JPS6084297A - 新規なアミノプリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアミノプリン誘導体に関する。

更に詳細には、本発明は液状媒体中のリガンドまたはソ
ノ結合相手物質（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ）の
特異的結合試験に用いる新規な標識共役体の合成に用い
ることもできる新規化合物に関する。特に本発明は、こ
のような試験法、具体的には血清中のチロキシン等のヨ
ードチロニンを測定するために用いるフラビンアデニン
ジヌクレオチド（ＦＡＤ）−標識共役体の合成に用いる
こともできる新規化合物に関する。

このヨードチロエン類は以下の一般式：〔式中、β１お
よびβ２はそれぞれ水素原子またはヨウ素原子を表わす
。〕 を有する。臨床的に重要な主たるヨードチロエン類を以
下の表−１に掲げる。

表−１ ヨードチロニン　β１　β２ ３．５．３’、５’−テトラヨードチロニン　ヨウ素　
ヨウ素（チロキシン；Ｔ−４） ３．５．３’−）リョードチロニン　ヨウ素水素（リオ
チロニン；Ｔ−３） ３　、３’、　５’−）リョードチロニン　水素　ヨウ
素〔リバーｙ、　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　’１１’−３）
３．３′−ジョードチロニン　水　素水素血清中の種々
のヨードチロエン類、：特に血清中のホルモンＴ−３お
よびＴ−４の濃度の定量的測定および担体蛋白である甲
状腺結合グロブリン（ＴＢＧ）上のヨードチロニン結合
位置の飽和度の定量的測定は甲状腺障害の診断の助けと
して価値がある。同様に血清をはじめとする体液の他の
成分の測定は、個人の健康を評価する際に役立っている
。臨床的に重要な他の物質の例は以下の記載より明らか
になるであろう。

特異的結合試験法は、放射性同位元素標識抗原が特異抗
体に結合するに当って、試験試料中の抗原と競合させら
れる初期の競争的結合放射線免疫試験法（以下ＲＩＡ法
と略記する。）から技術的に進歩してきている。このＲ
ＩＡ法では、試料中抗原は、抗体に結合した放射性標識
抗原（標識抗原の結合種）の放射能の、抗体に結合しな
いで残る抗原（遊離種）の放射能に対する比率を測定し
、次いで標準曲線とその比率を比較することによって定
量される。ＲＩＡ法に関する総説が、「クリニカル・ケ
ミストリー」第１９巻、１４６頁（１９７３）〔“Ｃ１
１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　”　１９　：　１−４６　（１９
７３）　）にスケリー（Ｓｋｅｌｌｙ）らによって書か
れている。ＲＩＡ法は、特異抗体の抗原またはハプテン
との結合に基づくと定義されているが、放射性標識結合
試験法は、ホルモンとその結合蛋白間におけるようなそ
の他の特異的結合作用に基づいて発展してきている。

放射性標識結合試験法から、米国特許第３，６５４゜０
９０号および同第３，８１７，８３７号に記載されてい
るように、酵素等の標識物質を用いる放射性同位体元素
によらない結合試験が発展してきている。

最近、１９７６年３月１８日に出願され、本出願人に譲
渡された米国特許出願番号箱６６７．９８２号および同
第６６７．９９６号に基づく西独特許公開束２，６１８
．４１９号公報および同第２，６１８，５１１号公報に
記載され°ているようなさらに改良された放射性同位体
元素を用いない結合試験法が開発されている。

この試験は特に補酵素、環式反応物、開裂可能な蛍光酵
素物質および化学発光性分子等のような特異な標識化物
質を用いている。

フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）は、ＦＡＤ
が有用な測定反応の補酵素として機能するので補酵素標
識として有用であると述べられている。１９７８年６月
２２日に出願され、本出願人に譲渡された米国特許出願
９１７，９６１号には、ＦＡＤは一定の生化学的系で補
欠分子族としても機能するので、標識として補欠分子族
を用いる改良された特異的結合試験法に有用であること
がさらに記載されている。

血清中のヨードチロニン濃度を測定するための種々の方
法論がある。ヨードチロニン試験法は、放射性標識ヨー
ドチロニンがＴＢＧに結合するに当って、血清ヨードチ
ロニンと競争するマーフィーとパラティ（Ｍｕｒｐｈｙ
　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｅ）による競争的蛋白結合試験法
〔ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・エンドクリ
ノロジカル・メタボリズム（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ、）　２４　：　１８７　
（１９６４））の発展により非常に進歩した。種々のヨ
ードチロニンの特異的抗血清の開発により、放射性標識
された血清ヨードチロニンがＴＢＧに対してよりもむし
ろ抗体に結合するように競争するＲＩＡ法を発明するこ
とができた。ヨードチロニンの競争的蛋白結合試験法お
よび放射免疫試験法において、放射性物質は１または２
以上のヨウ素原子が放射性ヨウ素同位体、通常は１２５
Ｔによって置換された本来のヨードチロニンよりなる。

上述した放射性同位元素によらない結合試験法により、
特に米国特許番号４，０４３，８７２号および同４，０
４０，９０７号に記載されている方法、さらには西独特
許公開番号２．６１８，４１９号、同２，６１８，５１
１号および上述した米国特許出願番号９１７，９６１号
に記載されている方法においてヨードチロニンを測定す
るためのさらに有利な方法が提供されている。

新規なフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）標識
共役体が、ヨードチロエン類等の分析学的に重要なリガ
ンドまたはその結合アナローブを測定するための結合試
験法に用いるために発明され、特に前述した補欠分子族
標識を用いる試験法に用いるために発明された。このＦ
ＡＤ標識共役体は一般式〔■〕　： リボフラビン−（ホス）２−リボース 〔式中、リボフラビン−（ホス）２−リボースはＦＡＤ
中のりボフラビンーピロホスフェートーリボース残基を
表わし；ｎは２〜６の整数、好ましくは２または６を表
わし；および−（ＣＯ）Ｌはアミド結合を介して結合さ
れた特異的に結合可能なリガンドまたはその特異的結合
アナローブ、好ましくはチロキシン等のヨードチロニン
を表わす。〕を有する。

この本願の標識共役体の特異的に結合可能なりガントま
たはそのアナローブは、化学的な言葉で言うと、通常、
蛋白、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、糖蛋白、ス
テロイド、または特異的結合の相手物質を得ることがで
きる他の有機分子である。機能上の用語では、リガンド
は通常抗原またはそれに対する抗体；ハプテンまたはそ
れに対する抗体；あるいはホルモン、ビタミン又は薬剤
もしくはそれの受容体またはその結合物質である。

最も普通には、抗原性ポリペプチド、抗原性蛋白質ある
いは抗体等の分子量１．、ＯＯＯ〜４，０００，０００
の免疫学的に活性なポリペプチドまたは蛋白、または分
子ｆｆ１１００〜１５００のハプテンである。

リガンドとしてヨードチロニンを含んでいるＦ　Ａ　Ｄ
　ｅｘ識共役体は、血清等の液状媒体中のヨードチロニ
ンを測定するための特異的結合試験法に特に有用であり
、かつ一般式〔■〕　：〔式中、リボフラビン−（ボス
）２−リボースはフラビンアデニンジヌクレオチド中の
りボフラビンービロホスフエートーリボース残基を表わ
し；ｎは２〜６の整数を表わし；β１およびβ２はそれ
ぞれ水素原子またはヨウ素原子を表わす。〕を有するこ
とが好ましい。

このＦＡＤ標識共役体は、リガンドまたはその特異的結
合相手物質のための結合試験法に用いられ、上述の米国
特許出願番号９１７，９６１号に詳細に記載されている
ように、ＦＡＤが触媒的に作用するように要求するアポ
補酵素とこのような共役体の結合により生じたＦＡＤ活
性、例えば補酵素活性または補欠分子族活性を測定する
ことによって試験するために測定、すなわち監視される
。

このＦＡＤ標識共役体は、種々の合成経路によって調製
することができる。このような標識共役体を合成するの
に用いることもできる本発明の中間化合物は以下の一般
的な反応法により合成することができる。すなわち；一
般式〔■〕　：ＣＩ！ を有する６−クロロ−９−（２’、３’−０−イソプロ
ピリデン−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン〔■〕〔ハ
ンプトン等、ジャーナル會オブ・アメリカン・ケミ力）
Ｌｘソ”ｊ”エテイー、（Ｈａｍｐｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ
、　Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）　８３　：　１５０（１９６１
）　）と、表−２に掲げられたものより選ばれるα、ω
−ジアミノアルカンとの反応により、一般式〔■〕　： 〔式中、ｎは２〜６の整数を表わす。〕を有する本発明
中間体である６−（ω−アミノアルキル）アミノ−９−
（２’、　３’−０−インプロピリデン−β−Ｄ−リボ
フラノシル）プリン［ＩＶ）が得られる。

