JPH04500361A - アミノ―またはアミドアルキルマレイミド、アミドアルキルマレイミドとペプチドまたはタンパク質との複合体またはヘテロ二官能性複合体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノアルキルマレイミドおよびＯｎから導出され友へブテノ−およびアンチデ ン誘導体ならびにペプチドまたはタンパク質との抱合体本発明は一般式！： 〔式中Ｒ１およびＲ２は同じかまたは異なシがり水素またはＣ１−Ｃ４−アルキ ル基を表わしかつＡは′＃ＬｆＩＡまたは分枝鎖、飽和または不飽和、場合によ り酸素−または硫黄原子またはカルボニル基により中断された、２〜６の炭素原 子を有するアルキレン鎖を表わす〕の新規アミノアルキルマレイミドならびに化 合物Ｎ−６−７ミノへキシルマレイミドを除く、相当するｒＲ１ｔ加塩に関する 。

さらに本宛Ｅ！Ａは一般式ＩＯ化合省および免疫学的結合体から形成された、一 般式 上記の意味での成分の抱合のためにしばしば、りンＲａｐは１５１または数種の カルざキシル基ないしは活性化されたカルボキシル基ｔＶする免疫学的な結合体 からアミド化によ夕形成された基でるる〕のアミドアルキルマレイミド−誘導体 に関する。免疫学的結合体としてたとえばハプテンおよび抗原が重要でらる。

その他に不発明は一般式Ｈの化合物の、ペプチドまたはタンパク質との反応によ シ製造できる、免疫学的抱合体に関する。この抱合体は以下ではハゲテン−ペプ チド−または抗原−ペプチド−抱合体と言い換えられる。

本発明の対象はまた一般式！および■の化合物ならびにペプチド−およびタンパ ク質−抱合体の製法および診断測定法、殊に免疫検定法でのＣの抱合体の使用に 関する。

多くの生化学的技暫で、２つのそれ自身官能性の異なる成分ないしは化合物が根 本的に重要である。そこでたとえばアフィニティークロマトグラフィーの領域で 、固形の、不溶の担体マトリックスに異なるＳ類の配位子が結合される。この配 位子は、Ｉ５ｃ科中に含有さｎかり当該配位子に特異的な物質を認識しかつ結合 する状態にるる。それにより、企図された試料中に含有＃素が重要でるる。

カーとも呼ばれる、多官能性反応試薬を使用する。これは大体において、互いに 抱合すべき成分の愕定の基とできるかぎり瞥異的に反応する、２つの化学的に反 応性の基を含有する。一般にこの際たとえばｒ−７レイミドー酪酸−Ｎ−とドロ キシ−スクシンイミドま九はｍ−マレイミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスフ クンイミドエステルＣＭＢＳ）のようなヘテロ−多官能性反応試薬と九とえばＮ 、Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−１，３−プ ロパンジアミンのようなホモ−多官能性反応試薬が区別される。ヘテロ多官能性 反応試薬は九とえば上記の場合マレイミド−およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイ ミド−基のような、２つの化学的に異なる反応性基を有する。

マレイミド基が非常にｑ＃異的にスルフヒドリル含有化合物と反応する一方、ヒ ドロキシスクシンイミド基は有利にアミノ基を含有する化合物との反応のために 好適でおる。この方法ですぐれ九種類および方法で２つの成分ないし化合物が互 いに抱合され、その際一方はたとえばスルフヒドリル基−基２よび他方はアミノ 基を含有する。同様の方法で２つの化学的に同種の反応性基を含有する、ホモ多 官能性反応試薬を、たとえば上述の場合スルフヒト−リル基のような、同一の官 能性基を有する成分Ｏ抱合Ｏために使用する。

互いに抱合すべき成分の特性に応じて、それによシ一連の、このような多官能性 反応試薬を使用する（に１ａ−Ｋｉ　Ｎａｐその仙、ＩｎＬ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ−１６（２）、１１１２９〜１４５Ａ’（１９８４年）およびＲ，Ｅ。

Ｆｅｏｎｓｃ、＝　、　Ｔ＋１ｔ、、Ｊ、、Ｐｅｐｔｉｄｓ　Ｐｒｑｔｓｉｉｉ 　Ｒｅｓ、２　９　、１９８７伍、電１Δ５〜１６１百参坪）。そこで六とえば ｆしたアガロース−固定相の製造のためのＮ−６−アミノへキシルマレイミドの 使用が記載されている。

たとえば号−ロツバ特許出願公開第０１４２１９３号明細賽のような従来技術か ら、でらに免疫原の製造が公知であ遵、その際ポリＫｆチド、オリゴサツカライ ドまたはオリゴヌクレオチドのような好適な抗原が九とえばホスホリピドのよう な疎水性化合物の反応性基と結合され、Ｃれはグリコシドの基少なくとも１種、 賽にサポニンにより親水性および疎水性部分と錯化される。、特にこのヨーロッ パ特許公開公報の例４には１〜ｘｙドルフィン−誘導体が記載さｎてお夕、その 中でＯのドデカペプチドのアミノ＃！はマレイミド−ブチルアミン基にＪり変性 されている。この公報はしかしこの１の誘導体が製造できりような記載を含んで いない。

多官匪性反工し試薬の他Ｏ適用領域１グ臨床診断用反応試薬０製造である。この 際免役検定法の原則によシ測定方法を実施するＣとが増え、Ｃれは特に高い感性 によｐすぐｎている。その際しばしば九とえば標識酵素および＃Ｊテすべきり質 、いわゆる分析質ないしは抗体全１合でさる物質、いわゆる抗原から成る抱合体 を使用する。この宥合体は特に多官能性反応に案の使用により製造で１机 ど〈端近の期の例は、同様の免疫検定法の領域でさらに電登ｉＣなってきている いわゆるＣＥＤＩＡ−技術でおる（　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｅｒｙ　 ３２／９．１６３７−１６４１（１９８６年）；米国特許第４７０８９２９号明 細書）。

