JPS60146155A - 物質の検出及び定量に用いる免疫学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質、ポリペプチド、ハプテンその他生物学
的に興味のある物ηの分析、試験又は検出に用いるため
の方法に関するものである。

本発明では、化学発光性分子でラベルした抗原、ハプテ
ン又は抗体を使って免疫体を形成させ、それを被分析物
質量を示すものとして利用するものである。従来、その
ような生物学的分子にラベルするには放射性同位体が用
いられたが、そうすると安定性や鋭敏性を失ない、測定
や廃棄に不便であるという問題が起る。それとは反対に
、化学発光によるラベルには危険がなく、安定で、簡単
なフォトン計数器を使って高感度で検出することができ
る。本発明においては化学発光という語を用いていて、
この現象を他種の発光現象、例えば蛍光、燐光など、と
区別しているが、関連のある生物発光現象は化学発光に
含めている。本発明のも５１つの観点では、免疫体の濃
度、従って被分析物質の＃度、を調べるには、上述のラ
ベル化学種が免疫体を生成するときの化学発光反応に関
するある種の物理化学的パラメーターの変化を利用する
のである。

本発明を好ましい形で遂行した場合には、これらの変化
は化学発光反応の進行速度に現われ、特に励起状態の形
成速度やその後の復帰速度に現われる。被分析物質の濃
度をめるために、ラベルされた免疫反応物の被分析物質
に結合したものと結合していないものを事前に分離して
おかなくてもよいというのが本発明に特有な重要な特徴
である。

多くの化学種が化学発光をする能力を持っていて、それ
は発熱反応で生成した振動的励起物ηがフォトンを出し
ながら基底状態に復帰するときに見られる現象である。

その種の反応は通常は酸化的なものであって、触媒成分
が関与する場合としない場合がある。例えばルミノール
は化学発光反応をするときに触媒の存在が必要であるが
、アクリジニウム・エステルは触媒を要しない。太ざつ
ばに言えば、化学発光反応には２つの段階があり、励起
状態の形成およびその後に起る非励起状態すなわち基底
状態への復帰である。ある１つの励起状態がフォトンを
放射してエネルギを失って対応する基底状態へ戻るとき
、その復帰速度は励起状態にある分子の濃度に比例する
。このような反応の復帰速度係数（それは前述の比例性
を等しくするようであるが）は１次であり、励起状態に
あるものの濃度は反応の全時間の１部分に当る（ｆニア
定の時間増分に指数関数的に関係する。

励起状態生成速度はその励起状態が単純に解消するのに
比べると本質的にもつと複雑な関係である。生成速度は
その励起状態の先駆物質の濃度（すなわち励起を受ける
前の分子発光性ラベルの濃度）の関数であり、また系中
にある他の反応物質の濃度の関数でもある。この例の励
起速度係数は励起状態生成に関与する反応に係わるいく
つかの速度パラメーターと熱力学パラメーターから成る
ものである、そのため、化学発光をする分子が事前に化
学的や物理的な相互作用をした際に起るようなパラメー
ターの変化があった場合には、その変化は励起状態の変
化として現われる。さらに、そのような変化はまたフォ
トンの放射数又は放射速度と反応生起の時間増分の間の
関係としても現われてくる。ある化学発光反応を定量的
に表現するのに励起相を利用すると大へん有利である。

第１に極めて迅速に行えて、１秒以下で正確な測定がで
きる。

第２には時間尺度が短いのでバックグランド値が小さく
、その結果として検出感度が高まる。

そして第３に速度測定を用〜・ると内部フィルタ効果に
よる妨害が小さくなる。

大まかに言って、本発明は生物学的に興味のある物質を
免疫試験を行なうことによって検出、分析、定量及び所
在場所決定を行なう方法に特徴があるもので、その試験
においては免疫反応の第１成分は抗原、ハプテン又は抗
体の形となっていて化学発光反応の１つ以上の成分と結
合しており、免疫反応の他方の成分、すなわち被分析物
質、はそれと錯体を形成して、その後の発光反応でエン
トロピー及び、又はエンタルピー変化を起すもとになっ
ていて、非錯化ラベル成分と対照的であり、その反応は
観察比較によって免疫錯体形成に関する情報を提供する
ものである。この際の発光強度、フォトン放射速度、発
光強度の変化速度などは非錯化成分の同じ性質とを観察
し比較するのが望ましい。

