JPH07504756A - プレコンジュゲートの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プレコンジュゲートの製造方法 １旦 我々は、プレコンジュゲート（ｐｒｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の新規製造方法と新 規使用方法とを見いだした。特に、我々の発明は、多形被検体からプレコンジュ ゲートを製造する方法に関する。プレコンジュゲートは、免疫反応性コンジュゲ ートをつくるために使用され得る。

生理学的流体のテストサンプル中の各種被検体を検出し定量するためのたゆまざ る広範な必要が存在している。被検体は、天然に存在する物質、たとえば、抗体 、抗原またはホルモンあるいはその代謝物または誘導体であってよい。被検体は 、また、人工的な物質、たとえば、薬剤（治療薬および乱用薬剤の両者を含む） 、毒素またはその代謝物あるいは誘導体であり得る。生理学的な流体は、たとえ ば、血液、血清、血漿、尿、羊膜流体、胸膜流体または脳を髄流体であってよい 。

免疫定量法は、各種被検体の検出と定量についてかなりの有用性を示している。

免疫測定は、免疫沈降反応を含む。免疫沈降反応は、それぞれが他方に対して特 異的結合能を有している２つの反応パートナ−が適当な流体媒質中で結合すると きに起こり得る。反応パ−トチ−は、抗原とその抗原に対する特異的結合パート ナ−たとえば抗体とであり得る。通常、反応パートナ−の一方は、生理的半流体 のテストサンプル中に未知量で存在し、検出されるべきおよび／または定量され るべき被検体である。典型的には、流体媒質は、緩衝された水溶液である。いっ たん開始させると、免疫沈降反応は、液体媒質中で通常は不溶性であるが、可溶 性でもあり得る、抗体抗原複合体または免疫沈殿の形成をもたらす。

液体媒質中の免疫沈殿の存在は、入射光エネルギーの減衰により光学的な性質を 変え得る、たとえば、液体媒質の光りの散乱および光りの吸収特性を変え得る。

これらの変化は、測光免疫検定での適当な光度計により検出され得る。測光免疫 検定技術は、ネフエロメトリック法（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ　ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅ）と比濁分析法（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ） との両方を含む。

ネフエロメトリック免疫検定では、光度計が用いられて、光検出器に向かう免疫 沈殿による光りの散乱または反射が測定される。免疫沈殿は、被検体と被検体に 対する特異的結合パートナ−との凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）または被検体− コンジュゲートと特異的結合パートナ−との凝集体であり得る。免疫沈殿により 散乱される光の量は、存在する免疫沈殿の数に正比例し、免疫沈殿の数は免疫沈 降反応が進行するに従い典型的に増加する。この比例関係は被検体の濃度の定量 的測定を可能とする。

比濁分析免疫検定では、免疫沈殿を含む液体媒質を通る光エネルギーの減衰また は減少が、光路に置かれた光検出器により測定される。光エネルギーの減少は、 免疫沈殿による入射光の反射、散乱および吸収により起こされ得る。免疫沈殿に より起こされる光の減少の量も、存在する免疫沈殿の数に正比例するので、被検 体の定量的測定を可能とする。

多数の薬剤を含め、多くの被検体は、ハブテンである。ハブテンは、人体を含め 動物の体に投与されるとそれ自体抗体の有意的な生成を通常もたらすことのでき ない低分子量（典型的には、約７，０００ダルトン未満）の物質である。このこ とが起こり得るのは、ハブテンが、人体の免疫システムにより認識されるには小 さ過ぎるからである。

ハブテン被検体についての従来の免疫検定法は、ハブテン含有テストサンプルを 抗体と混合した時、ハブテンが抗体と結合しないか、検出可能な免疫沈殿を形成 しないため、実用的ではない。幸いにも、ハブテンがより大きなキャリヤー分子 と結合すると、ハブテンは、抗原特性を獲得し得ることが知られている。言い方 を変えるなら、キャリヤー分子へのハブテンの結合（被検体−キャリヤー分子の 組み合わせをつくる）は、結合したハブテンが動物の免疫システムにより認識さ れることを可能とする。すなわち、免疫沈降反応が、ハブテン（キャリヤー分子 に結合している）とハブテンに対する抗体との間に起こり得る。

被検体−キャリヤー分子の組み合わせは、コンジュゲートまたは被検体コンジュ ゲートと呼ぶことができる。用語、コンジュゲートおよび被検体コンジュゲート は、ここでは、同じもの、すなわち、キャリヤー分子に結合したハブテン被検体 を意味するものとして用いている。被検体に対する（あるいは被検体類似体に対 する）特異的結合パートナ−との免疫化学的反応に加わることができるコンジュ ゲートは、免疫反応性コンジュゲートと呼ばれ得る。

免疫沈降反応に加わる免疫反応性コンジュゲートの能力は、生理学的流体の種々 なハブテン被検体に対する抑制免疫検定（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙｓ）（ＩＩＡ）の開発を可能とした。免疫検定全般について、抑制免 疫検定は、２つの特異的結合パートナ−たとえば抗体とその抗原が、特異的親和 性結合反応に加わり検出可能な凝集体を形成し得る原理に基づいている。

通常、抑制免疫検定は、次の（１）、（２）、（３）を−緒にすることにより行 われる：　（１）ハブテン被検体とキャリヤー分子とを含んでなる免疫反応性コ ンジュゲート；　（２）ハブテン検体に対する特異的結合パートナ−；および（ ３）生理学的流体のテストサンプルのアリコート。特異的結合パートナ−１典型 的には、検体抗体は、テストサンプル中の遊離の被検体（あるとして）と免疫反 応性コンジュゲートの被検体の部分とを区別しな（、免疫反応性コンジュゲート と特異的結合パートナ−とを結合させて検出可能な凝集体を形成し得る。

免疫反応性コンジュゲート−特異的結合パートナ−凝集体は、液体媒質の光学的 特性に影響を与えるほどの大きさを達成すると検出可能となる。か（て、大きな 凝集体は、液体媒質を通る入射光の透過率を減衰し得る。凝集体形成での液体媒 質による光減衰の量は、テストサンプル中に存在する被検体の量に反比例する。

このようにして、抑制免疫検定は、テストサンプル中の各種の〕＼ブテン被検体 を検出して定量するために使用され得る。

抑制免疫検定で用いられる免疫反応性コンジュゲートは、／％ブテン被検体をキ ャリ、ヤー分子に直接結合させることにより通常つくられるのではない。典型的 には、キャリヤー分子と被検体との間の空間的分離（ｓｐｅｔｉａｌ　５ｅｐａ ｒａｔｉｏｎ）が、より大きなキャリヤー分子が被検体抗体による被検体の認識 を過度に妨げるのを防止するために必要とされる。したがって、被検体の誘導体 が調製される。この被検体誘導体は、プレコンジュゲートと呼ばれ得る。プレコ ンジュゲートは、キャリヤー分子に結合してコンジュゲートをつくり得る。

プレコンジュゲートは、関心のもたれる被検体についた結合部分を含んでなり得 る。この結合部分は、リガンドとスペーサー鎖とを含んでなり得る。典型的には 、プレコンジュゲートは、スペーサー鎖の両端でリガンドと被検体を結合させる ことによりつくられる。

スペーサー鎖は、被検体抗体へのキャリヤー分子による立体障害を１１ｔｊ；Ｉ ｎ。さらに、スペーサー鎖は、プレコンジュゲートの被検体部分により比較的妨 げられることなくプレコンジュゲートのりガンド部分との特異的親和結合反応を キャリヤーが受けることを可能とする。ビオチン：アビジンが、しばしば用いら れるリガンド：キャリヤー分子結合パートナ−である。

免疫反応性コンジュゲートが、さまざまな被検体に対してっ（られている。免疫 コンジュゲートをつくる方法は、測定ごとに一定の免疫反応性を有するコンジュ ゲートを生じ得なくてはならない。さらに、この方法は、臨床的環境および院内 的環境（ｈｏｓｐｉｔａＩ　ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ）でもとめられるような、多 数のかつ反復的な免疫検定手法に対して十分な所望の免疫反応性コンジュゲート を生じ得なければならない。特に、治療的な薬剤モニタープログラムは、多量の 一貫して免疫反応性であるコンジュゲートを必要とし得る。

残念なことには、多数の被検体は、多形的な（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）性質を 有する、すなわち、免疫原種（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ）と非 免疫原種との両者を含んでなる。多形被検体の１種またはそれ以上の免疫原種だ けが、有用な免疫反応性コンジュゲートをつくるのに使用され得る。したがって 、多形被検体から適当な免疫反応性コンジュゲートをっ（るのは困難となり得る 。与えられた多形被検体特有の免疫原種／非免疫原種が生じ得るのは、そのよう な被検体が、被検体１分子当たり多数の異性体型（ｉｓｏｍｅｒｉｃ　ｆｏｒｍ ）および／または多数の反応性官能基を有するからである。

よって、結合部分を多形被検体と反応させてプレコンジュゲートをつくろうとす ると、複数のプレコンジュゲートが生じ得る。これらのプレコンジュゲートが、 キャリヤー分子と結合すると、複数のコンジュゲートが生じ得る。これらのコン ジュゲートのいくつかは、免疫反応性であり得る。同じプレコンジュゲート混合 物へのキャリヤー分子の添加により生じる他のコンジュゲートは、はとんどまた はまった（免疫反応性を有さないかもしれずあるいは可変的な免疫反応性を示す かもしれない。

多形被検体は、各種ビタミンたとえばビタミンＢ１□、ステロイド、抗腫瘍性の 化合物および抗生物質化合物たとえばアミノグリコシド抗生物質を含み、ゲンタ マイシン、トブラマイシンおよびアミカシンがあげられる。ゲンタマイシンは、 Ａ形とＢ形がある。ゲンタマイシンＡは、複数の密接な関係のある成分すなわち 異性成分を含み、少な（とも、ゲンタマイシンＡＩ、ゲンタマイシンＡ２．ゲン タマイシンＡ、およびゲンタマイシンＡ４がある。ゲンタマイシンＣは、少なく とも３種の密接な関係のある成分すなわち異性成分であるゲンタマイシンＣＩ、 ゲンタマイシンＣ２およびゲンタマイシンＣ３を含む。すべてのゲンタマイシン 異性体が免疫学的活性であるわけではないことが可能である。もしそうなら、ゲ ンタマイシンの１つまたはそれ以上の免疫学的に活性な異性体（免疫原種）だけ が使用されてテストサンプルゲンタマイシンに対する競合的抑制免疫測定で有用 な免疫学的に活性なゲンタマイシンコンジュゲートをつくることができる。

さらに、アミノグリコシド抗生作用（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）　ドプラマイノン は、トブラマイシン１分子あたりに５つまたはそれ以上の反応性アミン基および ４つの反応性ヒドロキシル基を有し得る。同様に、アミノグリコシド抗生作用ア ミカシンは、アミカシン１分子あたりに４つまたはそれ以上の反応性のアミン基 と８つまたは反応性のヒドロキシル基を有し得る。ゲンタマイシンのように、ト ブラマイシンおよびアミカシンの多形特性は、複数のコンジュゲートの形成をも たらし得、そのいくつかは、免疫反応性であろうし、池は、免疫反応性でないで あろう。

