JPH0720985B2 - ハプテン―蛋白質―接合体及び免疫検定法 - Google Patents
ハプテン―蛋白質―接合体及び免疫検定法Info
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- JPH0720985B2 JPH0720985B2 JP1013314A JP1331489A JPH0720985B2 JP H0720985 B2 JPH0720985 B2 JP H0720985B2 JP 1013314 A JP1013314 A JP 1013314A JP 1331489 A JP1331489 A JP 1331489A JP H0720985 B2 JPH0720985 B2 JP H0720985B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はハプテン−蛋白質−接合体及びその使用に関す
る。
る。
臨床診断において、特別な感度で優れている免疫検定法
の原理による測定法が増加性で実施されている。このた
めに、被測定物質（測定すべき物質）を、抗原、ハプテ
ン又は抗体であつてよく、標識付けすることのできる特
異的な免疫学的活性物質と、かつ大抵は、固相に結合し
ている特異的に結合性の少なくとももう１個の物質と反
応させる。固相に結合した、特異的結合性の物質被測定
物質及び標識された特異的結合性物質からの接合体の液
相からの分離の後に、双方の相の１方中で、被測定物質
の尺度である標識の量を測定することができる。標識と
しては屡々酵素が使用される。
の原理による測定法が増加性で実施されている。このた
めに、被測定物質（測定すべき物質）を、抗原、ハプテ
ン又は抗体であつてよく、標識付けすることのできる特
異的な免疫学的活性物質と、かつ大抵は、固相に結合し
ている特異的に結合性の少なくとももう１個の物質と反
応させる。固相に結合した、特異的結合性の物質被測定
物質及び標識された特異的結合性物質からの接合体の液
相からの分離の後に、双方の相の１方中で、被測定物質
の尺度である標識の量を測定することができる。標識と
しては屡々酵素が使用される。
免疫検定のために、非常に多くの変法がある。多くの目
的のために、例えば競合アッセイ（Kompetitive Assay
s）が実施される。この際、被測定物質と試料に添加さ
れる酵素で標識されている被測定物質の公知量は抗体に
対して競争する。
的のために、例えば競合アッセイ（Kompetitive Assay
s）が実施される。この際、被測定物質と試料に添加さ
れる酵素で標識されている被測定物質の公知量は抗体に
対して競争する。
従つて、一方では、標識酵素及び被測定物質もしくは抗
体と特異的に結合しうる化合物からの接合体に関する需
要があり、ここで、この接合体は、被測定物質もしくは
抗体とのみ反応すべきであり、結果を誤まらせないため
に、試料溶液中に存在する他の化合物と交叉反応性を有
してはならない。特異的に結合する物質及び標識酵素
は、屡々、直接相互には結合せず、スペーサーを介して
結合されるので、スペーサーへの抗体の親和性が問題と
なる。
体と特異的に結合しうる化合物からの接合体に関する需
要があり、ここで、この接合体は、被測定物質もしくは
抗体とのみ反応すべきであり、結果を誤まらせないため
に、試料溶液中に存在する他の化合物と交叉反応性を有
してはならない。特異的に結合する物質及び標識酵素
は、屡々、直接相互には結合せず、スペーサーを介して
結合されるので、スペーサーへの抗体の親和性が問題と
なる。
更に、特異的な抗体の需要も大きい。一般に、免疫原例
えば抗原又はハプテンを適当な形で数回、抗体形成可能
な組織中に注入することにより抗体が製造される。ハプ
テンは、分子量が1000ダルトンより小さく、単独では免
疫原作用をしないが、蛋白質に結合することにより免疫
原になると定義される分子である。免疫感作のために、
このハプテンを免疫原分子例えば、血清蛋白質と接合さ
せる。このような接合体を注入すると、組織は抗−蛋白
−抗体と共に所望の抗−ハプテン−抗体を形成する。次
いで、生じた抗体がこの組織から得られる。こうして、
ポリクローナル抗体を得ることができる。
えば抗原又はハプテンを適当な形で数回、抗体形成可能
な組織中に注入することにより抗体が製造される。ハプ
テンは、分子量が1000ダルトンより小さく、単独では免
疫原作用をしないが、蛋白質に結合することにより免疫
原になると定義される分子である。免疫感作のために、
このハプテンを免疫原分子例えば、血清蛋白質と接合さ
せる。このような接合体を注入すると、組織は抗−蛋白
−抗体と共に所望の抗−ハプテン−抗体を形成する。次
いで、生じた抗体がこの組織から得られる。こうして、
ポリクローナル抗体を得ることができる。
モノクローナル抗体の製造のためにも、まず、適当な組
織の免疫感作を一般にマウス中で実施すべきである。抗
原又はハプテン−接合体の常法による数回の注入によ
り、β−細胞は、この抗原又はハプテンに対する抗体を
合成し、分泌させることが可能になる。スクリーニング
により、所望の抗体を生産するβ−細胞をひ臓から単離
し、骨髄腫細胞（Myelomeglle）との融合により不死化
する。その後、この細胞はたえず、同じモノクローナル
抗体を生じる。
織の免疫感作を一般にマウス中で実施すべきである。抗
原又はハプテン−接合体の常法による数回の注入によ
り、β−細胞は、この抗原又はハプテンに対する抗体を
合成し、分泌させることが可能になる。スクリーニング
により、所望の抗体を生産するβ−細胞をひ臓から単離
し、骨髄腫細胞（Myelomeglle）との融合により不死化
する。その後、この細胞はたえず、同じモノクローナル
抗体を生じる。
通例、免疫感作のために使用される接合体（これではハ
プテンが１個の架橋を介して免疫原蛋白質に結合してい
る）では、屡々架橋分子との交叉反応が現われ、生じる
抗体が部分的に、免疫原中に存在する架橋構造に対する
かなり高い親和性を示す。この架橋認識（Bruekenerken
