JPS58142257A - 試験試料中の被分析物を測定する特異結合分析法、該分析法に使用する試薬系及び標識複合体 - Google Patents

試験試料中の被分析物を測定する特異結合分析法、該分析法に使用する試薬系及び標識複合体

Info

Publication number
JPS58142257A
JPS58142257A JP1448183A JP1448183A JPS58142257A JP S58142257 A JPS58142257 A JP S58142257A JP 1448183 A JP1448183 A JP 1448183A JP 1448183 A JP1448183 A JP 1448183A JP S58142257 A JPS58142257 A JP S58142257A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analyte
complex
luminophore
label
analog
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP1448183A
Other languages
English (en)
Inventor
ロバ−ト・ト−マス・バツクラ−
ト−マス・エム・リ−
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Corp
Original Assignee
Miles Laboratories Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Miles Laboratories Inc filed Critical Miles Laboratories Inc
Publication of JPS58142257A publication Critical patent/JPS58142257A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異結合分析技術の発展Fi、液体媒体中に極めて低仏
員度で存在する1診断、医学、環境及び工業に重要な1
種々の有機物質を#j定する極めて有用な分析法を提供
した。特異結合分析は。
測定すべき物質(本明細書に被分析物と記す)とその結
合対手との間の特異反応に基づく、被分析物及びその結
合対手の一方が抗体であり。
他方が対応するハプテンまえは抗原である場合。
この分析は免疫分析として知られている。被分析物と結
合対手との他の結合反応は、ホルモン。
ビタミン、代謝産物及び薬剤とそれぞれの受容体及び結
合物質との間の結合反応を含めて、結合分析の基礎とな
る。
常用の特異結合分析用IIにおいて1分析すべき試験試
料を種々の組成の試薬系と液体反応混合物中で混合する
。このような試薬系は通常、(1)被分析物まえはその
特異結合アナローブと標識物質との複合体である標識複
合体及び(暑)被分析物に対する結合対手の限定量から
成る。反応混合物中で、試料中の被分析物及び標識複合
体は、結合対手への結合に’14シて澗合し St識複
合体の結合対手−結金種及び遊su+iが形成する。
遊一種と対比して結合種を生ずる標識複合体の相対量k
i、試験試験試料中介被分析物11(會えは量)の函数
である。こうして遊sII中O榔識物質を調定し、i*
定され大量を試料中の被分析物の存在または量と相関さ
せることがで龜る。
結合種中の標識複合体を遊1m1111[KII識複合
体が存在する場41−に、 II識の監視に使用する手
段によっては本質的に区別できない場合1分析を完結す
るに#i結合種及び遊離種を物層的に分離しなければな
らない。この種の分析は1文献に「不均一系」と言われ
ている。標識複合体の結合穏及び遊離種が相互−存在し
ていても1区別できる場合には、「均−JIIKuえが
うことができ1分離工場を省くことが、できる。
本発明#i1発光性*gm、例えば化学発光物質及び螢
光物質を使用することを含む、試験試料中の被分析物の
定量及び定性用の、均−及び不均一系特異結合分析法及
び試薬系に関する。殊に、本発明は均−系のそのような
方法及び試薬系、特に螢光性#隼基質−活性標識を使用
する方法及び試薬系に関する6本発明は更に、このよう
な分析法及び試薬系に使用される発光性−及び発光団−
標識複合体に関する。
見い出されるべく、見い出された最初の高感度特異結合
分析は、標識として放射性同位元素を使用する款射免疫
分析であった。このような分析は、標識の監視しうる特
性が遊離種及び結合種間で定性上便化しないので、必ら
ず不均一型によらなければならない、放射性物質を取り
扱う不便さ及び困難のため、補因子、酵素基質。
酵素調節剤、例えば活性剤及び抑制剤、閉婁試薬、スピ
ンラジカル、酵素、バクテリオファージ、金属及び有機
金属錯体、有機及び無機触*。
補欠分子団、イヒ学−光性試薬及び螢光分子を含めて、
放射性同位元票以外の物質を標識成分として使用する分
析系が工夫された。
このような特異結合分析技術Ktj、発光性標識、%に
化学発光物質及び螢光物質を使用する技術がある。この
よう彦分析法では、標識複合体の遊離種は、適当な手段
により励起すると発光しうる発光団に結合した被分析物
またはそのアナローブから成る被分析物−発光団壷合体
を生じる。このような分析法の感度は1発光団標識を発
光によO#[定する能力に左右され、複合体の被分析物
またはアナローブ部分から妨害されることがない、複合
体中の被分析物またはそのアナローブが1発光団に近づ
くと1発光団標識の発光性を著しく減少しうる−のであ
る場合Kid、このような被分析物の分析法の感度は著
しく墨化する。
本発明の目的は、ある特異結合分析、譬に均一系分析に
使用される発光性標識の、このような被分析物で誘発さ
れる消光を軽減する手段を提供する仁とである。
均−系発光性酵素一基質一標識脣異結金分析法は、バー
ド(Burd )ら著、 Anal、 Bioehem
77 S 56(1977)及びドイツ連邦共和Iil
特許出願公開第2,618,511号明細書及び197
6年3月18日に出願され、  *iii受人に―受ら
ねた米国特許出願第667 、996号明細書に対応す
る英国特許第1 、552 、607号明細書に記載さ
れている。改良技術はハートら着、Cl1n、 Che
m、 23 : 1402(1977)及び米国特−許
第4.279,992号明細書に記載されている。この
ような技術のキニジンの分析への適用については、シス
ザ L Cs1szar)ら著、 Cl1n、 Che
m、 27 : 1087 (1981)に記載されて
いる。
発光性標識を使用する、文献記載の他の均一系特異結合
分析法は、下記の現象に基づくものを含む:螢光偏光(
McGregorら著、(:l in、 Chim。
Aetag3:161(197B) ) 、螢光消光C
Shawら著。
J、 Cl1n、 Pathol、30 : 526 
(1977) )−螢光増強(Sm1th、 FEBS
 L@tters 77 : 25 (1977)) 
−エネルギー移動(’jJl1manら著h J、 B
iol、 Chem。
251 : 4172 (1978)及び米国特許第3
,996,345号明細書〕、化学的に励起される螢光
〔米国特許第4.238,195号明細書〕及び螢光保
論(zukら着、 Cl1n、 Chem、25 : 
1554 (1979)及び米国特許纂3,935,0
74号及び同第3,998,943号明細書〕6 発光性標識を使用する不均−%異結合分析法は、米国特
許第3.720,760−j)、同第3,940,47
5号。
同第3,992,631号、41許第4,058,73
2号、同第4,133.639号、同第4.144,4
52号、同第4,171,311号及び同第4,201
,763号明細書に記載されている。
螢光免疫分析法の概!!はヴアイサー(■1sor )
ら著、 J、 Pharm、Sci、 70 : 46
9(1981) K記載されている。
本発明に補動的に間係するものとしては、ウニバー(W
eb@r)着、フラビンス・アンド・フラボプ四ティy
 (1Plavins and )’lavoprot
einm )〔スラター(81atter ) 、 x
 # スビーア(Elsevier)アムステルダム1
966 ) 15:〜21頁及び分子内、づ:。
衝突及びエネルギー移動の現象に関するフォルスI  
(Forster )著、 Ann、 Pbyt 2 
: 55(1948);静的消光の現象に関するラコウ
イッ(Lakowicz)ら著、 Bioehem、 
12 : 4161(1973):フラビンアデニンジ
ヌクレオチドの分子内錯体における重なりのない立体配
座及び重なりのある立体配座の相対割合を調べる際に螢
光の発生量及び寿命を使用する。スペンサー(5pen
cer )ら著、ストラフチャー・アンド・ファンクシ
ョン・オプ・オキシディジョン・リダクション・エンザ
イムス(Structure and Functio
n of 0xidationReduction I
n+c)rmes ) (アクン:y (Akegon
 )ら編集、パージャモン会プレス(Pergamon
 Press )にューヨーク、  1972)393
〜399頁;ヨーロッパ特許出li第15,695号明
細書及び免疫分析に非特異性蛋白結合による螢光妨害を
減少するため硬質高分子支持体に被分析物−螢光物質を
複合させる、ウルマン−(Ul 1man)ら著「ホモ
ジイニアス・・フルオレッセンス・イムノアッセイ([
omog@n@oum Fluor@5cence i
■unoasmaya)J。
イムノアツセイズ:クリニカル・ラボラトリイ・テクニ
ークス・フォア□・ザ1980ス(Immuno−as
saya : C11nieal Laborator
y Techniques forthe 19808
) (ナカムラら編集、 Alan R,Liesにニ
ーヨーク1980 ) ) 13〜43頁がある。
本発明#i、分析の関に使用したか%または生成し友被
分析物−発光団複合体からの発光を消光する能力を有す
る被分析物の測定に発光性標識を使用する特異結合分析
法を改良しえものである。この改良は、被分析物または
そのアナローブが1発色団と1分析の際に発光を測定す
る被分析物−発色団複合体の被分析物まえはアナローブ
部分との消光配列を実質的に妨害する(即ち1着しく阻
止する)結合基によって発光性標識に結合されえ標識複
合体を使用することによって達成される1本発明Fi、
消光する被分析物またはそのアナローブに化学的に接合
した発光団%特に螢光物質からの発光を測定するととに
よって1分析を監視する、即ち検出しうる信号が試験試
料中の被分析物と相関する、均−系ま九は不均一系の任
意の特異結合分析、特に均一系免疫分析に適用しうる0
発光を測定する被分析物−発光団複合体は、分析試薬と
して試験試料と混合される発光性標識複合体と同一であ
るか、またはこのような発光性標識複合体試薬の関与す
る化学反応の生成物1例えば発光性標識複合体の酵素変
性生成物であってもよい。
発光性特異結合分析の感度Fi、結合基が複合体におけ
る未複合発光団の発光度の10−%更に好ましくは15
9b、最龜好ましく#′120sを観察するのに充分に
複合体の発色団部分と被分析物部分との間の消光態を妨
害する場合に、著しく改良される。被分析物で誘発され
る消光の低減Ifi、結合基中に被分析物と発光団との
間の自由回転度を著しく制限するのに充分な剛性の部分
を含む仁とによって達成′される。
本明細書において、下記の用語は特に記載しない限り下
記のよう表意味を表わす: 被分析物−試験試料中の存在または量を測定する物質を
大は関連物質類。
被分析物の結合対応部−被分析物に対して。
′ 通常可逆的な、特異結合親和性を 有する任意の物質または物質類。
被分析物の特異結合アナローグー被分析物の結合対応部