表−２ ｎ　ａ、ω−ジアミノアルカン ２　１．２−ジアミノエタン ３　１．３−ジアミノプロパン ４　１．４−ジアミノブタン ５　１．５−ジアミノペンタン ６　１．６−ジアミツヘキサン 次いで、この本発明のアミノ−プリンは、カルボキシル
基を含むリガンドまたは所望のカルボキシル基を含むそ
のリガンドの結合アナローブ（例えばリガンドの誘導体
）とペプチド結合またはアミド結合を形成させることに
より結合させると−１り式〔■〕　： Ｉ′Ｌ３Ｕ　１．、；ｆ１３ 〔式中、−（Ｃｏ）Ｉ、はアミド結合によって結合され
たリガンドまたはそのアナローブを表わし、ｎは２〜６
の整数を表わす。〕 を有する本発明中間体であるアナローブ置換アデノシン
〔Ｖ〕が得られる。このような縮合反応は、カルボジイ
ミド反応〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｉ　４４：
　１３４４（１９６４））　、混合無水物反応〔エーラ
ンガー等、メソツズ・イン・イムノロジー・アンド−イ
ムノケミストリー、ウィリアムス、チェイス著、アカデ
ミツク・プＬ／　ｘ　（Ｅｒｌａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、　Ｍｅｔｈ−ｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　
ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｅｄ。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｅ、　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９６７）
Ｐ、１４ｇ）、および酸アジドと活性エステル反応〔コ
ツプル、ペプチド−アンド１了ミノアシド、ダブリュー
・エイ・ベンジャミン・インコーホレーテッド（Ｋｏｐ
ｐｌｅ　、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｍ１ｎｏ　
Ａｃ１ｄｓ。

Ｗ、　Ａ、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｉｎｃ、）　（Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　ｌ　９６６）　］　等の従来のペプチド
縮合反応を用いて、本発明中間体であるアミノ−プリン
［ＩＶ］をカルボン酸含有リガンドまたはりガンドアナ
ローグと直接反応させることにより行うことかできる。

また総説クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、　２２　：　７２６（１９７６）、）を参照せよ
。

もちろん、他の公知の方法が、リガンドまたはその誘導
体を中間体であるアミノ−プリン〔ｌＶ）に結合させる
ために有用であることは理解されよう。特に、従来の二
官能性結合剤を、カルボン酸基またはアミノ基を含んで
いるリガンドまたはその誘導体を、中間体であるアミノ
−プリン（１’Ｖ）に結合させるために用いることがで
きる。例えば、ビス−イソシアネート、ビス−イミドエ
ステルおよびグルタルアルデヒド〔イムノケミストリー
（Ｉｍ−ｍｕｎｏｃｈｅｍ、）　６　：　５３　（１９
６９）　）等のアミン−アミン結合剤を、アミノ基を含
んでいるリガンドまたはその誘導体を「１月ｉｌ１体で
あるアミノ−プリン［ＴＶ）に結合させるために用いる
ことができる。

マタ、アミン（例えば中間体であるアミノ−プリン）を
カルボン酸（例えぼりガントまたはその誘導体）に結合
させるに当って、橋状基を導入するごとき適切な結合反
応は周知である。この型のカップリング反応は、文献、
例えば上述のコツプルモ／グラフ　（Ｋｏｐｐｌｅ　ｍ
ｏｎｏｇｒａｐｈ）およびロウ拳アンド・ディーン、ア
フイニテイ・クロマトグラフィー、ジョンｅウィリー・
アンド・サンズ（Ｌｏｗｅ＆　Ｄｅａｎ、　Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｊｏｈｎ　
Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ）　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９
７４）に充分に記載されている。

このような結合技術は、有用な標識共役ｆ沓を調製する
に当って、先に述べたペプチド縮合反応と等しいと考え
られる。この結合技術は、中間体であるアミノ−プリン
［ＩＶ）に結合させるためのリガンドまたはそのアナロ
ーブの反応に与る官能性および所望の橋状基の長さによ
って選択される。

この開示の目的のために、すべての場合において、得ら
れた縮合生成物は、生成物の残部に結合し、かつ最後に
ＦＡＤに変換されるかまたはアミド結合を介して最後に
ＦＡＤ標識共役体の残部に結合する中間体であるアミノ
−プリンよりなる。このような縮合生成物または共役体
の残部は、リガンドそれ自体が中間体であるアミノ−プ
リン［ＩＶ）に直接結合しない場合には、リガンドの結
合アナローブの残基と考えられる。かくしてこの記載お
よび特許請求の範囲では、略記号−（Ｃ０）Ｌはアミド
結合を介して結合されるリガンドまたはその結合アナロ
ーブを表わし、そこではこのようなアナローブはペプチ
ド縮合によって結合されたリガンドの誘導体でもよいか
または、リガンドまたは誘導体を二官能性結合剤と結合
させることによって導入される橋状基を介して結合され
るリガンドまたはその誘導体であってもよい。

リガンドまたはその誘導体を中間体であるアミノ−プリ
ンＣＩＶ　）に結合させるに当って、結合時、このよう
なりガントまたはその誘導体のある反応基が副反応に関
与しないように保護することが望ましいことは明らかで
ある。また、とのＦＡＤ標識共役体の調製を完全にする
ために、以下に記載された合成工程時、反応の妨害を防
ぐために反応基を保護することが好ましい。包含される
特異的リガンドまたはその誘導体および結合技術の選択
によって、中間体であるアミノ−プリン〔ＩＶ）に結合
させる前または後に、リガンドまたはその誘導体の反応
部に保護基を付加することができる。

当業者は反応基を望ましく保護することから広範な種類
の従来のブロッキング反応を有し、この結果、付加され
るブロッキング基は次にくる合成工程で容易に除去する
ことができ、かくしてＦＡＤに結合した元来のりガント
または誘導体が得られる。

例えば、リガンドがヨードチロニンの場合には、中間体
であるアミノ−プリン（ＩＶＩと縮合または結合する前
に、アミノ基を保護するように処理することが好ましい
。この中間体であるアミノ基を保護されたヨードチロニ
ン［ＶＩ）は次式〔■〕　：〔式中、β１およびβ２は
水素原子またはヨウ素原子を表わし、Ｙはアミノ保護基
を表わす。〕を有する。アミノ基の保護は従来の方法で
あり、アミノ保護基は、好ましくはトリフルオロアセチ
ル基；他のアシル型の基（例えばホルミル基、ベンゾイ
ル基、フタリル基、ｐ−トシル基、アリールホスホリル
基、アルキルホスホリル基、フェニルスルホニル基、ベ
ンジルスルホニル基、トリチルスルフェニル基、０−ニ
トロフェニルスルフェニル基および０−ニトロフェノキ
シアセチル基）；アルキル型の基（例えばトリチル基、
ベンジル基およびアルキリデン基）；およびウレタン型
の基（例えばカルボベンゾキシ基、ｐ−ブロモカルボベ
ンゾキシ基、ｐ−クロロカルボベンゾキシ基、ｐ−メト
キシカルボベンゾキシ基、トシルオキシアルキルオキシ
チオカルボニル基、シクロペンチルオキシチオカルボニ
ル基、シクロヘキシルオキシチオカルボニル基、ｔ−ブ
チルオキシチオカルボニル基、ＩＪｌ−ジメチルプロピ
ルオキシチオカルボニル基、２−（１）−ビフェニル）
−２−プロピルオキシチオカルボニル基およびベンジル
チオカルボニル基）を包含する広範な種々の基より選択
できることは理解されよう。

中間体であるアミノ−プリン（ＩＶ）および中間体であ
るアミノ保護ヨードチロニン〔■〕との縮合または結合
によって形成された本発明中間体である置換アデノシン
は、（Ｃｏ）Ｌが次式〔■〕　：〔式中、β１およびβ
２は水素原子またはヨウ素１５ｉ子を表わし、Ｙは上述
のアミノ保護基を表わす。〕である一般式（Ｖ’ｌの化
合物である。

一般式（Ｖ）の中間体をオキシ塩化リンで処理すると一
般式〔■〕　： 〔式中、ｎは２〜６の整数を表わす。〕を有する本発明
中間体であるホスホＩＪ　）し化リガンドまたはアナロ
ーブ置換アデノシン〔■〕力（得られる。

この一般式〔■〕の化合物を加水分解すると、一般式〔
■〕　： 〔式中、ｎは２〜６の整数を表わす。〕を有する本発明
中間体であるリガンドまたはアナローブ置換５′−アデ
ニル酸（ＩＸ）が得られる。

リボフラビン−５′−モノホスフェートと、Ｎ、Ｎ’−
カルボニルジイミダゾールで処理することによってホス
ホルイミダゾリデートに活性化した一般式（ＩＸ）の化
合物とを縮合することにより一般式〔式中、ｎは２〜６
の整数を表わす。〕を有するＦＡＤ標識共役体〔Ｘ〕が
得られる。

リガンドがヨードチロニンであり、かつ（Ｃｏ）Ｌが一
般式〔■〕の化合物である好ましい具体例では、得られ
たＦＡＤ−ヨードチロニン共役体は一般式〔Ｍ〕　： 〔式中、β１およびＲ２は水素原子またはヨウ素原子を
表わし；Ｙは従来の方法により除去可能なアミノ保護基
または水素原子を表わし；ｎは２〜６の整数を表わす。

〕 を有する。

上述したように、ＦＡＤ標識共役体の合成過程で生成さ
れた新規な本発明の中間体化合物（［ＩＶ）　。

（Ｖ）、（■〕、および〔■〕）は以下の一般式（式Ａ
は中間体の゛アミノープリン（ＩＶ）に相当し、式Ｂを
有する。

式〔Ａ〕： 〔式中、ｎは２〜６の整数を表わす。〕式〔Ｂ〕： 〔式中、（Ｃｏ）Ｌは、アミド結合を介して結合された
特異的に結合可能なリガンドまたはその結合アナローブ
、好ましくは一般式〔■〕の化合物を表わし；ｎは２〜
６の整数を表わし；β１およびＲ２は、１ Ｒ１は水素原子または−Ｑ−ｐ−ＯＨを表わすかまたＨ １ はＲ２およびＲ３が水酸基のときＲ１は−Ｑ−ｐ−ＯＦ
１Ｈ を表わす。〕 上述したように、標識共役体に含まれるリガンドまたは
その結合アナローブは、はとんどの場合、抗原性ポリペ
プチド、抗原性蛋白質または抗体等の分子量１，０００
〜４，０００，０００の免疫学的に活性なポリペプチド
または蛋白質であるか、あるいは分子量１００〜１，５
００のハプテンである。このＦＡＤ標識共役体の合成に
おいて、このようなリガンドまたはそのアナローブをア
ミド結合を介して中間体であるアミノプリン〔■〕に結
合させる種々の方法を説明する。