Ｃの診＠測定法では同様［２りの化合物の結合の原則が利用でれている。その際 一般にハプテンまたは抗原でろってよい分析質は＃累的に不活性な、酵素β−ガ ラクトシダーゼの前駆体工程に結合される。この不活性な前駆体工程はペプチド でありかつ上記文献でＦ′ｉ酵素ドナーとも呼ばれる。その間に一連の楕々のペ プチドは、たとえばＢＤ４（Ｄように酵素ドナーとして公知でるる。

この試験の実施は次の原則による：酵素β−ガラクトシダーゼは４つの下部単位 から成シ、これは再び、酵素受容体ＥＡとも呼はれる、より大きなポリペグチド 鎖および酵素ドナーｇＤと呼ばれる、よシ小さなペプチド鎖から構成される。酵 素受容体および酵素ドナーは双方とも酵素的に不Ｉ′！ｉ性でおり、しかし自然 に活注四蓋体に会合さ几る。酵素ドナーおよび酵素受容体から形成されたｍｆＡ の非常にわずかな解離定数にもとづさ、形成され九＃素のｔは直接存在する酵素 ドナーないし一受容体のｆｆ１ｌｃ比例する。免疫検定法の実施の際、天然の陣 系ドナーの代わジに化学的に変性された酵素ドナーを使用することにより、時性 が役立てられる。これは、分析質が酵素ドナーの官能基に共有結合されるＣとに より丁ぐれている。分析質としてたとえば／−ズテンま几は抗原が重要でるる。

免反学的測定方法の際使用される試験系はその他にそのつどの分析質１ｃ特異的 な免疫原を認鷹する抗体を含有する。この−抗体は大体において、遊離のおよび ｄ！１．素ドナーに共’！結合された分析質を差別しない。抗体は試験系中に存 在する、分析質で変性された酵素ドナー−抱合体が完全に結合するのに十分な量 で存在する。それにより酵素ドナー２よび酵素受容体の自発的な解離が妨げられ る。

分析質の１１度の確定のための反応は測定すべき試料の定義され几Ｒを上記の試 験系に添加するというよりに実施する。この反応タイプが競合的試験でおるので 、分析質に向けられている、存在する抗体は試料から来る遊離分析質も、分析質 で標慮付けられ次酵素ドナーの一部も結合する。１１換反応によシ遊離分析員か ら解放された、標識けけさｔｔ４は素ドナーの遊離配分はその後自発的に酵素受 容体を用いて、酵素活性β−がラクトシダーゼー四黛体に解離され、そｔｖｍｔ 、は直接試料から生じる分析質の濃度に比例する。この＠発的解離によシ形成さ れ７を酵素β−ガラクトシダーゼの童ないし容量［ｉ！！有の活性は好適な酵素 基質、九とえばＯ−二トロフェニル−／−Ｄ−ガラクトピラノシドまたはクロル フェノールロート−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解および相当する発色 団の遊離によｐ測定する。

上記の必要な、免疫原（分析質）と＃素ドナーの間の結合の際、酵素ドナーの変 性が分子中、＃素ドナーと酵素受容体間の認ｆＲＶｃとって重要でないような箇 所でのみ行ってよいとい５問題が生じる。その他に＃未活性酵素錯体への解ｌ１ １！を妨げかつ測定すべきハプテンＯ測定値が鎮りた結果を見せかけるというこ とが起こシうる。

ハプテン−酵素ドナー−抱合体として、之とえばマレイミジルーベンズカルバミ ルーゾゴキクデニノヲ使用できることは文献公知でらる（　Ｃｈｉｎ、　Ｃｈｅ ｍ、　３２．１６３７（１９８６年））。ハブテンゾゴキシデニンの、酵素ドナ ーとの結合は３−マレイミド−安息香酸−インシアネートとの反応により行う。

上記で形成さｎ之ゾゴキクデニ７−絆導体との、＃ｌ素ドナーの側での結合は酵 素ドナーのアミノ酸システィンのスルフヒドリル基の、マレイミド基との反応に よシ行う。

上記の場合使用される多官能性反応試薬はしかし、一方ではそこにあるウレタン 結合が加水分解感性で８夕かつ反応試薬がそれによｐ十分Ｋｆ足でなくかつさら に存在するベンズカルバミル基によ）抗体の結合活性の一部がり７カーそれ自体 、即ち免役原中のハプテン２よびｌ＃累ドナー閣の架橋分子に向けられるという 欠点を有する。これは、抗原−抗体−反応の際しばしば免役学的試練での測定の 際不正４でに導？　交差反応性を考えに入れることを意味する。

その他に使用される多官能性反応試薬ができるかぎゃ安定でめりかつ容易に製造 可能でろるメｊｒＺｔ、Ｊべきであるという問題が生じる。さらに、これがハプ テンまたは抗原とできるかぎり樋かな条件下に反応しかつそれによシ抗体の免役 交差および獲得のために使用可能なパブテン−ペプチド−誘導体を徳かでかつ容 易な方法で製造できることが所望である。

マレイミド基を有するヘテロ多官能性反応試薬はしかししばしば、これが非常に 反応性であシかり容易にマレイン酸誘導体に加水分解されるという欠点を有する 。その高い反応性に基づき、Ｃれはしばしば、殊に化学量論酌量で使用される場 合、スルフヒドリル基に対し、わずかに特異性でろる。このわずかなｑ＃＃！注 は＊Ｍな反応混合物に４き、これはマレイミド基がたとえばアミンのような、結 合すべきペプチドまたはタンパク質の他の反応性基と反応する場合に生じる。こ の極の副反応は所望でない反応混合物に導き、これはしばしば分離するのが困難 である。製造される抱合体のできるかぎシ高い純度がしかし、免疫交差によりで きるかざシ高い荷異注およびわずかな交差反応性を有する抗体を得るために必賛 でろる。

