JPH0672882B2 - 物質の検出及び定量に用いる免疫学的方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質、ポリペプチド，ハプテンその他生成物
学的に興味のある物質の分析，試験又は検出に用いるた
めの方法に関するものである。本発明では、化学発光性
分子でラベルした抗原、ハプテン又は抗体を使つて免疫
体を形成させ、それを存在する被分析物質（検体）の量
を示すものとして利用するものである。従来、そのよう
な生物学的分子にラベルするには放射性同位体が用いら
れたが、そうすると安定性や鋭敏性をを失ない、測定や
廃棄に不便であるという問題が起る。それとは反対に、
化学発光によるラベルには危険がなく、安定で、簡単な
フオトン計数器を使つて高感度で検出することができ
る。本発明においては化学発光という語を用いていて、
この現象を他種の発光現象、例えば蛍光、燐光など、と
区別しているが、関連のある生物発光現象は化学発光に
含めている。本発明のもう１つの観点では、免疫体の濃
度、従つて被分析物質の濃度、を調べるには、上述のラ
ベル化学種が免疫体を生成するときの化学発光反応に関
するある種の物理化学的パラメーターの変化を利用する
のである。

本発明を好ましい形で遂行した場合には、これらの変化
は化学発光反応の進行速度に現われ、特に励起状態の形
成速度やその後の復帰速度に現われる。被分析物質の濃
度を求めるために、ラベルされた免疫反応物の被分析物
質に結合したものと結合していないものを事前に分離し
ておかなくてもよいというのが本発明に特有な重要な特
徴である。

多くの化学種が化学発光をする能力を持つていて、それ
は発熱反応で生成した振動的励起物質がフオトンを出し
ながら基底状態に復帰するときに見られる現象である。
その種の反応は通常は酸化的なものであつて、触媒成分
が関与する場合としない場合がある。例えばルミノール
は化学発光反応をするときに触媒の存在が必要である
が、アクリジニウム・エステルは触媒を要しない。大ざ
つぱに言えば、化学発光反応には２つの段階があり、励
起状態の形成およびその後に起る非励起状態すなわち基
底状態への復帰である。ある１つの励起状態がフオトン
を放射してエネルギを失つて対応する基底状態へ戻ると
き、その復帰速度は励起状態にある分子の濃度に比例す
る。このような反応の復帰速度係数（それは前述の比例
性を等しくするようであるが）は１次であり、励起状態
にあるものの濃度は反応の全時間の１部分に当る特定の
時間増分に指数関数的に関係する。

励起状態生成速度はその励起状態が単純に解消するのに
比べると本質的にもつと複雑な関係である。生成速度は
その励起状態の先駆物質の濃度（すなわち励起を受ける
前の分子発光性ラベルの速度）の関数であり、また系中
にある他の反応物質の濃度の関数でもある。この例の励
起速度係数は励起状態生成に関与する反応に係わるいく
つかの速度パラメーターと熱力学パラメーターから成る
ものである。そのため、化学発光をする分子が事前に化
学的や物理的な相互作用をした際に起るようなパラメー
ターの変化があつた場合には、その変化は励起状態の変
化として現われる。さらに、そのような変化はまたフオ
トンの放射数又は放射速度と反応生起の時間増分の間の
関係としても現われてくる。ある化学発光反応を定量的
に表現するのに励起相を利用すると大へん有利である。
第１に極めて迅速に行えて、１秒以下で正確な測定がで
きる。第２には時間尺度が短いのでバツクグランド値が
小さく、その結果として検出感度が高まる。そして第３
に速度測定を用いると内部フイルタ効果による妨害が小
さくなる。

大まかに言つて、本発明は生物学的に興味のある物質を
免疫試験を行なうことによつて検出、分析、定量及び所
在場所決定を行なう方法に特徴があるもので、その試験
においては免疫反応の第１成分は抗原、ハプテン又は抗
体の形となつていて化学発光反応の１つ以上の成分と結
合しており、免疫反応の他方の成分、すなわち被分析物
質はそれと錯体を形成して、その後の発光反応でエント
ロピー及び、又はエンタルピー変化を起し、非錯化ラベ
ル成分と対照的であり、その反応は観察比較によつて面
積錯体形成に関する情報を提供するものである。この際
の発光強度、フオトン放射速度、発光強度の変化速度な
どは非錯化成分の同じ性質とを観察し比較するのが望ま
しい。