による結合KIIして被 分析物と同様に挙動する任意の物 質または物質類。
試薬系一本発明の分析の実施に使用する組成物、試験具
、試験キットまたは 他の物理的配列1手段または試薬 の組合せ。
被分析物 本発明の分析は1発光性特異結合分析法によって検出さ
れ、測定される被分析物−発光団−複合体において発光
団の不所望な消光を示す被分析物に適用することができ
る。特定の発光団を消光する。被分析物の性質はステル
ンーフォルw −(9t@rn −VOlmer ) 
(D研究〔ステルン及ヒフ * Jl/−v−著、 z
、phys、 20 : 183 (1919)及びバ
アージア7 (Vaughan )及びウニバー(We
b@r)著、 Btoehem、 9 : 464 (
1970) )、−このような研究でFi、一定嬢度の
未複合発光団に増加するS度の潜在的消光物質を加え、
螢光に対する作用を監視する。被分析物轄通常、ペプチ
ド、ポリペプチド、蛋白、炭水化物、糖蛋白、ステロイ
ド、または特異結合対応部が生物学的糸に存在するか、
または合成されうる他の有機分子である。被分析物は1
機能的に1通常抗原とその抗体;ハプテンとその抗体;
及びホルモン、ビタミン、代謝産物及び薬剤及びこれら
の結合対応部から成る群から選択される0通常、被分析
物は1通常約1,000〜約10,000,000の分
子量を有する免疫活性ポリペプチドまた#i蛋白、例え
ば抗体ま九は抗原性ポリペプチドまたは蛋白。
または少なぐとも約100.通常的1 、500未満の
分子量を有するハプテンである。
代表的ポリペプチド被分析物i1t、アンギオテンシ:
/I及UT1.C−ペプチド、オキシトシン。
バソプレッシン、二二一ロフィシン、、//x)リン、
セクレチン、プラジキニン、及びグルカゴンである。
代表的蛋白分析物Fi、プロタミン、ムコ蛋白。
糖蛋白、グロブリン、アルブミン、スクレロ蛋白、燐蛋
白、ヒストン、リポ蛋白、りpモ蛋白及び核蛋白である
。特定の蛋白は例えば、グレアルブミン、α1−リポ蛋
白、ヒト血清アルブミン、α1−酸糖蛋白、α1−抗ト
リプシン、α1−糖蛋白、トランスコルチン、チロキシ
ン結合グロブリン、ヘパトゲロブリン、ヘモグロビン、
ミオグロビン、セルロプラスミン、α2−リボ蛋白、α
意−マクログロブリン、β−リボ蛋白、エリスロボエチ
ン、トランスフェリン、ヘモベキシン。
フィブリノーゲン、免疫グロブリン、例えばIgG、 
IfM、 IgA、 IgD及びIgE、並びにこれら
の断片1例えばli’c及びi’ab、補体因子、プロ
ラクチン、血液凝固因子1例えばフィブリノーゲン、ト
ロンビン等、インシュリン、メラノトロピン、ソマトト
ロピン、テロトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホ
ルモン、ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性
ラクトゲン。
内因子、トランスコバラミン、血清−S、例えばアルカ
リホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナ−ぞ、アミラーゼ
、リパーゼ、ホスファターゼ。
コリンエステラーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸トラン
スアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ、及びウロペプシン、エンドルフィン、エンケファ
リン、プロタミン。
組織抗原、細菌抗原、及びウィルス抗原、例えば肝炎関
連抗原(例えばs HBaAg、 HBcAg及びHB
aAg )である、一 本発明は、例えば約1500より小さい分子量を有する
ハプテン被分析物の分析に特に有用である。代表的I・
ブテン被分析物は、薬剤、代謝産物、ホルモン、ビタミ
ン及び同様の有機化合物の一般的種類を含む。ノ・ブテ
ン性ホルモンFi、ヨードサイロニン、例えばチロキシ
ン及びトリヨードサイロニンである。ビタミン類はビタ
ミンA、B、例えばBush Cs Dh E及びに、
iki!Ii!及びチアミンを含む。薬剤は抗生物質1
例えばアミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、トブ
ラマイシン、アミカシン、シソマイシン、カナマイシン
及びネチルマイシン、ペニシリン。
テトラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、
及びアクチノマイセチン;ヌクレオシド及びヌクレオチ
ド、例えばアテノシンジホス7エー) (ADP)、ア
デノシントリホス7エー)(ATP)、フラビンモノヌ
クレオチド(FMN)、フラビンアデニンジヌクレオチ
ド(FAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
(NAD)及びそのホスフェート誘導体(NADP)、
?ミジン及びアデノシン;プロスタグランジンミステロ
イド、例えばエストロゲン、例えばエストリオール及び
エストラジオール、ステロゲン、アンドロゲン、ジゴキ
シン、ジギトキシン、及び副腎皮質ステロイド;及びそ
の他の薬剤1例えばフエノバルビタール、フェニトイン
、ヒリミドン、エトスクシミド、カルバムアゼビン、パ
ルプロエート、テオフィリン、カフェイン、プ薗プツノ
ロール、キニジン、アはトリブチリン、コルチゾール、
デシプラミン、ジソビランド。
ドキセビン、ドキソルビイン、ノルトリブチリン、メト
トレキセート、″イミプラミン、リドカイン、プロカイ
ンアミド、N−アセチルプロヵインアミド、アンフェタ
ミン、カテコールアミン、及び抗ヒスタミン剤管含む。
消光作用 本発明は、測定される被分析物−発光団複合体中の発光
団の発光性、即ち励起される発光する能力が複合体の被
分析物またはアナローブ部分によって消光されるのを妨
害、即ち分析的に著しく防止する結合基を使用すること
に基づく。
被分析物で誘発される消光作用Fi1発光団と被分析物
部分との間の物理的、化学的まfc#i電気的反応に基
づくものであり、通常1分子内転位、特に本質的に直接
分子内衝突または共鳴エネルギー移動による転位に基づ
く0発光団と被分析物部分との間の反応により、被分析
部分が発光団と近似消光配列になる場合に発光団の消光
が起る。
1、直接分子内衝突 この消光現キーおいて1発光団の発光性の変調は静的ま
た・は動的工程から起りうる。発光団の励起前に発光団
と消光物質が反応する場合にFi、静的消光が起るが、
励起された発光団と反応する場合には動的消光が起り、
これによって消光メカニズムは励起状態の減少について
発光と割合する。動的及び静的消光は発光団と消光物質
との短い範囲の衝突または接触反応を必要とする。
直接分子内衝突による消光のw、m#i、文献〔バーシ
ャンら著、 Bioeh@m、 9 : 464(19
70))k記載されており、分析化学〔ギルボールド(
Guilbaalt)著、フルオレッセンス、インスト
ラメンテイション・アンド・プラクテイス(Fl−uo
r@5cenc@%  Instrum@ntatio
n  and  Praetice)、デツカ−(Da
cker ) (= z−ヨーク1967 ) 349
頁〕、膜蛋白質の研究〔シニツキイ(5hinitzk
y)ら著、  13ioeh@m、 16 : 982
(1977))−リポソーム−細胞反応の研究(ワイン
スタイン(W@1nat−ein)ら著、サイ:c ン
x (5cience ) 195 : 489(19
77) ) 、及び酵素分析〔ヤa ン(Y&rOn 
)ら著、ムma1. Biochem、 95 : 2
28 (1979) )  K適用された0発光団との
衝突が高頻度に起るように、 III鐵複合体中に消光
性被分析物まえはアナローブを結合させると、直接分子
内衝突による消光を示す系が生じる。複合体の対向発光
団及び被分析物部分の移動を制限する結合基を選択する
と、*突の傾度が減少し、このメカニズムにより発光団
の消光が低減される。
直接分子内衝突による消光は特に1複合体の発光団と被
分析物部分とが共に芳香族性である場合1両者の間で起
りやすい。恐らく、強い環−環反応が起り、その結果、
消光を促進する分子積み重ね構造が生じる。更に、被分
析物が重い原子を含む場合KFi、螢光減衰と競合する
三重現状態への系間交差の割合が増加して、消光を起し
うる。
2、共鳴エネルギー移動 このメカニズムにおいて、エネルギーは発光団から消光
物質へ60A程度、好ましくは25A未満の分子内で長
い距離にわた′つて移動する。
共鳴エネルギーの移動の理論はフォルスター(Fors
ter)Kよって確立された( Ann、 Phys、
 2 :55(1948) )、直接分子内消光とは異
なり、共鳴エネルギー移動による消光の効果は消光物質
の吸収スペクトルと発光団の発光スペクトルとのスペク
トルのオーバーラツプに左右される。
この消光現象は酵素分析〔ヤロン(Maron )ら著
λmm1. Bloeh@m、 95 : 22B (
1970) )及び免疫分析〔ウルマン(’(Jl 1
man )ら著、 J、Biol、 Chew251 
: 4172(1976)及び米国特許第3,996,
345号明細書〕に適用された。複合体の対向発光団及
び被分析物部分が共鳴エネルギー移動が起るのに充分に
接近する能力を制限する結合基を選択すると、このメカ
ニズムによる発光団の消光が顕著に壜る。
従って、用語「消光配列」は、直接分子内衡突及び共鳴
エネルギーの消光メカニズムに畳通の意味で使用する。
発光性標識複合体 檄識豪合体は、試験試料及び他の分析試薬と結合される
試薬本体であり、その複合体は被分析物、またはその特
異結合アナローブから成る。
発光性標識とは、自体発光体である物質、即ち励起され
ると発光しうる物質、または発光体の前駆物質、即ち化
学反応により変性されて発光体を生成する基である。従
って、発光性標wIt複合体試薬は、分析を完了するた
め発光度を測定する発光団−被分析物複合体と同一であ
るか。
またはその前駆物質であってよい。前駆物質である場合
KFi、標識複合体Fi1通常、酵素で触媒される化学
反応を受け、この反応により発光性**部分が変化し、
発光団となる0例えば。
化学反応により螢光性螢光団−被分析物複合体が生成す
る場合、被分析物またはアナローブに結合した非螢光性
螢光物質誘導体は螢光性標識複合体として作用する。
測定される被分析物−発光団複合体中の発光団は、物理
的、化学的または電気的な励起手段にさらす、例えば光
で照射または化学反応にさらすことによって刺激されて
発光しうる分子であってよい0発光団の主なカテゴリイ
#i、螢光物質、燐光物質及び化学発光物質である。螢
光物質及び燐光物質Fi、所定の第一の波長の光で照射
すると、第二の、それより長い波最の光を発する分子で
ある。化学発光物質Fi、化学反応により発光し、その
反応は酵素で触媒されて本。
されなくてもよい。
有用な螢光物質は例えば、ウンベリフェロン(7−ヒド
ロキシクマリン)、フルオレツセイン、インドール、β
−ナフトール、3−ビリドール、レゾルフィン、リサミ
ンローダミンB。
ローダミンB、アントラセン、3.10−ジフェニルア
ントラセン、ペリレン、ルプレン、ピレン、トリプトフ
ァン、フラビン、アクリジン、ナフタリン、α−ナフチ
ルアミン、5−ジメチルアミノ−1−す7タリンスルホ
ネート(ダンシル)、N−(P−(2−ベンズオキサゾ
イル)フェニルコマレイミド、チオクローム、アニリノ
スルホン酸及びこれらの種々の螢光性誘導体である。燐
光物質#i1例えばキノリン、1−ブロモナフタリン、
インドール、トリプトファン、チロシン。
及びこれらの樵々の燐光性誘導体である。マイ’r −
x (Meysrs)ら著、 Anal、 Chem、
 51 : 1609(1979)参照、有用な化学発
光物質は、例えばルミノール、イソルミノール、ルシフ