従って、上記の欠点を有しない、新規多官能性反応試薬を使用するという課題が 生じた。

弐！の本発明による化合物がヘテロ多官能性反応試薬娯として有利に使用できる ことが見出系九九。殊に、マレイミド−およびアミン基間に存在する基Ａがパブ テン−ペプチド−抱合体を用いて製造できる抗体のわずかな交差反応性の原因で ろることが示された。これは殊にＡ中で２〜５、殊［２，３ま几は４原子の鎖長 を有する、短＠Ｔｆｊｊ４体に当たる。

式ｌ中ＯＲ＋およびＲ２は同じかまたは異っていてよくかつそのつと水素原子ま たは友とえばメチル−、エチル−またはイノプロピル基のようなＣ１−Ｃ，−ア ルキル１１ｉを表わす。ＢｌおよびＲ２はしかし有利に水素原子を表わす。

基Ａは場合によシ酸素−または硫黄原子またはカルボニル基により中断されてい てよい、２〜６、特に２〜４のＣ−原子を有するＭｇ４または分枝、飽和ま几は 不飽和アルキレン基を妖わす。Ｃの意味で友とえば次のものが重要である：　Ａ ＝−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝２〜６　）　；−（ＣＨｇ）ｍ−ＣＨ（ＣＨ３）−（ ＣＨＪ。−；　−（ＣＨａ）ｍ−Ｃ（ＣＨ３）ｚ−（ＣＨＪ。−；−（ＣＨｇ） １．ｌｌ−Ｘ−（ＣＨａン。−（Ｘ＝Ｏ％　Ｓ、　Ｃｏ）；　−ＣＣＨ２）、− ＣＨ−ＣＨ−（ｍ　＝　０　＝　１〜４　＆よひｍ　＋　ｏ　＝　２〜５　）。

Ａｒ１Ｎ利ＩＣ基−（ＣＨ２）ｎ−（ｎ＝　２．３．４ｔｌａｓ）　お、Ｉ−び −ＣＨ４−０−ＣＨ，−、−ＣＨ２−８−ＣＨ２−、−ＣＨ，−Ｃｏ−ＣＨ２− を表わす。

アミンの酸げ加塩はたとえば酢ＩＭまたは塩酸のようなＭ−ま几は照機戚を有す る塩で６６゜一般式ｌの化合物にたとえば、一般式罵Ｈ２Ｎ−Ａ−ＮＥｓ　（厘 ） 〔式ＧＰＡは上記の〜１２）ｔ−表わす〕のシアミンを一般式■ Ｈ，Ｎ−Ａ−ＮＨ−Ｙ　（ｊＶ） 〔式中Ｙはアミノ基にとって好適な容易に分離可能な保護基、たとえばし、−ブ チルオキシカルざニル基ヲ表わす〕の化合物に移行しかつ引続き一般式■の化合 物を一般式 〔式中Ｒ１およびＨ２ｒｔ上記のものを表わしかり２は反応性基を表わす〕の化 合物と自体公知の方法で反応させかつ引続き保Ｍ基Ｙを再び分離することによ＃ ）製造する。

一般式厘のジアミンの、たとえばジーレ、−デチルーシカルポネート、Ｒ７−ブ トキシカルボニルクロリドまたはＮ−（ｔ、−ブトキシ−カルざニルオキシ）フ タルイミドのような好適な保護基反応試薬との反応はたとえばジオキサン、テト ラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドまたはエタノールのような溶剤中、−２ ０℃〜＋１００℃、譜に０℃〜＋２５℃の温度で自体公知の方法によシ行う。

式バの化合切の、式Ｖの化合物との反応は特に塩基性溶液中−２０℃〜＋８０℃ の濃度で実施する。反応性！Ｚとしてたとえばアルコ中ジカルボニル基のヨ５な 、アミンとの反応により容易に分離できるようなもの、たとえばエトキ７カルざ ニル基が重要でるる。

式■の新規化合物はへテロ多官能性反応試薬として殊に抱合体の製造のために使 用する。抱合体としてたとえばハプテン−ペゾチドー、ハプテン−タンパク質− １抗原−ペプチド−、抗原−タンパク質−または抗体−受容体−複合体が重要で ある。抗体−受容体−抱合体の場合、たとえば抗体は受容体分子に共有結合し、 その際受容体は分析質、作用物質、トキシンまたはフグナル製造＃素であってよ い。

本発明Ｏ他の対象はＲａｐが結合体の代表である、式１の化合物でワル、これは 分析質として免疫学的確定方法の鍬の使用のために好適である。このような結合 体はたとえばハプテンま友は几とえばハプテンコルチゾル、テオフィリンまたは ジゴキシデニンのような、少なくとも１種のカルボキシル基を有するかま九はカ ルざキシル基を有する誘導体に移行できた、抗原でろる。しかし原則的に基Ｈａ ｐにとって、これに向けられた抗原に対し骨異に得られるような全ての物質が重 要である。妹に一定方法の実施のために上記ＣＥＤＩＡ−技術１ｒ−より使用ｏ Ｔ症なようなものが好適でろる。この物質は妹Ｖこ分ぞ丁質、即ち患者の皿渭中 に存在し、かつその確？η；診断よ電埜であるような化合物で七つ１よい。

一般に峨ホ７“ハブ）′ン’に′ｉ、、抗淳の形成のｉめＩｒ直叛でなく間接的 ＆＋、好珈シ：免凝−を的担捧との結合により好適で、１−３るｊ１５な分子倉 ｔわす。上とえば次のハゾテンカ挙ケラれ、６：フエ、ｔバルビトーノ・、シフ ″Ｌニルヒダノド・イン、力４・バ°マゼビ′ン、パル７″ロイン酸、チロキシ ン（Ｔ４）、トリヨードチオニア（Ｔ３）、＝ストロン、工Ｘト５ジオール、！ ロブステロン、テストステ【ン、アルドステクン、葉酸、メチルアト乏ヒドロ葉 ＠またはシアンコバラミン（ビタミニ１Ｂ１２）。