ポリペプチドおよび蛋白 特異的に結合可能な蛋白リガンドの代表例は、一般的に
抗体、特にＩ、Ｇ、　Ｉ、Ｅ、　Ｉ、Ｍ、　Ｉ、Ａ群の
抗体、１えば肝炎Ｂ抗体であり、また、インシュリン、
脈絡膜のゴナドトロピン〔例えばＨＣＯ３、癌胚芽含有
抗原（ＣＥＡ）、ミオグロビン、ヘモグロビン、卵胞蓄
積ホルモン（ＴＳＨ）、人胎盤ラクトーゲン、チロギシ
ン結合グロブリン（ＴＢＧ）、内因子ｈランスコバラミ
ン、アルカリンホスファターゼ、ラクテイツクデハイド
ロゲナーゼ（酪酸脱水素酵素）等の酵素、肝炎８表面抗
原（ＨＢ６Ａ、）、肝炎Ｂ。抗原（ＨＢ８Ａ、）　、肝
炎核抗原（ＨＢｏＡ　、）等の抗原性蛋白質である。ポ
リペプチドリガンドの代表例は、アンジオテンシンエお
よび■、Ｃ−ペプチド、オキシトシン、パップレシン、
ニューロフィシン、ガストリン、セクレチンおよびグル
カゴンである。

ペプチドとして、この一般的なカテゴリーのリガンドは
、多くの有用なカルボン酸およびアミノ基を含有するの
で、中間体であるアミノ−プリン（ＩＶ）へのカップリ
ングは、上述のカルボジイミド反応、混合無水物反応等
の従来のペプチド縮合反応に従って行うことができるか
または同様に上述されたように中間体であるアミノ−プ
リン［ＩＶ）中のアミノ基にカルボン酸基およびアミノ
基をカップリングさせることができる従来の二官能性試
薬を用いることによって行うことができる。第一アミン
またはカルボン酸類に対する蛋白のカップリングに関す
る一般的な文献については詳細に」二連した。

ハプテン ハプテンは、イムノゲン（免疫）共役体の形で注入され
て、はじめて、宿主動物内に免疫化学的応答を引き起こ
す一群の広範な有機物質である。

このイムノゲン共役体は、はとんどと言ってよいほどア
ルブミンのような蛋白質である担体分子にカップリング
されたハプテンよりなる。イムノゲン共役体を形成する
ためのカップリング反応はこの分野で良く開発されてい
るが、一般的に言って、それはカルボン酸を有するリガ
ンドまたはリガンドのカルボン酸誘導体を蛋白担体の反
応に与りうるアミノ基にアミド結合を形成することによ
って、カップリングすることよりなる。このような周知
のカップリング反応は、カルボン酸を有するリガンドま
たは結合アナローブを中間体であるアミノ−プリン（Ｉ
Ｖ）のアミノ誘導体にカップリングすることにより標識
共役体を形成する本発明の反応に直接的に類似している
。

それ自体カルボキシル基を含有し、中間体であるアミノ
−プリン（ＩＶ）に直接カップリングできるハプテンリ
ガンドにはチロキシンおよびリオチロニンのヨウナヨー
ドチロニンホルモン類ならびにビオチン、バルプロン酸
、葉酸および成る種のプロスタグランジンのような他の
物質が含まれる。

以下に、それ自体、反応に与り得るカルボン酸基を有し
ないハプテン・リガンドのカルボン酸基を有する結合ア
ナローブを調製するための代表的な合成過程を示すが、
これによってこのようなアナローンが上述のペプチド縮
合反応または二官能性カップリング剤による反応（以下
の構造式ではｎは通常１〜６の整数を表わし、Ｍｅはメ
チル基を表わす。）によって中間体であるアミノ−プリ
ン（ＩＶ　）にカップリングさせることができる。

カルバマゼピン ジベンズ（ｂ、ｆ）アゼピンを米国特許４，０５８，５
１１号のシング（Ｓｉｎｇｈ）法に従ってホスゲン、０
）−アミノアルカノールおよびジョーンズ試薬（硫酸中
の三酸化クロム）を用いて次々に処理すると下記一連の
カルボン酸： が得られる。

キニジン ［７７−−ｒ　：ｌｌニアシストｊ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌｏｇｉｓｔ）　１７　：２１９　（１９７５）のク
ック（Ｃｏｏｋ）らの方法に従って、キニジンを脱メチ
ル化し、５−ブロモ吉草酸で処理し、次いで酸で加水分
解すると好適なカルボン゛酸誘導体が得られる。

ジゴキシンおよびジギトキシン 強心配糖体であるアグリコンを、「ジャーナル・オブ・
クリ二カル−インベステイゲイション」（Ｊ、　Ｃｌ１
ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　４７　：　１０３５　（１９
６Ｂ）のオリバー　（Ｏｌｉｖｅｒ）等の方法に従って
無水こはく酸とピリジンで処理すると下記化合物が得ら
れる。

〔式中、Ｚは水素原子または水酸基を表わす。〕テオフ
ィリン ［リサーチ・コミュニケーション・オブ・ケミストリー
・パソロジー〇アンド・ファーマコロジーＪ　（Ｒｅｓ
、　Ｃｏｍｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐａｔｈ、　Ｐｈａｒｍ
、）　１３　：　４９７（１９７６）のクック（Ｃｏｏ
ｋ）等の方法に従って、４．５−ジアミノ−１，３−ジ
メチルピリミジン−２，６−ジオンを無水グルタル酸で
熱処理すると下２化合物が得られる。

ＣＨ３ フエノバルビクールおよびプリミドン フエノバルビクールナトリウムを５−ブロモ吉草酸メチ
ルエステルと共に加熱し、生成物をフエノバルビタール
に相当する酸誘導体に加水分解した。〔タック（Ｃｏｏ
ｋ）等による「クオンテイタテイブパアナリテイツクφ
スタディーズ・イン・エビレプスイーＪ　（Ｑｕａｎｔ
ａｔｉｖｅ　Ａｎａｌｙｔｉｃ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ
　Ｅｐ−ｉｌｅｐｓｙ）　、ケリウェイおよびピーダー
リン（Ｋｅｌｌｅ−ｗａｙ　ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ
）共著、ラベンプレス（ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ）　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ’　（１９７６）　３９〜５８　〕プリミ
ドンの酸誘導体を得るために、タック（Ｃｏｏｋ）等の
同じ文献の方法に従って、２−チオフエノバルビタール
をアルキル化し、加水分解シ、次いで生成物をラネーニ
ッケルで処理すると下記化合物が得られる。

（ＣＨ山−〇〇〇Ｈ ［リサーチ・コミュニケーション・オブ・ケミストリー
・バンロンー・アンド・ファーマコロジーＪ　（Ｒｅｓ
、　Ｃｏｍｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐａｔｈ、　Ｐｈａｒｍ
、）　５　：　７６７（１９７３）のクック（Ｃｏｏｋ
）　等の方法に従って、ジフェニルヒダントインナトリ
ウムを５−ブロモ吉草酸メチルエステルと反応させ、次
いで酸で加水分解すると下記化合物が得られる。

モルフイン ［ザイエンＸＪ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１６８　：　１
３４７（１９７０）のスベクター（５ｐｅｃｔｏｒ）等
の方法に従って、モンフイン遊離塩基をβ−クロロ酢酸
ナトリウムで処理すると好適なカルボン酸誘導体が得ら
れる。

ニコチン ｒハイｔヶミス、）　！Ｊ　−Ｊ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）　１２（２４）：　５ｏ２ｓ　（１９７３）
のランプ：／　（Ｌａｎｇｏｎｅ）等の方法に従って、
トランス−ヒドロキシメチルニコチンと無水こはく酸を
反応させると下記化合物が得られる。

「ジャーナルのオブ・ステロイド−バイオケミｘ　ト１
７−　Ｊ　（Ｊ、　５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
）　５　：　７３９（１９７４）のボーミンガ−（Ｂａ
ｕｍｉｎｇｅｒ）等の方法に従って、ステロイド核の１
位または７位のいずれかを介して結合されたテストステ
ロンおよびアンドロステンジオンの好適なカルボン酸誘
導体が調製される。

下記化合物は代表的なテストステロン誘導体である。

エストロゲン類、例エバエストロン、エストラジオール
およびエストリオールの好適なカルボン酸誘導体は、上
記ボーミンガー等の方法に従って調製される。下記化合
物はエストロン誘導体を表わす。

ステロイド核の３位、６位または７位のいずれかを介し
て結合されるプロゲステロンおよびその代謝物の好適な
カルボン酸誘導体は、上記ボーミンガー等の方法に従っ
て調製される。下記化合物はプロゲステロン誘導体を表
わす。

