JPH0432840B2 -

Info

Publication number: JPH0432840B2
Application number: JP17092683A
Authority: JP
Inventors: Toshio Nanbara; Kazutake Shimada
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1983-09-16
Filing date: 1983-09-16
Publication date: 1992-06-01
Also published as: JPS6061597A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規ステロイド化合物、該化合物の製
造方法、及び該化合物からなる免疫化学的測定方
法によるエストリオール−３−サルフエート−
16α−グルクロナイド測定用抗原、すなわちエス
トリオール−３−サルフエート−16α−グルクロ
ナイドを免疫化学的測定方法によつて測定する際
に使用される抗体を得るための抗原に関するもの
である。従来、体液中に存在する抱合型エストリオール
は、検体の中に含まれているグルクロン酸抱合型
エストリオールや硫酸抱合型エストリオールを、
塩酸加熱水解、またはβ−グルクロニダーゼある
いはスルフアターゼの如き酵素を用いて水解し、
遊離型エストリオールとしたのち、抽出後、コー
バー反応（Kober reaction）を利用した比色法、
蛍光法あるいは免疫測定法などを組合せて測定さ
れてきた。しかしながら、水解操作を必要とする
これらの方法は操作が煩雑であり、かつ前述の遊
離型、抱合型等の分画測定が不可能である等の欠
点を有している。ところで、免疫化学的測定方法による体液中の
ホルモンの測定方法、すなわち、放射性物質で標
識したホルモンと非標識ホルモンがホルモン抗体
に競合して反応することを利用したラジオイムノ
アツセイ法、酵素で標識したホルモンと非標識ホ
ルモンがホルモン抗体に競合して反応することを
利用した酵素免疫測定法、感作担体に血球やラテ
ツクスを使用して凝集反応を利用する血球凝集反
応法やラテツクス凝集反応法等、免疫化学的測定
方法によるホルモンの測定方法は、生体試料の測
定方法として広く利用されている方法であるが、
これら免疫化学的測定方法によるホルモンの測定
方法においては、抗原抗体反応の平衡定数Ｋが大
なる程感度の優れた測定が可能となるので、その
抗体が親和性に優れていなければならなく、しか
も感作に用いる抗原の純度が低い場合にはその中
の夾雑物に対する抗体ができることとなるので、
純度の高い抗原から得られた抗体を使用しなけれ
ばならない。さらに、高純度の抗原で作つた抗体
でも、その抗原と類似構造を有する他の物質と反
応する所謂交叉反応（Cross−reaction）の問題
から、使用される抗体はその特異性においても優
れていることが必要である。本発明者らは、胎児胎盤機能が健全であるか否
かを検知するのに十分に効果のある体液中のエス
トリオール−３−サルフエート−16α−グルクロ
ナイドの量の測定を前記免疫化学的測定方法で測
定し得るように、抗原として使用し得る各種化合
物を合成し、これらから得られた抗体を、エスト
リオール−３−サルフエート−16α−グルクロナ
イドを免疫化学的測定方法で測定する際の抗体と
して利用し、その交叉反応の程度を確認してみた
ところ、特許請求の範囲第１番目の発明の新規ス
テロイド化合物、即ち、６−オキソエストリオー
ル−３−サルフエート−16α−グルクロナイド−
６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結
合体からなる新規ステロイド化合物を抗原とする
抗体が、ラジオイムノアツセイ法、酵素抗体法、
血球凝集反応法、ラテツクス凝集反応法等の免疫
化学的測定方法により抱合型エストリオールを測
定する場合、即ちエストリオール−３−サルフエ
ート−16α−グルクロナイドを測定する場合に、
近縁ステロイドとの交叉反応を無視し得る程の極
めて高い特異性を有するものであることが確認さ
れ、本発明が完成されるに至つたものである。特許請求の範囲第１番目の発明たる新規ステロ
イド化合物は、化学構造式（式中、−NHBSAはウシ血清アルブミン残基
を、Ｇは式で表示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様）で表示される６−オキソエストリオール−３
−サルフエート−16α−グルクロナイド−６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体
である。前記化学構造式〔〕で表示される新規ステロ
イド化合物は、特許請求の範囲第２番目に記載し
た構成、即ち (イ) 化学構造式（式中G′は、式で表示されるグルクロニル（アセテート−メチル
エステル）基を表わす。以下同様）で表示される