ェリン。
2.3−ジヒドロ・ベンゾ(9)フタラジン−1,4一
ジオン% 2,3−ジヒドロフタラジン−1,4−ジオ
ン、及びこれらの種々の化学発光性誘導体である。
結合基 常用の標識複合体の場合と同様に、発光性標識及び被分
析物またはそのアナローブは、水素を除いて、1〜50
個の原子、更に一般にFi1〜30個1通常1〜20個
の原子、主として炭素並びK11l酸3I、燐及び硫黄
から選択されたへテロ原子を含む連鎖によって共有結合
される。常用の結合基は1文献に詳細に記載されている
。例えば、米国特許第4,230,797号、同第4 
、279 、992号、開館3,817,837号、同
第3.935,074号及び同第3.996,345号
明細書参照。本発明#i。
発光団と被分析物部分との間の消光反応を著しく減少す
るのに充分な剛性を与えるため、そのような常用な結合
基中に挿入するため、比較的硬い基または部分的にしか
フレキシブルでない基を選択する点で従来とは異なる。
従来の潜在的消光の問題に対して本発明によって与えら
れる解決を知れば、当業者は従来の結合基に所望の剛性
を与えるため多数の化韓基から選択することができる。
このような基の例を以下に示す:結合手の型     
   構造の例 ビシクロ(2,2,2,)オクタン 他の系は、 Proc、Natl、Aead、Sci、
 UsA 58ニア19(1967)(ポリーL−プロ
リン) 、 JAC891: 1293(1969) 
(飽和ステロイド〕、JAC887:995(1965
) Cデカ環式ビステロイド系)、JAC890189
7(196g) (飽和縮合環網状構造)。
He1v、ChenzAeta 58:397(197
5)(双環式炭化水素フレーム)、  JAC890:
6425(1968)、JAC891:4786(19
69);及びJAC891:4169(1969)K記
載されている。
結合基内の剛性部分の両側に、通常、鱗及び被分析物部
分に結合する常用の結合構造がそれぞれ存在する。
分析技術 本発明は、広義に1発光性標識及び被分析物を九はその
アナローブから成る標識複合体を使用する均−系または
不均一系特異結合分析技術に適用することができる。こ
のような技術において、被分析物が発光性標識を消光し
うる種類の4のである場合1分析において測定される被
分析物−発光団複合体からの総潜在シグナルが対応して
減少し、これにより分析の感度、即ち再現性をもって検
出しうる被分析物の濃度の下限を低下する。
A、均−系 一般に、本発明の分析法は、α)試験試料を。
被分析物に対する結合対手及び本明細書に記載した標識
複合体を含む試薬系と混合し、標識複合体の結合対手−
緒金種及び遊離種(即ち、結合対手によって結合されて
いない)の反応混合物を形成させ、その際遊離種は被分
析物−発光団複合体(標111穢合体自体として、また
#141I繊複合体からの反応生成物として)を生成さ
せ、(2)発光団を適切な手段により励起させ、試料中
の被分析物の函数として放出される光t−II定する。
次に本発明を適用する特定の均一系分析技術の例を記載
するが、これらの例に限定されるものではない。
1、  III!基質−標識技術 この系でtL標標識会合体被分析物またはアナローブ及
び発光性標識1例えば螢光性標識、酵素基質−活性標識
から成り、このような標識は酵素による作用を受けて、
被分析物−発光団複合体を生成することができる。標識
複合体に作用して、検出される被分析物−発光団複合体
を生成させる酵素の能力は、被分析物を認識する結合対
手(一般に抗体またはそのフラグメント)と標識複合体
を結合させることによって低減する。この種の分析系F
1. 1978年4月10日出願された米国特許第89
4 、836号明細書(英国特許第1,552,607
号明細書に対応)に記載されている原理に含まれる。
このような酵素基質−標識技術において、標識複合体1
例えば基質−被分析物複合体は、酵素により開lI!ま
斥は変形作用を受けて複合体から区別される。検出可能
の性質を有する生成物を生じうる性質を有する。例えば
、複合体は、分析条件下で非螢光性であってよいが、#
素と反応すると、螢光性被分析物−螢光物質生成物を生
じる。
このような技術に使用する種々の螢光性基質−標識複合
体は明らかである0例えば、標識複合体は式: %式% 〔式中Gは解裂可能の基1例えばホスフェート基、カル
ボキシレート基またはグリコン基であ・・・ j:′: す%DtiGを除去すると螢光性生成物を生ずる螢光性
染料基1例えばウンベリフェロン、フルオレツセイン、
ローダミン及びその誘導体を表わし、R1j重合基を表
わし、Lrl1被分析物またはそのアナローブを表わす
〕を有するものである。標識複合体の酵素分解(例えば
ホスファターゼ、カルボキシラーゼ、グリコシダーゼ等
)ill、例えば抗体によって複合体の被分析物り部分
に結合させることによって行なわれる。米国特許第4 
、279 、992号明細書参照。特に好ましい基質標
識分析法は1式: 〔式中R及びLは前記の本のを表わす〕の標識複合体を
使用シ、これにより、螢光により識別される生成物を生
ずる複合体を解裂する、#索β−ガラクトシダーゼの能
力は、抗体と複合体との結合によって抑1制される。
本発明の目的で結合基R中に挿入される剛性部分の例は
、一般式: 〔式中81及びR”d適当な架橋要素である〕の複合体
を生ずるパラ−フェニレンである。この一般式の複合体
は、構造式(4) (4) 〔式中R1は適当な架橋要素、例えば結合ま九は水素を
除く原子数1〜20個の連鎖であり、LJIi前記のも
のを表わす〕で表わされる。この種の複合体は、下記の
反応式AK示したようにして製造される。7−β−ガラ
クトシルクマリン−カルボン1t(1)(バード(Bu
rd )ら著Cl1n。
Chsm、 23 : 1402 (1977) )を
DMF中でN−ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロ
へキシルカルボジイミドと室温で2時間反応させること
によって活性化ニスデル儲)に変換させることができる
〔アンダーツy (Anderson )ら著J、 A
m−er、 Chem、Soe、 86 : 1839
(1964) )。次に活性化エステル(2)を適当な
溶剤、例えばDMF中でトリエチルアミンの存在でノ(
ラーアミノ安息香酸と混合し、室温で24時間反応させ
る8次に、反応混合物を濾過して副、生成物であるジシ
クロヘキシル尿素を除去し、溶剤を高度真空中で蒸発さ
せ、その残渣から純粋なN−(〕(ラーカルボキシフェ
ニル)−7−β−ガラクトシルクマリン−3−カルボキ
シアミドG)を、例えば珪酸でクロマトグラフィーし、
エタノールと酢酸エチルとの混合物で溶離することKよ
って得ることができる。
反応式−A (4) 標all(3)を適当なアミド及びペプチド結合形成反
応〔1ベプタイヅ(peptides)”グツドマン(
Gooclman )及びマイエンホーファー(Mei
−enhofer)  @集、ジ曹−ン・ウィリイ参ア
ンド・ソング(John W目ey & 5ons )
 (=ニーヨーク1977)、6〜13頁及びそこに引
用されている文献参照〕によりアミノ−変性またはアミ
ノ−含有リガンドに結合することができる。
本発明の目的で結合基R中に挿入する剛性部は前記のも
のを表わす〕の複合体である。この種の複合体は、下記
の実験の部分に特に例示する。
2 蛍光の消光または増加 この系における標識−合体は、その標識部分で、標識複
合体が抗体に結合されたときに、測定可能な程度で蛍光
が消光または増加する蛍光物質を含む。蛍光性標識は通
常、直接測定され、その蛍光が検出可能のシグナルであ
る。この種の分析系は米国特許第3.940.475号
、同第4゜150.949号、同第4,160.016
号、同第4,160゜818号及び同第4.272.5
05号明細書、英国特許第1.583.869号明細書
、及びJ、Cl1n。
Path、30:526(1977)、並びに前記の他
の文献に記載されている。
1 蛍光偏光 この系における標識は蛍光物・質でもあるが、作用特性
は抗体による標識複合体の結合による蛍光の偏光である
。この種の分析系は、J、Exp。
Med、122:1029(1975)及び前記文献に
記載されている。
4、 エネルギー移動 この系では、標識はエネルギー移動供与体−受容体対の
一員であり、抗体はこのような対の他方と複合する。従
って、標識複合体が抗体によって結合されると、対の供
与体成分のエネルギー出現が、受容体成分への移動によ
って変化する。通常、供与体は蛍光物質であり、受容体
はその消光物質であり、この消光物質は同様に蛍光物質
であっても、蛍光物質でなくてもよい。
このような実施態様では、検出可能のシグナルは蛍光で
あるが、他の検出系であってもよい。
このような分析系は、米国特許第3.996.345号
、同第4.174.384号及び同第4.199.55
9号明細書並びに英国特許第2.018.424号明細
書並びに前記文献に記載されている。
5、化学的に励起さiる蛍光 この系では1.標識は再び蛍光物質であるが、蛍光を発
するエネルギー状態に化学的に励起される、蛍光物質標
識の能力は、抗体と標識複合体との結合によって影響さ
れる。標識の化学励起は、通常、蛍光物質標識をその場
で形成した高エネルギー化合物に曝すことによって達成
される。この種の分析系は米国特許第4.238.19
5号明細書に記載されている。
6 二重抗体立体障害 更に、米国特許第3.935.074号及び同第3、9
98.943号明細書に記載されている二重抗体免疫分
析系がある。標識複合体は2種のエピトープから成り、
その一方はリガンド及びリガンド抗体との免疫反応に関
与し、他方は第二の抗体によって結合されうるちのであ
り、2種の抗体は同時に標識複合体に結合するのを妨害
される。第二のエピトープは第二の抗体結合によって蛍
光が消光される蛍光物質であるか、又は第二の抗体への
結合に対する第二のエピトープの標識形との補助的競合
結合反応に関与することができる。このような系には前
記特許に記載されているように、種々の検出系が可能で
ある。
関連分析系は米国特許第4.130.462号及び同第
4.161.515号明細書及び英国特許第1.560
゜852号明細書並びに前記の他の文献に記載されてい
る。
B、不均一系 本発明の分析法は、標識複合体の結合種及び遊離種を分
離し、一方又は他方の標識成分を測定する常用の不均一
系分析技術にも適用することができる。このような不均
一系分析を実施する試薬手段は多数の異なる形を取るこ
とができる。一般に、このような手段は、3種の基本成
分から成り、これらの成分は(1)検出すべき被分析物
、(2)被分析物の結合対手及び(3)標識複合体であ
る。結合成分を同時に又は順次混合し、適当な静置時間
を置くと、標識複合体は、結合の程度、即ち、結合対手
に結合した標−複合体(結合種)の量と未結合の標識複
合体(遊離種)の量との比が存在する比分折物の量の関
数であるように、対応する結合対手性結合している。
結合種及び遊離種を物理的に分離し、その一方に存在す
る標識の量を適当な手段により発光団を励起し、生ずる
発光を測定することによって測定する。測定された発光
を熱性対照又は標準の結果、例えば標準曲線と比較する
。分離工程を実施する手段及び結合反応系を形成する手
段は文献に多数記載されている。分離は、固相抗体又は
抗原、第二抗体、又は同相第二抗体として一般に知られ
ている物質に関する技術又は免疫寮合体沈殿剤、吸着剤
等を使用する技術のような常用の技術によって達成する
ことができる。
追跡しうる結合反応系は、いわゆる競合結合法、連続飽
和法、「サンドウィッチ」法等である。
種々の公知不均一系に関する詳細については、更に文献
、例えば米国特許第3.720.760号、同第3.9
40.475号、同第3.992.631号、同第4.