多形被検体に対する競合的抑制免疫検定に用いるため多形被検体から適当な免疫 反応性コンジュゲートを有意的な収量で合成するさまざまな方法が試みられた。

これらの方法は、通常、有効でなく、労力を要する。

有用な免疫反応性種を多形被検体の非免疫反応性種から分離する試みがなされて いる。免疫原種は、次に、免疫反応性コンジュゲートをつくるために使用され得 る。そのような努力は、多くは、好首尾とはならず、あるいは達成が困難であり 、その理由は、関与する多形被検体の免疫原種および非免疫原種の構造および／ または化学的近似性に帰せられる。

多形被検体の反応性官能基の１つまたはそれ以上を選択的に封鎖（ｂ　ｌ　ｏ　 ｃ　ｋ）する試みもなされていて、これは、多形被検体の残りの未封鎖の反応性 官能基ｐ＜、所望の免疫反応性コンジュゲートの高い収率を可能とするであろう という理論に基づいている。そのような選択的な封鎖手法は、実用的でなく、時 間を要するものであり、費用のかかるものであることがわかっていて、しかも所 望の免疫原種のプレコンジュゲートの低い収量をもたらし得る。

したがって、多形被検体の免疫反応性種を含んでなるプレコンジュゲートの高い 収量をもたらす、多形被検体からプレコンジュゲートをつくる方法に対しての要 求が存在する。

１里 本発明は、これらの要求に合致するものである。我々の発明に従う方法は、多形 被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの高い収量をもたらす。

多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートは、免疫反応性のコンジ ュゲートをつくるために使用できる。免疫反応性のコンジュゲートは、テストサ ンプル多形検体に対する競合的抑制免疫測定でデベロッパー（ｄｅｖｅ　１ｏｐ ｅｒ）抗原として使用され得る。

■ 本発明の理解を便するように各種の用語の以下の定義を与える。

「被検体」は、生理学的流体中の検出されるべきおよび／または定量されるべき 一物質または一群の物質を意味する。用語「被検体」は、検体類似体をも包含す る。

「被検体類似体」は、被検体自体とほとんど同様にして被検体に対する反応パー トナ−に特異的に結合し得る物質である。

「ビデンテイト」または「ビデンディトコンジュゲート」は、スペーサ一部分に より付いた２つの化学的部分、すなわちビデンテイトメンバーを膏するヘテロニ 官能性コンジュゲートを意味し、それぞれのメンバーが、異なる巨大分子に特異 的に結合し得るものである。ビデンテイトコンジュゲートについてのさらなる定 義と詳細は、１９９０年６月８日提出の出願番号０７１５３６．０５８号の「新 規ビデンテイトコンジュゲートとその使用方法（Ｎｏｖｅｌ　Ｂｉｄｅｎｔａｔ ｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｏｆ　Ｕｓｅ　Ｔｈｅｒｅｏｆ ）Ｊなる表題の同時係属米国特許出願に見ることができる。

「結合部分」は、スペーサー化合物に結合したりガントを意味する。

「キャリヤー分子」は、結合部分のリガンド部分に対する特異的結合親和性を有 する化合物を意味する。

「コンジュゲート」または「被検体コンジュゲート」は、キャリヤー分子に結合 したプレコンジュゲートを意味する。コンジュゲートは、多形被検体が免疫沈降 反応に加わるようにさせ得る。

「ハプテン」は、被検体の有意的な生成をそれ自体通常起こし得ない部分的なま たは不完全な抗原を意味し、典型的には、低分子量薬剤である。

「免疫原種」は次の（１）および／または（２）を意味する；　（１）免疫反応 性コンジュゲートをつくるのに有用なプレコンジュゲートをつくるのに用いるこ とのできる多形被検体の異性体；　（２）免疫反応性コンジュゲートをつくるの に有用なプレコンジュゲートをつくるのに用いることのできる複数の官能基を有 する１つまたは複数の多形被検体分子。

「リガンド」は、キャリヤー分子に対して特異的結合親和性を有する分子を意味 する。

「非免疫原種」は、次の（１）および／または（２）を意味する（１）プレコン ジュゲート（このプレコンジュゲートは、コンジュゲートをつ（るために使用さ れたとき、多形被検体の免疫反応性種を含んでなるプレコンジュゲートからつく られたコンジュゲートよりも免疫反応性でないコンジュゲートをもたらす）をつ くるために使用できる多形被検体の１異性体または複数の異性体；　（２）プレ コンジュゲート（このプレコンジュゲートは、コンジュゲートをつくるために使 用されたとき、多形被検体の免疫反応性種を含んでなるプレコンジュゲートから つくられたコンジュゲートよりも免疫反応性でないコンジュゲートをもたらす） をつくるために使用できる複数の官能基を有する１つの多形被検体分子または複 数の多形被検体分子。

「多形被検体」は、多形被検体が免疫原種と非免疫原種との両者を含むように被 検体の１分子当たり、１つまたはそれ以上の異性体および／または１つまたはそ れ以上の反応性官能基を有する被検体を意味する。

「プレコンジュゲート」は、結合部分に結合した多形被検体を意味する。

「スペーサー化合物」は、リガンドと多形被検体との両者に同時に付き得るまた は付いている物質を意味する。

多形被検体からプレコンジュゲートを製造する本発明に従う方法は、２工程を有 し得る。第１の工程は、付着反応（ａｔｔａｃｈｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）で 結合部分と多形被検体とを反応させる。多形被検体は、免疫原種と非免疫原種と を含んでなる。第２の工程は、多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジ ュゲートから多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートを分離する 。

付着反応は、多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの量に比 較して多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの化学量論的過剰 量をもたらしうる。

好ましくは、付着反応は、結合部分と多形被検体を可溶化できる液体を含んでな る反応媒体中で起こる。

本発明の範囲には、（１）開示した方法のプロセスによる生成物および（２）付 着反応により製造されるプレコンジュゲートからつくられる免疫反応性コンジュ ゲートもはいる。そのような免疫反応性コンジュゲートは、多形被検体の免疫原 種を含んでなるプレコンジュゲートをキャリヤー分子と接触させることによりつ くられ得る開示された方法は、多（の各種の多形被検体からの免疫反応性コンジ ュゲートの製造に有用なプレコンジュゲートをつくるのに用いられ得る。

註悪 ある反応条件下で、結合部分と多形被検体とが、結合され得て、有用なプレコン ジュゲートの高収量の合成を一貫してもたらすことヲ我々は見いだした。プレコ ンジュゲートがキャリヤー分子と結合して免疫反応性のコンジュゲートをつ（り 得る。免疫反応性コンジュゲートは、多形被検体に対する競合的抑制免疫検定で デベロッパー抗原として用いることができる。

本発明に従う方法は、付着反応で、結合部分と多形被検体を反応させることによ り開始する。好ましくは、付着反応は、結合部分と多形検体の両者をここに述べ たこれらの反応体のすべての濃度で可溶化し得る反応媒賀中で行われる。

方法の第２工程は、多形被検体の非免疫原種を含むプレコンジュゲートから多形 被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートを分離する。分離工程は、多 形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの接触から、多形被検体 の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの実賀的すべてを除去する。した がって、分離工程は、免疫原種を含んでなり、免疫反応性コンジュゲートをつく るのに有用な本質的に純粋なプレコンジュゲートを生じ得る。多形被検体の免疫 原種を含んでなるプレコンジュゲートは、免疫反応性コンジュゲートをつ（るよ うにキャリヤー分子と接触され得る。

プレコンジュゲートを製造するために使用される多形被検体は、少なくとも一種 の免疫原種と少なくとも一種の非免疫原種とを含んでいる。よって、多形被検体 は、被検体１分子あたりに複数の異性体型および／または複数の反応性官能基を 有する。

多形被検体は、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ビタミンＢ１□ 、ネオマイノン、シソマインン、カナマイシン、ネオマイノン、バンコマイシン 、エリスロマイシン（エリスロマイシンＡＳＢ、Ｃ，Ｅ％Ｆ、Ｎ−デメチルエリ スロマイシン（Ｎ−ｄｅｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）Ａおよび対応 するプロピオネートエステルを含む）、ブレオマイシン、カブレオマイシン、ダ クチオマイシン、リンコマイシン、オレアンドマイシンおよびこれらの誘導体、 代謝物および類似体からなる群から選択され得る。

付着反応は、多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの量に関 して多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの化学量論的過剰量 をもたらし得る。

好ましくは、付着反応から生じる多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコン ジュゲートに対する多形被検体の免疫原種を含んでなる化学量論的過剰量の比は 、少な（とも約２＝１である。我々は、我々の方法により、約３＝１．４：ｌま たは５：１という比を得ることが可能なことを見いだした。本発明の特に好まし い実施態様では、付着反応で得られる多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレ コンジュゲートに対する多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲート の化学量論的過剰量の比は、約９：ｌであり得る。

これらの比は、たとえば、付着反応の生成物の薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ ）のスポットの相対的大きさの視覚的検査により測定された。

付着反応は、好ましくは、少なくとも約ｌｏ℃の温度で行われる。約１０℃より も低い温度では、付着反応は、完結までにより長い時間を要する。より好ましく は、付着反応は、約１５℃−約３０”Ｃの間の温度で行われる。約３０°Ｃより も高いと、反応体は分解を始める。

さらに、付着反応は、好ましくは、少なくとも約８時間、より好ましくは、約Ｉ Ｏ時間−約６０時間行われ、反応が本質的に完結するのを確実にする。

好ましくは、付着反応の開始時に存在する結合部分に対する多形被検体のモル比 は、少なくとも約０．５川である。より好ましくは、この比は、約０．５＋１− 約３０：１の間、最も好ましくは、約０．５：１−約５川の間である。特に好ま しい実施態様では、この比は、約ｌ　ｌ−約３：ｌの間であり得る。約０．５： １よりも小さい比では、結合部分との効果的な反応に不十分な被検体が存在する 。比が約３０：ｌより上だと、追加の多形被検体が、所望のプレコンジュゲート の生成に有意的な効果をもたらさない。これらの比が、等モル比に近づくと、所 望のコンジュゲートの収率が増す。さらに、示したモル比が用いられると、所望 のコンジュゲートが、高価な試薬を浪費せずに得られる。さらに、特に定めた特 定のモル比が、より再現性のあり予測可能な免疫反応特性を有する免疫反応性コ ンジュゲートをもたらすことが見いだされた。

本方法は、結合部分を、結合部分と付着し得て結合部分を活性化し得るカンプリ ング試薬と混合することにより付着反応に先立って活性化反応で結合部分を活性 化する工程をも含み得る。この工程が行われるとき、活性化反応の初めに存在す るカップリング試薬に対する結合部分のモル比は、好ましくは少なくとも約１： ０．９、より好ましくは、約１・１−約１＝５の間である。これらのモル比は、 付着反応工程に対して十分な活性化された結合部分を与えることが見いだされた 。比が、約ｌ：５よりも大きいと、結合部分に有意的に寄与しないカップリング 試薬の過剰量が、使用される。最も好ましくは、少なくとも約２０％の結合被検 体よりも多いカップリング薬剤の過剰量が、有効量のカップリング試薬により本 質的にすべての結合部分を活性化させるのを便するように使用され得る。