５−Ｕｆｌ、−ＵりりＨ 上述された方法は分析に重要なハプテンの好適なカルボ
ン酸誘導体を形成する多くの公知技術の例にすぎない。

主要な誘導技術としては、「クリニカル−ケミストリー
Ｊ　（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）　２２　：　７２６（
１９７６）に議論されており、１価アルコールのこはく
酸無水物によるエステル化〔アブラハムおよびグローバ
ー、プリンシプルズ・オブ・コンペテイテイブ・プロテ
ィン−パインディング・アセイズ、オデールおよびドー
ガディ株、ジェイｅビー・リピンコット・カンパニー（
フィラデルフィア１９７１）　１４０〜．１５７ページ
（Ａｂｒａｈａｍ　ａｎｄＧｒｏｖｅｒ　、Ｐｒ１ｎｃ
ｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ−ＢｉｎｄｉｎｇＡｓｓａｙｓ、ｅｄ、　０ｄｅ
ｌｌ　ａｎｄ　Ｄａｕｇｈａｄａｙ、Ｊ、　Ｂ、　Ｌｉ
ｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ、（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　
１９７１）ｐｐ、　１４０〜１５７））、ケトン基とカ
ルボキシルメチルヒドロキルアミンの反応によるオキシ
ムの形成〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　２３４　：
１０９０（１９５９））、クロロ酢酸塩を用いたカルボ
キシル基のフェノール残基への導入〔サイエンス（５ｃ
ｉｅｎｃｅ）１６８　：１３４７　（１９７０））、お
よびジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ）２３５　：　ｉｏ５】
（１９６０）に記載の方法によるジアゾ化されたｐ−ア
ミノ安息香酸へのカップリングが含まれる。

上述した一般的な反応の図式を、リガンドがヨードチロ
ニンチロキシンであるＦＡＤ標識共役体（すなわち、（
ｃｏ）Ｌが、β１およびβ２が共にヨウ素原子である一
般式〔■〕の化合物である。）のエチルアナローブ（ｎ
＝２）およびヘキシルアナローブ（ｎ＝６）の合成につ
いての以下の記載により例示する。

１、　エチルアナローブ １−Ｉ　標識共役体の調製 プリン（ＩＶ） １３．５６　ｆ　（４１，５ｍｍｏｌ）の６−りｏｏ−
９−（２’。

３′−〇−イソプロピリデンーβ−Ｄ−リボフラノシル
）プリン（ＩＩＩ）　（ハンプトン等、ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｈａｍ−ｐ
ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ａｍ−Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、
）　８３　：　１５０　（１９６１））を過剰（７５ｍ
／）の冷１，２−ジアミノエタンに撹拌下１５分間にわ
たって添加した。得られた溶液を室温に２４時間放置し
た。この溶液を真空蒸発させ、得られた黄色油状物を５
０　ｍｌ！の冷飽和炭酸水素ナトリウムと共に撹拌した
。この混合物を真空蒸発させ、得られた残渣をまず５０
ｍ／の水で３回、次いで５０　ｍ／の２−プロパツール
で４回さらに繰り返し真空蒸発させて１５Ｆの黄色ガラ
ス物質を得た。３ｆのガラス物質を少量の水に溶解させ
、次いで２５Ｘ５５ｃｍのアンモニウム形のダウｘツク
：ｘ、　（Ｄｏｗｅｘ）　５０Ｗ−Ｘ２陽イオン交換カ
ラム〔アメリカ合衆国、カリホルニア、リッチモンドの
バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ　−ＲａｄＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、　
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　ＵＳＡ）　）（７）頂部に置い
た。

このカラムをそれぞれ２１の水と０．５Ｍの炭酸水素ア
ンモニウムを用いて得られる直線勾配溶離液により溶出
した。次いで０．５Ｍと１．０　Ｍの炭酸水素アンモニ
ウムそれぞれ２１！を用いて得られる直線勾配溶離液を
用いて溶出した。このカラムからの溶出ｉＱを１９ｍ／
のフラクションに集め、シリカゲル薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）プレート　〔西独、ダームシュタットの
イー轡メルック（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）　）を用いてエタ
ノールと水酸化アンモニウムの９　：　ｌ　（ｖ：ｖ）
混合物で溶離して測定した。この展開したＴＬＣプレー
トを紫外線照射下で試験し、次いでニンヒドリン試薬〔
ランデラス、薄層クロマトグラフィー、アカデミツク１
プレス（Ｒａｎｄｅｒａｔｈ　、　Ｔｈ１ｎ　Ｌａｙｅ
ｒＣｈｒ６ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ）　（１９６６）　）を噴霧した。カラム
クロマトグラフィーのＮα２５０〜３５０フラクシヨン
を合わせ、真空蒸発させて目的のプリン［ＩＶ）を１．
５ｆの淡黄色の非晶性ガラス状物質として得た。

分析：Ｃ１，Ｈ２２Ｎ６０４として 計算値：　Ｃ，５１，４２；Ｔ（，６，３３；Ｎ、２３
．９９実測値：　Ｃ，５０，９２；Ｈ，６，５４；Ｎ、
　２３．０１ＮＭＲ（６０ＭＨ２，ＣＤＣｌ５）　：δ
１．３７（Ｓ、３Ｈ，イソプロピリデン）　、１．６３
　（Ｓ、３Ｈ，イソプロピリデン）、５．９２　（ｄ　
、　ＩＨ，１’−リボース）　、７’９０　（Ｓ　、　
ＩＨ，プリン）、８．２６（ｓ、ＩＨ，プリン） 旋光度〔α）ｆｉ＝　−７４，８５°（Ｃ＝１．０　、
０Ｈ３０Ｈ）１２１の残りの未精製の生成物を上述のよ
うにＤｏｗｅ＋ｃ　５０　Ｗ　−Ｘ　２を用いてクロマ
トグラフィーによって精製した。総収量は８Ｆ（収率：
５５％）であった。

［ＶＩ　） この化合物をブランクの方法〔ジャーナル・オブ・ファ
ーマス−ティカル・サイエンス（Ｂｌａｎｋ　。

Ｊ、　Ｐｈａｍ、　Ｓｃｉ、）　５３　：　１３３３　
（１９６４））によって調製した。

０℃に冷却し、かつ撹拌した５　ｆｌ　（６，４ｍｍｏ
ｌ）のし−チロキシン［米国、ミズーリ、セントルイス
のシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍ−ｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓ
ｓｏｕｒｉ　Ｕ　ＳＡ］を含有する６０ｍ１！の乾燥酢
酸エチルに１１．５ｍｌ！のトリフルオロ酢酸および１
．９　ｍｌのトリフルオロ酢酸無水物を添加した。３０
分後、この得られた清澄な溶液を３０ｍ１の水で３回、
５％炭酸水素ナトリウムで１回、５０　ｍｌの飽和塩化
ナトリウムで２回洗浄した。この合わせた水性洗液を２
０ｍ／の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を合
わせ、３０ｍ１の水で洗浄し、次いで硫酸マグネシウム
で乾燥させた。

この乾燥した酢酸エチル溶液を真空蒸発させて白色固体
を得た。エチルエーテルと石油エーテルの混合物で再結
晶して、融点２２８〜２３０’Ｃ（分解）を有する３、
９５ｇの桃白色の固体（収率ニア０．５９６）を得た。

分析：　Ｃ，７Ｈ，ｏＦ３Ｉ４Ｎｏ５として計算値：　
Ｃ，２３，３９；Ｈ，１，１５；Ｎ、　１．６０実測値
：　Ｃ，２３，００；Ｈ，１，０５；Ｎ、１．６５ＮＭ
Ｒスペクトル（６０ＭＨｚ、ＤＣＯＮ（ＣＤ３）２）：
δ７．２８（ｓ　、　２　Ｈｈ芳香環）　、８．０３　
（Ｓ、２Ｈ，芳香環）　、９．７　（ｍ、ＩＨ，アミド
基）工Ｒスペクトル（ＫＣｌ）ｃｍ−’　：　１７００
　（＞Ｃ＝Ｏ）旋光度〔α）Ｄ　＝−１４，９７°（Ｃ
＝　１．０　、ジメチルスルホキサイド） ２次の再結晶により融点２２４〜２２８℃（分解）の０
．９５ｇの第２の沈澱物を得た。総収量は８７．５％で
あった。

８．７２　ｆ　（１０，０ｍｍｏｌ）のａ−（Ｎ−）リ
フルオロアセチル）アミノ−β−〔３，５−ショート−
４−（３’、５’−ショート−４′−ヒドロキシフェノ
キシ）フェニル〕　プロピオン酸（Ｖｌ）と３．８６　
Ｆ　（１１，０ｍｍｏｌ）の６−（２−アミノエチル）
アミノ−９−（２’、　３’−Ｏ−イソプロピリデン−
β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（ＩＶ）を５０ｍ／の
乾燥ジメチルア、セトアミドに溶かした溶液を一２０℃
、乾燥アルゴン雰囲気中で；ｊ、’Ｊ製した。この冷却
しかつ撹拌した溶、液に、３、０４９　（１１０ｍｍｏ
ｌ）　（７）ジフェニルホスホリルアジド〔米国、ライ
スコンシン、ミルオーキーのアルドリッチ・ケミカル・
カンパニー（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
　、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ　、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　
Ｕ　ＳＡ　）を１０ｍ１の乾燥ジメチルアセトアミドに
溶かした溶液を添加し、次いで１．６　ｍｌ　（］　１
０　ｍｍｏｌ　）　（Ｄ乾燥）！Ｊｌ−ルアミンを添加
した。この溶液を室温に２２時間放置した。この溶液を
、撹拌下３００　ｍｌの０℃に冷却した水に滴加した。

この得られた白色沈澱物を濾過して集め、５６℃で真空
乾燥して１３ｆの淡いクリーム色の固体を得た。この固
体を５００ｍ１のアセトンに溶解し、この溶液を沸騰さ
せて濃縮した。この沸騰したアセトン溶液より沈澱した
白色固体を熱病過により集めた。