058.732号、同第4.133.639号、同第4
、144.452号、同第4.171.311号、同第
4゜201、763号及び同第4.230.797号明
細書及びJ、Pharm、8ci、70:469(19
81)及び前記文献から容易に得られる。
均−系及び不均一系特異結合分析を実施するため、他の
添加順序及び他の結合反応法を含む操作法は、本発明思
想を逸脱することなく工夫できるものである。
反応混合物及び条件 分析すべき試験試料は、比分折物を含むと思われる天然
に生ずるか又は人工的に作った液体であってよく、通常
、生物学的液体又はその希釈物である。分析しうる生物
学的液体は、血清、血秦、尿、唾液、乳、及び羊水及び
脳を髄液を含む。
結合反応は、緩和な条件下で進行する。反応混合物は一
般に少量の所望の有機補助溶剤を含む水性媒体である。
反応温度は、静電期間及び測定工程の間中通常の状況で
一定の水準に保持する。温度は一般に5〜50℃、更に
普通には20〜40℃である。反応は室温で進行する。
反応混合物のpHは5〜10、更に普通には6〜9であ
る。種々の試薬の濃度は試験媒体に予想される被分析物
の濃度に左右され、このような濃度は通常10−’−1
0”−”Mである。前記の反応パラメータの場合に、選
択は、結局常法で分析を実施する技術者の選択及び必要
に対して考慮した、実験で求めた最適条件に第一に基づ
く、従って、パラメータはいづれも本発明には限定的な
ものではなく、むしろ当業者に通常なしうることである
試薬系 本発明の試薬系、即ち試薬の組合せ又は手段は、本発明
の所望の分析法を実施するのに必要なすべての必須化学
成分を含む。試薬系は工業的に包装された形で組成物又
は混合物として提供され、この場合試薬の相溶性により
試験具又は試験キットとして、即ち必要な試薬を入れる
1個以上の容器の組合せ包装物が可能である。
試薬系には所望の結合反応系に適切な試薬が含まれ、常
に標識複合体及び前記の被分析物結合対手を必要とする
。このような結合反応試薬は標識複合体及び被分析物に
対する結合対手の外に、特定の分析法を実施するため他
の必要な、又は任意成分の試薬、例えば酵素基質−標識
法を使用する場合に必要な酵素を含むことができる。勿
論、試薬系は文献に公知の他の試薬を含んでいてよく、
これらの試薬は工業的観点及び使用者の観点から望まし
い物、例えば緩衝剤、希釈剤、標準品等であってよい。
試薬系及びこれと結合する固体担持物質から成る試験具
が好ましい。このような試験具の種々の形411980
年10月30日に出願された米国特許第202゜378
号明細書に記載されているので、これを参考文献として
本明細書に含める。
次に、実施例に基づいて本発明を詳述するが、本発明は
これに限定されるものではない。
例  1 この例では、蛍光物質標識としてウンベリフェロン誘導
体、及び消光性被分析物としてキニジン(6′−メトキ
シシンコニン)から成る二発色団系における分子積み重
ねを妨害するため、剛性N、 N/−ビペラジニレン部
分を含む水溶性結合基を使用する。これらの2個の芳香
族基を長さの興なる7レキシプルなアルキル連鎖、即ち
、4個及び12個のメチレン基を介して結合させた(式
I及び■)。結合基にある程度の剛性を加えるため、結
合基が剛性ビペラジニレン基を含む振合体も製造したC
弐■及び■)。
ム*合体の製造 !−ガラクFシルーウンベリフェロン−キニジン(1)
この化合物の構造は前記の式(1)で示される。
a6f(21mmol )ノロ’−ヒトa+シシ>w=
> (ス%−ル(Small )ら着J、 Mad、 
Chem。
!2: 1014(1979))、7F(25mmol
)のN−(4−プ四モブチル)フタリジン〔ウィスコン
シン州ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル社(A
ldrich Chemical to、 ) )、&
45f(25mmol )の炭酸カリウム[: K、C
0B) 、10011PlF)18−クラウン−6−(
1,4,7,10,13,16−ヘキ賃オキサシクロオ
クタデカン)(アルドリッチ社)及び150−のア七F
ンの混合物をアルゴン下に16時間還流した。シリカゲ
ルでりpマ)グラフィー処理し、メタノールから再結晶
して後処理すると、3.1Fの6’−(4−フタルイ文
ドプトキシ)シンコニンが融点228℃の白色結晶とし
て得られた。
この7タルイミド誘導体3f(5,9mm・1)、ヒド
ラジン5 ml及びメタノール100−を1時間加熱し
、次に冷却し、溶剤を除去する。固体残渣を100sl
のIN塩酸と共に攪拌し、濾過してフタルヒドラジドを
除去した。−液を水酸化ナトリウムで中和し、生じた沈
澱を水性メタノールから再結晶すると、1.6Fの6′
−イ4−アミノプトキシ)シンコエンが融点126〜1
28℃の白色針状晶として得られた。
分析:Cl−1穐へとして CHN 計算値  ’151   &19  1101実測値 
 72.97   &33  1077乾燥ジメチルホ
ルムアミド(DMF)20gJ中の7−β−ガツクトシ
ルクマリンー3−カルiン酸〔バードら着Cl1n、 
Chem、 23 : 1402(1977))434
1111Fの溶液を一10℃に冷却し、トリエチルアミ
ン120W(1,2mmol)及びクロ冑ギ酸イソブチ
ル160■(1,2mmol)と混合した。10分後、
トリエチルアミン塩酸塩の白色沈澱を濾過により除来し
、6’−(4−アミノブトキシ)シンコニン45011
P(1,2mmol)を加えた。室温で1時間攪拌した
後、溶剤を除去し、残渣をシリカゲルでクロマトグラフ
ィー処理した。カラムを酢酸エチA/:エタ/−4の:
3 : z′v/vs合物r溶st、、1511/スつ
の7ラクシ曹ンを集めた。フラクシlン44〜80をプ
ールし、蒸発した。2−ブーパノールから再結晶すると
、式(I)の化合物が融点191〜193℃の微細な白
色粉末として得られた。
分析:!ス・スペクトル(電場脱離):m/6713(
M マイナスHad):551(M  YイナスH,O
、マイナスC5HasOs )β−ガツクトシルーウン
ペリ7エロンーキニン(II)この化合物の構造は前記
の式(1)に示したとおりである。
7.76F(25mmol)の6′−ヒト!キシシンコ
ニン、11.839 (30,mmol )のN−(1
2−プルモトデシル)7’?ルイ主ド(アルドリッチ社
)、414fのKsCOs及び75w11の乾燥アセシ
ンの混合物をアルゴン下に還流器を付けて16時間攪拌
した。反応混合物を冷却し、前記と同様に後処理すると
、融点232〜234℃(分解)のオフホロイト色固体
として7fの6’−(12−フタルイ之トドデシルオキ
シ)シンコニンが得られた。
メタノール50−中の上記7タルイミド157f (2
5mmol )及びヒドラジン2131の溶液を1時間
還流した。回転蒸発器で揮発性物質を除去し、固体残渣
を一夜高度真空下に乾燥した。これにより6’−(12
−アミ/ドデシルオキシ)シンコニンが灰色固体として
得られたが、これをそれ以上特性決定をしなかった。1
 rrmolを7β−ガラクトシルクマリン−3−カル
ボン酸と前記の例と同様の方法で反応させた。反応生成
物をシリカゲルでクロマトグラフィ処理及びエタノール
からの再結晶によって精製すると、7011vの式1)
の化合物が融点118℃の黄褐色結晶として得られた。
分析: CayHstNmOis  としてCHN 計算値  66.88  7.29  4.98実測値
  66.75  7.31   463この化合物の
構造は前記の式(III)に示したとおりである。
1−(2−アミノエチル)ピペラジン(アルドリッチ社
)をトリフルオル酢酸エチルで処理してN−トリフルオ
ルアセトアミド誘導体に変えた。トルエンから再結晶す
ると、融点92〜93℃の白色針状晶が得られた。
分析:CaHuFs″N、 Oとして CHN 計算値   4!66  6.25    HL66実
測値   4!68  5.85  19.12この物
質10f(44mmol)をエチL/ンオキシド29を
及び氷酢酸1−を含むメタノール50−中で16時間放
置した。溶剤を除去し、トルエンから再結晶すると、1
0.1fの1−(2−ヒト田キシエチル)−4−(2−
)リフルオロアセトアミドエチル)ピペラジン(ヒドロ
キシ誘導体)が融点84℃の白色針状晶として得られた
分析: CmeH*aFmNsOmとしてCHN 計算値  44.61  6.74  15.61実測
値  45.24   a72  1五59ヒドロキシ
誘導体(3f、  11mm0t )及びトリエチルア
ミン1,3りf (13mmol )を塩化メチレン5
0−に溶かし、アルゴン下に攪拌しながら5℃に冷却し
た。これにメタンスルホエルク胃リド1当量加え、1時
間後に6′−ヒトaキシシンw=ン3.4 f (11
−mmol )及び無水KsCOs 4.5 f (2
4,5mmol )を加えた。反応混合物を室温に加温
し、17時間攪拌した。濾過し、蒸発し、残渣をメタノ
ール性水酸化カリウム中で4時間加熱して、Fリフルオ
ロアセチル基を除去した。生成物をシリカゲル上でクロ
マトグラフィー処理し、4 : 4 二1 V/V/α
のクロルホルム;メタノール:m水酸化7ンモニウムで
溶離すると、2.4fの6’−((2−(4−(2−ア
ミノエチル)ピペラジニル−1)エトキシ〕〕シンコニ
ンが褐色無定形固体として得られ、この固体は薄層クロ
マトグラフィーで均一であり、ニンヒドリン−陽性であ
った。このアミノをそれ以上特性決定しなかった。この
アミン1mmolを前記の例と同様の方法で7−β−ガ
ラクトシルクマリン−3−カルダン酸(前記)と反応さ
せた。反応生成物をシリカゲルでり胃マドグラフィー処
理し、4:IV/Vエタノール:IM水性重炭酔トリエ
チルアンモニウムで溶離し、次にセファデックスLH−
20でクリ!トゲラフイー処理し、メタノールで溶離し
た。式(1)の化合物34319が黄褐色固体として得
られた。
分析: CamHssNsOsx ・2HaOHN 計算値  6062   &74   &22実測値 
 5g、43  6.99  7.99β−ガラクトシ
ル−ウンベリフェロン−ピペラジニル−キニジン複合体
(Ill)の前記合成操作を変更して、1−(2−ヒト
ルキシエチル)−4−(2−トリフルオロアセトアミド
エチル)ピペラジンを下記の反応5c1の一般式Cで示
した適当な合成中間体(式中Gは適当なアミン保護基を
表わす)で代えることによって、m及びnがそれぞれ2
〜9である複合体を製造することができる。Cのような
中間体を得るため、ピペラジンを適当に保護されたβ−
アミノアルデヒド人人当当量還元によりアルキル化する
ことができる。生成するモノ置換ピペラジンBを普通の
有機鎖−彰成反応により中間体に変換することができる
反応式1 例えば、Bを種X−(C八)n−Y(式中Xは脱離基、
例えば臭素、塩素、p−トルエンスルホニル基、メタン
スルホニル基を表わし、Yは自体脱離基であるか、また
は1以上の工程で脱離基に変換しうる官能基、例えばと
ド田キシル基またはアセトキシ基を表わす)でアルキル
化することができる。二官能性中間体、例えばX−(C
H,)、−Yは有機化学において周知であり、α。
・−ジヒドロキシアルカンまたはα、―−ハpヒドリン
の類から単純な化学変換によって得られる( @Che
m、8ourcess USA”1979年、ニュージ
ャージ州フレミントンのディレクトリイース・パブリジ
ング社(Directories Pwbl−轟shi
ng Co、)参照〕 一般に、モノ置換ピペラジンBを、X及びYが脱離基を
表わす反応体X−(CHs) n”Yでアルキル化する
のは、ピペラジン環の過アルキル化を避けるため反応条
件を均密に制御する必要があるので、あまり好ましくな
い。
BをCに変換する反応は、Bをω−置換アルデヒドY 
−(CHa ) n−1−CHO(ポーチ(Borch
 )ら着−%J、Amer、Chem、8oc、93:
2897(1971))(式中Yは前記のような脱離基
または1以上の工程で脱離基に変換しうる官能基、例え
ばヒドロキシ基またはアセトキシ基である)で還元アル
キル化することによって達成することもできる。Y−(
CH,) 、1−CHOのような反応体はω−とドルキ
シアルデヒド類から得られる(ハード(Hurd )及
びソーンダー(5aunders。
Jr、 )著J、 Amer、 Chem、 Soc、
 74 : 5324(1952)参照〕。
オメガ−アミノアルデヒドNH意−(CH鵞)m−1−
CHO(式中m=2〜5)は公知化合物である〔1ケミ
ストリイ・オブ・カーボン・フンパウンド(Chemi
stry of Carbon Compounds)
’ロッド(Rodd )著、1巻、ニューミークのEl