nung）は免疫学的テストで、屡々、問題を生じる。
プテンが１個の架橋を介して免疫原蛋白質に結合してい
る）では、屡々架橋分子との交叉反応が現われ、生じる
抗体が部分的に、免疫原中に存在する架橋構造に対する
かなり高い親和性を示す。この架橋認識（Bruekenerken
nung）は免疫学的テストで、屡々、問題を生じる。
従つて、本発明の課題は、特異的にハプテンに対応する
抗体を形成し、架橋分子に対する親和性を有しないハプ
テン−蛋白質−接合体を提供することであつた。
抗体を形成し、架橋分子に対する親和性を有しないハプ
テン−蛋白質−接合体を提供することであつた。
更に、本発明の課題は、免疫検定に使用することがで
き、架橋分子との交叉反応を現わすことなしにハプテン
への抗体の特異的結合をもたらすハプテン−蛋白質−接
合体を提供することであつた。
き、架橋分子との交叉反応を現わすことなしにハプテン
への抗体の特異的結合をもたらすハプテン−蛋白質−接
合体を提供することであつた。
この課題は、１〜10個のモノサツカライド単位よりなる
糖の還元性末端に１個のハプテンが結合していて、この
糖のOH基に対してα−位に存在する他端の遊離CH2OH基
に蛋白質が結合していることよりなるハプテン−蛋白質
−接合体により解決される。
糖の還元性末端に１個のハプテンが結合していて、この
糖のOH基に対してα−位に存在する他端の遊離CH2OH基
に蛋白質が結合していることよりなるハプテン−蛋白質
−接合体により解決される。
意外にも、ハプテンが１個の糖を介して蛋白質に結合し
ているハプテン−蛋白質−接合体の使用により架橋化合
物と非常に僅かな交叉反応性を有する抗体を得ることが
成功した。この得られる抗体は、ハプテンに対する高い
親和性を有する本発明によるハプテン−蛋白質−接合体
を免疫感作のために使用する際に、高い抗体力価が得ら
れる。更に、本発明によるハプテン−蛋白質−接合体
は、免疫検定法での使用に特に好適である。この抗体
は、架橋分子に対して親和性を有せず、従つて非常に特
異的にハプテンのみに結合するので、この接合体を用い
て免疫検定法での使用の際に正確な結果が得られる。
ているハプテン−蛋白質−接合体の使用により架橋化合
物と非常に僅かな交叉反応性を有する抗体を得ることが
成功した。この得られる抗体は、ハプテンに対する高い
親和性を有する本発明によるハプテン−蛋白質−接合体
を免疫感作のために使用する際に、高い抗体力価が得ら
れる。更に、本発明によるハプテン−蛋白質−接合体
は、免疫検定法での使用に特に好適である。この抗体
は、架橋分子に対して親和性を有せず、従つて非常に特
異的にハプテンのみに結合するので、この接合体を用い
て免疫検定法での使用の際に正確な結果が得られる。
本発明によるハプテン−蛋白質−接合体において、ハプ
テンは糖を介して蛋白質と結合している。この架橋とし
て使用される糖は、１〜10個のモノサッカライド単位を
有していてよい。１〜５個のモノサッカライド単位を有
する糖を使用するのが有利である。このモノサッカライ
ド単位は、同一又は異なるものであつてよい。この糖
は、１個の還元性末端を有し、他端に１個の遊離CH2OH
基を、これに対してα−位のヒドロキシル官能基と共に
有することのみが重要である。使用モノサッカライド単
位は、少なくとも５個のＣ−原子を有する。殊に、ピラ
ノース又はフラノースが使用される。
テンは糖を介して蛋白質と結合している。この架橋とし
て使用される糖は、１〜10個のモノサッカライド単位を
有していてよい。１〜５個のモノサッカライド単位を有
する糖を使用するのが有利である。このモノサッカライ
ド単位は、同一又は異なるものであつてよい。この糖
は、１個の還元性末端を有し、他端に１個の遊離CH2OH
基を、これに対してα−位のヒドロキシル官能基と共に
有することのみが重要である。使用モノサッカライド単
位は、少なくとも５個のＣ−原子を有する。殊に、ピラ
ノース又はフラノースが使用される。
糖として、容易に入手できる化合物例えばグルコース、
マルトース又はマルトペンタオースを使用するのが有利
である。同様に、ラクトース、セロビオース又はアミロ
ペクチン単位も好適である。糖は、還元性末端を介して
ハプテンに結合される。この結合は、公知方法で、ハプ
テンの官能性基を介して行なう。このハプテンが１個の
OH基を有する場合は、糖のラクトール基とこのOH基との
間の結合をアセタール形成下に行なう。ハプテンが適当
な官能基を有しない場合は、適当な基を導入すべきであ
る。糖へのハプテンの結合は、いずれの場合にもそのエ
ピトープが自由に入り得るように行なうべきである。
マルトース又はマルトペンタオースを使用するのが有利
である。同様に、ラクトース、セロビオース又はアミロ
ペクチン単位も好適である。糖は、還元性末端を介して
ハプテンに結合される。この結合は、公知方法で、ハプ
テンの官能性基を介して行なう。このハプテンが１個の
OH基を有する場合は、糖のラクトール基とこのOH基との
間の結合をアセタール形成下に行なう。ハプテンが適当
な官能基を有しない場合は、適当な基を導入すべきであ
る。糖へのハプテンの結合は、いずれの場合にもそのエ
ピトープが自由に入り得るように行なうべきである。
通例、ハプテンとの反応の前に糖をペルアセチル化す
る。ハプテンとの反応の後に、この保護基を自体公知方
法で離脱させ、次いで、遊離のCH2OH基を選択的に誘導
体化もしくは活性化させる。
る。ハプテンとの反応の後に、この保護基を自体公知方
法で離脱させ、次いで、遊離のCH2OH基を選択的に誘導
体化もしくは活性化させる。
適当な蛋白質へのグルコース−ハプテン−接合体の結合
のために、糖の遊離CH2OH基を活性化させる。このこと
は、自体公知の方法で行なう。糖の活性化のために、自
体公知の化合物を使用することができる。例えば、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルが好適である。
のために、糖の遊離CH2OH基を活性化させる。このこと
は、自体公知の方法で行なう。糖の活性化のために、自