結合部分と結合部分に結合した多形被検体の免疫原種とを含んでなるプレコンジ ュゲートをつくるより詳細な方法は、好ましくは、結合部分を、結合部分に付着 でき結合部分を活性化し得るカップリング試薬と混合することにより結合部分を まず活性化する工程を有する。次の工程は、活性化された結合部分と、免疫原種 および非免疫原種を含む多形被検体とを、約１５℃−約３０℃の間の温度で、約 １０時間−約６０時間の付着反応で反応させる。多形被検体の活性化された結合 部分に対するモル比は、約０．５：１−約３０：１の間で、付着反応で用いられ る多形被検体と結合部分を活性化させるために用いられるカップリング試薬との モル比は、約１＝１−約１：５の間であり得る。最終工程は、多形被検体の免疫 原種を含んでなるプレコンジュゲートを１、非免疫原種を含んでなるプレコンジ ュゲートから分離する。

アミノグリコシドプレコンジュゲートをつ（る方法は、好ましくは、結合部分を 、結合部分に付着し得て、結合部部を活性化し得るカップリング試薬と混合する ことにより活性化反応で結合部分をまず活性化する工程を有する。第２の工程は 、約１５℃−約３０℃の間の温度で、約１０時間−約６０時間の付着反応で、活 性化された結合部分と多形アミノグリコシドとを反応させる。多形アミノグリコ ンドは、少なくとも１つの免疫原種と少なくとも１つの非免疫原種とを含んでな る。付着反応は、多形アミノグリコシドの免疫原種を含んでなるプレコンジュゲ ートの化学量論的過剰量をもたらし得る。多形アミノグリコシドと活性化された 結合部分とのモル比は、約０．５：１＝−約３０−１の間であり得る。活性化反 応の初めに存在するカップリング試薬に対する結合部分のモル比は、約１：ｌ− 約ｌ：５の間であり得る。本方法の最終工程は、多形アミノグリコノドの免疫原 種を含んでなるプレコンンユゲートを、多形アミノグリコンドの非免疫原種を含 んでなるプレコンジュゲートから分離する。分離工程は、多形アミノグリコンド の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの実質的すべてを、多形アミノグ リコシドの免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの接触から除（。よって 、分離工程は、免疫原種を含んでなり、免疫反応性のコンジュゲートをつ（るの に有用な本質的に純粋なアミノグリコノドプレコンジュゲートを生じ得る。多形 被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートは、免疫反応性コンジュゲー トをつ（るようにキャリヤー分子と接触され得る。

適当な結合部分は、リガンドを結合反応−ｏｉｎｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）で スペーサー化合物と結合させることによりつくることができる。リガンドは、キ ャリヤー分子との特異的結合反応を受けることができる小さな分子（約７，００ ０ダルトン未満の分子量）であり得る。リガンドは、被検体とは異なる化合物な ので被検体とリガンドが、異なる特異的結合パートナ−を持つ。よって、リガン ドは、ビオチン、ホルモンたとえばインスリン、ステロイドホルモン、甲状腺ホ ルモン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ビタミン例えばＢ１２、または葉 酸、ハブテンたとえばｌ−置換−２゜４−ジニトロベンゼン（ジニトロフェノー ルすなわちＤＮＰとしても知られる）、ジゴキシンまたはフルオレセインであっ てもよい。

キャリヤー分子は、リガンドと特異的親和結合反応をし得る典型的には大きな分 子（約７．０００ダルトンより大きな分子量）である。キャリヤー分子は、天然 または合成の巨大分子であり得、たとえば、抗体、アビジン、内因子、レクチン または相補的オリゴヌクレオチドであり得る。好ましいりガント−キャリヤー分 子の組み合わせは、ビオチン−アビジンであり、なぜなら、これらの化合物が容 易に得られ、かつ開示した方法で用いるに適するからである。

スペーサー化合物は、多形被検体とりガントとの間に挿入され、被検体をリガン ドから空間的に分Ｊする働きをする。これにより、スペーサー化合物は、被検体 とリガンドの両者がそれぞれの特異的結合パートナ−に同時に結合することを可 能とするように機能する。

よって、スペーサー化合物は、被検体をリガンドに接続させ、それぞれの結合パ ートナ−に同時に結合するようにプレコンジュゲートのりガントメンバーと被検 体の能力を調整するａ２つの特異的結合の同時的結合を可能とするような最低、 最大および好ましいスペーサー化合物の長さについての詳細は、１９９０年６月 ８日提出の出願番号第０７１５３６．０５８号の「新規ビデンテイトコンジュゲ ートおよびその使用方法（Ｎｏｖｅｌ　Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ　Ｃ。

ｎｊｕｇａｔｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｕｓｅ　Ｔｈｅｒｅｏｆ）Ｊな る表題の同時係属米国特許出願に見ることができる。

プレコンジュゲートのリガンド部分と多形被検体が異なる特異的結合パートナ− を有するため、プレコンジュゲートが、ヘテロニ官能性プレコンジュゲートとし て好ましいであろう。

好ましくは、結合部分は、付着反応で多形被検体と反応させられる前に、カップ リング試薬により活性化される。活性化された結合部分は、多形被検体とより容 易に反応し得る。カップリング試薬は、好ましくは、脱水剤たとえばカルボニル ジイミダゾール（ＣＤＩ）、■＝エチルー３−０３−ジメチルアミノプロピル（ カルボジイミド）（ＥＤＡＣ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＣＰ　ＣＣ ）または各種の本分野で公知のホスフェート化合物である。

又応媒質は、活性化された結合部分、多形被検体およびカップリング試薬を可溶 化し得る液体であり得る。特に、結合部分を可溶化する反応媒質の能力は、適当 な反応媒質の重要な性質である。適当な反応媒質は、ジメチルホルムアミド、水 、ジメチルスルホキッドおよびそれらの各種の混合物を含み得る。

選択された多形被検体が、アミノグリコシド抗生作用アミカシンであるなら、好 ましくは、反応媒質は、カーボネート化合物を含む。反応媒質へのカーボネート 化合物の添加は、反応生成物の仕上げおよび所望の免疫反応性種アミカシンプレ コンジュゲートを他の反応生成物たとえば非免疫反応性種アミカシンプレコンジ ュゲートから分離することをかなり便することが見いだされた。より好ましくは 、カーボネートは、ビカーボネートであり、なぜなら、ビカーボネートは、カー ボネートよりもより効果的であることがわかったからである。最も好ましくは、 カーボネートは、アルカリ金属ビカーボネートたとえばナトリウムビカーボネー トであり、なぜなら、このような化合物は、高価でなく容易に入手できるからで あり、また免疫反応性種アミカシンプレコンジュゲート反応生成物の単離を促進 することが見いだされているからである。

さらに、選択された多形被検体が、アミノグリコシド抗生作用のアミカシンであ ると、アミカシンの非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの量に関連する アミカシンの免疫原種を含んでなるプレコンンユゲートの化学量論的過剰量が通 常得られないことを我々は見いだした。

プレコンジュゲートから得られる免疫反応性コンジュゲートは、関与する多形被 検体に対する競合的抑制免疫検定でのデベロッパー抗原として用いられ得る。免 疫検定は、測光免疫検定たとえばネフエロメトリックまたは比濁による競合的抑 制免疫検定法であってよい。開示されたプレコンジュゲートから得られるコンジ ュゲートの一貫した免疫反応性は、以下の例により示される標準的な競合的免疫 検定手順により測定された。

以下の例は、本発明のさまざまな特徴と実施態様を説明するものであり、クレー ムした発明の範囲を限定することを意図するものではない。これらの例では、す べての得たプレコンジュゲートはビデンテイトコンジュゲートであった。

（ペンジルオキシ力ルポニル−６−アミンへキサン酸の調製）ペンジルオキシ力 ルポニルービス−６−アミノヘキサン酸をっ（るために用いたベンジルオキシカ ルボニル−６−アミノへキサン酸は、次のようにして得た。フラスコに、撹拌棒 、アミノカプロン酸（９８％の純度、成員（ＦＷ）１３１．１８、融点（ＭＰ） ２１０、凝固点（ＦＰ）３６℃）（Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、） ７７．２ｇ　（０，５９Ｍ）を水１６０ｍ１に含むものおよび６Ｎの水酸化ナト リウム９０ｍＬを加えた。この溶液を、水浴で約５℃に冷却し、この温度に保ち その間に次に示す工程の間攪拌した。このフラスコに、ベンジルクロロホルメー ト（９５％、ＦＷＩ７０．６０、Ｆ　Ｐ　９１　’Ｃ１密度（ｄ）１．１９５お よびｎｌ、５１９０）（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）８４ｍＬ （１００ｇ、　０．　５８６ｍＭ）と２Ｎの水酸化ナトリウム２９５ｍＬを９０ 分間かけて加えた。水酸化ナトリウム混合物中のペンシルクロロホルメートを、 ペンシルクロロホルメート８．５ｍＬのｌＯの等しい部分としてフラスコに加え 、さらに２９ｍＬの水酸化ナトリウムを加えた。

ベンジルクロロホルメートの８．５ｍＬの１ｏ回目の部分と水酸化ナトリウムの ２９ｍＬを加えた後、溶液を１時間攪拌し、次に、室温にしてから、さらに１時 間攪拌した。これによりｐＨ９の白色の溶液が形成された。次にこの溶液を２０ ０ｇの氷を含むＩＬのビーカーに注いだ。溶液のｐＨは、１塩酸（ＨＣＬ）５０ ｍＬでｐＨ２に調節した。次に、十分な水を加え得られる固体の白色沈殿の塊が 攪拌可能なようにし、次に、ｐＨをＨＣＬ″ｃｐＨ２に戻した。白色の沈殿をろ 過し、酸性にした水で洗浄した。液体のる液を次に酸性としてさらに白色の沈殿 を沈殿させた。

次に、この白色の沈殿を１５００ｍｌの水に懸濁させてから、粉砕して塊を砕き 、室温で１５時間攪拌した。この白色の沈殿をろ過し、１．ＯＬの水で洗浄して から、５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコの底を用いてブフナー漏斗に圧縮し た。次にこの白色の沈殿を２００ｍｌＳｌｏｏｍＬさらに１００ｍＬのヘキサン で順次洗浄して水とベンジルクロロホルメートを除去してから、乾燥した。白色 固体（ｍｐ５７．５−５９℃）のベンジルオキシカルボニル−６−アミンへキサ ン酸１３４．５ｇ　（０，５１Ｍ、８６％収率）が得られた。

立ｌ （ベンジルオキシカルボニル−ビス−６−アミノへキサン酸の調製ベンジルオキ シカルボニル−トリス−６−アミノヘキサン酸をつくるために使用したベンジル オキシカルボニル−ビス−６−アミノヘキサン酸は、次のようにして調製した。