sevier Publ、Co、 1951年、706
頁参照〕。還元アルキル化反応〔ポーチらの前掲文献〕
の間、アミノ基は反応条件下では安定であるが、分子に
有害でない条件下で#C大しりる基Gで保護する。酸性
または塩基性条件下に接触水素添加または特殊な試薬で
の処理によって脱離しうる多数の保護基Gが知られてい
る〔1ブロテクテイブ・グループ・イン・オーガニック
・ケ之ストリイ(Protective Groups
 inOrganic Chemistry )”、二
ニー冒−りのジョーン・ウイリイ・アンドーソンズ社、
1981年218〜287頁参照〕。前記のものよりm
が大きい(m=6〜9)ものは、前記のω−とドロキシ
アルデヒドHO−(C’s)m−1−CHOの公知変換
によって保護された形で製造することができる。これら
の物質は前記ハード及びソーンダースの文献に記載され
ているようにアセタールHO−(CH鵞)m−0−CH
(OC*Ha )sに変換することができ、ヒト田キシ
官能基を1以上の工程でアミノ官能基または保護された
アミノ官能基に変えることができる〔ミツツク(Mit
sunok−・・−1 w)らJ、 AmC′r、 Chem、Soc、 94
 : 679 (1972)参照〕。
キニジン(■) この化合物の構造は前記の式(IV)で示される。
5.8 f (19mmol )ノロ’−ヒドロキシシ
ンコニン3.879 (19mmol )のエチル5−
ブロモペンタノエート、1.87 rのKg COm 
、1001vの18−クラウン−6及び150dのアセ
トンの混合物をアルゴン下に16時間還流した。溶剤を
除去し、残分を塩化メチレンと希水酸化ナトリウム(N
aOH)との間に分配させた。有機相を分離し、乾燥し
、蒸発すると、2.69のエチルエステルが橙色固体が
得られた。これを1、25 fのに、 Cosを含むメ
タノール125iE/中で一夜還流した。メタノールを
除去し、残分をH,Oに溶解した。希塩酸(HCt)で
pHを7に調節すると、沈澱が生じた。水性エタノール
から再結晶すると、6′−(4−カルボキシブトキシ)
シンコニン(II)x、srが融点148〜153℃の
オフ・ホワイトの固体として得られた。
分析:C鵞4H1@凡04・八〇としてCHN 計算値  67.27  7.53  6.54実測値
  67.42  7.59  6.59キニジン(m
V) この化合物の構造は前記の式(P/)で示されf (1
9mmol )のエチル5−ブロモペンタノエート、1
87tのに、Cos、 1011Fの18−クラウン−
6、及び150−のアセトンの混合物をアルゴン下に1
6時間還流した。溶剤を除去し、残渣を塩化メチレンと
希水酸化ナトリウム(NaOH)との間で分配させた。
有機相を分離し、乾燥し、蒸発させると、エチルエステ
ル!61が橙色固体として得られた。これを1.25 
fのKsCOsを含むメタノール125tJ中で一夜還
流した。メタノールを除去し、残渣を水に溶かした。希
塩#(HO2)でpHを7に調節すると、沈澱が生じた
。水性エタノールから再結晶させると、1.6fの6’
−(4−カルボキシブトキシ)シンコニン(酸)がlk
点x4s〜153℃のオアーホワイトの固体として得ら
れた。
分析: C*aHs*N5O44(a Oとして、HN 計算値  67.27  7.53  6.54実測値
  67.42  7.59  6.59乾燥ジオキサ
ン400+Ij中の10Of100f(042の重er
t−ブチル−8−(4,6−シメチルピリミジンー2−
イル)チオールカーボネート(アルドリッチ)を室温で
、ジオキサン36〇−中の1,4−ビス−(3−アミノ
プロピル)ピペラジン182t(0,91mol)の溶
液に6時間にわたって滴下した。−夜攪拌後、反応混合
物を濾過し、蒸発すると、油性残分が得られた。これを
2tの蒸溜水に溶ぶし、アンバーライトIRC−50イ
オン交換樹脂(NI(4形)(ペンシルバニア州フイラ
デルフイアのローム・アンド・ハース社)の5cmX9
0cmのカラムに施した。カラムを500dの水で洗浄
し、2Lの水〜2tの0.s%水酸化アンモニウムを線
勾配にして用いて溶離した。所望のフックシ冒ンを合し
、蒸発して、652の1−(3−アミノプロピル) 、
 4 + (3−tert−ブチルオキシカルボニルア
ミノプロビル)ピペラジン(−級ア叱ン)が淡黄色油と
して得られた。
分析:マススペjp>k(Toe、V、):m/e30
1(MU+); 201 (MH+マイナスcooc−
(CHs)s ) 乾燥DMF25d中の前記の酸(2,059,+5mm
ol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド1.65?(
10mmol)の溶液を0℃でアルゴン下に攪拌しなが
ら冷却し、ジシクロへキシルカルlジイミド1.13 
fイ5.5 mmo 1 )を加えた。冷却浴を除去し
、反応混合物を室温で3時間攪拌し、その後前記の第一
アミン1.5 f (5mmol )を加えた。室温で
一□夜攪拌した後、溶剤を除来し、残渣をシリカゲルで
クロマトグツフィー処理し、7 : s v/マのエタ
ノール:IM水性重炭酸トリエチルアンモニウムで溶離
した。
こうして15Fの生成物が黄褐色ガラス状固体として得
られた。
分析: Cs5HnNsOi ・H*0として、CHN 計算値  6a8B   &79  11.82実測値
  6 &32   &83  1118この物質(1
,5f、、 12mmol )をトリフルオル酢醗中で
一10℃で3時間攪拌して、tert−ブチルオキシカ
ルボニル保護基を除去した。生成する第二アミンをそれ
以上精製しなかった。
これを50wJの水に取り濃NaOH溶液でpHを8.
0に調節した。
7−β−ガラクトシルクマリン−3−カルボン酸(前記
) 80011F(2,2mmol )及びN−ヒドロ
キシスクシンイミド50011g(5゜3mmol)を
DMF 10sLlに溶かすことによって第二の溶液を
製造した。この溶液をアルゴン下に攪拌しながら0℃に
冷却し、ジシクロへキシルカルlジイミド489Mg(
!4mmol)を添加した。
冷却浴を除去し、反応混合物を室温に加温し、2時間攪
拌して、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを生成
させた。
第二アミンのpH8の水溶液を0℃に冷却し、これに活
性エステルのDMP溶液を5分にわたって滴加し、更に
10−のDMFを加えるが、その間温度を5℃より低く
保持した。最終溶液のpHを水酸化ナシリウムで7.0
に調節し、反応混合物を室温で4時間攪拌した。粗生成
物を18ofの珪酸でりt2マドグラフィー処理し、2
tのエタノール〜2tの7 = 3 v/vのエタノ−
h : I M重1i1WIII )リエチルアンモニ
ウムを線状勾配で用いて溶離した。こうして900II
Pの所望の生成物がガラス状固体として得られな。
この生成物300”fをセファデックスLH−20の9
0asX!5mのカラムでクロマトグツフィー処理し、
メタノールで溶離した。式(■)の化合物16011F
が淡黄褐色ガラス状固体として得られた。
分析=C膠・−6N・O凰3として、 HN 計算値  6168  7.65  8.91実測値 
 63.53  6.82   &65β−ガラクトシ
ル−ウンベリフェロン−ピペラジニル−キニジン複合体
(F/)の前記の合成操作を羨更し、■の合成に使用し
たエチル5−プロモプチレートを適当なエチルω−クロ
a −又はブリモアルカノエートX −(OH,)、 
−Co。
C,H,で代えることによってr=1〜9の複合体を製
造するこ、とができる。r=1〜4の例は市販されてお
り、r=5〜9の例はバーシャー(I3arger )
ら著、J、Chem、Soc、1937 : 714、
サル%ンーリガグナー(8t1mon−Legagne
ur )着、Bul l、 8oc、 Chem、 F
rance 1956 :411及びリネル(L五nn
ell)及びボラ(Vora)著、J、 Pharm、
 Pharmacol、 4 : 55 (1952)
に記載されている。
■の合成に使用した1−(3−アミノプロピル) −4
−(3−tert−プチルオキシ力ルポニルアミノーブ
pビA/)ビイラジンを適当な14ジ置換ピペラジンG
(反応式2参照)で代えることによってn = 2〜9
、m+=2〜9の複合体を製造することができた。
反応式2 %式% Gのような中間体は、1当量の適当に保護されたーーア
ミノアルデヒドAでピペラジンを還元アルキル化するこ
とによって得られる。′生成するモノー奮換ピペラジン
Dを次に、保−された第二のω−アミノアルデヒドEで
アルキル化することによって1.4−ジ置換体Fに変え
ることができる。m = nの場谷\G及びG/は同一
であってよい。m〜nの場合、保護基G及びG′は、中
間体Fを生成するため、一方が他方の存在で選択的に除
去されるように選択しなければならない。陵性または塩
基性条件下に接触水素添加または弗素イオン、ヒドラジ
ン略のような特殊な試薬によって除去される多数の保護
基が知られている〔グリーン(Greens )の前掲
文献参照〕。
B、相対的蛍光強度及び蛍光の寿命の研究405 am
に設定した励起波長及び445 nmに設定した発光波
長を用いて8LM8000分光−蛍光計(イリノイ州つ
ルバナのSLMインストラメンツ社(8LM  Ins
truments 、 Inc、 )テ相対的蛍光強度
を測定した。蛍光の寿命は、スペンサー(8pence
r )及びウェーバ−(Weber)、Ann、N、Y
、Acad、8ci、 158:361 (1969)
に記載されている交差相関位@ (Cross−Cor
re −1at!on phase )及び変調蛍光針
によって測定した。
多数の蛍光分□・子の蛍光は、(1)励起前の基底状態
における分子反応による静的消光及び(2)励起された
一重項の寿命の間の反応による励起−重環状態の動的消
光によって影響される。消光物質の存在及び不存在で寿
命及び蛍光を測定すると、r=(τ0/τ)/FO/P
″)(式中τ。及びF。if消光瞼質の不存在における
寿命及び蛍光であり、T及びFは消光物質の存在におけ
る寿命及び蛍光である)であるから、励起時の非蛍光性
複合体の解離度rが得られる。
蛍光団が励起状鯵にある場合に消光対抗物(encou
nter )に対する二分子速度定数(ratecon
stant )である動的ステールンーフオルマ−(S
tern−Volmer)速度定数に:はh:=cL/
r−1/τ。−一1で得られ、基底状態での複合体形成
に関する平衡解離定数に、はに、=(1/γ−1)で得
られる。〔スペンサー及びウェーバ−蕾ストラクチャー
・アンド・ファンクシラン・オプーオキシデイション・
リダクション・エンザイム (8tructnre  
and  Function  of  0xidal
ionReduction Enzymes ) 、ア
クソン(Akesoa )ら編集、パージャモン・プレ
fi (Pergamos Preas ) にニー1
−り1972)393〜399頁〕。
結果を表Aに示す。4種の標−複合体(1−IV)のβ
−ガラクトシダーゼ分解の蛍光ウンベリフエ四ンー平ニ
シン生成物及び被分析物に接合していない蛍光性ウンベ
リフェロン誘導体([RA8jと記す)に関して、蛍光
データを集めた。
表     A ・物       結  合  手       相対
的蛍光  寿命(ナノ5e)((1)  なし    
          100%    1□+Gい「5
.2%     z3 4− cH,)r3                
 4.3 %      2.6−+ax、yr1−c
cHs九     42.41   13℃−ノ N−(2−ヒト四キシエチル)−7−ヒトロキシクマリ
ンー3−カルボキシアミ(米国特許第4.273.71
5号明細書I93    13.05   1.2xl
O’5IIe−’95    1&43   0.6x
101戴−1420,711,2xlO藤5lIIe−
1581,351,2110’5se−1ド ウンベリフェロン誘導体及び4種のウンベリ7エーンー
キニジン化合物におけるウンベリフェロン蛍光に関する
相対的量子効率は、ウンベリフェロン−キニジン化合物
におけるウンベリフェロン蛍光が種々の程度で消光され
る(表A)を示す。化合物■及び■は、予想されるウン
ベリフェロン蛍光のそれぞれ5.2%及び43%1゜か
示さないが、化合物■及び■はそれぞれ42.4襲及び
312%を示す。ウンベリフェロン誘導体及び4種のウ
ンベリフエpンーキニジン化合物におけるウンベリフェ
ロン蛍光の寿命も表Aに示す。
更に、計算した力学的パラメータ及び平衡パラメータを