公知の化合物である６−オキソエストリオール−
16α−グルクロナイド−アセテート−メチルエス
テル−３−ベンジルエーテルの水酸基を、アセチ
ル化剤を使用してアセチル化し、メチル（17β−
アセトキシ−３−ベンジルオキシ−６−オキソ−
１，３，５（10）−エストラトリエン−16α−イル
−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシツド）ウロネートを得る工程、 (ロ) 前記(イ)工程で得られた、化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ベ
ンジルオキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エ
ストラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−
Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウ
ロネートを、例えば、メタノール中５％パラジウ
ム炭を用いる接触還元に付す等により還元し、メ
チル（17β−アセトキシ−３−ヒドロキシ−６−
オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエン−
16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネートを得る工
程、 (ハ) 前記(ロ)工程で得られた化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ートをカルボキシメトキシアミンと反応させ、メ
チル（17β−アセトキシ−３−ヒドロキシ−６−
オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエン−
16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネート−６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムを得る工程、 (ニ) 前記(ハ)工程で得られた、化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムを、
通常の硫酸化剤、例えば、クロロスルホン酸
（chloro−sulfonic acid）、サルフアミン酸（sul
−famic acid）、メチルクロロスルホネート
（methyl chlorosulfonate）、エチルクロロスルホ
ネート（ethyl chlorosulfonate）等のサルフア
ートリオキシド錯体（sulfur trioxide complex）
とピリジン（pyridine）、あるいは硫酸（sulfuric
acid）、またはピリジン−サルフアートリオキシ
ド（pyri−dine−sulfur trioxide）、トリメチル
アミン−サルフアートリオキシド（trimethyl−
amine−sulfur trioxide）、トリエチルアミン−
サルフアートリオキシド（triethyl−amine−
sulfur trioxide）等と反応させ、前記化合物を硫
酸化して、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒド
ロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラ
トリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネー
ト−３−サルフエート−６−（Ｏ−カルボキシメ
チル）オキシムを得る工程、 (ホ) 前記(ニ)工程で得られた、化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−３−サルフエート−６−（Ｏ−カルボキシ
メチル）オキシムと、ｐ−ニトロフエノールとの
反応を、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在
下で遂行し、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−３−サルフエート−６−〔Ｏ−（ｐ−ニトロ
フエノキシ）カルボキシメチル〕オキシムを得る
工程、 (ヘ) 前記(ホ)工程で得られた、化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−３−サルフエート−６−〔Ｏ−（ｐ−ニトロ
フエノキシ）カルボニルメチル〕オキシムとウシ
血清アルブミンとを反応させ、６−オキソエスト
リオール−３−サルフエート−16α−グルクロナ
イド−アセテート−メチルエステル−６−（Ｏ−
カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体を得