フォトン放射の強度または速度（従って励起状態濃度）
とラベルされた免・疫反応体の発光反応開始後の反応時
間を関係付ける関数をまずグラフで表わすのが望ましい
。もう１つのグラフとして、いま問題としている被分析
物ηとともに予め詳卵器に入れておいたラベル化免疫原
についてもグラフを作製する。関数の変数の１つに対応
して、どこかの点で関係式を表わすグラフの傾きに変化
があれば、それは被分析物質の濃度の尺度であり、一連
の既知の（同じ被分析物質の）濃度を用いたものと比較
（して未知濃度が決定）される。もしラベルされた免疫
反応体がラベル化抗原又はハプテンであって、競争結合
系に用いられているならば、非結合のラベル化免疫反応
体についての速度的と熱力学的のパラメーターを、被分
析物質や抗体又は結合タンパクと共に予め培養したラベ
ル化免疫反応体のパラメーターと比較してみる。フォト
ン放射速度を変化させる結果となる速度的及び熱力学的
パラメーターの変化は被分析物質濃度に反比例するだろ
う、ラベル化免疫反応体がラベル化抗体である場合は、
後者を類似の競争反応系に使って、血清のような生物学
的流体中の抗体を測定するのに用いられるだろう。本発
明の１つの望ましい適用形態として、ラベルされた抗体
を被分析物質の存在址よりもモル的に過剰に用いるのが
よい。過剰量は５００％でも可能であるが、１００％を
越えないのがよい。さらに良いのは２０チ程度である。

本発明ではさらに、速度変化の観測値は固定抗体を用い
て形成された免疫錯体の形を太き（すると増巾すること
ができる。この場合、重合させた抗原と抗体をセルロー
スなどの固体支持体に結合させたものな用いて抗原抗体
錯体の寸法を大きくすると、励起速度の変化が大きくな
る。

被分析分質の量が、励起状態濃度（又は励起状態濃度の
変化速度又はそれがさらに偏った量）と反応時間とを関
係付ける関数のグラフ表示における変化として現われる
のが望ましい。これらのパラメーターは化学発光性ラベ
ルのフォトン放射（それはフォトン計数器で数えること
カーできる）の関数である。この関数又はその導関数の
いくつかのパラメーターを管現することによって被分析
物質の濃度について知ることができる。例えば反応経過
上の１点における関数の傾き、ある１点での計数値、反
応中のある部分での積分値、最大値又は予め選定された
値へ到着するのに要する時間及びいくつかの性質の組合
せなどについて知ることができるのである。

化学発光性ラベルとして望ましいものはアクリジニウム
塩、ルミノール、ジオキセタン、ビス−シュウ酸塩、フ
ルオレツセイン、ピロガロール、ルシゲニン、ロフィン
、フォトプロティン、及びこれらの誘導体で抗原、抗体
及びノ・ブテンと会合して化学４光性の免疫反応体を生
じるものである。

これまでのめ−系免疫試験法は酵素や蛍光性ラベルを用
いているが、本発明はそれと対照的に、小分子又はハブ
テンの測定に限定されることなく、すべての抗原化合物
の定量に適用されるものである。その抗原化合物として
は、医薬品（側光ばバルビッール酸塩、サリチル酸塩、
フェニトイン、モルフイン、ヘロイン、メトトレクセイ
ド、ジゴキシン）、ステロイド（例えばテストステロン
、フロゲステロン、エストラジオール、エストリオール
、コルチゾール、アルドステロン、ビタミンＤ）、ｉ式
ニュークレオチド、チロキシン、トリョードチロニン、
及びタンパク（例えばインシュリン、生長ホルモン、副
甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、グロラクチン、
副腎皮質刺激ホルモン、アルファフェトタンパク、フェ
リチン、ヒト免疫グロブリン（Ｉｆ）、インターフエレ
ン、袖体系の諸成分、およびバクテリアとウィルスの抗
原）があげられる。

これから分ることは、本発明は生物学的に興味ある物質
を均一系免疫試験法によって検出又は定量する方法を提
供するものであって、その方法では免疫錯体形成にある
程度依存して変化した物理化学的性質を持つ化学発光性
分子で抗原、抗体又はハプテンをラベルするのである。

本発明において均一系試験とは次のように定義されたも
のである。すなわちその試験におけるラベルの性質は免
疫錯体の形成敏とその濃度に依存して変えられ、その結
果として結合被分析物質と遊離の被分析物質を分離する
必要をなくしているものである。