この流液を絶えず排脱させるとさらに２つの別別の沈澱
物を得た。この３つの沈澱物を合わせて融点１９８〜２
００°Ｃ（分解）の白色固体８ｇ（収率：６６．６％）
を得た。

計算値：　Ｃ，３１，８９；Ｈ，２，５］　；Ｎ、　８
．１４実測値：　Ｃ，３１，９５；Ｈ，２，６０；Ｎ、
　７．８６ＮＭＲスペクトル〔２２０ＭＨ２（ＣＤ３）
２Ｓｏ〕　：　δ　１，３２（Ｓ、３Ｉ（、イアプロピ
リデン）　、１．５５　（Ｓ。

３Ｈ，イソプロピリデン）　、６．１４　（ｄ　、　Ｉ
Ｈ。

１′−リボース）　、７．０２　（Ｓ、２Ｈ，チＯキシ
ン）　、７．８２　（Ｓ　、　２Ｈ，チロキシン）　、
８．２５（Ｓ、ＩＩ（、プリ７）　、８．３６　（Ｓ　
、ＩＨ，プリン）　、８．４１　（ｔ、ＩＨ，Ｊ＝６．
アミ　ド）、９．６４　（ｄ　、　ＩＨ，Ｊ＝ｓ　、　
）リフルオロアセトアミ　ド） 旋光度（ａ　）Ｄ−−１１，８２°（Ｃ＝１．０．ピリ
ジン）］、　２　ｆ　（１，０ｍｍｏｌ）のＮ−（２Ｃ
Ｎ−（）　リフルオロアセチル）　３，３’、５．５’
−テトラヨードチロニルコアミノエチル）−２’、３’
−０−インプロピリデンアデノシン〔■〕を１０ｍ／の
乾燥リン酸トリエチルに溶かした溶液を０℃、乾燥アル
ゴン雰囲気中で調製した。この冷却し、かつ撹拌した溶
液に０．４５　ｍｌ　（５ｍｍｏｌ　）のオキシ塩化リ
ンを添加した。

得られた溶液を０℃に２４時間保ち、ついで１１の氷水
中に撹拌しながら滴加した。得られた沈澱物を濾過によ
り集め、真空乾燥して１．２３９の白色固体を得た。こ
の固体をアセトンに溶解し、０．３２　ｍｌ　（２，２
ｍｍｏｌ　）　（Ｄ　トリエチルアミンを添加シた。沈
澱物が生成した。この混合物を真空蒸発させ、得られた
残渣を乾燥アセトンで浸出し、次いで乾燥メタノールお
よび乾燥エタノールの混合物から再結晶して融点１７３
〜１８３℃（分解）を有する白色固体３９０ｍＪ（収率
：２７．８９６）を得た。

分析”３８Ｈ４８Ｆ３Ｉ４Ｎρ、２Ｐとして計算値：　
Ｃ，３２，５０；Ｈ，３，４５；Ｎ、７．９８実測値：
　Ｃ，３２，２４；Ｈ，３，０８；Ｎ、　７．５８ＮＭ
Ｒスペクトル〔６０ＭＨ２，（ＣＤ３）２ＳＯ〕　：　
δ１．５３（ｓ、３Ｈ，イソプロピリデン）、６．２（
ｄ。

Ｉ　Ｉ−Ｉ　、　１’Ｈ−リボース）　、７．１　（Ｓ
、２Ｈ，チロキシン芳香環）、　８．２７　（Ｓ　、　
ＩＨ，プリン）、８．５２　（Ｓ　、　ＩＨ，プリン） 旋光度Ｃａ　）Ｄ−−１７，５０°（Ｃ＝１．０　、　
ＣＨ３０Ｈ）２００　ｍｆ　（０，１４ｍｍｏｌ　）の
Ｎ−（２−（Ｎ−（）　リフルオロアセチル）−３，３
’、５．５’−テトラヨードチロニルコアミノエチル）
−２’、３’−０−イソプロピリデン−５′−アデニル
酸のモノトリエチルアミン塩−１水和物〔〜■〕を０℃
の１ｍｌの水に懸濁し、次いで９ｍｊ’のトリフルオロ
酢酸を撹拌しながら滴加した。

３０分後、清澄な溶液を得た。この溶液をさらに０℃に
１５時間保ち、次いで３０℃で真空蒸発させた。得られ
た残渣を２５℃で２０ｍ１！づつの乾燥エタノールで４
回真空蒸発させ、次いで２５℃で真空乾燥させて白色固
体を得た。

この固体を１０ｍ１！の冷メタノールと共に３０分撹拌
し、次いで沖集し、２５℃で真空乾燥して、１８８℃以
上で分解しながらゆっくり融解する白色固体１３５ｍｇ
（収率ニア６％）を得た。

分析：　”２９Ｈ２□Ｆ３■４Ｎ７０□１Ｐとして計算
値：　Ｃ，２７，９７；Ｈ，２，１９；Ｎ、　７．８７
実測値：　Ｃ，２８，１１；Ｈ，２，３１；Ｎ、７．６
５ＭＭＲスペクトル〔２２０ＭＨ２，（ＣＤ３）２ＳＯ
〕　：δ５．９５（ｄ、ＨＬＩ’−リボース）　、７．
０４　（Ｓ　、　２Ｈ。

チロキシン芳香環）、７．８４　（Ｓ　、　２Ｈ，チロ
キシン芳香環）　、８．２５　（Ｓ　、　ＩＨ，プリン
）、８．３６　（Ｓ　、　ＩＨ，プリン）　、８．４３
　（ｍ、ＩＨ。

アミド）　、９．６６　（（］　、１８．）リフルオロ
アセトアミド） 旋光度〔α）Ｄ　−−２，７２°（Ｃ＝１．０．ピリジ
ン）フラビンアデニンジヌクレオチド−チロキシン共役
体（Ｘ） ４９８　ｍｆ　（０，４ｍｍｏｌ　）のＮ−（２−［Ｎ
−（トリフルオロアセチル）−３，３’、５．５’−テ
トラヨードチロニルコアミノエチル）−５’−アデニル
酸（ＩＸ）ｔ−１０ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミドに
溶解し、これに９６μｌ　（０，４ｍｍｏｌ　）のトリ
ーｎ−ブチルアミンを添加し、次いで３２０　ｍｆ　（
２，、Ｏｍｍｏｌ　）の１，１′−カルボニルジイミ゛
ダゾールを添加した。脱湿下、室温で１８時冊撹拌した
後、２８０μｌの水を添加し、次いで溶媒を真空蒸発さ
せた。

得られた油状物を１０ｍ１！の乾燥ジメチルホルムアミ
ドで４回繰り返し真空蒸発させて乾燥させた。

得られたホスホイミダゾリデートを１０ｍ１！の乾燥ジ
メチルホルムアミドに再び溶解し、リボフラビン−５′
−モノリン酸のトリーｎ−オクチルアミン塩を１０ｍ＃
の乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした３、４　ｍｍｏ
ｌ溶液に滴加した。１９２　ｍｆ　（０，４ｍｍｏｌ　
）のりボフラビンー５′−モノリン酸のアンモニウム塩
を１０ｍＪの水に溶解させた溶液を、１７６μｌ（０，
４ｍｍｏｌ　）のトリーローオクチルアミンを１００ｍ
Ｊのアセトンに溶かした溶液に撹拌下で添加して塩を調
製した。３０分後、得られた混合物を真空蒸発させた。

この残渣を乾燥ジメチルホルムアミドより繰り返し真空
蒸発させることにより乾燥させて塩をオレンジ色の固体
として得た。

リン酸イミダシリン（ＩＸ）とりボフラビンー５′−モ
ノリン酸塩を含有する上記溶液を、２４時間後、等分し
、一方を真空蒸発させた。得られた残渣を、ジメチルホ
ルムアミドとＩＭのｐＨ７，５の炭ｍ水素）！ｊエチル
アンモニウムド（７）　１９’：　］　（ｖ　：　ｖ）
混合物中で、１８時間、予め膨潤させた１００ｇのセフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｉ、：［（−２０（
スｘ−デン国、ウプサラのファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）］より
調製した２、　５　Ｘ　７８ｃｍのカラムを用いてクロ
マトグラフに付した。このカラムを上記１９：１（Ｖ　
：　Ｖ）の混合物で溶出し、１０ｍｆのフラクションを
集めた。このカラムの溶出液をシリカゲル６０シラン化
ＲＰ−２ＴＬＣプレート（西独、グームシュタットのイ
ー・メルツク社製）を用いて溶出して測定した。

このＴ　Ｌ　Ｃプレートを、アセトン、クロロポルム、
メタノール水およびトリエチルアミンの４０：４０：２
５：１：１の混合物を用いて展開した。

上述のカラムクロマトグラフィーのＮα１１〜１７のフ
ラクションを合わせ、次いで真空蒸発させた。

この残渣を０．３　Ｍの炭酸水素アンモニウムで１８時
間予め膨潤させた１２５ｆの５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−
２０より調製した２、　５　Ｘ　７５　ｃｍのカラムを
用いてクロマトグラフに付した。このカラムを０．３Ｍ
の炭酸水素アンモニウムで溶出し、１０ｍ１！のフラク
ションを集めた。この溶出液を２５４ｎｍにおける紫外
線吸収によって測定した。

フラクションの容量をＮ０１５０から２０　ｍｌに増加
させた。この溶離液の塩濃度を下記のように、すなわち
、フラクションＮｏ、　２９５では０．１５Ｍの炭酸水
素アンモニウム、フラクションＮα３７６では０．０７
５Ｍの炭ｍ　水素アンモニウム、フラクションＮｏ、　
４３０では水のように段階的に減少させた。合計で４８
０個のフラクションを集めた。Ｎｏ、　２００〜２３５
のフラクションを合わせ、真空蒸発させて標識共役体〔
Ｘ〕を黄色−オレンジ色の残流として得た。