る工程、 (ト) 前記(ヘ)工程で得られた、化学構造式で表示される６−オキソエストリオール−３−サ
ルフエート−16α−グルクロナイドアセテート−
メチルエステル−６−（Ｏ−カルボキシメチル）
オキシム−BSA結合体を部分加水分解し、化学
構造式で表示される目的化合物たる６−オキソエストリ
オール−３−サルフエート−16α−グルクロナイ
ド−６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−
BSA結合体から成る新規ステロイド化合物を得
る工程から成るものである。特許請求の範囲第３番目の発明は、前述の化学
構造式〔〕で表示される新規ステロイド化合物
たる６−オキソエストリオール−３−サルフエー
ト−16α−グルクロナイド−６−（Ｏ−カルボキ
シメチル）オキシム−BSA結合体が、該結合体
を抗原とする抗体を用いて免疫化学的測定方法に
よりエストリオール−３−サルフエート−16α−
グルクロナイドを測定する場合には、前記抗体の
特異性が高く、エストリオール−３−サルフエー
ト−16α−グルクロナイドを簡便、且つ正確に定
量することが出来るという前記新規ステロイド化
合物の性質を利用するものである。以下、本発明の新規ステロイド化合物の具体的
な製造方法、製造工程途中で得られた化合物と最
終目的化合物との分析結果、ならびに最終目的化
合物たる新規ステロイド化合物を、エストリオー
ル−３−サルフエート−16α−グルクロナイドを
免疫化学的測定方法で測定する際の抗原として使
用する場合のその使用方法等について説明する。実施例１前記化学構造式〔〕で表示される公知の化合
物、６−オキソエストリオール−16α−グルクロ
ナイド−アセテートメチルエステル−３−ベンジ
ルエーテル973mgをピリジン６mlに溶かした溶液
に、６mlの無水酢酸ピリジン６mlに溶かした溶液
を添加し、この混合物を70℃に１時間加温した。
次いで、反応混合物を氷冷されている水中に注い
だ後エチルアセテートで抽出し、有機層を５％
HC、水、５％NaHCO₃、水の順で、洗滌して
から、無水Na₂SO₄で脱水し、最後に溶媒を真空
蒸発させた。この残渣物をシリカゲルを使用した
カラムクロマトグラフイーに付し、ヘキサン−エ
チルアセテート２：１の溶出物を状態ジクロロメ
タン−メタノールで再結晶し、前記化学構造式
〔〕で表示される化合物に相当するメチル
（17β−アセトキシ−３−ベンジルオキシ−６−
オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエン−
16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネート450mgを
無色の針状結晶として得た。前記再結晶化物の分析結果は次の通りである。 m.p. 160−164℃ 〔α〕²⁰ _D −35.1°（ｃ＝0.10、CHC₃） C₄₀H₄₆O₁₄の計算値Ｃ；63.99、Ｈ；6.17 実験値Ｃ；64.00、Ｈ；6.38 N.m.r.（CDC₃）δ： 0.78（3H，ｓ、18−CH₃）， 2.02、2.03、2.06、2.07（各3H、各ｓ、17β、
２−′、３−′、4′−OCOCH₃）， 3.78（3H，ｓ、18−COOCH₃）， 3.99（1H，ｍ、5′−Ｈ）， 4.30（1H，ｍ、16β−Ｈ）， 4.57（1H，ｄ、Ｊ＝８Hz、1′−Ｈ）， 4.90−5.40（3H，ｍ、２−′、３−′、4′−
Ｈ）， 5.01（1H，ｄ、Ｊ＝6Hz、17α−Ｈ）， 5.13（2H，ｓ、３−OCH₂C₆H₅）， 7.00−7.70（8H，ｍ，amromaticH）。前記工程で得られた化学構造式〔〕に相当す
る化合物メチル（17β−アセトキシ−３−ベンジ
ルオキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート437mgをメタノール200mlに溶かした溶液を、
５％Pd／C527mgと共に、室温下H₂気流中3.5時間
振とうした。次いで、セライトによる過操作で
触媒を除去した後、液物を真空蒸発操作に付
し、この残留物をヘキサン−エチルアセテート
（１：１）の混合溶媒を使用したシリカゲルのカ
ラムクラマトグラフイーに付した。引き続いて、
薄層クロマトグラフイーのスポツト（R0.34）
に相応する吸着剤の溶離物をジクロロメタン−メ
タノールの混合溶媒で再結晶化した結果、化学構
造式〔〕に相当する化合物、メチル（17β−ア
セトキシ−３−ヒドロキシ−６−オキソ−１，
３，５（10）−エストラトリエン−16α−イル−2′，
3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシツド）ウロネート185mgを、無色の針状結
晶として得た。前記針状物の分析結果は次の通りである。 m.p. 207−210℃ 〔α〕²⁰ _D −160.9°（ｃ＝0.09、CHC₃） C₃₃H₄₀O₁₄H₂Ｏの計算値Ｃ；58.41、Ｈ；6.24 実験値Ｃ；58.49、Ｈ；6.20 N.m.r.（CDC₃）δ： 0.78（3H，ｓ、18−CH₃）， 2.02、2.03、2.06、2.07（各3H、各ｓ、17β、