本発明は諸種の異なる方式で実行できる。そのいくつか
の例を次に詳しく記載する。

実施例　１ ラベル化抗体を用いるヒト・アルファ１−フェトタンパ
クの均−系試Ｍ 一連のアルファフェトタンパク（ＡＦＰ　）の血清標準
溶液な′調製し、既知体積（５０μｔが望ましい）従っ
て既知量のＡＦＰを一連の試験用管に入れる。同体積の
未知血清を検査のため他の一連の試験用管に入れ、すべ
ての管に０．１　Ｍ　＋７７酸塩緩衝液ｐＨ６，３（１
００ｆｉｌ　）を加える。ＡＦＰ（多クローン及び単ク
ローン性）Ｋ対する抗体で、アクリジニウムエステルで
ラベルされ、望ましくはナノグラム当り２　Ｘ　１０’
発光計数の比活性を持つものをそれぞれの管に加え、Ａ
ＦＰ被分析物質より過剰になるようにする。管を室温の
ｈｌｉｔ＆に（３０分間がよいが）保ち、その後ルミノ
メータ−に入れて、化学発光反応開始で度に合わせて管
の分析速度を調節する。この化学発光反応は０．５Ｍ水
酸化ナトリウムと０．１　％（体積）のいわゆる“１ｏ
ｏボリユーム’（３０％束量／体積の意）とよばれろ過
酸化水素とを含む水溶液を適量の２００μｔだけ加える
ときに開始する。励起状態生成速度（すなわち適当な時
間にわたるフォトン放散速度）は標準及び未知の試料に
ついてフォトン計数器で測定する、そのやり方にはいく
つかの違った方法がある。１つの方法では、１秒間に放
散されるフォトンの全数を記録し、もう１つの方法では
フォトン放散速度を時間の関数として表わす関係式を微
分して反応開始時の速度を計算可能にしている。

いずれの場合にも被分析物質の濃度が未知の試料に対す
る結果は一連の既知量の被分析物質の標準を用いて作製
した検量線（その例を第３図と、第４図に示す）と比較
する。

第３図は均−系ラベル化抗体の免疫試験における化学発
光速度を時間及びＡＦＰ　８度の関数としてグラフ表示
したものである。３本の曲線は３つの異なるＡＦＰ濃度
、３２８　、１６４及び４１ｎｆ／ｎｔに対応するもの
である。第４図は定収された試薬量と応答を表わす曲線
であって、計数値が濃度と直線的に変る関係を示してい
る。

典型的な装置を第１図に図式的に示す。Ｐはフォトン計
数器、Ｒはデーター取得装置、ｌは積分器、Ｄは微分器
、Ｃは計算器、Ｌはプリンター、Ｍはディスク装置であ
る。第２図はフォトンの毎秒計数値を時間に対して描い
た典型的グラフ表示であって、現実の放散速度（曲線の
上の点の値）、変化速度（１点における曲線の傾き）、
全計数（曲線下の面８ｔ）が変化する様子を表わしてい
る。第２図で直線Ｘは反応の初期速度を示す傾きである
。この図から他の特性を誘導したり推論したりできるこ
とが分るだろう。例えば最大値に到達する時間、０．５
秒まで、あるいは他の任意の間隔内の計数値などがめら
れる。

実施例　２ ラベル化抗原を用いるヒト・アルファ１−フェトタンパ
ク（ＡＦＰ　）の均一系試験アクリジニウムエステル分
子でラベルしてナノグラム当り比活性を２　Ｘ　１０’
発光計数にした精製ＡＦＰと共に、標準及び未知血清（
５０μｔ）を評卵器に入れ、次に室温４時間後にラベル
化ＡＦＰの５０チを結合させることが知られている濃度
の多クローン性又は単りローン性抗ＡＦＰ抗体とともに
ふ卵器に入れる。管には最終の試験量２００μｔ　（０
，Ｉ　Ｍリン酸塩緩術液、０．１５　Ｍ塩化す）　ＩＪ
ウム、Ｉ）Ｈ６，３）を入れ室温で４時間ふ卵器に保つ
。次いで前回のように、この混合物にアルカリ性過酸化
水素を注いだ後、発光を測定する。試料について観測さ
れた励起状態生成速度を標準のものと比較し、実施例１
と同様にしてＡＦＰ含有量を内挿法で決定する、実施例
　３ トリョードチロニン（Ｔ３）の均一系試験Ｔ３を含む標
準試料と未知試料、それぞれ５０μｔ、を０．２５　％
のメルチオル酸塩を１含むＨＥＰＥ８緩衝液（０，０１
Ｍ　、　ｐＨ７，４）で１００μＬに希釈する。アクリ
ジニウムエステルでラベルしたＴ３５０μｔを加え、つ
いで抗体５０μｔをＴ３に加える。反応３０分後、アル
カリ性過酸化水素を注入した後、実施例２に記載の通り
発光を測定する。試料について観測された励起状態生成
速度を標準のものと比較し、実施例１と同様に内挿法に
よってＴ３含有社をめる。