例１に示した手順に従って得たベンジルオキシカルボニル−６−アミンへキサン 酸（ＦＷ２６５．９５）５１．５グラム（５１，５ｇ）（０，１９６Ｍ）を、ト ルエン（ＡＣＳ等級）６４０ｍＬとトリエチルアミン（ＦＷＩＯｌ、ｔ（１、Ｂ Ｐ８８．８°Ｃ，ＦＰ２０℃、ｄｏ、７２６）２０ｍＬ（０，１４３Ｍ）に溶解 させた。次にこの溶液を水浴で０℃に冷却した。この冷溶液を撹拌させている間 に、エチルクロロホルメート（Ｆ〜Ｖ１０８．５２、ＢＰ９３°Ｃ，ＦＰ３６℃ 、ｄｉ、１３５）（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）２１ｍＬ　（ ２３，８ｇ、０．２１９Ｍ）を、ｉＩ下した。次にこの溶液を更に３０分間攪拌 してから、ろ過して、白色の固体の沈殿であるトリメチルアミン塩酸塩を除去し た。

ろ過した溶液を氷水浴で冷却し、この溶液に、冷２Ｎ水酸化ナトリウムｌｏｏｍ Ｌ中に溶解させたアミノカプロン酸２５．４ｇ（０，１９４Ｍ）を攪拌しながら ４５分間で加えた。次にこの溶液を０℃で１時間攪拌し、さらに、室温で２時間 撹拌し、この間に白色の沈殿が生じた。次にこの溶液を室温で夜通し放置してか ら、白色の固体の沈殿からトルエンをデカントした。

次にこの白色の固体の沈殿をエチルエーテルｌｏＯｍＬで３回洗浄した。次にこ の白色の固体をろ過し、ｐＨ２の酸性の水に入れ、ろ過し、ヘキサンで洗浄して から、乾燥して白色の固体であるベンジルオキシカルボニル−ビス−６−アミノ ヘキサン酸３１　ｇ　（０゜０８１８ｍＭ、４１％の収率、融点１０２℃−１０ ３℃）を得た。

９／ｌのクロロホルム／メタノールに含むようにした白色の固体のシリカゲル薄 層クロマトグラフィーは、シングルスポットＲｆＯ。

４５を与えた。

匠ユ （ベンジルオキシカルボニル−トリス−６−アミノへキサン酸の調製） トリスアミノヘキサン酸をつくるために用いたベンジルオキシカルボニル−トリ ス−６−アミノヘキサン酸は次のようにして調製した。例２の手順に従って得た ベンジルオキシカルボニル−ビス−６−アミノへキサン酸（ＦＷ３７８．４７） ２４ｇ　（６３，４ｍＭ）、撹拌棒、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（ＦＷ ７２．１１゜沸点（ＢＰ）６７℃および密度（ｄ）０．９８５）（Ａｌｄｒｉｃ ｈ　Ｃｈｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）２００ｍＬ、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）６０ｍＬおよびトリエチルアミン（ＦＷＩＯｌ、１９、ＢＰ８９℃、ｄｏ、７ ２６）（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ　ｌ　Ｃｏ、）９ｍＬ　（６，５３４ ｇ、６４．６９ｍＭ）を５００ｍＬの丸底フラスコに入れた。

乾燥管を取り付け、この混合物を攪拌して固体を溶解させ、次に、塩／氷浴に入 れて一５℃に冷却した。次にフラスコにエチルクロロホルメート（ＦＷ１０８． ５２、ＢＰ９３℃、ｄｉ、１３５）（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）６ｍ Ｌ　（６，８１０ｇ、６２．７５ｍＭ）を加えて攪拌し、この混合物を一５℃で １５分間温装した。次に混合物はろ過し、ろ液に、２Ｎの冷水酸化ナトリウム６ ９ｍＬに溶解したアミノカプロン酸（ＦＷ１３１．１８、ＭＰ２１０６Ｃ）（Ａ ｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）１６．６ｇ（１２６，５４ｍＭ）を １５分間かけて加えた。次にこの混合物を一５°Ｃで１５分間攪拌し、さらに室 温で１５分間攪拌した。次に、溶剤をロータリーエバポレーション（ｒｏｔａｒ ｙ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により完全に除去した。

残りの固体を水を使用してビーカーに移し、１塩酸ＨＣＬを用いてｐＨ２まで酸 性として白色の固体を得た。この固体をろ過してがら水で洗浄した。固体が濡れ ている間に、メタノールから再結晶してから４℃で夜通し冷却した。次にこの固 体をろ過し、乾燥して白色の固体のベンジルオキシカルボニル−トリス−６−ア ミノヘキサン酸１７．５４ｇ　（５８％の収率）を得た。シリカゲル薄層クロマ トグラフィーを用いて単一の最終生成物の存在を確認した。

五工 （トリスアミノヘキサン酸の調製） ビオチンヘキサン酸をつ（るために用いたトリスアミノヘキサン酸は次のように して調製した。例３の手順に従い得たベンジルオキ７カルポニルートリスー６− アミノへキサン酸（ＦＷ４９１．６）３グラム（６，１ｍＭ）を、撹拌棒を有し た５００ｍＬの丸底フラスコに入れた１５０ｍＬのメタノールに溶解させた。フ ラスコを窒素をフラッシュした。次にこのフラスコに、活性炭に担持させた５％ パラジウム触媒（ＫｏｄａｋまたはＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 ）をスパチュラ２杯すなわち約１／２グラムを加えた。次にフラスコを窒素ガス で大気圧と室気圧（ｒｏｏｍ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）でフラッシュした。３．５時 間攪拌した後、。８／２クロロホルム／メタノール中で、シリカゲル薄層クロマ トグラフィーを準備し、ＵＶ、ヨウ素およびニンヒドリンスプレーにより視覚化 した。ＴＬＣは、出発物質であるベンジルオキシカルボニル−トリス−６−アミ ノヘキサン酸（Ｒｆｏ、６）の消失とアミン生成物の出現を示した。

全部で５時間攪拌した後、フラスコ中の溶液を窒素によりフラッシュし、固体が 溶けるのに十分な温度まで加熱し、次に、珪酸上を用いてホワットマン（Ｗｈａ ｔｍａｎ）１＃フイルター（ＷｈａｔｍａｎＣｏ、）でろ過してパラジウム触媒 を除去した。次に溶液は、ロータリーエバポレージ窪ンにより３０ｍＬまで濃縮 し、次にエチルエーテル３０ｍＬと一緒にして溶液が濁るようにし、１４℃の冷 室に夜通し置いた。４％水酸化アンモニウムと一緒にした１／１クロロホルム／ メタノール中でのシリカゲル薄層クロマトグラフィーおよびヨウ素とニンヒドリ ンスプレーとによる視覚化を行った。ＴＬＣは、シングルスポットＲｆ０．３を 与えた。次に溶液を、ろ過して白色の固体であるトリスアミノヘキサン酸（ＦＷ ３８９゜６）２．１　ｇ　（５，３９ｍＭ）（８９％の収率）を得た。

Ｌｉ （ビオチントリス−アミノ−ヘキサン酸の調製）ゲンタマイシンのようなアミノ グリコシド被検体に共有結合し得るビオチンヘキサン酸誘導体を次のようにして 合成し、精製した。

丸底フラスコに、ビオチン（ＦＷ２４４）　１２５２ｍｇ　（５，１３ｍ　Ｍ　 ）とＤ　Ｍ　Ｆ　６０　ｍ　Ｌとを電磁撹拌棒と共に入れた。乾燥管を取り付け てから、フラスコを、油浴で１５分間７Ｏ−７５６Ｃの温度で加熱した。次に、 １．１′　−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（ＦＷ１６２）９２３ｍｇ　 （５，７０ｍＭ）をフラスコに加えてから、攪拌してから、３０分間７０−７５ ℃の温度で１置した。

次に、反応混合物を室温まで冷却してから、フラスコに、Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミド（ＮＨ５）（ＦＷＩ　１５）６５６ｍｇ　（５，７０ｍＭ）を加えた。

次に混合物を１８時間室温で攪拌して活性化したビオチン溶液を得た。次に、例 ４の手順にしたがって得たトリス−アミノヘキサン酸（ＦＷ３８９．６）２ｇ　 （５，１３ｍ〜■）を０．２Ｍの重炭酸ナトリウム６０ｍ１に溶解し、活性化し たビオチン溶液に加えた。トリス−アミノヘキサン酸のほかに、多くの長いまた は短い鎖の有機酸が、最終的な被検体−コンジュゲート中のキャリヤー分子から 被検体の所望の立体距１１１１（ｓｔｅｒｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｉｎｇ）に応じ て、調製され用いることができる。

次に、反応を夜通し進行させてから、６ＭのＨＣＬの添加により反応混合物をｐ Ｈ２に調節し、固体の反応生成物をろ過して流体を除去した。得られた固体を０ ．６ＮのＨＣＬｌｏｏｍＬと共に粉砕してから、ろ過し、メタノールから再結晶 し、乾燥させて白色の固体のビオチントリス−ヘキサン酸（ＦＷ６１５）２．８ ｇ　（８９％の収率）を得た。ビオチントリス−ヘキサン酸は、以下に詳細に示 す方法に従いプレコンジュゲートをつくるのに有用な結合部分である。この特定 の結合部分は、１８炭素原子スペーサー鎖を有する。

８／２クロロホルム／メタノール中でのシリカゲル薄層クロマトグラフィーおよ びヨウ素とニンヒドリンスプレーによる視覚化は、合成のさまざまな工程で用い られ、出発アミンの消失とビオチン酸誘導体の出現とを示した。

匠旦 （ビオチニル化ゲンタマイシンプレコンジュゲートの調製）Ａ、アビジンとの特 異的親和性結合反応をし得るゲンタマイシンービオチンプレコンジュゲ−１・は 次のようにして調製した。この例および他の例で用いられている略語ｒｍＭＪは 、ミリモルすなわち１モルの１０００分の１を意味する。２５ｍＬの丸底フラス コに、熱をかけてＤＭＦ　（無水物９９％＋、ゴールドラベル、ＦＷ７３゜１０ 、ＢＰ１５３℃、ｄｏ、９４５）（Ａｌｄｒｉｃｈ）１５ｍＬに溶解させた例５ の手順にしたがって得たビオチントリスアミノヘキサン酸結合部分１９９ｍｇ　 （０，１７２ｍＭ）を入れた。次に、反応フラスコを７０−７５°Ｃの油浴に１ ５分間入れた。次に、結合部分を活性化するカップリング試薬として１．１′カ ルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（ＭＷ１６２．２）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、）３０ｍｇ　（０，１８５ｍＭ）をフラスコニ加えた。反応溶 液の温度を３０分間７０−７５℃に保ってから、室温に冷却した。