挙げた表Aのデータは下記のことを示す: (1) p)Iasのビシン緩衝液中には26℃で、4
及び12個のメチレン基のアルキル連鎖を有するウンペ
リ7工腎ンーキニジン化合物は主として(I及び■にお
いてそれぞれ93%及び95襲)内部で積み重ねられた
形として存在する。剛性ピペラジン結合手を導入すると
、積み重ねた形はそれぞれ4個及び10個のメチレン基
を有する■及び■において42襲及び58%に減少する
(b)  ウンベリフェロンとキニジンとの間の分子内
反応は、結合がフレキシブルであζ場合に強い(■では
Ka=0.7及び■では14)。剛性ピペラジン結合手
を導入した場合、ウンベリフェロンとキニジンとの平衡
解離定数の14及び19倍の減少は剛性子の膜安定化効
果によると結論される。
(c)  0.6 X 10纂〜1.2 X 10’ 
5c−1に及ぶ4種のウンペリ7工四ンーキニジン化合
物の動的速度定数は低いが、動的消光は単なる拡散現象
であるので、これらは予想どおりほぼ同一である。
C,キニジン免疫分析 キニジンに関する基質標識蛍光免疫分析(SLPIA)
を下記のようにして実施した。
(1)試薬 A、抗体/酵素試薬−β−ガラクトシダーゼ5単位/l
を含むpH&5の50mMビシン緩衝液〔カルホルニア
州うジョラのカルパイ、オケムーベーリング(Calb
iochem−Behr!ng ) ) 、抗血清の不
存在での蛍光の20%に蛍光を減少させるに充分な、キ
ニジン免疫原に対する抗血清及び15.4mMナトリウ
ムアジド。
B、複合体試薬−0,92mMβ−fラクトシル−fl
ンベリ7エロンーキニジン(mV ) ヲ含t?pH3
,5の5 mMギ酸塩緩衝液、001%ツイーン20〔
アトラス−ケミカル社(AtlasChemical 
Co、及び15.4mMナトリウムアジド。
C,キニジン標準品−50mMビシン緩衝液で51倍に
希釈し、15.4mMナトリウムアジドを含む、正常ヒ
ト血清に加えたU8P−NF標準キニジングルコネート
ら (2)分析法 キュベツト中の抗体/酵素試薬3dに希釈した+=ジン
標準品100 stを加えた。反応を開始させるため、
複合体試薬100μtを各キュベツトに混合しながら加
えた。20分後、各キュベツトにおける蛍光強度を測定
した(励起400nm、発光450flffl)。
(3)結果 分析を実施して下記の結果を得た。
0     29.2 2.5     42.O NO61,0 7,577,6 1009(10 例  2 この例では、剛性を変えた標識複合体中の結合基を使用
して別の二発色団系を研究した。この系は蛍光標識とし
てのウンベリフェロン誘導体及び消光性被分哲:、物と
してのチロキシンから成る。蛍光物質及び被分析物を7
レキシブルな基(式v■及び■)及び剛性基(式■及び
■)を介して結合させた。
A、l1合体の製造 !−ガラクトシルーウンベリフェロンーチpキシン(V
)この化合物の構造は前記の式(V)で示される。
17.74F(0,1mol )の4−ア之ノプチルア
ルデヒドジェチルア七タール(アルドリッチ)、2L1
1Ll(0,16mol)のトリエチルアミン及び10
0gLlの乾燥エタノールから成る0℃の混合物に、2
1.3F(016mol)のエチルトリフルオルアセテ
ートを15分にわたって加えた。
反応混合物を室温に加湿し、−夜攪拌した。
溶剤を減圧下に除去し、残渣をエーテルに取り、食塩水
で洗浄した。有機相を乾燥し、濾過し、蒸発し、all
Iする褐色油を分留により精製すると、24.6 Fの
4−(トリフルオ曽アセドア叱ド)ブチルアルデヒドジ
エチルアセタールが沸点104〜105℃(0,01m
5+Hg)f)無色の′11 油として得られた。
分析: ”HNMRXヘク)# (CDCts) : 
1.2(t 、 J −7Hz、68) : 4.3 
(m、 4)1);  12〜4.0 (m、  6H
) ; 4.5 (t 、  J= 5 Hz、IH)
; 6.3 (s、IH)、赤外線スペクトル(ニー)
):1705B  (CO)。
テトラヒト賞フラン(TH1?):酢酸:H,0(1:
t:t)3o−中の前記アセタール3.1f (12m
mol )の溶液をアルゴン下で室温で48時間攪拌し
た。蒸発して得られた油を101? (12mmol 
)のチロキシンエチルエステル〔クレイトン(C1ay
ton )及びヘムス(Hems)、J、Chem、S
oc、1950:840)及び275−の無水エタノー
ルと合せた。シアノ水素化硼素ナトリウム(4224,
51g mmol )を加え、混合物を室温で24時間
攪拌した。反応混合物を濾過し、減圧下に蒸発し、残分
を塩化メチレン:酢酸エチルから再結晶すると、4.3
29のN−(4−トリフルオロアセトアミドブチル)チ
ロキシンエチルエステルが融点202〜204℃の白色
粉末として得られた。
分析: C雪sHf*mLFsN寓Os ・2HsOと
してCHN 計算値  27.40   !70  178実測値 
 27.36  2.45  2,77無水エタノール
10〇−中のN−(4−トリフルオロアセトアミドブチ
ル)チロキシンエチルエステル2−5 f (Z6mm
ol )の溶液を加熱還流し、塩化水素で7時間処理し
た。反応混合物を冷却し、減圧下に濃縮し、残分をエタ
ノール−エーテルから2回沈酸させると、2.1fのN
−(4−アミノブチル)チロキシンエチルエステル2塩
酸塩がオアーホワイトの粉末として得られた。これをビ
スエタルレートとして分析した。
分析: C*tHzs l4CI4N*04・2(C雪
へ〇):c    HN 計算値  211L84  3.67  2.69実測
値  29.32   &28  2.910℃の乾燥
DMF3d中の前記7−β−ガラクトシルクマリン−3
−カルボン酸184Ng(0、5mmol ) 及びN
−ヒドロキシスクシンイミド64119(0,55mm
ol )にジシp g ヘ4 シにカルボジイミド10
82? (0,5mmol )及びDMFo、75m/
を加えた。反応混合物を室温に加温し、90分攪拌し、
次にトリエチルアミン0.350111j(5当量)を
含むジメチルスルホキシド(DM80)5−に前記の2
塩酸塩521■(0,5mmol )を溶解して製造し
た第二の溶液と混合した。室温で24時間攪拌した後、
溶剤を除去し、珪酸70fでクロマドグラフイー処理し
、酢酸エチル〜1 : 1 v/vの酢酸エチル:エタ
ノールを線状勾配で用いて溶離した。エタノールから再
結晶すると、318119のN−(4−(7−β−ガラ
クトシルクマリン−3−カルlキシアミド)ブチル〕チ
ロキシンのエチルエステルが融点118℃の白色粉末と
して得られたO 分析: C5vHssIaN*OxmとしてCHN 計算値  36.24  112  1.96実測値 
 3602   Z97  1.90前記のエチルエス
テル56911P(0,5mmol )に水性メタノー
ル中の7 % KICOs 11液23mを加えた。室
温で24時間攪拌した後、澄明な溶液が得られた。H,
0で60−に希釈し、希酢酸でpHtt6.Oに調節し
た。こうして得られた沈澱を熱メタノールで洗浄すると
、48919のN−〔4−(7−β−ガラクトシル−ク
マリン−3−カルlキシ7尖ド)ブチル〕チロキシン(
v)が融点186℃の白色固体として得られた。
分析:CK八、I4N諺0凰$として HN 計算値  3108  286   Z34実測値  
3468   I94   I91この化合物の構造は
式(W)で示される。
DMF20+wj中の前記7−β−ガラクトシル−クマ
リン−3−カルlン11366119 (Iylnol
)、N−ヒトルキシスクシンイミド11519(1mm
ol )及びジシク田へキシルカルボシイ鷹ト2061
jp(1mmol)の溶液を室温で1時間攪拌した。こ
れにチロキシンエチルエステル805”F (1mmo
l )を加え、反応混合物を一夜攪拌した。溶剤を除去
し、粗生成物をシリカゲル250tでりVマドグラフィ
ー処理し、酢酸エチル:エタノールで溶離した。エタノ
ールから再結晶すると、式(M)の化合物34019が
融点187〜188℃の白色固体として得られた。
分析: Cs5H*eI4NO*sとしてHN 計算値  34.31  2.53  1.21実測値
  34.77   ’187  1.17β−ガラク
トシル−ウンベリフェロン−チロキシンエチルエステル
(■) この化金物の構造は前記の式(■)で示されるO DMFl 0om中の前記7−β−ガラクトシルクマリ
ン−3−カルボン酸:lL67F(10mmol ) 
、N−ヒトルキシスクシンイミド1.05f (10m
mol )及びジシクνへキシルカルボシイ主ド2−0
6 f (10mmol )の溶液を室温で2時間攪拌
した。この溶液を濾過し、濾液を水100d中の6一ア
文ノへキサン酸1.45 ?(10mmol )及びト
リエチルアミン2..02f(20almol )の0
℃の溶液に15分間にわたって製部した。2時間後、溶
剤を除去し、残留する油を珪酸でクロマトグラフィー処
理し、酢酸エチル:エタノール混合物で溶離した。エタ
ノールから再結晶すると、2tのN−(5−カルボキシ
ペンチル)−7−β−ガラクトシルクマリン−3−カル
ボキシアミドが融点170℃の淡黄色結晶として得られ
た。
分析’ cat八丁へ011として CHN 計算値  54,88  5,65  2.91実測値
  54.27   Fk、65  191この114
81 W (1mmol )、トリエチルアミン101
”%’(1mmol)及びDMF 10t/の混合物を
アルゴン下に攪拌しながら一1θ℃に冷却した。この混
合物に136IlvのりUロギ酸イソブチルを加え、1
5分後885 W (1,1mmol)のチロキシンエ
チルエステルを加えた。反応混合物を一1θ℃で1時間
攪拌し、室温に一夜加温した。溶剤を除去し、残渣なシ
リカゲルでクロマトグラフィー処理し、酢酸エチル−エ
タノール混合物で溶離した。メタノールから再結晶する
と、400■の式(■)の化合物が融点148℃の白色
固体として得られた。
分析8Cs−也・I4N鵞O!意としてCHN 計算値  36,93  3.18  2−21実個値
  37.61   155  2..13この化合物
の構造は前記の式(■)で示される。
DMF2501E11?中で1−(2−)リフルオロア
セトアミドエチル)ピペラジン(562,025m01
)、トリエチルアミン37.5m及びエチルクtwoア
セテート30.39 (0,27mol)を混合した。
温度を5分間で70℃に上昇させた。反応混合物を室温
で一夜攪拌し、次に濾過してトリエチルアンモニウム塩
酸塩を除去した。
溶剤を除去し、残留する油状残分を250Wllのクロ
ロホルムに取り毎回30011Llの水で2回洗浄した
。有機相を乾燥し、蒸発すると、51fの4−(2−ト
リフルオロアセドアミドエチル)ピペラジン−1−酢酸
エチルが黄褐色の固体として得られた。この固体をそれ
以上特性決定しないで、4:lのメタノール:水250
WLt中の水酸化カリウム20Fと共に6時間攪拌した
生成物をシリカゲル1400Fでクロマトグラフィー処
理し、4 ’ 4 : I V/V/Vのり00ホルム
、メタノール、濃水酸化アンモニウムで溶離した。メタ
ノールから再結晶すると、2L5ff)4−(2−アミ
ノエチル)ピペラジン−1−酢酸が融点225℃(分解
)の白色結晶として得られた。
DMF40+wJ中の前記7−β−ガラクトシルクマリ
ン−3−カルダン酸2.6 f (a 5 mm#1)
1N−ヒドロキシスクシンイミド730119(6゜5
mmol)及びジシクロへキシルカルボジイミド1.3
F(6,3mmol )の溶液を室温で36時間攪拌し
た。この溶液を濾過して沈澱したジシクロヘキシル尿素
を除去し、濾液を水40d中の4−(2−アミノエチル
)ピペラジン−1−酢酸1.2f(6,4mmol )
の冷溶液に製部した。
これに52089(6,2mmol )のNaHCOs
を加え、反応混合物を一夜室温に加温した。生成した沈
澱を水:2−プロパツールから再結晶すると、2=29
の4−(2−(7−β−ガラクトシルクマリン−3−カ
ルボキシアミド)エチルコピペラジン−1−酢酸(標識
酸誘導体)が白色固体として得られた。250■の試料
を水:メタノールから再結晶すると、融点187〜19
2℃の白色結晶18011Fが得られた。
分析:C篇、HaIO,1−H,0としてCHN 計算値  51.89   m98  7.46実測値
  51.87   m90  7.90111記のN
−(4−トリフルオロアセドア宅ドブチル)チロキシン
エチルエステル(!Of。
1m 1 mmo l )を20mのテトラヒトt2ヤ
フンに溶かしN 41dの2N水酸化ナトリウム溶液と
混合した。混合物を一夜アルゴン下に50℃で攪拌した
。溶剤を蒸発し、残渣1lr5tの珪酸でクロマトグラ