２−′、３−′、4′−OCOCH₃）， 3.77（3H，ｓ、18−COOCH₃）， 3.97（1H，ｄ、Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ）， 4.55（1H，ｄ、Ｊ＝７Hz、1′−Ｈ）， 7.03（1H，dd、Ｊ＝８，３Hz、２−Ｈ）， 7.18（1H，ｄ、Ｊ＝８Hz、１−Ｈ）， 7.46（1H，ｄ、Ｊ＝３Hz、４−Ｈ）。 MS ｍ／ｚ 660（M⁺） U.v.λ^EtOH _naxnm：257，317 薄層クロマトグラフイーの別のスポツト
（R0.15）に相当する吸着剤の溶出物をジクロロ
メタン−メタノールの混合溶媒で再結晶した結
果、6ζ−ヒドロキシ化合物40mgを無色針状結晶と
して得た。前記針状物の分析結果は次の通りである。 m.p. 230−235℃ 〔α〕²⁰ _D −106.3°（ｃ＝0.09、CHC₃） C₃₃H₄₂O₁₄・H₂Ｏの計算値Ｃ；58.23、Ｈ；6.51 実験値Ｃ；58.61、Ｈ；6.41 N.m.r.（CDC₃）δ： 0.78（3H，ｓ、18−CH₃）， 2.02、2.03、and2.06（3H、3Hand6H、各ｓ
17β、２−′、３−′、4′−OCOCH₃）， 3.77（3H，ｓ、18−COOCH₃）， 3.97（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz、5′−Ｈ）， 4.55（1H，ｄ，Ｊ＝７Hz、1′−Ｈ）， 6.72（1H，dd，Ｊ＝９，３Hz、２−Ｈ）， 7.00−7.55（2H，ｍ，１−，４−Ｈ）。 MS ｍ／ｚ 644（Ｍ−H₂Ｏ）⁺ U.v.λ^EtOH _naxnm：283，290（shoulder）前記工程で得られた化学構造式〔〕に相当す
る化合物、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒド
ロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラ
トリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネー
ト202mgとカルボキシメトキシルアミン塩酸塩482
mgとをメタノール32mlに溶かした溶液中に、酢酸
ナトリウム485mgを水４ml中に溶かした溶液を添
加し、この混合物を35℃で１晩攪拌し続けた。次
いで、メタノールを蒸発、除去した後の溶液を水
で希釈し、エチルアセテートで抽出後、有機層を
水で洗滌し、無水Na₂SO₄上で乾燥し真空下溶媒
を留去した。この乾燥物をシリカゲルを使用した
カラムクロマトグラフイーにかけ、クロロホル
ム／メタノール／水（80：20：2.5）の混合溶媒
の溶出物として化学構造式〔〕に相応する化合
物、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒドロキシ
−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエ
ン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル
−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネート−６
−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム267mgを無色
の油状物質として得た。前記油状物質の分析結果は次の通りである。 N.m.r.（CDC₃）δ： 0.67（3H，ｓ、18−CH₃）， 2.02、2.05and2.08（6H、3Hand3H、各ｓ，
17β、2′−、３−′、4′−OCOCH₃）， 3.74（3H，ｓ、18−COOCH₃）， 3.97（1H，ｄ，Ｊ＝9Hz、5′−Ｈ）， 4.60（3H，ｍ，1′−Ｈ，＝NOCH₂−）， 6.73（1H，ｄ，Ｊ＝8Hz、２−Ｈ）， 6.79（1H，ｄ，Ｊ＝8Hz、１−Ｈ）， 7.23（1H，ｓ，４−Ｈ）。前記工程で得られた化学構造式〔〕に相当す
る化合物、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒド
ロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラ
トリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネー
ト−６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム242mg
をピリジン３mlに溶かした溶液に、氷冷されてい
るピリジン（1.0ml）−クロロスルホン酸（0.5ml）