体公知の化合物を使用することができる。例えば、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルが好適である。
この活性化されたグルコース−ハプテン−接合体を、次
いで標準条件下に所望の蛋白質の遊離ε−アミノ基に結
合させる。蛋白質としては、通例使用される免疫原性担
体蛋白質例えばエデスチン又は牛血清アルブミン又は免
疫検定法で使用される酵素が好適である。酵素としてβ
−ガラクトシダーゼ及びペルオキシダーゼを使用するの
が有利である。本発明の特に有利な実施例では、ステロ
イドホルモン、糖架橋分及び免疫原蛋白質からなるハプ
テン−蛋白質−接合体が提供される。ステロイドホルモ
ン例えばエストロゲン、テストステロン、コルチゾン及
び強心配糖体（これらすべてにステロイド基本構造が共
通している）の検出は、診断のために非常に重要であ
る。従つて、ステロイドホルモンに対応する抗体並びに
免疫検定法を実施するためにステロイドホルモン−酵素
−接合体の自由な供給が望ましい。ところで、ステロイ
ドホルモンをそれがC6−原子の所に１個のOH基を有する
ように誘導体化することが非常に有利であると判明し
た。このOH基は、糖架橋部のラクトール基とアセタール
形成下に自体公知法で反応することができる。この結合
は、ステロイドホルモンのエピトープに悪影響をせず、
分子の不所望の変化をもたらさない。使用目的に応じ
て、ステロイドホルモン及び糖架橋部からの接合体に、
免疫原性蛋白質又は酵素を結合させることができる。
いで標準条件下に所望の蛋白質の遊離ε−アミノ基に結
合させる。蛋白質としては、通例使用される免疫原性担
体蛋白質例えばエデスチン又は牛血清アルブミン又は免
疫検定法で使用される酵素が好適である。酵素としてβ
−ガラクトシダーゼ及びペルオキシダーゼを使用するの
が有利である。本発明の特に有利な実施例では、ステロ
イドホルモン、糖架橋分及び免疫原蛋白質からなるハプ
テン−蛋白質−接合体が提供される。ステロイドホルモ
ン例えばエストロゲン、テストステロン、コルチゾン及
び強心配糖体（これらすべてにステロイド基本構造が共
通している）の検出は、診断のために非常に重要であ
る。従つて、ステロイドホルモンに対応する抗体並びに
免疫検定法を実施するためにステロイドホルモン−酵素
−接合体の自由な供給が望ましい。ところで、ステロイ
ドホルモンをそれがC6−原子の所に１個のOH基を有する
ように誘導体化することが非常に有利であると判明し
た。このOH基は、糖架橋部のラクトール基とアセタール
形成下に自体公知法で反応することができる。この結合
は、ステロイドホルモンのエピトープに悪影響をせず、
分子の不所望の変化をもたらさない。使用目的に応じ
て、ステロイドホルモン及び糖架橋部からの接合体に、
免疫原性蛋白質又は酵素を結合させることができる。
本発明によるハプテン−蛋白質−接合体は、免疫感作の
ために好適である。免疫感作のために使用する際には、
蛋白質が免疫原性担体、蛋白質例えばエデスチン又は牛
血清アルブミンである接合体を使用するのが有利であ
る。しかしながら、蛋白質としての酵素を含有する接合
体も免疫感作のために好適である。本発明による接合体
を、抗体形成のために好適な組織中に、一定間隔で数回
注入する。この接合体は、非常に高いパーセンテージで
ハプテンのみと反応し、糖架橋部と交叉反応性を有しな
い抗体を形成する作用をする。この抗体は、自体公知の
方法で組織から得ることができる。本発明により使用さ
れるハプテン−担体−接合体は、ポリクローナル抗体の
製造用の免疫感作にも、モノクローナル抗体の製造のた
めにも好適である。
ために好適である。免疫感作のために使用する際には、
蛋白質が免疫原性担体、蛋白質例えばエデスチン又は牛
血清アルブミンである接合体を使用するのが有利であ
る。しかしながら、蛋白質としての酵素を含有する接合
体も免疫感作のために好適である。本発明による接合体
を、抗体形成のために好適な組織中に、一定間隔で数回
注入する。この接合体は、非常に高いパーセンテージで
ハプテンのみと反応し、糖架橋部と交叉反応性を有しな
い抗体を形成する作用をする。この抗体は、自体公知の
方法で組織から得ることができる。本発明により使用さ
れるハプテン−担体−接合体は、ポリクローナル抗体の
製造用の免疫感作にも、モノクローナル抗体の製造のた
めにも好適である。
本発明のもう１つの実施形では、１個の糖架橋部を介し
て酵素に結合しているハプテンからのハプテン接合体を
免疫検定法に使用する。こうして形成されたハプテン−
酵素−接合体は、標識酵素として免疫検定法の原理によ
る測定法で使用することができる。この際、次いでハプ
テン及び糖架橋部から形成された接合体を活性化された
CH2OH−基を介して酵素の遊離NH2−基と反応させる。
て酵素に結合しているハプテンからのハプテン接合体を
免疫検定法に使用する。こうして形成されたハプテン−
酵素−接合体は、標識酵素として免疫検定法の原理によ
る測定法で使用することができる。この際、次いでハプ
テン及び糖架橋部から形成された接合体を活性化された
CH2OH−基を介して酵素の遊離NH2−基と反応させる。
本発明によるハプテン−酵素−接合体は、例えば、自体
公知の量で試料溶液に添加することができ、次いで、ハ
プテンと反応する抗体に関して競争する。
公知の量で試料溶液に添加することができ、次いで、ハ
プテンと反応する抗体に関して競争する。
免疫感作及び免疫検定法の実施のために、架橋部の種類
が異なる種々の接合体を使用するのが特に有利であるこ
とが判明した。従来公知の架橋化合物例えばカルボキシ
メトキシム、ジメチルカルボキシメトキシム又はヘミス
クシネートを使用すると、免疫検定法で使用されるハプ
テン−酵素−接合体は糖架橋部を有すべきである。免疫
検定のために、糖架橋部を有する本発明によるハプテン
−蛋白質−接合体を用いる免疫感作により得られた抗体
を使用する場合、公知の有利に疎水性の架橋部を有する
ハプテン−酵素−接合体を使用するのが有利であると判
明した。