フィー処理した。カラムをクロルホルム:メタノール:
濃水酸化アンモニウムの2:1:1及び111:IV/
マ/V混合物の下相のそれぞれ3tで順次溶離した。得
られたオアーホワイトの粉末を2N水酸化ナトリウム5
11Llを含むエタノールに溶かし、木炭で処理し、濾
過し、酢酸で沈澱させると、N−(4−アミノブチル)
チロキシン1.5 fが融点166℃(分解)の白色粉
末として得られた。
分析: CmsHs* I4 N5Os −1%0とし
てCHN 計算値  26.85  161  3.30実測値 
 26..47  2,51  3.29メタノール3
〇−中のN−(4−アミノブチル)チロキシン1.35
 f (1,6mmol )の懸濁液をHCI ガスで
2分処理し、次に48時間還流した。蒸発し、メタノー
ルから再結晶すると、N−(4−アミノブチル)チロキ
シンメチルエステルの2塩酸塩1.35 fが得られた
分析: CmoH*s IaNmOm ・2 HC1と
してCHN 計算値  26.14  163  3.05実測値 
 25.16   m66  3.09DMFBd中の
標識酸誘導体269wg(05mmol)及びN−ヒド
ロキシスクシンイミド51w9(0,55mmol )
(F)溶液をθ℃km[l、DMFZd中のジシクロへ
キシルカルボジイミド11211F(’0.54mmo
l )の溶液と混合した。
反応混合物を室温に加温し、48時間攪拌した。
濾過し、濾液を下記のようにして製造した第二の溶液に
加えた。
DMFl 0d中の前記2塩酸塩メチルエステル477
WN(0,5mmol )に固体重炭酸ナトリウムi 
2 sag(1,5mmol )を加えた010分間攪
拌した後、標識酸誘導体のN−ヒトルキシスクシンイミ
ドエステルを含む濾液を加えた。
鏝終溶液を20時間攪拌し、更に重炭酸ナトリウム42
11F(0,5mmol )を加え1、攪拌を更に20
時間続けた。反応混合物を濾過し、溶剤を除まし、残渣
な珪酸100fでクロマトグラフィー処理した。カラム
を1tのエタノール〜1tの4 : 1 v/vエタノ
ール:IM重炭讃トリエチルアンモニウム水溶液を線状
勾配で用いて溶離した。こうして得た粗生成物をセファ
デックスLH−20で再度クロマトグラフィー処理し、
メタノールで溶離した。メタノール−酢酸エチルから再
結晶すると、式(■)のメチルエステル191111P
が融点125℃のオフ−ホライトの粉末として得られた
分析: CaaHa* l4NIO14としてCH′・
・・  N 計算値  31L25  3.72   [07実測値
  37.92  4.01  499前記エステル2
30岬(166xmol)及び70襲水性メ、タノール
中の7%炭酸カリウム溶液&53dの混合物を24時間
攪拌し、水で22−の総量に希釈した。希酢酸でpHを
6.0に調節した。生成した沈澱を濾過し、乾燥すると
、1B119の黄褐色の粉末が得られた。この試料13
0■を熱DMF 2+wjに溶かし、濾過し、無水エタ
ノール4.7dで希釈した。冷却すると、式(■)の化
合物98岬が融点203℃(分解、180℃から暗色に
なる)の淡ベージュ色粉末として得られた。
分析: Ca5Hn l4NIO14としてHN 計算値  37.76  3,61   5.12実測
値  35.50  3,43  4.35β−ガラク
トシル−ウンベリフェロン−ピペラジニル−チロキシン
資金体(■)の前記合成法を変簀して、n = 2〜9
、m = 2〜9、p=1、r:=:2〜9であり、β
!及びβ雪がそれぞれHまたはIである複合体を下記の
ようにして製造することができる。
式(■)の合成において4−(2−ア之ノエチル)ピペ
ラジン−1−酢酸を適当な4−(ω−アミノアルキル)
ピペラジン−1−アルカン酸りで代えることによりn 
= 2〜9 、IB =e 2〜9の豪合体を製造する
ことができる〔反応式3参照〕。Lのような中間体は、
ピペラジンを1当量のX 4−CB、 罎C00C:n
 Hl (式中Xは前記のような脱離基を褒わす)と反
応させてモノ−アルキル体Hとすることによって製造す
ることができる。これを・−ヒト四キシアルデヒド(ハ
ード及びポーチの前記文献参照〕で還元アルキル化して
化合物Jにすることができ、そのアルコール基は1以上
の工程で脱離基(K)に変換することができる。後者の
中間体は、モノー置換ピペラジンHを前記の二官能性反
応体X + CHI)−1Yでアルキル化することによ
っても得られる。KからLへの変換は、脱離基Xを適当
な溶剤中でアタルイミドカリウムで置換することによっ
て達成することができる。JからLへの変換は前記の主
ツノ力の文献に記載されている方法で達成することがで
きる。中間体りを、エステル官能基の段階的除去(酸ま
たは塩基で緩和な処理)及び7タルイ主ド官能基の段階
的除去(ヒドラジンまたは強酸)によりMに変換するこ
とができる。
■の合成において4−アミノブチルアルデヒドジエチル
7セタールを・−アミノアルデヒドジエチルアセタール
Qで代えることによって、rが2〜9である複合体を製
造することができる〔反応式4参照〕。
゛ 反応式4 このようなアセタールは前記のω−ヒトpキシアルデヒ
ドアセタールN(ハードの前掲文献)から得られる。こ
れらのヒドロキシア七タールは、直接、前記攬ツノクの
操作によって、または間接的にヒドロキシ基を脱離基に
変え1種0)、次にXを7タルイミドカリウムで置換す
ることによってΦ−7タルイミドアルデヒドアセタール
Pに変えることができる。中間体Pをヒドラジンで処理
すると、ω−ア叱ノアルデヒドアセタールQが生成する
β−ガラクトシルーウンペリ7工pンービペラジ品ルー
チロキシン(IK) この化合物の構造は前記の式(K)で示される。
11.1 F(0,05mol)の1−(2−トリフル
オロ子七ドア之ドエチル)ピペラジン(アルドリッチ)
、9.911Llの3−クロロブ讐ピオンアルデヒドジ
エチルアセタール(アルドリッチ)、2.6Fの重炭酸
ナトリウム及び50sJのDM80の混合物を室温で3
日間攪拌した。更に9dの前記クロルアセタールを加え
、反応混合物を85℃で90分間加熱した。溶剤を除来
し、残渣をりopホルムに取り、水で3回洗浄し、乾燥
し、蒸発した。粗生成物を300fのシリカゲルでクロ
マトグラフィー処理し、160:10: 1 v/v/
vのクロロホルム、メタノール、濃水酸化アンモニウム
で溶離した。こうして3.5tの1−(3−ジエシキシ
プpビル)−4−(2−トリプルオロアセトアミドエチ
ル)ピペラジン(以下ジエチルアセタールと記す)が黄
色前として得られた。
分析:マススペクトル(70e、V、):m/e355
(M  );238(M  マイナスCH雪CH(OC
I)II )s ) :299 (M  マイナスCF
、CONncm−)。
ジエチルア七タール(50011v、 1.4 rrt
noj)を濃塩酸04−を含むテトラヒドロフラン2〇
−中で室温で4時間攪拌した。溶剤を蒸発し、3−(4
−(2−)リアルオロアセトアミドエチル)ピペラジニ
ル−1〕ブνビオンアルデヒド(以下アルデヒドと記す
)から成る残液を高度真空下に30分間乾燥した。チリ
キシンエチルエステルmall (1f 、 1.2 
mmoj )を95−水性エタノール15sdに溶かし
た。アルデヒドを加え、次に1当量の20%水酸化ナト
リウムを加えて、I)H5,Oの溶液が得られた。この
溶液に300”lF(48mmol )のシアノ本書化
硼素ナトリウムを加えた。室温で3日間攪拌した後、反
応生成物を1001のシリカゲルでクーマドグラフィー
処理し、160:10:IV/マ/Vのクロルホルム:
メタノール:濃水酸化アンモニウムで溶離すると、62
011FのT4エステル中間体が融点84〜90℃の白
色粉末として得られた。
分析:C3魯HsmFsIa NaへとしてCHN 計算値  31,45  3.02  124実測値 
 3092  180  5.00600Mfl(05
6mmol )の前記T4 X X ? k中間体を、
水10d中に8−一水酸化カリウム11tを溶かすこと
によって作った溶液1dに溶かした。室温で48時間攪
拌した後、薄層クロマトグラフィー(シリカゲル上、4
:4:1マ/ V / Vクロロホルム:メタノール:
濃水酸化アンモニウム)処理すると、N−((3−(4
−(2−アくノエチル)ピペラジニル−1〕プロピル〕
〕チロキシンc以下T4酸中間体と記す)に完全に変換
したことが判った。溶剤を除去し、残渣を水10−に取
った。溶液のpHを重炭酸ナトリウムで9.0に調節し
、DMF40MIを加えた。
同時に、230”9(0,62mmol )の前記7−
β−ガラクトシルクマリン−3−カルボン酸及び701
9(0,67mmol )のN−ヒドロキシスクシンイ
ミドを5−のDMFに溶かし、0℃に冷却した。ジシク
ロへキシルカルボジイミド(12711F、 062m
mol )を加え、溶液を室温に加温し、3時間攪拌し
た。ジシクロヘキシル尿素の沈澱を濾過により除去し、
濾液をT4酸中間体の冷(−5℃)溶液に加えた。合し
た溶液を一夜攪拌した。溶剤を除去し、残渣を1002
のシリカゲルでり田マドグラフィー処理し、5:1マ/
Vエタノール:1M重炭酸トリエチルアンモニウム水溶
液で溶離した。こうして、230岬のチロキシン誘導体
(■)が融点207〜215℃(分解)の白色固体とし
て得られた。
分析:C4・H44I4 Na Ou ・′地0として
CHN 計算値  36.05  3.63  420実測値 
 35.87  3.89  4.06β−ガラクトシ
ルーウンベリ7工四ンービペラジニルーチpキシン豪合
体(K)の前記合成法を変更して、■の合成における4
−(2−アミノエチル)ピペラジン−1−酢蒙を■に示
したような適当な4−(61−アミノアルキル)ピペラ
ジン−1−アルカン酸Mで代えることによって烏=2−
〜9、m=2〜9の複合体を製造することができる。
B、相対的蛍光強度の研宛 4 Q Q nmに設定した励起波長及び459 nm
に設定した発光波長を用いてアミンコ・ボーマン分光蛍
光針(Am1nco Bownan 8peetrof
luoro−meter ) (メリーランド州シルパ
ースプリンゲスのアメリカン・インスシラメント社(、
^mericanInstrument Co、 ) 
)で測定した。
結果を表Bに示す。前記の5種の標識複合体(V−IK
 )をβ−ガラクトシダーゼで分解した蛍光性ウンペリ
7工pンーチpキシン生成物及び被分析物に結合してな
い蛍光性ウンベリ7工pン誘導体(@RA8”と記す)
について蛍光データを集めた。
データから、結合手にN、N/−ビペラジニレン基を挿
入す、ると、蛍光物質標識はその正常な蛍光(未結合、
即ちクンペリ7工四ン誘導体の蛍光)の約20弧の蛍光
を示すことが判った。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)  被分析物まえはその結合アナp−グ及び発光
    性標識から成る標識複合体を含む試験系と試験試料を混
    合し、これKより酋記榔H合体の結合種及び遊離種を含
    む反応混合物を形成させ、前記遊離−が励起すると発光
    しうる発光団(phot・phor ) K結合し大前
    記値分析物またはアナローブから成る被分析物−一党団
    一複合体を生成し、前記被分析物−発光団一複舎体の被
    分析−まえはアナ四−グ部分が員光団と消光配列に1に
    ′)えと1にそのような発光を着しく減少することかで
    11.前記l1lFl#種または遊離種中の前記発光団
    を#匍し、1じる発光を試料中の被分析物の画数として
    一定することKより、試験試料中の拳分析物を一定する
    特異結合分析において;前記標識複合体中の前記被分析
    物またはアナローブを、前記発色団と前記被分析物また
    はアナローブ部分との消光配列な実質的に妨害する結合
    基によって前記発光性標識に結合させること及びそのよ
    うな結合基がビペラジニレン、フェニレン、シクロヘキ
    シレン、2価炭素同嵩濃及びヘテロ濃縮合i1%アセチ
    レ′ン、ビス−置換単糖類、2価ビシクロオクタンロッ
    ド及び2価スビp−結合濃構造から選択され九基から成
    ることを特徴とする試験試料中の被分析物を一定する特
    異結合分析法。 +21  前記結合基がN 、 N’−ビペラジニレン
    基から成る特許請求の範Il篇1項記載の分析法。 (3)  前記発光団が螢光物質である特許請求の範囲
    第1項記載の分析法。 (4)  前記標識複合体が遊離種である場合に比べて
    結合種で存在する場合に1発光団の発光性が測定可能K
    ik1にり、前記発光団を反応混合物中で励起肯せ、生