次に、反応フラスコに、Ｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨ５）（９７％、ＦＷｌ 　１５．０９）（Ａｌｄｒｉｃｈ）２０ｍｇ　（０，１７２ｍＭ）を加えてから 、室温で夜通し攪拌した。合成の次の工程は、試験管中の水３ｍＬ中に７１　ｍ ｇ　（０，０Ｏ８５５ｍＭ）のゲンタマイシン硫酸塩、効力（ｐｏｔｅｎｃｙ） ：ゲンタマイシン硫酸塩１ｍｇ当たり５９１ｇｇのゲンタマイシン、９．４％水 ）（Ｓｉｇｍａ）を溶解させることであった。重炭酸ナトリウム（ＦＷ８４．０ １）（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）１００ミリグラムを、試験管中のゲンタマイ シン硫酸塩／水溶液にゆっくりと加えた。泡立ちが終わった後、試験管中のゲン タマイシン溶液に重炭酸ナトリウムをさらに１００ｍｇを加えた。

次に、反応フラスコ内の活性化されたビオチンにゲンタマイシン溶液を加えて活 性化された結合部分とゲンタマイシンとの間の付着反応を開始させた。次に１ｍ Ｌづつ合計８ｍＬの水を反応フラスコに加えて反応溶液が透明になるようにした 。反応溶液を次に室温で１５時間攪拌した。もう１つの実験では、反応溶液を室 温で６０時間撹拌して同等の結果を得た。反応溶液は次に蒸発乾固して、残留す る白色の残留物をメタノールと共に粉砕してからろ過した。

ろ液は蒸発乾固し、残った固体の残留物を５ｍＬのメタノールに溶解させてから 、メタノールスラリーとして詰めたセルロースの１ｃｍｘ３０ｃｍのカラムクロ マトグラフィーカラムに配置した。カラムは、７５ｍＬのメタノールで溶離し、 さらに１００ｍＬのメタノール１５％水酸化アンモニウムさらに１００ｍＬのメ タノール７１０％水酸化アンモニウムにより溶離した。カラムの進行は、メタノ ールに含むようにしたカラム溶離フラクション（ｃｏｌｕｍｎｅｌｕｔｉｏｎ　 ｆｒａｃｔｉｏｎ）のＴＬＣにより追跡した。選択したフラクションを一緒にし 、蒸発乾固してアビジンへの接合への準備のゲンタマイシン−ビオチンプレコン ジュゲート１４．５ｍｇを得た。

プレコンジュゲートを形成する付着反応の初期のゲンタマイシン（多形被検体） ：ビオチントリスアミノヘキサン酸（結合部分）二ＣＤＩ（カップリング試薬） ：ＮＨ５のモル比（Ｇ：Ｂ：ＣＤＩ：ＮＨ５比）は、ｌ：２：２．２：２であっ た。　。

Ｂ、アビジンとの特異的親和性結合反応をし得る第２のゲンタマイシン−ビオチ ンブレコンジュゲートを次のようにして調製した。

用いたゲンタマイシン：ビオチン（またはビオチントリスアミノヘキサン酸）： ＣＤＩの相対的モル比は、２９：ｌ：１．２であった。ビオチントリスアミノヘ キサン酸１０ミリグラム（０，０１７ｍＭ）を７０℃の油浴で１０分間温めて反 応媒質としてのＤＭＦ　１０ｍＬに溶解させた。これに続き、カップリング試薬 としてＣＤＩ（ＭＷＩ　６：２）３．５ｍｇ（０，０２１６ｍＭ）を添加し、３ ０分間浦浴中で撹拌し、さらに室温で１時間攪拌した。つぎにＮＨ５（２５ｍｇ 、０．０２１７ｍＭ、ＭＷＩ　１５）加えて、反応混合物を夜通し撹拌した。次 の工程として、反応混合物へ乾燥ＤＭＦ２０ｍＬに含むようにしたゲンタマイシ ン（ＭＷ４６２）　２３４ｍｇ　（０，５０ｍＭ）をゆっくりと加えてから夜通 し攪拌した。次に溶剤を蒸発させた。

残った固体の残留物を最少量のメタノールに溶解させてから、シリカゲル７ｇを 詰めた１ｃｍｘ３０ｃｍのシリガゲルカラムに充填した。溶離剤として、メタノ ールさらに１０％水酸化アンモニウム／メタノールを用いて、第２のプレコンジ ュゲート０．１３４ｇを得た。

Ｃ，アビジンとの特異的親和性結合反応をし得る第３のゲンタマイシン−ビオチ ンプレコンジュゲートを次のようにして調製した。

用いたゲンタマイシン：ビオチン（またはビオチントリスアミノヘキサン酸）： ＣＤＩの相対的モル比は、１．３・１：１．２であった。乾燥管を有した丸底フ ラスコに、乾燥Ｄ　Ｍ　Ｆ　１５０　ｍ　ｌに溶解させたビオチントリスアミノ ヘキサン酸２ｇ　（３，４４ｍＭ）を加えた。次にフラスコを７０−７５°Ｃの 油浴に１５分間入れた。カップリング試薬としてＣＤ　Ｉ　６６７ｍｇ　（４， １２ｍＭ）を加えてから、７５℃で３０分間攪拌した。

室温に冷却後、ＮＨ３４７０ｍｇ　（４，１０ｍＭ）をフラスコに加え、反応を ２０時間進行させた。２．１３４ｇ　（４，１６ｍＭ）のゲンタマイシンを乾燥 ＤＭＦ１００ｍＬ中に溶解させた。次に、活性化させたビオチンを分岐漏斗を通 じてゲンタマイシン／ＤＭＦ溶液に３０分かけて加えた。これに引き続き、室温 で２４時間攪拌した。

減圧下で溶剤を蒸発させた後、残留物を少量のメタノールに溶解させ、メタノー ルスラリーとして充填したシリカゲル７０ｇを含む２．５ｃｍｘ６０ｃｍのカラ ムの上部に装填した。過剰の未反応ビオチンを、メタノール１４００ｍＬを用い て溶離した。次に、カラムを、メタノールに含むようにした５％水酸化アンモニ ウムにより溶離した。カラムフラクションは、ＴＬＣ（５％ＮＨ，ＯＨ／ＣＨ、 ＯＨ）を用いてモニターした。シンナムアルデヒドスプレーに陽性反応を示すフ ラクションを一緒にし１．５ｇの第３のゲンタマイシン−ビオチンブレコンジュ ゲートを得た。

上記したように調製したすべてのゲンタマイシンービオチンブレコジュゲートに ついて、活性化したビオチンエステルとゲンタマイシンとの間の反応が、免疫反 応性ゲンタマイシンコンジュゲートをつ（るために用いられ得なかったゲンタマ イシンプレコンジュゲート（すなわち、ゲンタマイシンの非免疫反応性種に結合 したビオチン結合部分）の量と比較して、免疫反応性ゲンタマイシンコンジュゲ ートをつくるために使用され得たゲンタマイシプレコンジュゲート（すなわち、 ゲンタマイシンの免疫反応性種に結合したビオチン結合部分）の量の過剰をもた らすことが明白であった。

したがって、たとえば、ＴＣＬ反応生成物スポットの相対的な大きさの視覚によ る検査は、免疫反応性ゲンタマイシン橿ブレコンジュゲートのスポットが非免疫 反応性ゲンタマイシン種のＴＬＣスポットよりも大きいことを示した。ＴＬＣス ポットの相対的大きさの調査（少なくとも主生成物（大きなＴＬＣスポット）の アビジンとの接合と続く免疫反応性の研究を後続させる）は、所望のプレコンジ ュゲートの収量が所望されないプレコンジュゲートの収量と比較して過剰である ことを示した。特に、特定した反応パラメーターについて、免疫反応性ゲンタマ イシン種；ンンユゲートＴＬＣスポット、非免疫反応性ゲンタマイシン種ブレコ ンジュゲートＴＬＣスポットの相対的面積は約２＝１から約５：ｌに変化した。

ゲンタマイシン：ビオチン比５：ｌ、ＩＯ＋１，１５：１．２０・１，２５：１ およびさまざまな中間濃度比が上記の方法に用いられ得る。そのような代わりの 被検体：結合部分比により得られる反応生成物は免疫反応性フンシュゲートをつ くるために用いられ得るプレコンジュゲートをもたらすであろうことが当然予期 できる。

さらに、ゲンタマイシン（多形被検体）：ＣＤＩ　（カップリング試薬）比は、 約０．５：１−約３０：１の間の比に変化し得、上記の結果に比較される結果を 有すると当然仮定される。

例ニー （ケンタマインンービオチンーアビジンコンジュゲートの調製）Ｉ　ゲンタマイ シンに対する競合的抑制免疫検定での抑制剤として有用なゲンタマイシンービオ チンーアビンコンジュゲートは次のようにして調製した。５０ｍＬの管に、ＨＡ ＢＡｌ　００μＬと共にｐＨ７，４のＯ，ＩＭのりん酸塩緩衝液２０ｍＬに溶解 させたアビジン２０３．１ｍｇを入れた。次に、メタノールに含むようにした上 記の例６Ａの手順にしたがってつくったプレコンジュゲート２１ｍｇを、２００ μＬアリコートとしてアジピン溶液に加えて（色がピンク−オレンジから明るい 黄色に変化した）、１時間放置した。

次にこの混合物をｐＨ６，０のくえん酸塩緩衝塩水（ＣＢＳ）１ｍＬを用いて透 析バッグ（６，４ｍｍ、１２，０００−１４，０００ＭＷカットオフ）に移した 。透析は、４°Ｃで、ＣＢＳ中、ｐＨ６゜０で、２０００ｍＬの容量で、３日間 にわたり５回の交換で行い、免疫反応性ゲンタマイシン−（Ｃ，、、Ｎ５）−ビ オチンーアビジンコンジュゲーｈ　２９　ｍ　Ｌを回収した。

Ｉ■、第２のゲンタマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲートが、上記の例 ６Ｂの手順にしたがってつくられたプレコンジュゲート０．１３４をメタノール ５ｍｌに溶解させることにより調製された。次に、２０ミリグラムのアビジン（ ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｎ　ＧｍｂＨ）を２０μＬの２（４ヒドロキ シフエニルアゾ）安息香酸指示薬と共にｐＨ７，４の０．１Ｍのりん酸塩緩衝剤 １ｍＬ中に溶解させた。次に、プレコンジュゲート溶液を５０μＬづつアジピン 溶液に加え、４５０μＬを加えるようにした。色は、ピンク−オレンジから明る い黄色に変化した。次に、この混合物を１時間室温に放置し、てから、０．０５ Ｍのりん酸塩緩衝剤（ｐＨ７，４）に対して透析した。透析を継続させるにあた り緩衝剤を４回、２日間にわたり変えた。

Ｉ　Ｉ　１．第３のゲンタミンービオチンーアビジンコンジュゲートが、上記の 例６Ｃの手順にしたがってつくられたプレコンジュゲート１．４ｇをメタノール ＩＣ１ｍ１に溶解して調製された。次に、アビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）１ ００ミリグラムを、ｐＨ７，４のＯ，ＩＭのりん酸塩緩衝剤５ｍＬに溶解させ、 さらに、２−（４ヒドロキシフエニルアゾ）安息香酸指示薬１００μＬを添加し た。