が異なる種々の接合体を使用するのが特に有利であるこ
とが判明した。従来公知の架橋化合物例えばカルボキシ
メトキシム、ジメチルカルボキシメトキシム又はヘミス
クシネートを使用すると、免疫検定法で使用されるハプ
テン−酵素−接合体は糖架橋部を有すべきである。免疫
検定のために、糖架橋部を有する本発明によるハプテン
−蛋白質−接合体を用いる免疫感作により得られた抗体
を使用する場合、公知の有利に疎水性の架橋部を有する
ハプテン−酵素−接合体を使用するのが有利であると判
明した。
次の実施例につき本発明を詳説する： 例１ エストラジオール−６α−マルトース−β−Gal−免疫
原製造用処方 1.エストラジオール−3,17−ジアセテート（II） 無水酢酸600mlに、攪拌及び冷却下に過塩素酸1.2mlを加
える。引続、少量宛エストラジオール（Ｉ）54.4g（200
mモル）を30〜40℃で添加し、25℃で30分間攪拌する。
無水酢酸を40℃の浴温で高度真空中で蒸発させ、残分を
ジエチルエーテル中に溶かす。ひだ付きフイルターを通
して濾過し、濾液を飽和NaHCO3−溶液500mlで２回洗浄
する。エーテル相を分離し、水500mlで洗浄し、Na2SO45
0gで乾燥させる。溶剤を蒸発除去し、残分を石油エーテ
ル500mlで浸漬する。固体生成物を吸引濾過し、デシケ
ータ中、CaCl2上で乾燥させる。
原製造用処方 1.エストラジオール−3,17−ジアセテート（II） 無水酢酸600mlに、攪拌及び冷却下に過塩素酸1.2mlを加
える。引続、少量宛エストラジオール（Ｉ）54.4g（200
mモル）を30〜40℃で添加し、25℃で30分間攪拌する。
無水酢酸を40℃の浴温で高度真空中で蒸発させ、残分を
ジエチルエーテル中に溶かす。ひだ付きフイルターを通
して濾過し、濾液を飽和NaHCO3−溶液500mlで２回洗浄
する。エーテル相を分離し、水500mlで洗浄し、Na2SO45
0gで乾燥させる。溶剤を蒸発除去し、残分を石油エーテ
ル500mlで浸漬する。固体生成物を吸引濾過し、デシケ
ータ中、CaCl2上で乾燥させる。
2.6−オキソ−エストラジオール−3,17−ジアセテート
（III） II35.6g（100mモル）を氷酢酸500ml中に溶かす。CrO314
2gを氷酢酸820ml及び水110ml中に溶かし、20℃で滴加
し、25℃で２時間攪拌する。次いで、水12l中に注ぎ、
ジクロロメタン５×500mlで抽出する。集めた有機抽出
物を水1lで洗浄し、Na2SO450g上で乾燥させ、蒸発濃縮
させる。
（III） II35.6g（100mモル）を氷酢酸500ml中に溶かす。CrO314
2gを氷酢酸820ml及び水110ml中に溶かし、20℃で滴加
し、25℃で２時間攪拌する。次いで、水12l中に注ぎ、
ジクロロメタン５×500mlで抽出する。集めた有機抽出
物を水1lで洗浄し、Na2SO450g上で乾燥させ、蒸発濃縮
させる。
得られた粘液性残分（3g）から、シリカゲルでの分取カ
ラムクロマトグラフイ（溶離液：酢酸エステル／石油エ
ーテル1:1）により生成物IIIを分離する。
ラムクロマトグラフイ（溶離液：酢酸エステル／石油エ
ーテル1:1）により生成物IIIを分離する。
収量:12.5g（粘稠性油状物34％）。
3.6α−ヒドロキシ−エストラジオール−3,17−ジアセ
テート（IV） III9.3g（25mモル）を無水エタノール300ml及び無水テ
トラヒドロフラン150ml中に溶かし、０℃に冷却し、攪
拌下にNaBH43.8g（100mモル）を加える０℃で1.5時間後
に、ジエチルエーテル１で稀釈し、水各500mlで２回
洗浄し、Na2SO430g上で乾燥させる。溶剤を溜去し、残
分をシリカゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離
液：酢酸エステル／石油エーテル1:1）により分離す
る。生成物IVが、粘液性で徐々に結晶性の油状物として
得られる。収量:4.2g（45％）。
テート（IV） III9.3g（25mモル）を無水エタノール300ml及び無水テ
トラヒドロフラン150ml中に溶かし、０℃に冷却し、攪
拌下にNaBH43.8g（100mモル）を加える０℃で1.5時間後
に、ジエチルエーテル１で稀釈し、水各500mlで２回
洗浄し、Na2SO430g上で乾燥させる。溶剤を溜去し、残
分をシリカゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離
液：酢酸エステル／石油エーテル1:1）により分離す
る。生成物IVが、粘液性で徐々に結晶性の油状物として
得られる。収量:4.2g（45％）。
4.エストラジオール−６α−マルトシド−ペルアセテー
ト（Ｖ） IV3.7g（10mモル）をヘプタアセチルマルトーストリク
ロルアセトイミデート（製造:R.R.Schmidt und J.Miche
l、Angew.Chem.92（1980）、763参照）11.7g（15mモ
ル）と共に無水ジクロルメタン100ml中に溶かす。攪拌
下に、三弗化ホウ素−エーテレート1.5mlをジクロルメ
タン5ml中に20℃で滴加する。1.5時間の攪拌の後に、な
おジクロルメタン5ml中の三弗化ホウ素−エーテレート
0.1mlを添加し、更に15分間攪拌する。飽和NaHCO3−溶
液各50mlで３回、次いで、水100mlで洗浄する。有機相
をNa2SO410gで乾燥させ、蒸発濃縮させる。生成物Ｖを
シリカゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離後：
酢酸エステル／石油エーテル3:2）により残分から分離
する。
ト（Ｖ） IV3.7g（10mモル）をヘプタアセチルマルトーストリク
ロルアセトイミデート（製造:R.R.Schmidt und J.Miche
l、Angew.Chem.92（1980）、763参照）11.7g（15mモ
ル）と共に無水ジクロルメタン100ml中に溶かす。攪拌
下に、三弗化ホウ素−エーテレート1.5mlをジクロルメ
タン5ml中に20℃で滴加する。1.5時間の攪拌の後に、な