    じる発、光が試料中の被分折物の函数である均−置の特
    許請求の1IliI第1項記載の分析法。 (5)Cd  被分析物の結合対手、及び伽)前記被分
    析物まえはその結合7ナローグ及び発光性amから成る
    標識複合体 から威p%この試薬系を試験試料と拠金して筐体反応混
    合物にすると、前記標識複合体の結合対手−緒金種及び
    遊離種が生威し、前記遊離種が励起すると発光しうる発
    光mに紬含し大前記被分析物またはアナローブかう虞為
    被分析物−発光団−複合体を生威し、前記被分析物−発
    光団−複合体の被分析物資えはアナローブ部分が発光団
    と消光配列に1に′:)えと11にそのような発光を著
    しく減少す為ことができる。試験試料中の被分析物の特
    異結合分析用の試薬系において;前記被分析物書えはア
    ナ田−グが、前記発色団と前記被分析物★たはアナロー
    ブ部分との消光配列を実質的に妨害する一合基によって
    前記標識複合体中の前記発光性標識に結合し、そのよう
    な結合基がピペラジニレン、フェニレン、シクロヘキシ
    レン、2価炭素同sm及びヘテロ壌式縮合濃、アセチレ
    ン、ビスー置換拳糖類%2価ビシクロオクタンロッド及
    び2価スピロ−結合製構造から選択された基から成るこ
    とを%像とする試験試料中の被分析物の特異結合分析用
    の試薬系。 (6)前記結合基がN、N’−ビペラジニレンかう成る
    特許請求の範S菖5項記載の試薬系。 ゛(7)前記発光団が螢光物質である特許請求の範WA
    第5項記載の試薬系。 (8)励起すると発光しうる発光団に化学的に結合され
    た前記被分析物またはその結合アナローブからなり、該
    発光が、複合体の被分析物またはアナローブ部分が発光
    団と消光配列になる場合に着しく減少する。試験試料中
    の被分析物の特異分析測定に使用する標識複合体におい
    て;前記被分析物またはアナローブが。 前記発光団と前記被分析物またはアナローブ部分との消
    光配列を実質的に妨害する結合基によって前記発光団に
    結合し、該結合基がビペラジニレン、フェニレン、シク
    ロヘキシレン、2m炭素同**及びヘテロ褒式纏舎濃、
    アセチレン、ビスー置換単糠II1.2価ビシク■オク
    タンpツド及び2価スヒロー曽舎拳構造から選択された
    基から成ることを4111とする試験試料中の被分析物
    の特異結合分析用の標識複合体。 (一式: 〔式中wz #i2〜9の整数であ〕、1は3〜9の整
    数であIll、 Ra!艙舎基でToMhL&!被分析
    物またはそのアナローブである〕の!−ガラクトシルー
    ウンベリフエpンー標識複金体。 I@Lが分子量1500未満のハプテンである特許請求
    の範I!1篇9項記載の複合体。
JP1448183A 1982-02-01 1983-01-31 試験試料中の被分析物を測定する特異結合分析法、該分析法に使用する試薬系及び標識複合体 Pending JPS58142257A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34460782A 1982-02-01 1982-02-01
US344607 1982-02-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS58142257A true JPS58142257A (ja) 1983-08-24

Family

ID=23351224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1448183A Pending JPS58142257A (ja) 1982-02-01 1983-01-31 試験試料中の被分析物を測定する特異結合分析法、該分析法に使用する試薬系及び標識複合体

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0087564A1 (ja)
JP (1) JPS58142257A (ja)
AU (1) AU9094982A (ja)
ES (1) ES519447A0 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60146155A (ja) * 1983-12-29 1985-08-01 ザウエルシユ ナシヨナル スク−ル オブ メデイシン 物質の検出及び定量に用いる免疫学的方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0134307B1 (de) * 1983-07-29 1989-04-19 Henning Berlin GmbH Chemie und Pharmawerk Voraktivierte Kunststoffoberflächen zur Immobilisierung von organisch-chemischen und biologischen Materialien, Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben
US4743535A (en) * 1984-11-07 1988-05-10 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
EP0144913A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-20 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
IL73579A0 (en) * 1983-12-12 1985-02-28 Miles Lab Hybridization assay employing labeled probe and antihybrid
IL73580A0 (en) * 1983-12-12 1985-02-28 Miles Lab Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents
EP0144914A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-13 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents
JPH0534345A (ja) * 1991-02-19 1993-02-09 Tdk Corp 化学発光を利用する抗原・抗体の測定方法
US5741715A (en) * 1995-05-30 1998-04-21 Roche Diagnostic Systems, Inc. Quinidine immunoassay and reagents
DE202010010103U1 (de) 2010-07-09 2011-11-04 Sudhaus Gmbh & Co. Kg Lenkrolle für Koffer, Gepäckstücke, Transportbehälter o.dgl.
WO2020108657A1 (zh) * 2018-11-30 2020-06-04 厦门甘宝利生物医药有限公司 含有肝靶向特异性配体和甲状腺素受体激动剂的药物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4130462A (en) * 1976-12-16 1978-12-19 Syva Company Receptor steric hindrance immunoassay for receptor determination
US4279992A (en) * 1978-03-13 1981-07-21 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay employing an enzyme-cleavable substrate as label

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60146155A (ja) * 1983-12-29 1985-08-01 ザウエルシユ ナシヨナル スク−ル オブ メデイシン 物質の検出及び定量に用いる免疫学的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES8402939A1 (es) 1984-03-01
AU9094982A (en) 1983-08-11
ES519447A0 (es) 1984-03-01
EP0087564A1 (en) 1983-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4160016A (en) Receptor fluorescent immunoassay
EP0108399B1 (en) Substituted carboxyfluoresceins
EP2467139B1 (en) Imatinib immunoassay
EP1846763B1 (en) 5-fluoro-uracil immunoassay
CN104704366B (zh) 异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物
US4495281A (en) Tricyclic antidepressant drug immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
JPS6323882A (ja) アヘンアルカロイドおよびそれらの代謝物のための免疫検定法、トレ−サ−、免疫原および抗体
JP4435305B2 (ja) トピラメートのイムノアッセイ、並びに類似体及び抗体
DE2913549A1 (de) Chemisch induzierter fluoreszenz- immuntest und testreagens zu dessen durchfuehrung
JPS58757A (ja) 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット
JPS58142257A (ja) 試験試料中の被分析物を測定する特異結合分析法、該分析法に使用する試薬系及び標識複合体
CA1339439C (en) Benzodiazepines assay, tracers, immunogens and antibodies
WO1992012975A1 (en) Haptens, tracers, immunogens and antibodies for immunoassays for cotinine
EP1216994B1 (en) Tricyclic antidepressant derivatives and immunoassay
CN107003304A (zh) 用于羟考酮和羟吗啡酮的测定法的缀合物
CA1270819A (en) Compounds and assay for tricyclic antidepressants
EP0875762A2 (en) Immunogens for raising antibodies useful in methadone fluorescence polarization immunoassay
JPS59101481A (ja) 置換カルボキシフルオレセイン
GB2023609A (en) Flavin-adenine-dinucleotide Derivatives for Use in Specific Binding Assays
JP3130043B2 (ja) プロポキシフェンのイムノアッセイ用ハプテン、トレーサー、免疫原および抗体
CA2836539A1 (en) Gemcitabine immunoassay
JPH06316599A (ja) ジフェンヒドラミンおよびその代謝産物の免疫学的測定のための組成物および方法
CA1338763C (en) Compounds and assay for tricyclic antidepressants
Thomas SYNTHESIS AND EVALUATION OF FLUORESCENT REAGENTS FOR THE STUDY OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS.
JPS63503142A (ja) 新規なフレカイニド誘導体およびイムノアッセイにおけるその応用