実施例　４ 遊離Ｔ３の均一系試験 この試験法の基礎になっているのは、アクリジニウムエ
ステルがアミノ基によって結合しているＴ３は自然のま
まの結合性タンパク（すなワチチロキシン結合性グロブ
リン）とは反応しないだろうが抗体とは結合するという
原理である。遊離Ｔ３の試験は次のように行われる。Ｔ
３（５０μｔ）を含む標準及び未知試料なＨＥＰＥＢ緩
衝Ｗ　（０，０１Ｍ　、　ｐ’Ｈ７，４）　”’ｅ　１
００　μＬ　Ｋ薄める。

ラベルしたＴ３５０μｔを加え、ついで抗体溶液５０μ
ｔを加える。３０分間の反応の間にラベルは抗体と結合
する。この結合を妨げるのは遊離のＴ３で、Ｔ３は抗体
の結合部位をめて競争的に行動する。そのために、反応
時間が過ぎたのち、前述のようにアルカリ性過酸化水素
を加えてから発光を測定する。試料の励起状態生成速度
を標準のそれと比較し、実施例１と同様にして遊離Ｔ３
濃度をめる。

実施例　５ インシュリンの均−系試験 標準及び未知の血清（５０μｔ）をアクリジニウムエス
テル分子でラベルしたｌｆ’Ｎ　ＩＫインシュリンとふ
卵器に入れ、次に予め沈殿させたインシュリン抗体とふ
卵器に入れる。これらのものは上述の化学発光反応速度
を高めるために使われる高分子量錯体を代表するもので
ある。０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（’Ｈ６，３）　２０
０μｔに加えた混合物を室温で３時間ふ卵器に入れたの
ち、発光によって分析する。未知試料について観、測さ
れた反応速度を標準のそれと比較し、それから内挿法に
よってインシュリンの濃度をめる。

実施例　６ 血清甲状腺刺激免疫グロブリンの均一系試験可溶化され
た甲状腺膜製剤を０．１４　ＩＳＡを含むＰＢＳ　（Ｐ
Ｈ６，３）に溶かし、検査しようとしている血清ＩｐＧ
分画１００μｔとともＫふ卵器に入れる。膜の使用量は
ラベルされたチロトロフィン（７８Ｈ）の使用量の１０
〜３０％に結合するのに充分な量とする、 室温で１時間、ふ卵器に入れたのち、ＴＳＨでラベルし
たアクリジニウムエステルを加工、混合物をさらに１時
間ふ卵器に入れる。試験管の内容を実施例１と同様にし
て発光測定し、発光速度を正常血清ＩｒＧ製剤のそれと
比較し、甲状腺刺激抗体が病理学的に有意な量が存在す
るかどうかを決定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するための装置な概図的に
示す。 ｍ２図はフォトン計数と時間との関係を示すグラフであ
る。 第３図は均−系ラベル化抗体の免疫試験における化学発
生速度を時間及びＡＦＰ　１４度の関数として示すグラ
フである。 第４図は均−系ラベル化抗体ＡＦＰ試験（実施例１）の
試薬歇応答性を示すグラフである。 １ 代理人　谷　山　輝　雄１島゛ ＴＩＭＥ（Ｓ） Ｆ／ｃ、２゜ ｆｇ；、１ （ＡＦＰ）　（ｎｇ／ｍ１） ｆ７Ｇ、４゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　生物学的に興味ある物質を検出し、分析し、数量化
   し、存在位置を決める方法において、抗原、ハプテン又
   は抗体として存在している免疫反応の第１成分を化学発
   光反応の１１ｉｆｔ以上の成分と結合せしめ、免疫反応
   のもう１つの成分、すなわち被分析物質、は上記の物質
   と錯体を形成せしめて、非錯化のラベル化成分と異なっ
   て次に起る発光作用においてエントロピー変化及び、又
   はエンタルピー変化をおこさしめ、その反応を観測、比
   較して免疫錯体生成に関する情報を得ることを特徴とす
   る方法。 ２　発光強度又はフォトン放散速度を観測し、非錯化成
   分の同等の性駕と比較する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３　強度又は放散の変化速度を感得、計測又は記録する
   特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４　化学発光性のラベルされた免疫反応体が２ベル化抗
   原又はラベル化ハプテンであり、競争的に結合する免疫
   系で用いられる特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
   れかに記載の方法。 ５　ラベルされた免疫反応体がラベル化抗体である特許
   請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の方法。 ６　反応のラベル化第１成分が他方の成分すなわち被分
   析物質よりモル数で過剰に存在する特許請求の範囲第１
   項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 ７　固定抗体を用いて免疫錯体の寸法を太き（すること
   によって測定された差の大きさを増巾する特許請求の範
   囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の方法。 ８　重合抗体又は固体支持物に抗体を結合させたものを
   用いて錯体の寸法を特徴とする特許請求の範囲第７項に
   記載の方法、