フオトン放射の強度または速度（従つて励起状態濃度）
とラベルされた免疫反応体の発光反応開始後の反応時間
を関係付ける関数をまずグラフで表わすのが望ましい。
もう１つのグラフとして、いま問題としている被分析物
質とともに予めインキユベーターに入れておいたラベル
化免疫抗原についてもグラフを作製する。関数の変数の
１つに対応する任意の与えられた点における関係式を表
わすグラフの勾配の変化は被分析物質の濃度の１つの尺
度であり、この尺度は被分析物質の一連の既知の濃度と
比較できる。もしラベルされた免疫反応体がラベル化抗
原又はハプテンであつて、競争結合系に用いられている
ならば、非結合のラベル化免疫反応体についての速度的
と熱力学的のパラメーターを、非分析物質や抗体又は結
合タンパクと共に予め培養したラベル化免疫反応体のパ
ラメーターと比較することができる。フオトン放射速度
を変化させる速度的及び熱力学的パラメーターの変化は
非分析物質濃度に反比例するだろう。ラベル化免疫反応
体がラベル化抗体である場合は、後者を類似の競争反応
系に使つて、血清のような生物学的流体中の抗体を測定
するのに用いられるだろう。本発明の１つの望ましい適
用形態として、ラベルされた抗体を被分析物質の存在量
よりもモル的に過剰に用いるのがよい。過剰量は500％
でも可能であるが、100％を越えないのがよい。さらに
良いのは20％程度である。本発明ではさらに、速度変化
の観測値は固定抗体を用いて形成された免疫錯体の形を
大きくすると増巾することができる。この場合、重合さ
せた抗原と抗体をセルロースなどの固体支持体に結合さ
せたものを用いて抗原抗体錯体の寸法を大きくすると、
励起速度の変化が大きくなる。

被分析物質の量は、励起状態濃度（又は励起状態濃度の
変化速度又はさらにその偏り量）と反応時間とを関係付
ける関数のグラフ表示における変化として現われるのが
望ましい。これらのパラメーターは化学発光性ラベルの
フオトン放射（それはフオトン計数器で数えることがで
きる）の関数である。この関数又はその導関数のいくつ
かのパラメーターをモニターすることによつて被分析物
質の濃度について知ることができる。例えば反応経過上
の１点における関数の傾き、ある１点での計数値、反応
中のある部分での積分値、最大値又は予め選定された値
へ到着するのに要する時間及びいくつかの性質の組合せ
などについて知ることができるのである。

化学発光性ラベルとして望ましいものはアクリジニウム
塩、ルミノール、ジオキセタン、ビス‐シユウ酸塩、フ
ルオレツセイン、ピロガロール、ルシゲニン、ロフイ
ン、フオトプロテイン、及びこれらの誘導体で抗原、抗
体及びハプテンと結合して化学発光性の免疫反応体を生
じるものである。

これまでの均一系免疫試験法は酵素や蛍光性ラベルを用
いているが、本発明はそれと対照的に、小分子又はハプ
テンの測定に限定されることなく、すべての抗原化合物
の定量に適用されるものである。その抗原化合物として
は、医薬品（例えばバルビツール酸塩、サリチル酸塩、
フエニトイン、モルフイン、ヘロイン、メトトレクセイ
ド、ジゴキシン）、ステロイド（例えばテストステロ
ン、プロゲステロン、エストラジオール、エストリオー
ル、コルチソール、アルドステロン、ビタミンＤ）、環
式ニユークレオチド、チロキシン、トリヨードチロニ
ン、及びタンパク（例えばインシユリン、生長ホルモ
ン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プログラ
チン、副腎皮質刺激ホルモン、アルフアフエトタンパ
ク、フエリチン、ヒト免疫グロブリン（Ig）、インター
フエロン、補体系の諸成分、およびバクテリアとウイル
スの抗原）があげられる。