一般式りのアミドアルキルルイミドー誘導体の製造の友めに上記でＨａｐと定義 されたハプテンまたは抗原が］重要でおる。一般式ｌのマレイミドの、好適なＨ ａｐ−誘導体との反応のために％　Ｈａｐ中に存在するカルボキシル基金まず反 応注酵導体に移行するＣとにより活性化するのが有利でおる。これは九とえばＮ −ヒドロキシ、スクシン−イミドエステルのまたとえばＮ　、　Ｎ’−ジシクロ へキシルカルボシーイミドのような縮合剤の存在−ご行なわれる。この方法で製 造されたＨａｐ−カルボン酸−Ｎ−−ニトロキシスクシンイミドエステルｉ−ｔ ソの後直接一般式１のマレイミド誘導体を用いて高い収率で一般式ＵＯ相当する マレイミドー−・ブテン−誘導体に反応される。しかし原則的にえとえばイミダ ゾーリルー、ヒトｅｌ中シベンゾトリアゾーリルー、ｐ−二トロフェニル−１定 はインブトキンカルボニル基のような刀Ａ・ホキシル基の他の活性化基金使用す ることも呵乾″ｆ：わる。

一般式１０本発明（Ｃよる化合物の有利な実施形では免役学的結合体は九とえＶ ′ｉステロイドホルモ、ンのよりなハプテンまたはキザンデＺ誘導体、たとえば コルチｒ−−ル、テオフィリンオ几はジゴキシデニンでアル。

原則的にしかし反応性カルざキシル基を有するような全でＯハプテンが使用でき る。カルボキシル基は遊離形でまたはたとえば無水物、エステルまたはアミドＯ ような活性化された誘導体の形で存在していてよい。

しかし、化学的変性によシ相当するカルボキシル基を後からハゲテンに移行する 場合、本来はカルざキシル基を含有しないよりな・・ブテンを結合体として使用 することもできる。相当する変性反応Ｆｉ迩切な従来技術から公知でわる。

本発明の他の実流形では、・・ブテンがステロイドホルモンでおる、一般式］の 化合＊’に使用する。九とえばエストロゲン、テストステロン、コルチゾンオヨ ヒ心グリコシドのよりな、その全てのステロイド骨格が一緒でおる、ステロイド ホルモンの検出が診断において重要でわる。免疫検定の実施のためのステロイド ホルモンないしは相当するハプテンーペデチドー抱合体に対する抗体Ｑ使用は従 って所望である。

ハプテンの、一般式ｉの化合物へ０綺導体化にょ９７％　ｙＱデンのエビドーグ が妨げられない０とが示され、そこでそのつどの、１足すべき試料中に存在する 、目安にさノした退隠ハプテンはまた相当する変性された一！テンーペプチドー 抱合体を同じ程度認める。

同様に式Ｅｖ化合物の、スルフヒドリル基含有イプチドまたはタンパク質との反 応によｐ得られる、誘導体化さハ、たハプテンーープチド〜抱合体は結合特性を さらＩｃ損うことなしに酵素受容体１１ＣＡを用いてβ−ガラクトシダーゼＯデ トラマーー錯体に会合することが示された。ｃｉＬは再び原則的に存在する、＃ 素の誘導体化で、ｅ！ｒ、素活注の不オリな影響を示さずかつ重要な基質全未変 性のβ−ガラクトシダーゼと同様の方法で分離する。

免疫感作のための使用の際、一般式ｌ　（Ｄ　Ｈａｐ−誘導体を使用する。ハプ テン誘導体は抗体形成のため好適な有機り甲蘭隔をめけで注入する。千Ｑ際非児 に高いパーセンテージでハプテ／に対し向けられている抗体の形成に至シかり結 合基との交差反応性を有１−ない。

一般式Ｈの本発明によるハプテン誘導体はポリクローン抗体）製造の几めの免反 感作のためにも、モノクローン抗不の製造のためにも好適である。

鳶異的にも、本発明による一般式ＩＩのハプテン誘導体を使用することにより、 架橋化合物との非常にわずかな交差反応性を有する抗体を得ることができる。得 ら７′１．九仇体はハシテンに対する隅い層相性を有する。

免疫感作のための本発明によるハプテン誘導体の使用の際高い抗体膚足１が傅ら ｎる。さらに本発明による一！テンーペプチドー兇合体は免疫検定法での使用の 几めに符に好適でおる。抗体が２Ｊ：橋分子に親和性を有しないかまたは非常に わずかな親和性のみを有しかつ従ってハプテンが非常に固有に結合するので、こ の抱合体を用いて免疫検定法での使用の際非常に正確な結果が得られる。

一般式口の本発明による。・・ブテン誘導体は、これが一方では遊離ハプテンの 構造をさらに不変に包含し、他方ではたとえば従来技術から公知の誘導体と比較 して架橋分子中で特電的な変化を有するという利点を有する。本発明によるハプ テン誘導体の使用はそれゆえ異種リンカ−技術の実施を容易かつ効果的方法で可 能にする。

本発明は芒らに一般式Ｂの化合物の、ペグチドおよびタンパク質との反応により 製造できる、抱合体に関する。ベニｆチドおよびタンパク質として特に、式■Ｏ 化合物のマレイミド基と反応する、スルフヒドリル基ないしはシスティア基を有 するようなものが重要である。このような誘導体の製造はタンパク質の化学的変 性の自体公知の方法により行う。特にし′Ｄλレベグチド、殊に上記ＣＥＤＩＡ −孜術で使用回層な酵素ドナーＨＤを使用する。ペプチドま友はタンパク質の変 性は自体公知の方法によル好適な緩ｍ額、九とえばりン鍍塩緩衝液中、０〜４０ ℃、特に１５〜２５℃の温度で、１〜２４時間にわたる式■の化合物での注入に よシ行う。