次に、ｌＯＯμＬのプレコンジュゲート溶液、さらに５０μＬのプレコンジュゲ ート溶液をアジピン溶液に加えた。次に、５ｍＬのりん酸塩緩衝剤を加えてから 、１時間室温に放置した。この混合物を１時間室温に放置してから、ｐＨ７，４ の０．０５Ｍのりん酸緩衝剤５００　ｍ　Ｌに対して透析をした。透析の継続に あたり、２日間にわたり緩衝剤を４回交換した。

皿旦 （ゲンタマイシンに対するモノクロナール抗体の調製）２つの形のまたは種のゲ ンタマイシンに対するモノクロナール抗体をつくることのできるハイブリドーマ を調製した。使用した材料は次のようであった。使用したミエローマ細胞は、Ｐ ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミニｏ−マ（Ｋｅａｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　エーユ ｍｍｕｎｏ１．．　１２３：１５４８　（１９７９）により開発された非分泌（ ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ）マウスミエローマライン）から由来した（ｄｅｒ ｉｖｅｄ）。使用した膵臓細胞は、下記の手順により免疫とされたＢａ１ｂ／ｃ マウスから取った。増殖培地は、ｌＯ％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と２ｍ Ｍの１−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により補足したＤ ＭＥ低グルコース（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。使用培地 は、細胞を除去するように遠心分離しろ過した６５３゜ｌ細胞の３日培養からの 培地であった。ＣＨＡＴ培地は、ｌｏｏ単位／ｍ＋のベニンジンーストレプトマ イシン溶液（ｉｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４ＸＩＯ−’Ｍのアミノプ テリン（Ｓｉｇｍａ）　、１　ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍのヒボキサンチン（ＭＡ　Ｂｉ ｏｐｒｏｄｕｃ　ｔ　ｓ）　、１．６ＸＩ　Ｏ−’Ｍのチミジン（ＭＡ　Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および１０単位／ｍｌのインスリン（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｙ）と した５０％ならし培地および５０％増殖培地であった。ならし培地は、５０％増 殖培地−５０％使用培地および２．５ｘｌＯ−’Ｍのｂ−メルカプトエタノール （Ｓ　ｉ　ｇｍａ）であった。約１３００−１６００の間の分子量を有するポリ エチレングリコール（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を用いた。注入培地は、１００単位／ｍ ｌのペニシリン−ストレプトマイシン溶液としたＤＭＥ低グルコースであった。

ハイブリドーマ注入に先立ち、半ミリリッターのブリスタン（Ｐ　ｒ　ｉ　ｓ　 ｔ　ａｎｅ）（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、Ａｉｄｒｉｃ ｈより入手可能）をそれぞれのＢａ１ｂ／ｃマウスに腹腔的注入した。

ハイブリドーマは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　２２ ５６：４９５（１９７５））により開発された方法を用いてつくられた。免疫し たマウスからの膵臓を、頚部の脱臼の後、無菌除去し、組織篩（ｔｉｓｓｕｅ　 ５ｉｅｖｅ）中で粉砕して単細胞懸濁物が得られるようにした。洗浄後、細胞を 、洗浄した６５３．１ミエローマ細胞と膵臓対ミエローマ細胞を２．１の比とし て混合してから、ペレットとした。上澄みを除去し、ＰＥＧを１分間かけてゆっ くりと加えた。ＰＢＳを加えて全量を２２　ｍ　ｌにしてから、次にＰＥＧ添加 の開始後、細胞を８分間ペレットとした。ペレットを２００　ｍ　ｌのＣＨＡＴ 培地に再懸濁させて、０．２ｍｌの懸濁物を１０個の９６−ウェル（ｗｅ　ｌ　 １）のマイクロタイター板のそれぞれのウェルに加えた。ウェルには、融合後６ および７日で新しいＣＨＡＴを供給した。

放射線免疫検定（ＲＩ　Ａ）を用いる増殖に対するウェルのテストは、１００回 目開始し、続く３−４日間の間継続させた。陰性対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏ ｎｔｒｏｌｌ）よりも大きなカウントを有するウェルは、続く日に再テストした 。読みが、テストの第２日に陰性対照よりも大きいままの場合、コロニーは陽性 とみなし、クローン化した。クローン化は、ならし培地の希釈を２つの９６−ウ ェル板に限定して行い、１つの板は５細胞／ウエル、１つの板はｌ細胞／ウェル とした。クローン化の後、１週間して、単一のコロニーウェルをＲＩＡによりテ ストした。すべてのウェルが陽性とテストされると、そのラインは、純粋とみな され、安定化のため２回目のクローン化がされた。すべてのウェルが、１００％ 陽性となるとテストされるのでないと、陽性のウェルが第２回のクローンに用い られた。板は、クローン化の後７日に再びテストされた。この手順は、すべての クローンが１００％陽性とテストされるまで繰り返された。次に、細胞を増殖培 地で膨張させ、マウス１匹当た０約３ｘ１０６ハイブリドーマ細胞の濃度として ブリスタンプライムド（Ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウス の腹膜腔中に注入培地で注入した。

注入に先立ち、培養細胞からの上澄みをオフタロ二−ゲル拡散法（Ａｃｔａ　Ｐ ａｔｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　５ｃａｎｄ　２６：５０７　（１９４９））によ るイソタイピングに対して用いた。マウスにハイブリドーマ細胞を注入した後、 約１０日で、マウスから腹水流体を収集した。次に、腹水流体をＲＩＡにより力 価測定しくｔｉｔｅｒｅｄ）、ＩｇＧイソタイプ含量を、ベックマン■Ｃ５速度 比濁計（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＩＣ５ｒａｔｅ　ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ）を使用 して測定した。

Ｇｅｎｔ　３Ｂｌモノクロナ一ル抗体の発生（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に対する 免疫化プロトコールは次のようにした。雌のＢａ１ｂ　／　ｃ　７ウスに、フロ イントコンプリート（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ）に含むようにし たゲンタマイシンＢＳＡ抗原２０μｇを腹腔内注入した。１月後、ゲンタマイシ ンＢ５Ａ２０μｇを静脈内注入した。その２週間後、ゲンタマイシンＢ５Ａ２０ μｇを、静脈注入と腹腔内注入の組み合わせで与えた。その３日後、免疫したマ ウスの膵臓を取り出し、融合（ｆｕｓｉｏｎ）を行った。このようにして調製し たハイブリドーマは、ゲンタマイシンに対して特異的親和性を有するモノクロナ ール抗体を生成しうるものであった。

ＧＶ　ＡＳ５モノクロナール抗体の発生に対する免疫化プロトコールは、次のよ うにした。雌のＢａ１ｂ／ｃマウスに、フロイントコンプリート中に含むように したゲンタマイシンＢＳＡ抗原ｌμｇを静脈内注入した。３日目に、マウスに、 ゲンタマイシンＢ５Ａｌ３９μｇを静脈内注入した。４日目に、マウスに、ゲン タマイシンＢ５Ａ１３０ｇｇを静脈内注入した。５日目に、ゲンタマイシン１３ ９μｇを静脈内注入した。６日目に、ゲンタマイシン１３９μｇを再び静脈内注 入した。７日目に、免疫したマウスの膵臓を取り出し、融合を行った。そのよう に調製したハイブリドーマは、ゲンタマイシンに対して特異的親和性を有するモ ノクロナール抗体を生成しうるものであった。

ゲンタマイシンに対する２つの異なるモノクロナール抗体を調製した；その理由 は、ゲンタマイシンは、いくつかの似ているが同一でない化学種または異性体で 存在するからである。よって、ゲンタマイシンの２つの種に対するモノクロナー ル抗体を用いるゲンタマイシンに対する検定は、存在する全ゲンタマイシンの量 のより正確な定量を可能とする。

倒」− （ゲンタマイシン免疫血清を有するゲンタマイシンービオチンーアビンコンジュ ゲートの免疫反応性） ゲンタマイシン免疫血清との例７の手順に従い得たゲンタマイシン−ビオチン− アビジンコンジュゲートの免疫反応性は次のようにして測定した。ゲンタマイシ ン−ビオチン−アビジンコンジュゲート溶液は、０．１％ＢＳＡによりＩＣ３” 希釈剤（Ｂｅｃｋｍａｎ）中に希釈し、それぞれアビジン０．５．０．４．０． ３．０．２およびＯ，１ｍｇ／ｍＬの５種類の希釈度を得るようにした。例８の 手順に従い得た抗ゲンタマイシンモノクロナール抗体を含む腹水流体をろ過し希 釈した。次に、ゲンタマイシン免疫血清をＩＣ８希釈剤中に希釈しそれぞれ１１ ５、ｌ／１０．１／１５、ｌ／１７゜５およびｌ／２０の５種の免疫血清希釈度 を得た。

免疫反応性検定は、ＩＣ５”手動懸濁針（Ｂｅｃｋｍａｎ）で行った。得られた 結果は、下記の表１に示してあり、ゲンタマイシンモノクロナール抗体を免疫血 清中に存在させて調製したゲンタマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲート の明白で有意的な免疫反応性を示している。ＯＲは、計測器の範囲の読みを越え るか外れるを示している。

抗血清を含むゲンタマイシンモノクロナール抗体により調製したゲンタマイシン ービオチンーアビジンコンジュゲートのクロス力価測定（ｃｒｏｓｓ−ｔｉｔｅ ｒｉｎｇ）での吸収速度ユニ、ソト涯上旦 （既知量のゲンタマイシンによる競合的抑制免疫検定でのゲンタマイシン−ビオ チン−アビジンコンジュゲートの使用）ゲンタマイシンに対する測光免疫検定を 、既知量のゲンタマイシンを用いて、例７の手順にしたがって調製したコンジュ ゲートを使用して行った。既知量のゲンタマイシン（０、ｌ、２．４．８および １２μｇのゲンタマイシン／ｍＬ）による６つのカリプレーター（ｃａｌｉｂｒ ａｔｏｒ）を準備した。５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ■５臨床分析器（Ｂｅｃｋｍａ ｎ）を用いて、競合的抑制免疫検定反応が起こった際の液体媒質の濁度の変化を 測定した。

調製した免疫反応性コンジュゲートの添加での時間のキュベツト媒質の濁度の変 化の割合（ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｈａｎｇｅ）を各カリブレーク−について測定し た。割合の信号は、横軸上のカリブレーク−のゲンタマイシン濃度に対して縦軸 上にプロットした。得られたこのような検量値（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｖａ ｌｕｅ）と、サンプル中のゲンタマイシンの未知量により起こされるキュベツト 液体媒質の変化の初期割合との５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ■　５臨床分析器による 自動的比較は、テストサンプルの単位体積あたりに存在するゲンタマイシンの量 の検出と定量を可能とした。

検出した測光割合信号を横軸上の６つのカリブレーターのゲンタマイシン１度に 対して縦軸上にプロットし、ゲンタマイシン濃度に対する光の減衰のプロットを 確立した。得られた結果は、調製したゲンタマイシンービオチンーアビジンコン ジュゲートが、競合的抑制免疫検定でのゲンタマイシンの検出と定量に有用であ ることを示した。