これから分ることは、本発明は生物学的に興味ある物質
を均一系免疫試験法によつて検出又は定量する方法を提
供するものであって、その方法では免疫錯体形成にある
程度依存して変化する物理化学的性質を持つ化学発光性
分子で抗原、抗体又はハプテンをラベルするのである。

本発明において均一系試験とは次のように定義されたも
のである。すなわちその試験におけるラベルの性質は免
疫錯体の形成量とその濃度に依存して変化し、その結果
として結合被分析物質と遊離の被分析物質を分離する必
要をなくしているものである。

本発明は諸種の異なる方式で実行できる。そのいくつか
の例を次に詳しく記載する。

実施例 １ ラベル化抗体を用いるヒト・アルフア1-フエトタンパク
の均一系試験 一連のアルフアフエトタンパク（AFP）の血清標準溶液
を調製し、既知体積（50μが望ましい）従つて既知量
のAFPを一連の試験用管に入れる。同体積の未知血清を
検査のため他の一連の試験用管に入れ、すべての管に0.
1Mリン酸塩緩衝液pH6.3（100μ）を加える。AFP（多
クローン及び単クローン性）に対する抗体で、アクリジ
ニウムエステルでラベルされ、望ましくはナノグラム当
り２×10⁵発光計数の比活性を持つものをそれぞれの管
に加え、AFP被分析物質より過剰になるようにする。管
を室温のインキユベーターに（30分間がよいが）保ち、
その後ルミノメーターに入れて、化学発光反応開始で放
射されるフオトンを５秒以下の間数える。管をインキユ
ベーターに入れる前に、加える試薬の添加速度に合わせ
て管の分析速度を調節する。この化学発光反応は0.5M水
酸化ナトリウムと0.1％（体積）のいわゆる“100ボリユ
ーム”（30％重量／体積の意）とよばれる過酸化水素と
を含む水溶液を（適量は200μ）を加えたときに開始
する。励起状態生成速度（すなわち適当な時間にわたる
フオトン放散速度）は標準及び未知の試料についてフオ
トン計数器で測定する。そのやり方にはいくつかの違つ
た方法がある。１つの方法では、１秒間に放散されるフ
オトンの全数を記録し、もう１つの方法ではフオトン放
散速度を時間の関数として表わす関係式を微分して反応
開始時の速度を計算することが可能である。いずれの場
合にも被分析物質の濃度が未知の試料に対する結果は一
連の既知量の被分析物質の標準を用いて作製した検量線
（その例を第３図と、第４図に示す）と比較する。

第３図は均一系ラベル化抗体の免疫試験における化学発
光速度を時間及びAFP濃度の関数としてグラフ表示した
ものである。３本の曲線は３つの異なるAFP濃度、328,1
64及び41ng/mlに対応するものである。第４図は定義さ
れた試薬量と応答を表わす曲線であつて、計数値が濃度
と直線的に変る関数を示している。

典型的な装置を第１図に図式的に示す。Ｐはフオトン計
数器、Ｒはデーター取得装置、Ｉは積分器、Ｄは微分
器、Ｃは計算器、Ｌはプリンター、Ｍはデイスク装置で
ある。第２図はフオトンの毎秒計数値を時間に対して描
いた典型的グラフ表示であつて、現実の放散速度（曲線
の上の点の値）、変化速度（１点における曲線の傾
き）、全計数（曲線下の面積）が変化する様子を表わし
ている。第２図で直線Ｘは反応の初期速度を示す傾きで
ある。この図から他の特性を誘導したり推論したりでき
ることが分るだろう。例えば最大値に到達する時間、0.
5秒まで、あるいは他の任意の間隔内の計数値などが求
められる。