種々のＲＤ−誘導体の製造は米国特許第４７０８９２９号明細薔ないしはミクロ デエックス　−ル！（Ｍｉｃｒｏ−ｇｅｎｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、）、コンコード（ Ｃｏｎｃｏｒｏｄ）　、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）　（ＵＥｉＡ ）で得られる。

本発明の対象はそれゆえまた免疫検定法の実施の際次側で具体的な実施例を用い て本発明を詳述する二側　１ ａ）　Ｎ−（Ｌ、−ｆチルオキシカルボニル）−エタン−１，２−シアミン エチレンジアミ７１２ｇ（０，２モル）ラジオキサン／水（５０１５０ｖ／ｖ） ２００ｍに溶解する。１．５時間内に水浴中で攪拌および冷却しながらジオキサ ン１００１中のジーし、−デチルーゾカルボネー）　２１．８１　（０，１モル ）の溶液をＷ８２１［Ｉシた。室温で１時間さらに攪拌し、その抜水５ＱＱｍ／ で希釈しかつ酢酸エステル１ぷで抽出する。有機浴液を水浴々２００ｄで３回洗 浄し、０．１　ｎ　ＨＣｔ各々３００１１１／で２回抽出する。１つにされたＨ Ｃｌ−相を２ｎＮａｏＨで−１０，０に調節しかつ酢酸エステル６００１１／で 抽出する。有機溶液をさらに水３００ＷＬ！で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４２０Ｊｉ’ で乾燥させかつ水流真空中で蒸発させる。

収量二粘性の油状物ｉ、３５　Ｉｉ（シーし、−プチルージカルボネートに対し 、理論値の８．４％に相当）。

ＤＣニジリカデル、メタノール／酢酸エステル（６６／　３３　ｖ／ｖ　）、ニ ンヒドリンスプレーで噴霧（Ｆａ。

Ｍｅｒｃｋ、　ＤａｒｍｓＬａｄす：Ｒｒ＝０．１４ｂ）Ｎ−（＊、−ブチルオ キシカルボニル）ペンタン−１，５−Ｐアミン−アセテート ペンタン−１，５−シアミン２０．４　ｇ（０，２モル）をジオキサン／水（５ ０１５０ｖ／ｖ）２００ｒｘｌＫ溶解する。１．５時間内に水浴中で攪拌および 冷却しながらジオキサン１００Ｍ１中のジーｔ、−グチルーゾカルボネ−）　２ １．８１　（０，１モル）の溶液を滴加する。０℃で２時間および引続き２０℃ で１８時間さらに攪拌し、その抜水５００１で希釈しかつ酢酸エステル１Ｊで抽 出する。有機浴液を水浴々２００ｄで２回洗浄し、Ｎ１１２８０４５０　ｇで乾 燥させかつ回転蒸発器で蒸発させる。半固形残渣を１０チ酢酸２００−で浸出し 、不溶のビスーＢＯＣ−ペンタンー１，５−ジアミンｔｌ＆引ｉ１１遇する。濾 液を蒸発器せかつ残留する粘液状生成物を４〜６時間高度真空中で乾燥させる。

収量：１１．６．ｌｉ’（シーも、−プチルーゾカルボネートに対し理論値の４ ４％に相当）。

ＤＣニジリカデル、メタノール／クロロホルム／アンモニア４５／４５／１０Ｃ Ｖ／Ｖ／りニンヒドリンスプレーで噴ｈｌ　（Ｆａ−Ｍｅｒｃｋ−Ｄａｒｍｓｔ ａｃｌし）　＃　Ｒｆ　＝　０−６５　ｍ例　２ ａ）ｙ−（ね、−ジチルオキシ刀ルボニル）−２−ＩＪ−マレインイミド）エチ ルアミン 例１ａによりｍ造された化合’ＩｊｌＪ０．８　ｇ　（５ｍモル）を飽和重炭酸 ナトリウム−溶液２５１１１に溶解する。溶液をひだ付き濾紙を介して濾過しか り０℃に冷却する。

引続キ攪拌しなからＮ−（エトキシカルボニル）マレインイミド（０，Ｋｅｌｌ ｅｒおよびＪ、　Ｒｕｄｉｎｇｅｒ、　Ｈｅ１ｖ。

Ｃｈｉｍ、Ａｃｋａ５８　（１９７５年）、５３１〜５４１の方法によ〕製造） ０−８４ｇ（５ｍモル）を添加しかつ室温で１５分間さらに攪拌させる。この際 Ｎ−（エトキシカルボニル）マレインイミドはちょっとしてから完全に溶解し、 一方表記化合物は反応の経過で沈殿する。ＴＥＦ　４　［Ｉ　Ｉｆ／を添加し、 室温で４５時間さらに攪拌する。その後１ｎＥＣｉでｐ）ｊ　６．０に調節し、 酢酸エステル各々５０ｍ１で２回抽出しかつ抽出物をＮａ２８０４５１で乾燥さ せる。水流真空中での蒸発後表記化合物が無色の、固形残渣として得られる。

収ｔ：１．１ｇ（理論値の９２％） ＤＣニジリカデル、クロロホルム／酢酸エステル＜６６７５３　ｖ／Ｙ）、０− １　％　ＪＣＭｎ０４−Ｌａｇで噴１１　；　Ｒｒ　＝　０．５０ｂ）Ｎ−（ｔ 、−ブチルオキシカルボニル）−５−（Ｎ−マレインイミド）ペンチルアミン 例１ｂにより製造された化合物１３−１．９（５０ｍモル）を飽和炭酸ナトリウ ムー浴液２５０ゴに溶解する。

＃液をひたｌｔｔき濾紙を介してａｔ遇しかっ０℃に冷却する。？Ｒ拌しなから Ｎ−（エトキシカルボニル）−マレインイミド８８−４ＦＣ５０モル）を添加し かつ室温で１５分間さらに攪拌し、その＠Ｎ−（エトキクカルボする。引続きテ トラヒドロ７ラン４００ｄおよび付加的に飽和炭酸ナトリウム溶液２５０１１７ を添加しかつ１時間さらに反応させる。その後ｍ液を酢酸エステル２Ｘ５００１ Ｌ／で抽出し、抽出物を水５ＱＱａ／で洗浄しかりＮａ２８０４５０　ｇで乾燥 させる。回転蒸発器で蒸発後生酸物が粘性の油状物として得られ、これは高度真 空で乾燥される。