匠上土 （未知量のゲンタマイシンによる競合的抑制免疫検定でのゲンタマイシン−ビオ チン−アビジンコンジュゲートの使用）例７に示した手順により調製したプレコ ンジュゲートを、５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ■　４臨床分析器（Ｂｅｃｈｍａｎ） で行った別個の競合的抑制免疫検定で用い、５１人の異なる患者からの血清サン プル中の未知ゲンタマイシンの量を測定した。免疫検定では、０３０ｍｇ／ｍ＋ のコンジュゲートを使用した。

検定は、同じ５１人の患者サンプルに繰り返し、同じ患者サンプルで得た結果と 比較した、その際次の（１）、（２）および（３）を使用した＝　（１）異なる ゲンタマイシンコンジュゲートを存在させたゲンタマイシン免疫検定キットを有 する５ｙｎｃｈｒｏｎ■比濁臨床分析器（Ｂｅｃｈｍａｎ）；　（２）Ａｒｒａ ｙＴ″自動化不フロメトッリク分析器および；　（３）Ａｂｂｏ　ｔ　ｔ　ＴＤ Ｘ”ゝ１蛍光偏光免疫検定計測器（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｏｌａｒｉｍｉｚ ａｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　（ＦＰＩＡ）　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ） 。免疫検定に用いたモノクロナール抗体は、１：４に希釈したＧＶＡＳ５モノク ロナール抗体であった。

泗」−１ （免疫反応性トブラマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲートの調製） Ａ、免疫反応性トブラマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲートは、次のよ うにして調製した。ビオチントリスアミノヘキサン酸（１０ｍｇ、０．０１７ｍ ＭＳＭＷ５８２）を乾燥Ｄ　Ｍ　Ｆ　２　ｍ　ｌと共にフラスコ中で、７５℃の 油浴で加温することにより溶解させてから、この温度にさらに１０分間保持した 。次にＣＤＩ　（３，５ｍｇ、０．０２１６ｍＭ、ＭＷＩ　６２）をフラスコに 加え、７５℃の温度でさらに３０分間保ってから、室温で２時間攪拌した。次に 、ＮＨ５（２，５ｍｇ、０．０２１７ｍＭ、ＭＷＩ　１５）をフラスコに加え、 室温で夜通し攪拌した。

次に、トブラマイシン（２４ｍｇ、０．０５１ｍＭ、ＭＷ４６５．５）を乾燥Ｄ ＭＦ５ｍＬに溶解し、活性化したビオチンを、この溶解したトブラマイシンに室 温で攪拌しながら滴下した。室温での攪拌を夜通し続けた。次に、溶剤を蒸発乾 固した。残った固体残留物を最少量のメタノールに溶解し、シリカゲルメタノー ルスラリーを詰めた１ｃｍｘ３０ｃｍのクロマトグラフィーカラムに入れ、メタ ノールさらにメタノール７１０％水酸化アンモニウムにより溶離した。適当なフ ラクションをＴＬＣにより測定されるように集め、１０ｍｇのトブラマイシン− ビオチンプレコンジュゲートを得た。

この実験では、使用したトブラマイシン・ビオチン：ＣＤＩ／Ｎ次に、コンジュ ゲートは、Ｏ，ＩＭのｐＨ７，４のりん酸塩緩衝剤２．５ｍＬ中にアジピン５０ ｍｇを溶解させてっ（った。ＨＡＢＡを、先に上記したようにして用いて、トブ ラマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲートの形成を測定した。コンジュゲ ートは、緩衝剤を６回変えてＣＢＳに対して透析した。

Ｂ、第２のトブラマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲートは、トブラマイ シン、ビオチン：ＣＤＩ／ＮＨ５のモル比３０：１＝１．３を用いることを別と して、この例で上記のようにして調製した。

抗−トブラマイシンヤギポリクロナール抗体を用いて、テストサンプル中の未知 量のトブラマイシンに対する競合的抑制免疫検定で調製された２種のコンジュゲ ートの免疫反応性と有用性を測定した。標準線と検量線を確立した。２種の調製 したトブラマイシンコンジュゲートは、両方とも、トブラマイシンに対する免疫 検定に用いるのに免疫反応性であり適当であると測定された。

Ｃ１第３のトブラマイシン−ビオチン−アビジンコンジュゲートは、次のように して調製した。ビオチントリスアミノヘキサン酸結合部分（４１５ｍｇ、０．７ １ｍＭ）を、乾燥管を有する丸底フラスコ中で乾燥ＤＭＦ４５ｍｌと共に、７０ −７５°Ｃの油浴中て加温することにより溶解させてから、さらに１５分間この 温度に保った。次に、ＣＤＩ　（１４０ｍｇ、０．８６ｍＭ）をフラスコに加え 、７５°Ｃの温度をさらに３０分間攪拌しながら保った。室温に冷却した後、Ｎ Ｈ５（９７ｍｇ、０．８４ｍＭ）をフラスコに加え、溶液の室温での攪拌を２０ 分間継続させた。

次に、トブラマイシン（ｌ　０００ｍｇ、２．１４ｍＭ）を、０゜５Ｍの重炭酸 ナトリウム５０ｍＬに溶解させ、活性化したビオチンを、室温で攪拌を行いつつ ３０分間かけこの溶解させたトブラマイシンに添加漏斗を通じて加えた。次に、 室温での攪拌を２４時間続けた。次に、溶剤を減圧下で蒸発乾固した。残った白 色の残留物（３，４５ｇ）を、熱いメタノールｌ　ＯＯｍＬで２回（各回Ｌｏｏ ｍＬ）抽出し、ろ過し、さらに蒸発を行い白色の固体３．１９ｇを得た。

この３．１９ｇの白色の固体を、５０　ｍ　ｌのメタノールに溶解させてから、 ５ｇのシリカゲルに吸収させた。減圧下で溶剤を除去した後、このシリカゲルを 、メタノールスラリーとして詰めた７０ｇのシリカゲルを含むシリカゲルカラム （２，５ｃｍ　ｘ　６０ｃｍ）の上部に移した。このカラムを７００ｍ１のメタ ノールで溶離して、過剰のビオチントリスアミノヘキサン酸を除いてから、１０ ％水酸化アンモニウムとメタノール６００　ｍ　ｌにより溶離した。カラムフラ クションは、１０％水酸化アンモニウムとメタノールを用いてＴＬＣによりモニ ターし、シンナムアルデヒドスプレーに陽性反応であることにより適当と判断さ れたフラクションを一緒にして第３のプレコンジュゲ−１−３７０ｍｇを得た。

アビジンへの接合は、先に示したように行い、上記した方法により測定し、第３ のコンジュゲートも、トブラマイシンに対する競合的抑制免疫検定に用いるのに 免疫反応性であり適当であった。

第３のプレコンジュゲートを調製するために使用したトブラマイシン・ビオチン ：　ＣＤ　Ｉ／ＩＮＳのモル比は、３：ｌ・ｌ　２であった。

上記のようにして調製したトブラマイシンービオチンブレコンンユゲートのすべ てについて、活性化したビオチンエステルとトブラマイシンとの間の反応は、免 疫反応性トブラマイシンコンジュゲートをつくるために使用できなかったトブラ マイシンプレコンジュゲート（すなわち、トブラマイシンの非免疫反応性種に結 合したビオチン結合部分）の量に比較して免疫反応性トブラマイシンコンジュゲ ートをつくるのに使用できたトブラマイシンプレコンジュゲート（すなわち、ト ブラマイシンの免疫反応性種に結合したビオチン結合部分）の量の過剰をもたら したことが明瞭である。

よって、たとえば、反応生成物のＴＬＣスポットの相対的大きさの視覚による検 査は、免疫反応性トブラマイシン種プレコンジュゲートのスポットが、非免疫反 応性トブラマイシン種プレコンジュゲートのＴＬＣスポットよりも大きいことを 示した。ＴＬＣスポットの相対的大きさの調査（少な（とも主生成物（より大き なＴＬＣスポット）のアビジンとの接合および少なくとも主生成物の引き続（免 疫反応性の調査を後続させた）は、所望のプレコンジュゲートの収量が所望され ないプレコンジュゲートの収量に比較して過剰であったことを示した。持に、特 定の反応パラメーターについて、免疫反応性トブラマイシン種ブレコンジュゲー トＴＬＣスポット、非免疫反応性トブラマイシン種プレコンジュゲートＴＬＣス ポットの相対的面積は約２・ｌから約５：ｌに変化した。

トブラマイシン　ビオチンの比５：１．１０：ｌ、１５：１．２０・１．２５： ｌおよびさまざまな中間のｔａ度比が上記の方法で使用され得る。そのつような 代わりの被検体：結合部分の比により得られる反応生成物は、免疫反応性コンジ ュゲートをつ（り得るプレコンジュゲートを生じることが当然予期できる。

さらに、トブラマイシン（多形被検体）：ＣＤＩ　（カップリング試薬）比は、 上記の結果に匹敵する結果を持って約０．５：１−約３０・１の間の比に変わり 得ることが当然とされる。

ビオチニル化アミカンンプレコンジュゲートを次のようにして調製した。ＤＭＦ 中のＣＤＩ／ＮＨ５で活性化したビオチントリスアミノヘキサン酸を、０．５Ｍ の重炭酸ナトリウムに溶解させたアミカシンと夜通し反応させてから、カラムク ロマトグラフィーによるプレコンジュゲートの溶離を行った。

そのように調製したプレコンジュゲートをアビジンに接合させたところ抗−アミ カシン抗体に対する同様の免疫反応性を示すことがわかり血清テストサンプル中 のアミカシンに対して競合的抑制免疫検定での抑制剤として有用であると測定さ れた。

免疫反応性コンジュゲートを調製するのに適当ないくつかのアミ力ンンービオチ ンプレコンジュゲートが、ＤＭＦ中のＣＤＩ／ＮＨ５によりビオチン結合部分を 活性化し、０．５ＭのＮａＨＣ○、中に含むようにしたアミカシンの添加により つくられた。アミカシンとビオチンとのカップリングを夜通し行った。使用反応 体のモル比は、アミカシン　ビオチン：ＣＤＩ／ＮＨ３５：　１　：　１．２で あった。カラムクロマトグラフィーを、１０％ＮＨ，ＯＨ／ＭｅＯＨ溶離を用い て行った。

アミカノンを、ビオチントリスアミノヘキサン酸結合部分と反応させて次のよう にしてアミカシンプレコンジュゲートを調製した。

ビオチントリスアミノヘキサン酸結合部分（ＭＷ５８２．１ｇ１１．７２ｍＭ） を７５Ｃで加温して１００ｍ１の乾燥ＤＭＦに溶解させた。次にＣＤ　Ｉ　（３ ３４ｍｇ、２．０８ｍＭ）を加え、この温度で３０分間攪拌してから、２時間室 温で攪拌した。次に、ＮＨ５（２３５ｍｇ、２．０４ｍｇ）を加え、室温で夜通 し攪拌を続けた。