おジクロルメタン5ml中の三弗化ホウ素−エーテレート
0.1mlを添加し、更に15分間攪拌する。飽和NaHCO3−溶
液各50mlで３回、次いで、水100mlで洗浄する。有機相
をNa2SO410gで乾燥させ、蒸発濃縮させる。生成物Ｖを
シリカゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離後：
酢酸エステル／石油エーテル3:2）により残分から分離
する。
収量:1.3g（粘稠性油状物31％）。
5.エストラジオール−６α−マルトシド（VI） V0.99gをメタノール15ml中に溶かし、2NNaOH5mlを加え
る。25℃で20時間攪拌し、次いで、2NHClの添加によりp
H値を50に調節し、溶液を真空中で蒸発濃縮させる。残
分をジメチルホルムアミド10ml中に溶かし、濾過し、濾
液を高度真空中で蒸発乾涸させる。残分をアセトン10ml
で浸漬し、吸引濾過し、乾燥させる。粗生成物をシリカ
ゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離液：クロロ
ホルム／メタノール3:2）により精製する。
る。25℃で20時間攪拌し、次いで、2NHClの添加によりp
H値を50に調節し、溶液を真空中で蒸発濃縮させる。残
分をジメチルホルムアミド10ml中に溶かし、濾過し、濾
液を高度真空中で蒸発乾涸させる。残分をアセトン10ml
で浸漬し、吸引濾過し、乾燥させる。粗生成物をシリカ
ゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離液：クロロ
ホルム／メタノール3:2）により精製する。
収量:360mg（52％）。
6.エストラジオール−６α−マルトース−ヘミグルタリ
ール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（VII） VI310mg（0.5mモル）を無水ジメチルホルムアミド10ml
中に溶かし、グルタール酸−ω−ｏ−トリメチルエステ
ル−ω′−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル1.75
g（6mモル）を添加する。ナフイオン（Nafion）117300m
g及びモレキュラーシーブ4A2gの添加の後に、不活性ガ
ス雰囲気下で20時間攪拌する。その後、ひだ付きフイル
ターを通して濾過し、濾液に0.1NHCl2mlを添加し、溶液
を15分間攪拌する。次いで、0.1NNaOHでpH−値を5.0に
調節し、溶液を高度真空中で蒸発乾涸させる。残分を再
度無水ジメチルホルムアミド10ml中に溶かし、濾過し、
かつ再び蒸発乾涸させる。残分を無水酢酸10mlで浸漬
し、次いで、石油エーテル10mlを添加し、固体を吸引濾
過する。生成物VIIをジエチルエーテルで洗浄し、高度
真空中、30℃で乾燥させる。
ール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（VII） VI310mg（0.5mモル）を無水ジメチルホルムアミド10ml
中に溶かし、グルタール酸−ω−ｏ−トリメチルエステ
ル−ω′−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル1.75
g（6mモル）を添加する。ナフイオン（Nafion）117300m
g及びモレキュラーシーブ4A2gの添加の後に、不活性ガ
ス雰囲気下で20時間攪拌する。その後、ひだ付きフイル
ターを通して濾過し、濾液に0.1NHCl2mlを添加し、溶液
を15分間攪拌する。次いで、0.1NNaOHでpH−値を5.0に
調節し、溶液を高度真空中で蒸発乾涸させる。残分を再
度無水ジメチルホルムアミド10ml中に溶かし、濾過し、
かつ再び蒸発乾涸させる。残分を無水酢酸10mlで浸漬
し、次いで、石油エーテル10mlを添加し、固体を吸引濾
過する。生成物VIIをジエチルエーテルで洗浄し、高度
真空中、30℃で乾燥させる。
収量:280mg（68％） 7.エストラジオール−マルトース−免疫原（VIII）活性
ハプテン（VIII）100mlをジメチルホルムアミド5mg中に
溶かし、0.1N燐酸緩衝液（pH8.5）0.5l中のβ−ガラク
トシダーゼ1gの溶液に加える。25℃で20時間攪拌し、水
に対して透析させ、凍結乾燥させる。この凍結乾燥物を
免疫感作のために使用する。
ハプテン（VIII）100mlをジメチルホルムアミド5mg中に
溶かし、0.1N燐酸緩衝液（pH8.5）0.5l中のβ−ガラク
トシダーゼ1gの溶液に加える。25℃で20時間攪拌し、水
に対して透析させ、凍結乾燥させる。この凍結乾燥物を
免疫感作のために使用する。
この反応式は次のとおりである： 例２ ａ）ジフエニルヒダントイン−４′−テトラアセチルグ
ルコシド（II） ５−（４−ヒドロキシフエニル）−５−フエニルヒダン
トイン （Ｉ）1.07g（8mモル）をテトラアセチルグルコース−
トリクロルアセトイミデート（R.R.Schmidt und J.Mich
el、Angew.Chem.92（1982）、763により製造）2.36g
（4.8mモル）と共に無水テトラヒドロフラン40ml中に溶
かす。攪拌下に無水テトラヒドロフラン5ml中の三弗化
ホウ素エーテレート0.15mlを20℃で滴加する。室温で16
時間攪拌後に、更に、テトラアセチルグルコース−トリ
クロルアセトイミデート0.98g（2mモル）及び三弗化ホ
ウ素−エーテレート0.1mlを添加し、更に４時間攪拌す
る。その後、反応混合物にNaHCO32gを加え、濾過し、濾
液を真空中で蒸発濃縮させる。残分をアセトン20mlで抽
出し、抽出物を真空中で蒸発濃縮させ、生成物をシリカ
ゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離液：酢酸エ
ステル／石油エーテル2:1）により分離する。
ルコシド（II） ５−（４−ヒドロキシフエニル）−５−フエニルヒダン
トイン （Ｉ）1.07g（8mモル）をテトラアセチルグルコース−