この残渣のアルカリ性水溶液は以下の波長、すなわち２
６６ｎｍ、３５０ｎｍ、３７３ｎｍおよび４５０ｎｍに
おいて紫外線吸収極大値を示した。４５０ｎｍにおける
吸収から計算した収率は約５％であった。

ヘビＱ　（Ｃｒｏｔａｌｕｓ　Ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）
より単離したホスホジエステラーゼ〔米国、ニューシャ
ーシー、フリーホールドのツーシントン・バイオケミカ
ル−コーポレーション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　。

Ｆｒｅｅｈｏｌｄ　、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　ＵＳＡ
）　）は上記生成物をリボフラビン−５′−モノホスフ
ェートとブロッキング基テするトリフルオロアセチル基
が除去されたチロキシン置換５′−アデニル酸〔１ｘ〕
に加水分解した。

１−１１１　チロキシンの結合試験法 上記の調製した標識共役体を非蛋白基標識特異的結合試
験法に以下のように用いた。（このような試験法につい
ては、先に参照した米国特許出願９１７．９６１号にさ
らに詳細に示されている。）Ａ、アポグルコースオキシ
ダーゼの調製米国、インヂアナ、エルクハードのリサー
チ・プロダクツ・ディビジョン・オブ・マイルス・ラボ
ラトリーズ−インコーホレーテッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｌｅ
ｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｅｌｋ−
ｈａｒｔ　、　Ｉｎｄｉａｎａ　ＵＳＡ　）より入手し
た低カタラーゼ活性を有する精製グルコースオキシダー
ゼを３０容の０．５％（Ｗ　：　Ｖ）マンニトールに対
して１２時間それぞれ２回透析した。１００ｍｇのグル
コースオキシダーゼを含有する一定量の透析液を凍結乾
燥して一２０℃で保存した。

２００　ｍｌｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を、濃硫
酸でｐＨ１，６，に調製した１２ｍｊ’の水に溶解し、
１５０ｍｆ！の木炭［：米国、ニューヨーク、オレンジ
バーブのシュパルツーマンのＲＩ　Ａ　クレード（ＲＩ
Ａｇｒａｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｓｃｈｗａｒｚ−Ｍａｎｎ、
　Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＵＳＡ　
）　）と混合し、次いで０℃に冷却した。１００ｍｇの
凍結乾燥したグルコースオキシダーゼを３，１ｍｌの水
に再度溶解し、その３ｍｌを、３分間続けて撹拌しなが
らアルブミン−木炭懸濁液に添加した。次いでこの懸濁
液を、５０　ｍｌの使い捨て可能なプラスチック製シリ
ンジ上スウイーネツクス（Ｓｗｅｅｎｅｘ）流過装置〔
ミリボアーコーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃ
ｏｒｐ、））に装着された０、８μ、直径２５　ｍｍの
ミリボア　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）−フィルター〔米国
、マサチューセッツ、ベッドフォードのミリボア・コー
ポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　ＵＳＡ　）　）によッテ
Ｆｘ過した。コ（７）？戸液に、２ｍｌの０．４Ｍのリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，６）を添加した後、５Ｎ水酸化
ナトリウムを添加してｐＨ７，０に迅速に中和した。次
いで、１５０ｍＦの乾燥木炭を添加し、０℃で１時間撹
拌した。得られた懸濁液をまず０．８μのミリボア・フ
ィルターにより流過し、次いで０．２２μのミリボア・
フィルターにより流過した。この原液に、グリセロール
を２５％（ｖ　：　ｖ）まで添加し、安定化したアポグ
ルコースオキシダーゼ調製物を４℃で保存した。

Ｂ、試薬試験 １、標識共役体−上記ｓ−１のように調製したエチルア
ナローブ標識共役体を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７）中で１μＭの濃度に希釈した。

２、　アポ酵素−アポグルコ”−スオキシダーゼを０、
１　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７＞によシ０．６μＭのＰ
ＡＤ結合部濃度に希釈した。このアポ酵素調製物のＦＡ
Ｄ結合部濃度は、アポ酵素でインキュベートするときグ
ルコースオキシダーゼの最、大の活性を得るために要す
るＦＡＤの最小量を測定することによシ、実験的に決定
した。

３、　不溶化抗体−マーチ等、アナリテイカル・バイオ
ケミストリー（Ｍａｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　６０　：　１１９　（１９７４
）の方法に従って臭化シアン（ブロム・シアン゛）によ
って活性化したセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）４
　Ｂゲル〔スウェーデン、ウプサラのファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｊａ　Ｆｉｎｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）　）の洗浄した湿った
ケーキを、８５りの抗体（チロキシン−牛血清アルブミ
ン共膜体に対して抗血清より単離されたもの）を２０ｍ
１の０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解さ、
せた溶液に添加し、４℃で３６時間ゆつくシ攪拌した。

カップリング反応完了後、１ｍｌの１Ｍアラニンを添加
し、４時間以上続けて攪拌して未反応部をブロックした
。得られたセファロース結合抗体を、焼結ガラス涙過器
上で、それぞれ４００ゴの５０ｍＭ酢酸ナトリウム−５
００ｍＭ塩化ナトリウム（Ｐ）Ｉ５）、５０ｍＭリン酸
塩緩衝液−５００ｍＭ塩化ナトリウム及び８００−の１
００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）を用いて洗浄した。

次いで、この湿った濾過ケーキを０．０１％ナトリウム
アジドを含有する１００ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７
）に懸濁して２２ｍ１の約５０％懸濁液を得た。

４、　標準溶液−５ｍＭの水酸化ナトリウムに溶解した
チロキシンの１．１５ｍＭ保存溶液を０．１　Ｍリン酸
塩緩衝液（ｐＨ７）で２μＭに希釈した。

５、　測定試薬−グリコースオキシダーゼ試験試薬を、
１３０μノ当シ以下の混合物、す′力わち、０、１　Ｍ
　ＩＪン酸塩緩衝液（声７）に溶解し尤１．２■／ｒｒ
Ｌｌのペルオキシダーゼ〔米国、ミズーリ、セントルイ
スのシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉ　ＵＳＡ））の溶液２５μ１１水に溶解した１
　０　ｉｎ　Ｍ　４−アミノアンチピリン５μノ溶液、
０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）に溶解した２５ｍＭ
３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸
塩の溶液２０μ７，０．１ＭＩＪン酸塩緩衝液（ｐＨ７
＞に溶解した１　６、５　Ｘ牛血清アルブミンの溶液３
０μｌおよび安息香酸飽和水溶液に溶解した１Ｍグルコ
ースの溶液５０μｌを含有するように調製した。

Ｃ０試験法 １５０μｌの不溶化抗体懸濁液、８０μｊの標識共膜体
溶液、反応混合物中における種々のチロキシン濃度を与
えるだめの種々の量のチロキシン標準溶液、および充分
な量のＯｌＩ　Ｍ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ７）を混合し
て総量５００μノとすることによシ調製した。この反応
混合物を２５℃で２時間攪拌しながらインキュベートし
た。各反応混合物を、ガラス繊維の栓をし、過ヨウ素酸
塩とエチレングリコール溶液で順次子め処理した乾燥パ
スツールピペットによって真空濾過して起こシ得るＦＡ
Ｄの汚染を予防した。３００−の各ろ液に１３０／ｊｌ
の測定試薬と５０μノのアポ酵素溶液を添加した。１時
間後、各反応混合物の吸光度を５２０　ｎｍで測定した
。

Ｄ、結果 以下の表−３にチロキシンの測定の試験結果が示されて
いる。この吸光度は、アポ酵素溶液（吸光度：０．５２
２）の残シの酵素活性および抗体懸濁液（吸光度：０．
１４２）中の内因性ＦＡＤのだめに補正した２回の実験
の平均として表現した。

表−３ チロキシン標準添加量（μｌ）　吸光度（５２０ｎｍ）
０　０．２３３ ２ｓ　Ｏ，２１１ ７５０，２８１ ２５００，２８に の結果は、この標識共役体が液状媒体中のリガンドを測
定するだめの特異的結合試験法に有用であることを示し
ている。

２、　ヘキシルアナローブ ２−１　標識共役体の調製 １６、Ｏｆ　（５０ｍｍｏｌ）の６−クロロ−９−（２
’、　３’−０−インプロピリデン−β−Ｄ−リボフラ
ノシル）プリン（−ＩＦ）　（ハノットン等、ジャーナ
ル・オプ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｈａｍ
ｐｔｏｎ　ｅｔ　ａｌＩＩＪ、　Ａｍ、　Ｏｈｅｍ、　
Ｓｏｃ、　）８３　：１５０１　（１９６１））を攪拌
下、５８１Ｆ（５００ｍｍｏ＋）の新たに蒸留した１、
６−ジアミツヘキサンの融解した試料（７０℃）に添加
した。この反応混合物をアルゴン雰囲気下、４０℃で１
８時間攪拌した。過剰のジアミンを減圧（６０℃、１゜
Ｈｇ　）蒸留によシ除去した。得られた淡黄色残渣を１
５０ｔのシリカゲル６０〔西独、ダームシュタットのイ
ーーメルック（Ｌ　Ｍｅｒｃｋ　。

１）ａｒｍｓｔａｄｔ　、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ
　）　）上に吸着させ、かつそれを覆うためにクロマ′
トゲラフ用無水エタノールと炭酸水素トリエチルアンモ
ニウム塩（ｐｈｒ７．５．ＩＭ）の９：１（ｖ：ｖ）混
合物を用いた。