複合体を添加し、この混合物を室温下に１晩攪拌
した。次いで、得られた反応混合物を５％
NaHCO₃50ml中に注ぎ、30分間攪拌後、この混
合溶液をアンバーライトXAD−４カラム（11cm
×１cm内径）に吸着させた。更にそのカラムを水
洗後、１滴の濃アンモニアを含んでいるメタノー
ルで溶離させた。しかる後に、溶出物を、シリカ
ゲルを使用したカラムクロマトグラフイーにか
け、更に、クロロホルム／メタノール／水（80：
20：2.5）の混合溶媒で溶離させ、化学構造式
〔〕に相応する化合物、メチル（17β−アセト
キシ−３−ヒドロキシ−６−オキソ−１，３，５
（10）−エストラトリエン−16α−イル−2′，3′，
4′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シツド）ウロネート−３−サルフエート−６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム87mgを無色の
無定形物質として得た。前記無定形物質の分析結果は次の通りである。 N.m.r.（CDC₃）δ： 0.78（3H，ｓ、18−CH₃）， 1.97，1.98and2.04（3H、3Hand6H、各ｓ，
17β、2′−、３−′、4′−OCOCH₃）， 3.70（3H，ｓ、−COOCH₃）， 3.22（1H，ｄ，Ｊ＝9Hz、1′−Ｈ）， 4.77（2H，ｓ，＝NOCH₂−）， 7.10−7.80（3H，ｍ，aromaticH）。 IRν^KBr _naxcm^-1： 1735（Ｃ＝Ｏ）， 1240（−OCOCH₃）， 1040（−OSO₃Ｈ）。前記工程で得られた化学構造式〔〕に相当す
る化合物、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒド
ロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラ
トリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネー
ト−３−サルフエート−６−（Ｏ−カルボキシメ
チル）オキシム42mgをアセトニトリル４mlに溶か
した溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド65
mgとｐ−ニトロフエノール100mgとを添加し、こ
の混合物を室温で遮光下21.5時間攪拌した。次い
で、窒素ガス気流中で溶媒を蒸発後、残渣物をエ
チルアセテートを展開溶媒とする分取用薄層クロ
マトグラフイーにかけ、スポツト（R0.4）に相
応する吸着剤をアセトニトリルで抽出した結果、
化学構造式〔〕に相当する化合物、メチル
（17β−アセトキシ−３−ヒドロキシ−６−オキ
ソ−１，３，５（10）−エストラトリエン−16α−
イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ
−グルコピラノシツド）ウロネート−３−サルフ
エート−６−〔Ｏ−（ｐ−ニトロフエノキシ）カル
ボニルメチル〕オキシム23mgを無色の油状物質と
して得た。前記油状物質の分析結果は次の通りである。 N.m.r.（CD₃OD）δ： 0.80（3H，ｓ、18−CH₃）， 1.99、2.06（各6H、各ｓ17β、2′−、3′−、
4′−OCOCH₃）， 3.71（3H，ｓ、18−COOCH₃）， 6.86（2H，ｄ，Ｊ＝9Hz、

【式】）， 7.20−7.80（3H，ｍ、１−，２−４−Ｈ）， 8.09（2H，ｄ，Ｊ＝９Hz、

【式】）。 0.1M燐酸塩緩衝液（PH7.4）1.2mlにウシ血清ア
ルブミン（BSA）27mgを溶かした溶液に、前記
工程で得られた化学構造式〔〕に相当する化合
物、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒドロキシ
−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエ
ン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル
−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネート−３
−サルフエート−６−〔Ｏ−（ｐ−ニトロフエノキ
シ）カルボニルメチル〕オキシム23mgをピリジン
0.5mlに溶かした溶液を加え、この混合物を室温
にて16時間攪拌した。次いで得られた反応液を、
４℃にて水で７時間、次いで0.05M NaHCO₃で
１晩透析した後、これを真空凍結乾燥し、化学構
造式〔〕に相応する化合物、６−オキソエスト
リオール−３−サルフエート−16α−グルクロナ
イドアセテート−メチルエステル−６−（Ｏ−カ
ルボキシメチル）オキシム−BSA結合体を得た。引き続いて、前記工程で得られた６−オキソエ
ストリオール−３−サルフエート−16α−グルク