アミカノン（ＭＷ５８５．５ｇ、８．５５ｍＭ）を０．５ＭのＮａ　ＨＣＯ３８ ０ｍ　Ｌに溶解させてから、活性化したビオチンエステルを漏斗を通じてゆっく りと加えた。１５分後、０．５ＭのＮａＨＣＯｓ　４０　ｒｎ　Ｌを水１０ｍＬ と共に加えた。次に室温で夜通し攪拌を続けた。

次に、溶剤を完全に蒸発させて１２．１５ｇの固体を得た。この固体を２００ｍ １の加熱したＭｅＯＨ（各回１００　ｍ　ｌ　）で抽出してからろ過した。ろ液 を蒸発乾固し６．２９ｇの固体を得た。この固体をメタノールに溶解させてから シリカゲル８．５ｇに吸収させ、次にＭ　ｅ　ＯＨに詰めたシリカゲルカラムに 充填した。溶離したフラクションをＴＬＣにかけた。適当なフラクションを一緒 にし蒸発させて、５７０ｍｇの所望のアミカシン−ビオチンコンジュゲートを得 た。使用したアミカシン：ビオチン：ＣＤＩ：ＮＨ５の比は、５＋１：１．２： １．２であった。

上記の実験を、アミカシン：ビオチン：ＣＤＩ：ＮＨ５比３０：１：１：３：１ ．３とし、重炭酸ナトリウムをＤＭＦで変えて繰り返した。カラム溶離剤は、メ タノール中に含むようにした１０％水酸化アンモニウム（ＮＨ，ＯＨ）として用 いた。重炭酸ナトリウムのような炭酸塩を用いないことはアミカシンプレコンジ ュゲート反応生成物を単離するのをより困難とすることがわかつた。

アミカシン：ビオチン比５：１，１０＋１１１５：１．２０：１．２５：ｌおよ びさまざまな中間の濃度比が上記の方法で使用可能である。そのような代わりの 被検体；結合部分比により得られる反応生成物は免疫反応性コンジュゲートをつ くるために使用され得るプレコンジュゲートを生成することが当然予期される。

さらに、アミカシン（被検体）：ＣＤＩ　（カップリング試薬）比は、上記の結 果に匹敵する結果をもって約０．５：１と約３０：ｌの間の比に変えられること が当然のこととされる。

１００ｍｇのアビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｈｅｉｍＧｍｂＨ）をｐ Ｈ７，４のＯ，ＩＭのりん酸塩緩衝剤に溶解させた。ＨＡＢＡをカラー指示薬と して用いた。ｌ　：　Ｉ　Ｍ　ｅ　ＯＨ／　Ｈ２０２５ｍ　ｌに溶解させたアミ カシンプレコンジュゲート５８０ｍｇを全量６００μＬに対し１００μＬのアリ コートで加えた。溶液の色が、ピンク−オレンジから明るい黄色に変化した。次 に、５ｍｌのりん酸塩緩衝剤を加え、溶液をＣＢＳに対して３回の交換で透析し た。

免疫反応性コンジュゲートをつくる開示した方法は、以下に示す利点を含め多く の利点を有する： １　免疫反応性コンジュゲートを調製するのに有用な多形被検体プレコンジュゲ ートの一貫して高い収率が得られる。

２、多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの量に関して多形 被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの化学量論的過剰量が、アミ ノグリコシド抗生作用アミカシンを別として本発明により得ることができる。

３、アミノグリコシド抗生作用アミカシンが、反応媒賀中の炭酸塩を用いること により他の反応生成物から容易に単離され得る。

４、開示された方法は、穏和な条件下で行われ得る。

本発明をある特定の実施態様に関連して詳述したが、他の実施態様、変形および 変更が、開示した発明の範囲内である。たとえば、多形被検体は、ある種のアミ ノグリコシド抗生物質だけに限定されるものではない。さらに、プレコンジュゲ ートは、各種のカップリング試薬と結合部分を用いてつくることができる。

したがって、次の請求項の範囲の精神は、上記した本発明の特定の実施態様の記 載に限定されるべきものではない。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成６年９月６日

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．プレコンジュゲートを製造する方法において、（ａ）付着反応で （ｉ）結合部分と （ｉｉ）免疫原種と非免疫原種とを含んでなる多形被検体とを反応させる工程と ； （ｂ）多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートを、多形被検体の 非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートから分離する工程と を含んでなるプレコンジュゲートを製造する方法。
2. ２．付着反応が、多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの量 に関して多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの化学量論的過 剰量をもたらす請求項１の方法。
3. ３．付着反応が、少なくとも約２：１の多形被検体の免疫原種を含んでなるプレ コンジュゲートと多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの 比をもたらす請求項２の方法。
4. ４．付着反応が、少なくとも約３：１の多形被検体の免疫原種を含んでなるプレ コンジュゲートと多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの 比をもたらす請求項３の方法。
5. ５．付着反応が、少なくとも約４：１の多形被検体の免疫原種を含んでなるプレ コンジュゲートと多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの 比をもたらす請求項４の方法。
6. ６．付着反応が、少なくとも約５：１の多形被検体の免疫原種を含んでなるプレ コンジュゲートと多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの 比をもたらす請求項５の方法。
7. ７．付着反応が、少なくとも約９：１の多形被検体の免疫原種を含んでなるプレ コンジュゲートと多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートとの 比をもたらす請求項６の方法。
8. ８．付着反応が、少なくとも約１０℃の温度で行われる請求項１の方法。
9. ９．付着反応が、約１０℃−約３０℃の間の温度で行われる請求項１の方法。
10. １０．付着反応が、少なくとも約８時間行われる請求項１の方法。
11. １１．付着反応が、約１０時間−約６０時間行われる請求項１の方法。
12. １２．付着反応の初めに存在する結合部分に対する多形被検体のモル比が、少な くとも約０．５：１である請求項１の方法。
13. １３．付着反応の初めに存在する結合部分に対する多形被検体のモル比が、約０ ．５：１−約３０：１の間である請求項１の方法。
14. １４．付着反応の初めに存在する結合部分に対する多形被検体のモル比が、約０ ．５：１−約５：１の間である請求項１の方法。
15. １５．付着反応の初めに存在する結合部分に対する多形被検体のモル比が、約１ ：１−約３：１の間である請求項１の方法。
16. １６．付着反応が、多形被検体と結合部分を可溶化できる液体を含んでなる反応 媒質中で起こる請求項１の方法。
17. １７．反応媒質が、炭酸塩を含んでなる請求項１６の方法。
18. １８．付着反応に先き立ち、結合部分に付着し得て結合部分を活性化し得るカッ プリング試薬と結合部分とを混合することにより活性化反応で結合部分を活性化 する工程をさらに含む請求項１の方法。
19. １９．活性化反応の初めに存在するカップリング試薬に対する結合部分のモル比 が、少なくとも約１：０．９である請求項１８の方法。
20. ２０．活性化反応の初めに存在するカップリング試薬に対する結合部分のモル比 が、約１：１−約１：５の間である請求項１８の方法。
21. ２１．リガンドをスペーサー化合物に結合させて結合部分をつくる工程をさらに 含む請求項１の方法。
22. ２２．多形被検体化合物が、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ビ タミンＢ１２、ネチルマイシン、シソマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、 バンコマイシン、エリスロマイシン、プレオマイシン、カプレオマイシン、ダク チノマイシン、リンコマイシン、オレアンドマイシンおよびこれらの誘導体、代 謝物および類似体からなる群から選択される請求項１の方法。
23. ２３．多形被検体が、抗生作用アミノグリコシド化合物である請求項１の方法。
24. ２４．請求項１の方法による生成物。
25. ２５．結合部分と該結合部分に結合した多形被検体の免疫原種とを含んでなるプ レコンジュゲートを製造する方法において、（ａ）結合部分に付着し得て結合部 分を活性化し得るカップリング試薬と結合部分とを混合することにより結合部分 を活性化反応で活性化する工程； （ｂ）約１５℃−約３０℃の間の温度で約１０−約６０時間の間付着反応で （ｉ）活性化された結合部分と （ｉｉ）免疫原種および非免疫原種を含んでなる多形被検体とを 反応させる工程；および （ｃ）多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートを、多形被検体の 非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートから分離する工程を含み、付着反応 の初めに存在する活性化された結合部分に対する多形被検体のモル比が、約０． ５：１−約３０：１の間であり、活性化反応の初めに存在するカップリング試薬 に対する結合部分のモル比が、約１：１−約１：５の間であり、そして付着反応 が、結合部分と多形被検体を可溶化し得る液体を含んでなる反応媒質中で行われ る工程 を含んでなるプレコンジュゲートを製造する方法。
26. ２６．付着反応が、多形被検体の非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの 量に関して多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートの化学量論的 過剰量をもたらす請求項２５の方法。
27. ２７．多形被検体が、抗生作用アミノグリコシド化合物である請求項２５の方法 。
28. ２８．アミノグリコシドプレコンジュゲートを製造する方法において、 （ａ）結合部分に付着し得て結合部分を活性化し得るカップリング試薬と結合部 分とを混合することにより結合部分を活性化反応で活性化する工程； （ｂ）約１５℃−約３０℃の間の温度で約１０−約６０時間の間付着反応で （ｉ）活性化された結合部分と （ｉｉ）免疫原種および非免疫原種を含んでなる多形アミノグリコシドとを 反応させる工程；および （ｃ）多形アミノグリコシドの免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートを、多 形アミノグリコシドの非免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートから分離する 工程を含み、付着反応の初めに存在する活性化された結合部分に対する多形アミ ノグリコシドのモル比が、約０．５：１−約３０：１の間であり、活性化反応の 初めに存在するカップリング試薬に対する結合部分のモル比が、約１：１−約１ ：５の間であり、そして付着反応が、結合部分と多形アミノグリコシドを可溶化 し得る液体を含んでなる反応媒質中で行われる工程 を含んでなるアミノグリコシドプレコンジュゲートを製造する方法。
29. ２９．付着反応が、多形アミノグリコシドの非免疫原種を含んでなるプレコンジ ュゲートの量に関して多形アミノグリコシドの免疫原種を含んでなるプレコンジ ュゲートの化学量論的過剰量をもたらす請求項２８の方法。
30. ３０．多形体アミノグリコシドが、アミカシンまたはその誘媒体または類似体で あり、そして反応媒質が、炭酸塩を含んでなる請求項２８の方法。
31. ３１．免疫反応性コンジュゲートを製造する方法において、（ａ）付着反応で （ｉ）リガンドを含んでなる結合部分と（ｉｉ）多形披検体の免疫原種と非免疫 原種とを含んでなる多形被検体とを反応させる工程と：（ｂ）多形被検体の免疫 原種を含んでなるプレコンジュゲートを、多形被検体の非免疫原種を含んでなる プレコンジュゲート殻分離する工程、 （ｃ）多形被検体の免疫原種を含んでなるプレコンジュゲートをリガンドに対す る結合親和性を有するキャリヤー分子と接触させ、よって免疫反応性コンジュゲ ートをつくる工程を含んでなる免疫反応性コンジュゲートを製造する方法。