収量：９．６．９（理論値Ｃ）６Ｂ’ｌｒＫ相当）ＤＣニジリカデル、ｎ−ブタ ノール／氷酢１１／水４０／　１０　／　５０　＜ｖ／ｖ／ｖ）、０．１％ＫＭ ｎＯ４−浴液で噴霧；Ｒｆ＝０゜８５゜ 例　３ ａ）２−（Ｎ−マレインイミド）エチルアミン−塩酸塩 例２ａからのＢＯＣ−アミン化合物００−９６ＩＣ４モル）をジオキサン中の２ 　ｍ　ａｃｊ　２５　ｍＫ　ｆｔｇ解し、室温で放置させる。３０〜６０分関内 に生成＠４が沈殿しはじめる。室温で２４時間放置させ、その後結晶を吸引濾過 し、師酸エステル約１０Ｗ１１で後洗浄しかつ乾燥養子ｃａｃｔ２　＄−ユびパ ラフィン上で乾燥場せる。

収ｔ：無色の、微細結晶性粉本０．５８　Ｎ　（理論値の８２％）。

ＤＣニジリカデル、ｎ・−ブタノール／氷酢飲／水（Δ０／　１０　／　５０　 ｖ／ｖ／ｖ）、ニンヒドリ：ｙ　スｆ　ｖ　−テＩＩＪ　ｆｇ（Ｆａ、　１Ｊｅ ｒｅｋ、　ＤａｒｍｇＬａｄＬ）　；　Ｒｆ＝　０．２２ｍＣ６Ｈ９ＣＡＮ２０ ２　（１７６−６０）　＃計算値：　Ｃ４０，８１Ｈ５，１４Ｎ　１５．８６測 定値：　Ｃ４０，６０）１５．２９　Ｎ　１５．４６ｂ）５〜くＮ−マレインイ ミド）ペンチルアミン−塩ｆＲ塩 例２ｂにより製造されたＢＯＣ−７ミノ化合物８．４６ｇ（３０ｍモル）をジオ キサン中の２ｍａｃ１１００１Ｌ／に溶解しかつ室温で放置させる。３０〜６０ 分間内に生成物は沈殿しはじめる。室温で２４時間放置し、その後結晶を吸引濾 過し、酢酸エステル約５０ｍ！で後洗浄しかつ乾燥６申Ｃａ（ｊ２おＪびパラフ ィン上で乾燥させる。

収ｉｉ：無色の、倣細結晶性粉木４−７　ｇ（理論値の７２チに相当）。

ＤＣニジリカデル、ｎ−ブタノール／氷酢酸／水（４０／　１０　／　５　Ｄ　 ）　（ｖ／ｖ／ｖ）、＝７　ヒト！ｊ　７　スフｖ−ＴＩ’Ｊｔ’Ｑ　（Ｆａ、 　Ｍｅｒｃｋ　、　ＤａｒｍｓＬａｄｔ）　ｔ　Ｒｆ　Ｃｌ３２゜ＣｇＨ１５Ｃ ｔＮ２０□（２１８，６９）　；計算値：　Ｃ４９−４３Ｂ　９゜９１　Ｎ　１ ２．８１側１定１直　：　Ｃ４９−１９Ｈ９−９９Ｎ　１２．５９例　４ へブテンーカルボン酸−誘導体の製造 次の−・デテンカルｆン歌（喧交献の処方により製造された： ａ、）　コルチゾル−３−（０−カルボキシメチル）−オキシム コルチゾルおよびエタノール中のカルボキシメチルヒドロキシルアミン−ヘミ塩 酸塩から。

文献：Ａ、ツゾ（Ｔｓｕ、ｊｉ）その他、ステロイズ（Ｓ　ｔｅｒｏｉｃｌｓ） ２４（１９７４年）、第６９〜５８頁 ｂ）３−ｏ−スクシニルーソコキシｒニンゾゴキシデニンおよび無水コー・り酸 からの文献二〇、Ｃ，オリバー（Ｏｌｉｖｅｒ）その他２．：、Ｃｌ１ｎ。

Ｘｎｖｅａ＊、　４７　（１９６８年）、第１０６５〜１０４２頁 Ｃ）　ジゴキシン−４ζグルタリル〜ヒドロキシスクシ；〆イミドエステル ジゴキシンおよびＴＥＦ中のグルタリル−Ｗ−オルトトリメチルエステ＋−Ｗ’ −ヒドロチシスクシンイミドエステルから。

文献：　Ｈ，−Ｇ。バック（Ｂａｔｚ）その他、西ドイツ国特許出ω公告第２５ ３７１２９号明細書ないし米国特許第４１５５９４９号、同第４４３６８２８号 明細書ｄ）８−（３−カルボキクプロピル）−テオフィリン４．５−シアミノ− １，３１７メチルビリミジンー２＃６−シオンおよび無水ゲルタン酸力１ら。

Ｃ，Ｅ、クック（Ｃｏｏｋ）その他、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　Ｐａａｈｏｌ 。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　１３　（１９７６年）、第４９７〜５０５頁ｅ）　５− エチル−５−フェニル−１−（３−カルボキクプロピル）バルビッール！（１− （３−カルボキクプロピル）−フェノバルビタール） ナトリウムフエノバルビタールおよび４−−ｔロム酪酸−エチルエステルカラ。

Ｃ，ＩＥ−タック（Ｃｏｏｋ）その他、てんかんにおける量的類推調量、Ｐ、ケ ラウェイ（Ｋｓｌｌａｖｒａｙ）　＊よびインデマルペーターゼン（Ｉｎｇｅｍ ａｒ　ＰｅＬｓｒｓｅｎ）（ａｄ、）、ラベン　プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓ ｓ）、ニューヨーク１９７６年、第６９〜５８頁。