このカラムを上記９：１（Ｖ：Ｖ）の混合溶媒で溶出し
、２０ｍ１づつのフラクション９ｏｏ４ＥＡｋ集めた。

このフラクションを無水エタノールと炭酸水素トリエチ
ルアンモニウム塩（ｐＨ７，５，ＩＭ）Ｑ７：３（ｖ：
ｖ）混合物で溶出しながらシリカゲル６０を用いた薄層
クロマトグラフィ（ＴＬＯ）にＬシ試験した。カラムク
ロマトグラフィからの煮３９１〜９００のフラクション
を合わせ、蒸発させて１５．０　ｇのガラス状残渣（収
率ニア４％）を得た。この残渣の１ｇの試料を少量のメ
タノールに溶解させ、メタノールで予め膨潤させ−ｆｃ
８０ｇのセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　ＬＨ
−２０（スウェーデン、ウプサラのファルマシア・ファ
イン―ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｏ
ｈａｍｌｃａｌａ、Ｕｐｐｇａｌａ８ｗｅｄｅｎ　））
より調製したカラムの頂部に族シタ。

このカラムをメタノールで溶出した。合計で９゜個の８
−づつのフラクションを集めた。このフラクションを、
無水エタノールと炭酸水素トリエチルアンモニラＡ　（
ＰＨ７，５、ＩＭ）の７　：　３　（ｖ：ｖ）の混合物
で溶出しながらシリカゲル６０のＴＬＯによって試験し
た。カラムクロマトグラフィーのＡ１９〜２７のフラク
ションを合わせ、真空蒸発させて９１０■（９１チ回収
）の白色ガラス状物質を得た。

分析：　０１９Ｈ３ＯＮ＋１０４　として計算値：０，
５６．１４：Ｈ，７，４４；Ｎ。

２０、６８ 実測値：０，５Ｂ、９１；Ｈ，７，３３；Ｎ。

１９．１８ ＮＭＲスペクトル（６０ＭＨｚ　、０ＤＯＩｓ　）：　
δ１，４゜（ｓ、３Ｈ，インプロピリデン）、５．９８
（ｄ、ＩＨ。

１′−リボース）、７．９２　（ＩＩ　ｌ　ＩＨｔプリ
ン）。

８．３６（ｇ、ＩＨ，プリン） 旋光度〔α〕雷＝−５０，１１’　（０＝１．０　、メ
タノール）Ｎ−（６−（Ｎ−（）リフルオロアセチル）
　−”　＋　３’　＃　５　ｚ　５’上述のｚ−Ｉで記
載したように調製した４、３６．１７（５，０ｍｍｏｌ
）のα−（Ｎ−トリフルオロアセチル）アミノ−β−〔
３，５−ショート−４−〔３／　、　５／　−ショート
−４′−ヒドロキシフェノキシ）−フェニル〕プロピオ
ン酸（Ｖ［）、２．２４　ｇ（５，５ｍｍｏｌ）の６−
（６−アミンヘキシル）アミノ−９−（２’、３’−０
−イソグロビリデンーβ−Ｄ−リボフラノシル）プリン
（ＩＶ）を１００ｍ１！の乾燥ジメチルホルムアミドに
溶かした溶液を一２０℃で乾燥アルゴン雰囲気下調製し
た。この冷却し。

かつ攪拌した溶液を、１．５２７７　（５，５ｍｍｏｌ
　）のジフェニルホスホリルアジド〔米国、ウィスコン
シン、ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル・カン
パ＝　−（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｏｏ、
　、Ｍｌ１ｗａｕｋｅ＠ｔＷｉａｃｏｎａｉｎ　ＵＳＡ
　）　：）の５０ｍ／の乾燥ジメチルホルムアミド溶液
を添加し、次いで０．８　ｍｌ　（５，５ｍｍｏｌ）の
乾燥トリエチルアミンを添加した。この溶液を室温で２
２時間放置した。次いで、この溶液を６ｏｏｍｌの冷水
（０℃）に攪拌下部下した。

得られた白色沈澱物を濾過して集め、６０℃で真空蒸発
させて、４．９，９（収率ニア８％）の白色固体を得た
。この固体試料をアセトンと水の混合液がら再結晶して
融点２０５〜２０７℃（分解）の白色固体を得た。

分析：　０ｓｓＨｓｓＦｓ　ＩａＮｙＯｓとして計算値
：　０，３４．２８；Ｈ，３，０４；Ｎ、７．７７実測
値：　０，３４．２２：）（，２，９９；Ｎ、７．４１
マススペクトル（２（ｌｒｎａ　）　ｍ／　ｅ　：　１
２６２　（ＭＨ）　ｅｌ　１　ｅ　４　（Ｍ”−０００
Ｆｍ　）１水和物　〔■〕 １．８９ｇ　（１，５ｍｍｏｌ）のＮｉ６−［：Ｎ−（
）リフルオロアセチル）　”’　”　＋　３’　ａ　５
ｙ　５’−テトラヨ−ドチロニル〕アミノヘキシル）−
２’、３’−０−イソプロビリデ／アデノシン（Ｖ）を
１５−の乾燥リン酸トリエチルに溶かした溶液を一１０
℃で乾燥アルゴン雰囲気下で調製した。得られた沈澱物
を濾過により集め、Ｘ空乾燥して１．９１ｇ（収率：８
７チ）の白色固体を得た。この固体を１０＋＋Ｌｌのメ
タノールに溶解させ、　０．３８　ｒｔｔｌ　（２，６
ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加した。この溶液を
真空蒸発させ、得られた残渣をメタノールとエチルエー
テルの混合物で再結晶して融点１５１〜１５４℃（分解
）の白色固体７２ｏｑ（収率：３３％）を得た。

分析：　０４＊ＨｓｓＦｓＩ４ＮｓＯｓｚＰとして計算
値：　０，３４．５４：ＩＩ、３．８６：Ｎ、７．６７
尖測値゛：　０，３５．２４；Ｈ，３，８８；Ｎ、７．
７５マススペクトル（２０ｍｍ）ｍ／ｅ　：　１３４２
　（ＭＨ）。

１２４４　（Ｍ　−０００Ｆ、　） ５−− 旋光度〔α）　１７．２０°（Ｑ＝ｌ、Ｑ　、　０Ｈ３
０Ｈ）− Ｎ−（６−（Ｎ−（）リフルオロアセチＡ＜）　−３、
３’　、　５　、５’（ＩＸ） ６０　（１＋ｙ　（０，４１ｍｍｏｌ）のＮ−（６−（
Ｎ−（トリフルオロアセチル）　−３、３’　、　５　
、５’−テ）　５ｒ　ヨー　１’チロニル〕アミノヘキ
シル）　−２／　、　３／−〇−イングロビリデンー５
′−アデニル酸モノトリエチルアミン塩・１水和物〔■
〕を０．６−の水（０℃）に懸濁し１次いで６ゴのトリ
フルオロ酢酸を攪拌下滴加した。５０分後湾澄な溶液を
得た。

この溶液を０℃に１５分間さらに保ち１次いで３０℃で
真空蒸発させた。得られた残渣を２ｏｍ／容の無水エタ
ノールで５回真空蒸発させ１次いで３０ｄの水と共に、
すりつぶし少量のメタノールで洗浄した。得られた白色
固体４３０■をメタノールから再結晶して融点ｉｓｏ〜
１８３℃（分解）の白色固体２９０　ｗｒｙ　（収率：
５４．６チ）を得た。

分析：　０ｓｓＨｓｓＦｓＩｉＮ７ＣｈｔＰとして計算
値：　０，３０．４６；Ｈ，２，７１；Ｎ、７．５４実
測値：　０，３０゜７７　；）Ｌ　２．５５　：Ｎ、　
７．２９マススペクトル（２０ｍｍ）ｍ／ｅ：１３０２
（Ｍ）Ｉ　）１２０４（Ｍ　−０００Ｆ３　） フラビンアデニンジヌクレオチド−チロキシン共役体　
（Ｘ）１３０．１３　ｍｆ　（０，１ｍｍｏｌ　）のＮ
−（６−（Ｎ−（トリフルオロアセチル）　−３、３’
　、　５　’、　５’−テトラヨードチロニル〕アミノ
ヘギシル）　＋　５７−アデニル酸（■）＆アルゴン雰
囲気下に１にいた。この試料に、１４μノ（０，１ｍｒ
ｎｏｌ　）のトリエチルアミン′ｆｉ：１ｒｆＬｌの乾
燥ジメチルホルムアミド溶液１　ｍｌに溶かした溶液を
加え５次いで１６．２　ｔｒｙ　（０，１ｍｍｏｌ）の
１，１′−力ルボニルジイミダゾール＜　ｔ　ｍＡ’の
乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を添加した。

２４時間後、１６，２〜の１，１′−力ルボニルジイミ
ダゾール全１−の乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした
溶液の第２の等量溶液を添加した。

骸湿下に、室温で、計４８時間上記反応を進行させた。

４７．３　ｍｇ　（０，１ｍｍｏ’ｌ）のりボフラビ／
−５′−モノホスフェートのアンモニウム塩試料全上記
１−１に記載したように相当するトリーｎ−オクチルア
ミン塩に変化させた。この塩を３−の乾燥ジメチルホル
ムアミドに溶解させ、中間体であるアデニル酸のホスホ
ルイミダゾリデー）　（ＤＯを含有する上記溶液に添加
した。