トリクロルアセトイミデート（R.R.Schmidt und J.Mich
el、Angew.Chem.92（1982）、763により製造）2.36g
（4.8mモル）と共に無水テトラヒドロフラン40ml中に溶
かす。攪拌下に無水テトラヒドロフラン5ml中の三弗化
ホウ素エーテレート0.15mlを20℃で滴加する。室温で16
時間攪拌後に、更に、テトラアセチルグルコース−トリ
クロルアセトイミデート0.98g（2mモル）及び三弗化ホ
ウ素−エーテレート0.1mlを添加し、更に４時間攪拌す
る。その後、反応混合物にNaHCO32gを加え、濾過し、濾
液を真空中で蒸発濃縮させる。残分をアセトン20mlで抽
出し、抽出物を真空中で蒸発濃縮させ、生成物をシリカ
ゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離液：酢酸エ
ステル／石油エーテル2:1）により分離する。
収量:1.38g（52％）。
ｂ）ジフエニルヒダントイン−４′−グルコシド（II
I） II1.2g（2mモル）をメタノール15ml中に溶かし、ナトリ
ウムメチレート100mgを加える。25℃で25時間攪拌し、
次いでアンバーライト（Amberlite）LG50H+1gを添加
し、更に、15分間攪拌する。反応混合物を濾過し、濾液
を真空中で蒸発濃縮する。粗生成物を少量のメタノール
中に溶かし、シリカゲルカラム上に装入し、クロロホル
ム／メタノール（3:1）で溶離させる。
I） II1.2g（2mモル）をメタノール15ml中に溶かし、ナトリ
ウムメチレート100mgを加える。25℃で25時間攪拌し、
次いでアンバーライト（Amberlite）LG50H+1gを添加
し、更に、15分間攪拌する。反応混合物を濾過し、濾液
を真空中で蒸発濃縮する。粗生成物を少量のメタノール
中に溶かし、シリカゲルカラム上に装入し、クロロホル
ム／メタノール（3:1）で溶離させる。
収量:520mg（61％）。
ｃ）ジフエニルヒダントイン−４′−グルコース−ヘミ
グルタリール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（IV） III0.43g（1mモル）を無水テトラヒドロフラン10ml中に
溶かし、グルタール酸−ω−ｏ−トリメチルエステル−
ω′−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.87g（3
mモル）を加える。この溶液にｐ−トルオールスルホン
酸40mgを加え、25℃で20時間攪拌する。引続き、溶液を
真空中で蒸発濃縮させ、残分を酢酸エステル30ml中に溶
かし、0.1NHCl及び水各20mlで洗浄する。有機相をNa2SO
45gで乾燥させ、真空中で蒸発濃縮させる。生成物IVを
シリカゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離液：
酢酸エステル／テトラヒドロフラン3:1）により混合物
から分離する。
グルタリール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（IV） III0.43g（1mモル）を無水テトラヒドロフラン10ml中に
溶かし、グルタール酸−ω−ｏ−トリメチルエステル−
ω′−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.87g（3
mモル）を加える。この溶液にｐ−トルオールスルホン
酸40mgを加え、25℃で20時間攪拌する。引続き、溶液を
真空中で蒸発濃縮させ、残分を酢酸エステル30ml中に溶
かし、0.1NHCl及び水各20mlで洗浄する。有機相をNa2SO
45gで乾燥させ、真空中で蒸発濃縮させる。生成物IVを
シリカゲルでの分取カラムクロマトグラフイ（溶離液：
酢酸エステル／テトラヒドロフラン3:1）により混合物
から分離する。
収量:0.26g（41％）。
ｄ）ジフエニルヒダントイン−グルコース−免疫原
（Ｖ） 活性ハプテンV50mgをジメチルホルムアミド5ml中に溶か
し、0.1N燐酸緩衝液（pH8.5）50mlを添加する。25℃で
５時間攪拌し、水に対して透析させ、凍結乾燥させる。
凍結乾燥物をアセトンで洗浄し、真空中で乾燥させ、免
疫感作のために使用する。
（Ｖ） 活性ハプテンV50mgをジメチルホルムアミド5ml中に溶か
し、0.1N燐酸緩衝液（pH8.5）50mlを添加する。25℃で
５時間攪拌し、水に対して透析させ、凍結乾燥させる。
凍結乾燥物をアセトンで洗浄し、真空中で乾燥させ、免
疫感作のために使用する。
反応式は次のとおりである： 例３ 本発明による免疫原及び技術水準の免疫原を用いる免疫
感作により抗血清を製造し、その交叉反応性を比較し
た。
感作により抗血清を製造し、その交叉反応性を比較し
た。
このために、羊各10匹を、まず、フロインドのアジュバ
ント中の免疫原100μｇで免疫感作し、かつ、約８週間
の周期で免疫原各50μｇで３回更に免疫感作させた。60
日もしくは150日後に、抗血清を取り出し、免疫吸着的
に（immunsorptiv）精製する。
ント中の免疫原100μｇで免疫感作し、かつ、約８週間
の周期で免疫原各50μｇで３回更に免疫感作させた。60
日もしくは150日後に、抗血清を取り出し、免疫吸着的
に（immunsorptiv）精製する。
免疫原としてエストラジオール−蛋白質−接合体を使用
する。担持蛋白質として、すべての場合に、β−ガラク
トシダーゼを使用する。系１〜３に関して、エストラジ
オールに技術水準でカルボキシメトキシム（cmo）、ジ
メチルカルボキシメトキシム（dmc）及びへミスクシネ
ート（hs）を結合させる（Steroid Biochem.22（198
5）、285、Chem.Pharm.Bull.22（1974）、1167、Steroi
ds23（1974）、549参照）。化合物１〜３の式は次に示
すとおりである： cmo/dmc/hs−ε−リジン−変性エストラジオール（例
３）： 他の３種の系（４〜６）では、本発明による免疫原を架