ハゲテン−カルボン酸−Ｎ−とドロ中シスククンイミドエステル 一般的製造処方 例４ａＳ　ｂ、ａＳ　ｅにより製造さｎ之ハゲテン刀ルボン６！０−５ｍモルを Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド６３ａ７　（０，５５ｍ　％ｋ　）と−ｇＫ、１ ％Ｘ　ＤＭＥ　１０　ＭＩＣｇ解し、Ｎ　、　Ｎ’−ジシクロヘキシル刀ルポゾ イミド１．１３■（０−５５ｍモル）を加える。室温で４時間攪拌させ、濾過し かり真空中で爵ｇｔ−蒸発延せる。残渣をＴＨＦ２０＋１／にと夕、場合により Ｎ　、　Ｎ’−ジシクロヘキシル原票の不浴の残りを濾過にょ夛除去する。ハプ テン−カルボン酸−Ｎ−ヒドクキシスク７ンイミドエステルの溶液をこの形で次 の工程の定めに使用する。

例　６ ハフテン−カルボン酸−［２−（Ｎ−マレインイミド）エチルアミド〕 一般的処方： 例５からの活性化され几ハプテンの溶液に２−（Ｎ−マレインイミド）エチルア ミン８８１Ｂ９（０，５ｍモル）を与える。攪拌しながらトリエチルアミン５１ ■（ｏ、５ｍモル）を滴加し、その後室温で６時間さらに攪拌する。溶液を真空 中でＭ発し、ハフテンーマレインイミドー化合物ｆｌＡ−Ｃｉシリカゲルカラム （２，５×３０１）でのカラムクロマトグラフィーにょシ好適な溶剤で檀褒する 。相当する一分金集め、真空中で蒸発させる。

例５６により製造された化合物の浴液を真空中半分Ｋまで濃縮し、沈縦を濾別す る。その後浴剤を真空中完全に除去する。残渣をインプロパツールで浸出し、固 形の生成物を牧引濾過しかつ乾燥４中で乾燥させる。

次の生成物が得られる： ａ）；ルチゾル（６−ｏ−カルボキシメチル）−オキシムの２−（Ｎ−マレイン イミド）エチルアミド７８ｍ′？Ｆ！、：ｎｅＲｘ−ｘｆル／）　ｌｉ−ル（９ ０／１Ｑ　ｖ／ｖ）。

収音：１８０■（理論値の６４％）。

ＤＣニジリカｒル、酢酸エステル／メタノール（９０／　１０　ｖ／ｖ　）　； 　Ｒｒ＝０．６０゜ＣｚｏＨ３ｓｌＪ３０ｓ　（５５７，６５）　；計算値：　 Ｃ６２，４６Ｅ　７．０５　Ｎ　７．５４測定［：　０６２．２０　Ｂ　７．１ ０　Ｎ　７．３１ｂ）３−ｏ−マロニルーゾゴキシデニンの２−（Ｎ−マレイン イミＩ’）エチルアミド ｆｆＮ１１ｅ　：　６酸エステル／石油エーテル／エタノール（４０／　４０　 ／　２０　Ｖ／Ｖ／ｖ　）収量：１４５〜（理論値の４７％）。

ＤＣニジリカゲル、酢酸エステル／石油エーテル／エタノール（４０／　４０　 ／　２０　ｖ／ｒ／ｖ　）　；０３３Ｈ４４ＮｚＯｅ　（６１２，７１）計算値 ：　Ｃ６４，６９Ｈ７，２４Ｎ　４．５７測定値：　Ｃ６４，６０ヨ７．４４　 Ｎ　４．２９Ｃ）　ゾがキシン−ｒ−グルタリルーヒドロキシスクシンイＳ　） −エステルの２−（Ｎ−マレイン（ミ）”）エチルアミド 溶離液：酢酸エステル／石油エーテル／メタノール（４０／　４０　／　２０　 ｖ／ｖ／ｖ　）。

収音：２２０号（理縞値０４３チ）。

ＤＣ：’／リカデル、６：ｃ！！エステル／石油エーテル／メタノール（４０／ 　４０／　２０　ｖ／ｖ／ｖ　）　；Ｒｒ　＝　０．４８゜ Ｃ５２ＨフロＮ２０１ｇ　（１０１７−１５）　ｎ計１ｉ［：　６１．４Ｄ　Ｈ ７，５３Ｎ　２．７５＃Ｉ定１直　：　６１．３１　Ｂ　７．６８　Ｎ　２．５ ０ｄ）８−（３−カルざキシグロビル）−テオフィリンの２−（Ｎ−マレインイ ミド）エチルアミド収量：　１２０Ｍ９（理論値の６２％）ＤＣニジリカｒル、 ブタノール／氷酢酸／水（４０／１０１５０　Ｖ／ｖ／Ｖ　）　； Ｒｒ　＝　０．７９゜ Ｃ１フＨ２ＯＮ、０５　（３８８，３８）　；計算値：　Ｃ５２，５７Ｂ　５． １９　Ｎ　２１．６４Ｃ５２，４１Ｈ５，０１Ｎ　２１．７４＠）’Ｉ−＜３− カルボキシプロピル）−フェノパルビタールの２−（Ｎ−マレインイミド）エチ ルアミド収ｔ：　９５■（理論値の４４９ｂ） ＤＣニジリカデル、匪酸エステル／メタノール（９０／　１０　ｖ／ｖ　）　： 　Ｒｒ＝　０−８３゜Ｃｚ２ＨａａＮａＯａ　（４４０−４６）　ｐ計算値：　 Ｃ５９，９９Ｂ　５．４９　Ｎ　１２．７２５９．６０　５．７９　１２．５５ 例　７ ハプテン−ペプチド−抱合体の製造 米ＩＪ譜ｆｆｆｆ１ｌｓ！４７０８９２９ｊＪ細齋（７９８７＆１１月２４ＥＤ に記載さｈｆｃｗ素ドナーＫＤ４　２００Ａｇ　ｔ”　０．０５　ｍりン酸ナト リウム緩ｖｆＪｇ、ｐ）１６．５１５０ｗ７に溶解しかつアセトニトリル２０Ｗ Ｌ！中の活性化されたハプテンＨＡ−０２０”９に加える。ｆＩ液を室温で４時 間攪拌させる。抱合体をＨＰＬＣによＪＣ−１８カラム（Ｄｙｎａｍａｘ　６０ 　Ａ　８．４−６　＊　２５０　ｔＸ　；勾配液：２０〜１００％Ｂ、Ｂ＝アセ トニトリル／水６５／３５ｖ／ｖ　）で精製する。抱合されていないＥＤ４の保 持時間はＣの際２５．３５分である。相当する画分を集め、水５ノに対し透析す る。抱合体の溶液はこの形で米国特許出ａ第４７０８９２９号明細書に挙げられ た、または二者択一な、免疫学的試験方法に使用される。