得られた溶液を室温で、除湿した暗所で２４時間放散し
た。この溶媒を真空蒸発させ、得られた残渣を、ジメチ
ルホルムアミドと炭酸水素トリエチルアンモニウム（Ｉ
　Ｍ　、　ｐＨ７，５）の１９：１（ｖ：ｖ）の混合物
で１８時間予め膨潤させた１００ｇの５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｌ）Ｉ−２０より調製した２、　５　Ｘ　７８　ｃｍ
Ｏカラムを用いてクロマトグラフに付した。このカラ°
ムを上記１９：１（ｖ：ｖ）の混合物で溶出し１次いで
５ｄのフラクションを集めた。このカラムからの溶出液
をシリカゲル６０のシラン化した几Ｐ−２のＴＬＯ−プ
レート上で溶出することによシ測定した。このＴＬＯプ
レートをアセトン、クロロホルム、メタノール、水およ
びトリエチルアミンの４０：４０：２５：１：ｉ（ｖ：
ｖ）の混合物を用いて展開した。カラムクロマトグラフ
ィーからのＡ２４〜３８のフラクションを合わせ。

真空蒸発させた。この残渣を、０．１Ｍの炭酸水素アン
モニウム塩で１８時間予め膨潤させた１２５ｇの５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０より調製した２、５Ｘ８５ｃｒ
ｎのカラムを用いてクロマトグラとに付した。このカラ
ムを２人の０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムと２！の水を
用いて直線勾配法で溶出し、２３ゴのフラクショ／を集
めた。この溶出液を紫外線吸収（２５４ｎｍ）により測
定した。Ａｌ７０〜１８２のフラクションを合わせ、真
空蒸発させた。この残渣を０．０５　Ｍの炭酸水素アン
モニウムで予め膨潤させた８０ＩのＳｓ＋ｐｈａｄｅｘ
　ＬＨ−２０１＃）調製した２、５Ｘ５５ｃｒｎのカラ
ムを用いてクロマトグラフに付した。このカラムｆｆ１
２／の０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウムと２ｊの０．０
２Ｍ炭酸水素アンモニウムを用いて直線勾配法により溶
出した。この溶出液を紫外線吸収（２５４ｎｍ）により
測定した。２１の０．２Ｍ炭炭酸水素アンモニア溶出を
続け、２３ゴのフラクションを集めた。合計２５７個の
７ラクシヨンを集メタ。Ａ７０〜１１０のフラクション
を合わせ、真空蒸発させて標識共役体（Ｘ）　ｔ−黄色
−オレンジ色の残渣として得た。

この残渣のアルカリ性水溶液は、以下の波長、すなわち
２７０ｎｍ、３４５ｎｍおよび４５０　ｎｍで紫外線吸
収極大を示した。４５０　ｎｍの吸収よシ計算した収率
は約５％であった。

ヘビ毒（０ｒｏｔａｌｕｓ　Ａｄａｍａｎｔｅｕｓ　）
より単離したホスホジエステラーゼ〔米国、ニューシャ
ーシー、フリーホールドのツーシントン・バイオケミカ
ル・コーポレーション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｌ
ｏｅｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ、＋　Ｆｒｅｅｈｏｌｄ　
、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　ＵＳＡ）は、上記生成物を
リボフラビ／−５′−モノホスフェートド。

ブロックしているトリフルオロアセチル基をすでに除い
たチロキシン置換５′−アデニル酸に加水分解した。

２−１１　チロキシンの結合試験 上記のように調製した標識共役体を以下のように非蛋白
標識化特異的結合試験法に用いた。（このような試験法
に関する説明が、前述した米国特許出願番号９１７，９
６１号にさらに詳細に見出される。） Ａ、　アポグルコースオキシダーゼの調製用いるアポ酵
素を、上記１’−１のＡに記載された方法によって調製
した。

Ｂ、試験試薬 １、　標識共役体□２−１のように調製したヘキシルア
ナローブ標識共役体を０．１　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液（
ｐｉ（７）中で１０　ＯｎＭＯＭ度に希釈した。

２、　アポ酵素□この試薬は、上記１−１［のＢ−２に
記載されたものと同じである。

３、不溶化抗体−この試薬社、上記１−１０Ｂ−３に記
載されたものと同じである。

４、標準溶液□チロキシンを５ｍＭ水酸化ナトリウムに
溶解させた１、　１５　ｍＭの保存溶液を。

０、１　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液（ｐＨ７）中で１μＭに
希釈した。

５、測定試薬□グルコースオキシダーゼ試薬を、その１
１７μｌ当９以下の混合物を含有するように調製した。

すなわち、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（〆１７）に溶解し
た１、２■／１１Ｌｌペルオキクダーゼの溶液２５μ！
〔米国、ミズーリ、セントルイスのシグマ・ケミカル−
カンバ＝　−（Ｓｌｇｍａ　Ｏｈｅｍｌｃａｌｏｏ、　
、　ａｔ、　Ｌｏｕｌｓ　ｒ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　ＵＳ
Ａ）　）、水に溶解１．７’ｃ　１０　ｍＭの４−アミ
ノアンチピリンの溶液５μ４１’、０．１ＭＩＪン酸塩
緩衝液に溶解した２、０ｍＭの３．５−ジクロロ−２−
ヒドロキシベンゼンスルホン酸塩の溶液２０μＡＩ’、
０．１ＭＩＪン酸塩緩衝液に溶解した３０チ牛血清アル
ブミンの溶液１７μ！および安息香酸飽和水溶液に溶解
したＩ　Ｍグルコースの溶液５０μノよりなる。

Ｃ８試験法 ３０μｌの不溶化抗体Ｗ濁液、１００μｌの標識共役体
溶液、チロキシン標準溶液を加えないか又は１００μｌ
のチロキシ／標準溶液および充分な量の０．１　Ｍ　リ
ン酸塩緩衝液を総容量５００μノとなるように混合する
ことにより結合反応混合物を調製した。この反応混合物
を２５℃で２時間振盪しながらインキュベートした。次
いで、起こり得るＦＡＤの汚染を除去するために各反応
混合物を過ヨウ素酸塩およびエチレングリコール溶液で
予め逐次処理したガラス繊維の栓をした乾燥パスツ−ル
ビベットにより真空濾過した。３５０μｌの各溶液に、
１１７μノの測定試薬と５０μノのアポ酵素溶液を加え
た。１時間後、各反応混合物の吸光度を５２０　ｎｍで
測定した。

Ｄ、結　果 チロキシンを測定する試験結果が以下の表−４に示され
ている。吸光度の結果は、アポ酵素溶液（吸光度０．４
６７　）中の酵素残基の活性および抗体懸濁液（吸光度
０．０４１）中の内因性のＦＡＤに対して補正された２
回の実験の平均として表現さ詐ている。

表−４ ００，２３１ １０’ＯＯ，２９５ この結果は１本発明の操識共膜体が液状媒体中のリガン
ドを測定するための特異的結合試験法に有用であること
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 〔式中、Ｘは水素原子又は（Ｃｏ）Ｌを表わし；（Ｇｏ
   ）Ｌは、アミド結合を介し′て結合される特異的に結合
   可能なリガンドまたはその結合アナローブを表わし；ｎ
   は２〜６の整数を表わし；Ｘが水素は一〇−ｐ−ＯＨを
   表わし、Ｒ２およびＲ３が水酸基をＨ １ 表わすときＲ１は−Ｑ−ｐ−ＯＨを表わす。〕Ｈ で示される化合物。 （２）前記の特異的に結合可能なリガンドが抗原または
   それに対する抗体；ハプテンまたはそれに対する抗体；
   またはホルモン、ビタミンまたは薬剤もしくはそれに対
   する受容体または結合物質である特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。 （３）前記の特異的に結合可能なリガンドが抗原性ポリ
   ペプチド、抗原性蛋白質、ハプテンまたは抗体である特
   許請求の範囲第１項記載の化合物。 （４）前記の特異的に結合可能なリガンドが分子量１，
   ０００〜４，０００，０００の抗原性ポリペプチドまた
   は抗原性蛋白質である特許請求の範囲第１項記載の化合
   物。 （５）前記の特異的に結合可能なリガンドが抗体である
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。 （６）前記の特異的に結合可能なリガンドが１００〜１
   ，５００の分子量のハプテンである特許請求の範囲第１
   項記載の化合物。 （７）前記の特異的に結合可能なリガンドがヨードチロ
   ニンホルモンである特許請求の範囲第１項記載の化合物
   。 （８）前記の特異的に結合可能なリガンドがチロキシン
   である特許請求の範囲第７項記載の化合物。 （９）前記の式中、ｎが２である特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。 （１α　前記の式中、ｎが６である特許請求の範囲第１
   項記載の化合物。 （１１）前記の式中、玉Ｃｏ）Ｌが次式：〔式中、Ｙは
   水素原子またはアミノ保護基を表わし；β１およびβ２
   はそれぞれ水芝原子またはヨウ素原子を表わす。〕 で示される基である特許請求の範囲第１項記載の化合物
   。 （１２）　前記の式中、ｎが２である特許請求の範囲第
   １１項記載の化合物。 （１３）前記の式中、ｎが６である特許請求の範囲第１
   １項記載の化合物。 （１４）　前記の式中、Ｙがトリフルオロアセチル基で
   ある特許請求の範囲第１１項ないし第１３項のいずれか
   に記載の化合物。 （１５）　前記の式中、β１およびβ２が共にヨウ素原
   子である特許請求の範囲第１４項記載の化合物。 （１６）　前記の式中、β１およびβ２が共にヨウ素原
   子である特許請求の範囲第１１項ないし第１３項のいず
   れか１こ記載の化合物。