橋形成体としてのグルコースと共に使用する。
する。担持蛋白質として、すべての場合に、β−ガラク
トシダーゼを使用する。系１〜３に関して、エストラジ
オールに技術水準でカルボキシメトキシム（cmo）、ジ
メチルカルボキシメトキシム（dmc）及びへミスクシネ
ート（hs）を結合させる（Steroid Biochem.22（198
5）、285、Chem.Pharm.Bull.22（1974）、1167、Steroi
ds23（1974）、549参照）。化合物１〜３の式は次に示
すとおりである： cmo/dmc/hs−ε−リジン−変性エストラジオール（例
３）： 他の３種の系（４〜６）では、本発明による免疫原を架
橋形成体としてのグルコースと共に使用する。
製造は例２と同様に行なつた。
交叉反応の測定 1.試薬 被覆緩衝液： 炭酸ナトリウム50mモル/l、pH9.6 試料緩衝液： 燐酸ナトリウム10mモル/l、pH7.4、NaCl0.9％、ツイー
ン（Tween）20 0.1％ クロテイン（Crotein）C1％、 洗浄緩衝液： NaCl 0.9％、スイーン20 0.1％ 抗体−酵素−接合体： ペルオキシダーゼと羊Fcγに対応するウサギからのポリ
クローナル抗体とからの接合体（試料緩衝液中に溶解）
25mU/ml 基質： ABTS 1.9mモル/l （２、３′−アジノ−ジ−〔３−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩） ポリハプテン： 例１、７と同様にして製造したウサギIgGへのエストラ
ジオール 系１〜３では、例1.7と類似のポリハプテンを使用し
た。系４〜６では例1.7と同様であるが活性ハプテンと
してエストラジオール−６−cmo−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルを使用して製造したポリハプテンを
使用した。
ン（Tween）20 0.1％ クロテイン（Crotein）C1％、 洗浄緩衝液： NaCl 0.9％、スイーン20 0.1％ 抗体−酵素−接合体： ペルオキシダーゼと羊Fcγに対応するウサギからのポリ
クローナル抗体とからの接合体（試料緩衝液中に溶解）
25mU/ml 基質： ABTS 1.9mモル/l （２、３′−アジノ−ジ−〔３−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩） ポリハプテン： 例１、７と同様にして製造したウサギIgGへのエストラ
ジオール 系１〜３では、例1.7と類似のポリハプテンを使用し
た。系４〜６では例1.7と同様であるが活性ハプテンと
してエストラジオール−６−cmo−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルを使用して製造したポリハプテンを
使用した。
エストラジオール−誘導体： エストラジオール−６−cmo−ε−リジン（１） エストラジオール−６−dmc−ε−リジン（２） エストラジオール−６−hs−ε−リジン（３） ６−グルコシル−エストラジオール（例1.5と同様にし
て製造）。
て製造）。
cmo/dmc/hs−ε−リジン変性エストラジオールの製造
は、エストラジオール−６−cmo/dmc/hs−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル1mモル/l及びＮ−α−ｔ−ブ
チロキシカルボニル−リジン1mモル/lをジメチルホルム
アミド5ml中に溶かし、室温で２日間インキユベートす
ることにより実施した。生成物をジイソプロピルエーテ
ルの滴加により沈澱させ、真空中で乾燥させた。
は、エストラジオール−６−cmo/dmc/hs−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル1mモル/l及びＮ−α−ｔ−ブ
チロキシカルボニル−リジン1mモル/lをジメチルホルム
アミド5ml中に溶かし、室温で２日間インキユベートす
ることにより実施した。生成物をジイソプロピルエーテ
ルの滴加により沈澱させ、真空中で乾燥させた。
抗体滴定 予備実験により、個有の特異性試験で使用されるべき抗
体量を測定した。このために、ポリハプテン１μg/被覆
緩衝液mlの溶液100μl/凹みを有するマイクロ滴定プレ
ートを、振動下に室温で１時間インキユベートした。引
続き、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
体量を測定した。このために、ポリハプテン１μg/被覆
緩衝液mlの溶液100μl/凹みを有するマイクロ滴定プレ
ートを、振動下に室温で１時間インキユベートした。引
続き、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
抗血清（試料緩衝液中の４段の稀釈律1:100まで）100μ
ｌを凹み１個当りに加え、室温で１時間振動した。引続
き洗浄緩衝液で３回洗浄した。
ｌを凹み１個当りに加え、室温で１時間振動した。引続
き洗浄緩衝液で３回洗浄した。
抗体−酵素−接合体100μｌを加え、室温で１時間振動
し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
検出反応は、基質100μl/凹みの添加により開始した。
室温で15分後に、405nm（対照波長490nm）で測定した。
室温で15分後に、405nm（対照波長490nm）で測定した。
半最大結合（halfmeximalen Bindung）に必要な抗血清
稀釈律を力価と定義した。この抗体量を次の実験で使用
した。
稀釈律を力価と定義した。この抗体量を次の実験で使用
した。
抗血清の特異性（交叉反応） 抗血清の特異性の検査のために、反応性を溶液中に提供
される成分と相互に比較した。
される成分と相互に比較した。
マイクロ滴定プレート（Ａ）を被覆緩衝液中のポリハプ
テン１μg/mlの溶液100/凹みと共に、室温で１時間イン
キユベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