ロナイド−アセテート−メチルエステル−６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体
を水50mlに溶かした溶液に5N NaOH0.08mlを加
えてPH12に調製し、室温にて26.5時間攪拌した。
次いで、反応液を冷流水で１晩透析した後、真空
冷凍乾燥した結果、化学構造式〔〕に相応する
目的化合物たる６−オキソエストリオール−３−
サルフエート−16α−グルクロナイド−６−（Ｏ
−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体33
mgを得た。得られた前記結合体におけるステロイド：
BSAのモル比率は、濃硫酸による呈色反応を利
用した600nmにおける吸光度測定の結果、14：１
であることが確認された。尚、以上の実施例における分取用薄層クロマト
グラフイーにはシリカゲル60HF₂₅₄を、またカラ
ムクロマトグラフイーにはシリカゲル60（70−
230mesh）またはシリカゲルＧ（Type60）を使用
した。実施例２抗体の作製（ウサギの免疫）３匹の白色雄ウサギを、前記実施例１で得られ
た６−オキソエストリオール−３−サルフエート
−16α−グルクロナイド−６−（Ｏ−カルボキシ
メチル）オキシム−BSA結合体からなる抗原で
以下のごとく免疫した。即ち、抗原0.5−１mgを殺菌処理されている等
張食塩水0.5mlに溶解し、これをFreundコンプリ
ートアジユバンド0.5mlでエマルジヨンにし、こ
のエマルジヨンをウサギの背中と足蹠とに数箇所
皮下注射した。この操作を１ケ月に１度の割で８
ケ月間繰り返し、最終注射の10日後に採血した。前記採血した血液を、3000回転／分で15分間遠
心分離し、得られた抗血清を、0.004％のBSAを
含んでいる0.05Mホウ酸緩衝液（PH7.4）（以下、
アツセイバツハーと略す）で希釈して測定に使用
した。アツセイ操作標準曲線を、以下の操作で作製した。即ち、10
ml用遠心管に、アツセイバツハー0.1ml中に０，
50，100，250，500，700，1000，2000，5000pg
の非標識エストリオール−３−サルフエート−
16α−グルクロナイドを含む溶液0.1mlとアツセイ
バツハー0.1ml中に³Ｈ−標識エストリオール−３
−サルフエート−16α−グルクロナイド80pg
（8000d.p.m.）を含有している溶液0.1mlとを加え
た。各点の測定は二重測定法により行つた。次いで、アツセイバツハーを添加することによ
り全量を0.3mlにした後、１：800，１：2000，
１：1800に希釈されている抗血清0.1mlを添加し
た。その混合物を４℃にて一夜〓置し、更にデキ
ストラン炭末を含有しているアツセイバツハー
0.4mlを添加した。この混合物を3000rpmで15分
間遠心分離し、上清液0.6mlをとり、放射活性を
計測し、標準曲線を作製した。交叉反応について６−オキソエストリオール−３−サルフエート
−16α−グルクロナイド−６−（Ｏ−カルボキシ
メチル）オキシム−BSA結合体で免疫した前述
のウサギから得られた抗血清について、17種類の
近縁ステロイドとの交叉反応性を試験した結果を
第１表に示す。尚、第１表の交叉反応の欄における数値は、非
標識エストリオール−３−サルフエート−16α−
グルクロナイドの50％阻止量を100とし、これに
対する各種ステロイドの読みの比率の逆数を百分
率で表示したものである。

【表】

【表】第１表の結果より明らかなように、本発明の新
規ステロイド化合物たる６−オキソエストリオー
ル−３−サルフエート−16α−グルクロナイド−
６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結
合体を抗原とする抗血清は、エストリオール−３
−サルフエート−16α−グルクロナイドに対する
特異性が極めて高く、近縁ステロイドとの交叉反
応性が低く抑えられているので、前記本発明の新
規ステロイド化合物が、免疫化学的測定方法によ
りエストリオール−３−サルフエート−16α−グ
ルクロナイドを定量する際の抗原として極めて有
用な物質であることが明確である。尚、本発明の新規ステロイド化合物を抗原とし
て利用し、免疫化学的測定方法によりエストリオ
ール−３−サルフエート−16α−グルクロナイド
を測定する前記ステロイド化合物の使用方法を、
以上、ラジオイムノアツセイ法で測定する場合に
基いて説明したが、同様にして酵素免疫測定法、
血球凝集反応法、ラテツクス凝集反応法等の免疫
化学的測定方法でエストリオール−３−サルフエ
ート−16α−グルクロナイドを測定する場合に
も、抗原として使用し得るものであることは勿論
である。

Claims

【特許請求の範囲】１化学構造式（式中、−NHBSAはウシ血清アルブミン残基
を、Ｇは式で表示されるグルクロニル基を表わす。以下同
様）で表示される６−オキソエストリオール−３