そこで次のものが得られた：　− ａ）テオフィリン−８−昨酸一（２−（Ｎ−マレインイミド）エチルアミド〕− ＫＤ４−抱合体収ｔ：ｉ２μｇ：保持時間（ＨＰＬＣ）ニジ６．９１分。

ｂ）フェノパルビタールー１−酪酸−〔２−（マレインイミド）エテルアミド） −ＥＤ４−抱合体数１：　ｉ　ｓｓμｇ：保持時間（ＨＰＬＣ）　：　２５．７ ８分例　８ ：Ｉ　ルチｆ−ルー６−カルボン酸−［２−（Ｎ−マレインイミド）エチルアミ ドツーβ−ガル−免疫原の合成 β−ガル（Ｇａυ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｎｒ、　５７０ ０７９）５００号を２０℃で０．１ｎリン酸カリウム椴衝液−１６，０５Ｑａｕ に醪解し、ジオ：？サン１０１中の、例４ａにより製造されたコルチゾルー化合 物１１０■を強力に攪拌しながら瀾加する。冷加の軒了恢約１６時間さらに攪拌 し、そＶ俊蔓液ｔ−ＡｃＡ　２０２ウルトロデルー力ラム（８００扉ｌ容量）上 へ与え、ｏ−ｏ　ｉ　ｎリン酸刀すウム緩ｍｇｐ）１７．０、Ｑ、９　％　Ｎａ Ｃ１で溶離する。タンパク質金有−分金集め、濃度を２８０皿でのＵＶ　−吸収 により（タンパク質濃度＝ＥＸ１．９■／ｄ）確定する。免疫原の収量は典型的 には６５０〜４５０■でおる。タンパク質抱合体を凍結乾燥し、−２０℃で貯蔵 する。

国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　９０００９５７ Ｓ＾　３７５３０

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中Ｒ１およびＲ２は同じかまたは 異なり、水素またはＣ１〜Ｃ４−アルキル基を表わしかつＡは直鎖または分枝、 飽和または不飽和の、場合により酸素−または硫黄原子またはカルボニル基によ り中断された２〜６のＣ−原子を有するアルキレン基を表わす〕のアミノアルキ ルマレイミドならびにＮ−６−アミノヘキシルマレイミドを除く、その酸付加塩 。
2. ２．Ｒ１またはＲ２が水素を表わす、請求項１記載のアミノアルキルマレイミド 。
3. ３．Ａが２〜５のＣ−原子を有する直鎖アルキレン鎖を表わす、請求項１または ２記載のアミノアルキルマレイミド
4. ４．一般式ＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）〔式中Ａは上記のものを表わす〕 のジアミンを一般式ＩＶ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）〔式中Ｙは容易に分離可能な保護基 でわる〕の化合物に移行しかつ引続き一般式ＩＶの化合物を一般式Ｖ：▲数式、 化学式、表等があります▼（Ｖ）〔式中Ｒ１およびＲ２は上記のものを表わし、 Ｚは反応性基を表わす〕の化合物と自体公知の方法により反応させかつ引続き保 護基Ｙを再び分離することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のア ミノアルキルマレイミドの製法。
5. ５．一般式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中Ｈａｐは１種または数種のカ ルボキシル基またはカルボキシル誘導体を有するハプテンまたは抗原からアミド 化により形成される基であり、Ｒ１およびＲ２は同じかまたは異なり、Ｃ１〜Ｃ ４−アルキル基または水素原子を表わし、Ａは直鎖または分枝、飽和または不飽 和の、場合により酸素−または硫黄原子またはカルボニル基により中断された、 ２〜６のＣ−原子を有するアルキレン基を表わす〕のアミドアルキル−マレイミ ド。
6. ６．１種または数種のカルボキシル基またはカルボキシル誘導体を有するハプテ ンまたは抗原を請求項１〜３のいずれか１項による一般式Ｉの化合物と自体公知 の方法で反応させることを特徴とする、請求項５または６記載の一般式ＩＩのア ミドアルキルマレイミドの製法。
7. ７．請求項５または６によるアミドアルキルマレイミドを、スルフヒドリル基を 有するペプチドまたはタンパク質１種または数種と反応させることにより得られ るペプチド−またはタンパク質抱合体。
8. ８．請求項５または６による一般式ＩＩの化合物を、１種または数種のスルフヒ ドリル基を有するペプチドまたはタンパク質と自体公知の方法で反応させること を特徴とする、抱合体の製法。
9. ９．ヘテロ多官能性リンカーとしての、請求項１〜３のいずれか１項による化合 物の使用。
10. １０．ペプチド−またはタンパク質抱合体の製造のための請求項５または６によ る式ＩＩの化合物の使用。
11. １１．診断測定方法での、請求項８による抱合体の使用。
12. １２．免疫学的測定の実施のために、請求項８による抱合体を含有する診断剤。