テン１μg/mlの溶液100/凹みと共に、室温で１時間イン
キユベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
抗血清（二重滴定濃度で）及び抗原〔稀釈系列エストラ
ジオール誘導体５μg/試料緩衝液mlまで（第４段の試料
緩衝液で）〕をクロテインC1％を予め装入したマイクロ
滴定プレート（Ｂ）中で混合し（50μｌ＋50μｌ）、室
温で30分間インキユベートした。この混合物の100μｌ
分をポリハプテンで被覆されたマイクロ滴定プレート
（Ａ）中に移した。室温で１時間振動下にインキユベー
トし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
ジオール誘導体５μg/試料緩衝液mlまで（第４段の試料
緩衝液で）〕をクロテインC1％を予め装入したマイクロ
滴定プレート（Ｂ）中で混合し（50μｌ＋50μｌ）、室
温で30分間インキユベートした。この混合物の100μｌ
分をポリハプテンで被覆されたマイクロ滴定プレート
（Ａ）中に移した。室温で１時間振動下にインキユベー
トし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。
抗体−酵素−接合体100μl/凹みを加え、室温で１時間
振動させた。引続き洗浄緩衝液で３回洗浄した。
振動させた。引続き洗浄緩衝液で３回洗浄した。
検出反応を基質100μl/凹みの添加により開始させ、室
温で15分後に405nm（対照波長490nm）で測定した。
温で15分後に405nm（対照波長490nm）で測定した。
半最大結合に必要な抗原の濃度を相対的親和性と定義す
る。
る。
抗血清と種々のエストラジオール誘導体との反応性に比
較のために、エストラジオールの相対的親和性を＝100
％とする。反応性（交叉反応に相当）は、相対的親和性
の百分率から得られる： 結果を第Ｉ表に示す。ここで、糖架橋部を有する免疫原
がリンカーそのものに対応する抗体に関する定性的表現
である同族エストラジオール−誘導体に比べて明白に優
れていることが明らかである。交叉反応が低い程、この
結果は良好である。
較のために、エストラジオールの相対的親和性を＝100
％とする。反応性（交叉反応に相当）は、相対的親和性
の百分率から得られる： 結果を第Ｉ表に示す。ここで、糖架橋部を有する免疫原
がリンカーそのものに対応する抗体に関する定性的表現
である同族エストラジオール−誘導体に比べて明白に優
れていることが明らかである。交叉反応が低い程、この
結果は良好である。
試料1:第１免疫感作後60日の血清採取 試料2:第１免疫感作後150日の血清採取
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/535 8310−2Ｊ (72)発明者 ヘルベルト・フオン・デル・エルツ ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・イン・ デル・アウ 21 (72)発明者 クリスチヤン・クライン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ブリユ ーテンシユトラーセ 16 (56)参考文献 特開 昭58−111754（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｊｍｍｕｎｏｌ．ｖｏｌ．113，ｎ ｏ．３，Ｐ．896−903
Claims (9)
- 【請求項１】１〜10個のモノサッカライド単位より成る
糖の還元性末端にハプテンが結合していて、この糖の他
端の、OH基に対してα−位に存在する遊離CH2OH基に蛋
白質が結合していることを特徴とする、ハプテン−蛋白
質−接合体。 - 【請求項２】モノサッカライド単位はピラノース又はフ
ラノースである、請求項１記載のハプテン−蛋白質−接
合体。 - 【請求項３】糖としてラクトース、セロビオース、マル
トース、又はマルトペンタオースを使用する、請求項１
又は２記載のハプテン−蛋白質−接合体。 - 【請求項４】ハプテンは、C6−原子の所に１個のOH基を
有し、これを介して糖がその還元性末端で結合している
ステロイドホルモンである、請求項１から３までのいず
れか１項記載のハプテン−蛋白質−接合体。 - 【請求項５】ハプテンは、エストラジオール又はジゴキ
シンである、請求項４記載のハプテン−蛋白質−接合
体。 - 【請求項６】蛋白質は酵素である、請求項１から５まで
のいずれか１項記載のハプテン−蛋白質−接合体。 - 【請求項７】酵素はβ−ガラクトシダーゼ又はペルオキ
シダーゼである、請求項６記載のハプテン−蛋白質−接
合体。 - 【請求項８】OH基に対してα−位の遊離CH3OH基に免疫
原蛋白質が結合している、請求項１から５までのいずれ
か１項記載のハプテン−蛋白質−接合体。 - 【請求項９】請求項６又は７記載のハプテン−蛋白質−
接合体を標識酵素として使用する免疫検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3802060.2 | 1988-01-25 | ||
| DE3802060A DE3802060A1 (de) | 1988-01-25 | 1988-01-25 | Hapten-protein-konjugate und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01233369A JPH01233369A (ja) | 1989-09-19 |
| JPH0720985B2 true JPH0720985B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=6345924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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