−サルフエート−16α−グルクロナイド−６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体
からなる新規ステロイド化合物。２(イ) 公知化合物である化学構造式（式中、G′は式で表示されるグルクロニル（アセテート−メチル
エステル）基を表わす。以下同様）で表示される
６−オキソエストリオール−16α−グルクロナイ
ド−アセテート−メチルエステル−３−ベンジル
エーテルの水酸基をアセチル化して、メチル
（17β−アセトキシ−３−ベンジルオキシ−６−
オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエン−
16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネート−を得る
工程、 (ロ) 化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ベ
ンジルオキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エ
ストラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−
Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウ
ロネートを還元し、メチル（17β−アセトキシ−
３−ヒドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−
エストラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ
−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）
ウロネートを得る工程、 (ハ) 化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ートをカルボキシメトキシルアミンと反応させて
メチル（17β−アセトキシ−３−ヒドロキシ−６
−オキソ−１，３，５（10）−エストラトリエン−
16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネート−６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムを得る工程、 (ニ) 化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムを
硫酸化してメチル（17β−アセトキシ−３−ヒド
ロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エストラ
トリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネー
ト−３−サルフエート−６−（Ｏ−カルボキシメ
チル）オキシムを得る工程、 (ホ) 化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−３−サルフエート−６−（Ｏ−カルボキシ
メチル）オキシムに、ジシクロヘキシルカルボジ
イミドの存在下において、ｐ−ニトロフエノール
を反応させ、メチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−３−サルフエート−６−〔Ｏ−（ｐ−ニトロ
フエノキシ）カルボニルメチル〕オキシムを得る
工程、 (ヘ) 化学構造式で表示されるメチル（17β−アセトキシ−３−ヒ
ドロキシ−６−オキソ−１，３，５（10）−エスト
ラトリエン−16α−イル−2′，3′，4′−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシツド）ウロネ
ート−３−サルフエート−６−〔Ｏ−（ｐ−ニトロ
フエノキシ）カルボニルメチル〕オキシムをウシ
血清アルブミンと反応させ、６−オキソエストリ
オール−３−サルフエート−16α−グルクロナイ
ド−アセテート−メチルエステル−６−（Ｏ−カ
ルボキシメチル）オキシム−BSA結合体を得る
工程、 (ト) 化学構造式で表示される６−オキソエストリオール−３−サ
ルフエート−16α−グルクロナイド−アセテート
−メチルエステル−６−（Ｏ−カルボキシメチル）
オキシム−BSA結合体を部分加水分解し、化学
構造式で表示される６−オキソエストリオール−３−サ
ルフエート−16α−グルクロナイド−−６−（Ｏ
−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体と
することを特徴とする新規ステロイド化合物の製
造方法。３化学構造式で表示される６−オキソエストリオール−３−サ
ルフエート−16α−グルクロナイド−−６−（Ｏ
−カルボキシメチル）オキシム−BSA結合体か
らなることを特徴とする免疫化学的測定方法によ
るエストリオール−３−サルフエート−16α−グ
ルクロナイド測定用抗原。