実施例 ２ ラベル化抗原を用いるヒト・アルフア1-フエトタンパク
（AFP）の均一系試験 アクリジニウムエステル分子でラベルしてナノグラム当
り比活性を２×10⁵発光計数にした精製AFPと共に、標準
及び未知血清（50μ）をインキユベーターに入れ、次
に室温４時間後にラベル化AFPの50％を結合させること
が知られている濃度の多クローン性又は単クローン性抗
AFP抗体をこれに加える。管には最終の試験量200μ
（0.1Mリン酸塩緩衝液、0.15M塩化ナトリウム、pH6.3）
を入れ室温で４時間ふ卵器に保つ。次いで前回のよう
に、この混合物にアルカリ性過酸化水素水を注いだ後、
発光を測定する。試料について観測された励起状態生成
速度を標準のものと比較し、実施例１と同様にしてAFP
含有量を内挿法で決定する。

実施例 ３ トリヨードチロニン（T3）の均一系試験 T3を含む標準試料と未知試料、それぞれ50μ，を0.25
％のメルチオル酸塩を含むHEPES緩衝液（0.01M,pH7.4）
で100μに希釈する。アクリジニウムエステルでラベ
ルしたT350μを加え、ついで抗体50μをこれに加え
る。反応30分後、アルカリ性過酸化水素を注入した後、
実施例２に記載の通り発光を測定する。試料について観
測された励起状態生成速度を標準のものと比較し、実施
例１と同様に内挿法によつてT3含有量を求める。

実施例 ４ 遊離T3の均一系試験 この試験法の基礎になつているのは、アクリジニウムエ
ステルがアミノ基によつて結合しているT3は自然のまま
の結合性タンパク（すなわちチロキシン結合性グロブリ
ン）とは反応しないだろうが抗体とは結合するという原
理である。遊離T3の試験は次のように行われる。T3（50
μ）を含む標準及び未知試料をHEPES緩衝液（0.01M,p
H7.4）で100μに薄める。ラベルしたT3 50μを加
え、ついで抗体溶液50μを加える。30分間の反応の間
にラベルは抗体と結合する。この結合を妨げるのは遊離
のT3で、T3は抗体の結合部位を求めて競争的に行動す
る。そのために、反応時間が過ぎたのち、前述のように
アルカリ性過酸化水素を加えてから発光を測定する。試
料の励起状態生成速度を標準のそれと比較し、実施例１
と同様にして遊離T3濃度を求める。

実施例 ５ インシユリンの均一系試験 標準及び未知の血清（50μ）をアクリジニウムエステ
ル分子でラベルした精製インシュリンをインキュベータ
ーに入れ、これに予め沈殿させたインシュリン抗体を加
える。これらのものは、上述の化学発光反応速度を高め
るために使われる高分子量錯体を代表するものである。
0.01Mリン酸塩緩衝液（H6.3）200μに加えた混合物を
室温で３時間インキュベーターに入れたのち、発光によ
つて分析する。未知試料について観測された反応速度を
標準のそれと比較し、それから内挿法によつてインシユ
リンの濃度を求める。

実施例 ６ 血清甲状腺刺激免疫グロブリンの均一系試験 可溶化された甲状腺製剤を0.1％HSAを含むPBS（PH6.3）
に溶かし、検査しようとしている血清IgG分画100μと
ともにインキュベーターに入れる。膜の使用量はラベル
されたチロトロフイン（TSH）の使用量の10〜30％に結
合するのに充分な量とする。

室温で１時間、インキュベーターに入れたのち、TSHで
ラベルしたアクリジニウムエステルを加え、混合物をさ
らに１時間インキユベーターに入れる。試験管の内容を
実施例１と同様にして発光測定し、発光速度を正常血清
IgG製剤のそれと比較し、甲状腺刺激抗体が病理学的に
有意な量が存在するかどうかを決定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するための装置を概図的に
示す。 第２図はフオトン計数と時間との関係を示すグラフであ
る。 第３図は均一系ラベル化抗体の免疫試験における化学発
生速度を時間及びAFP濃度の関数として示すグラフであ
る。 第４図は均一系ラベル化抗体AFP試験（実施例１）にお
ける試薬応答量が温度に直線的に変化することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−142257（ＪＰ，Ａ) 臨床病理 臨時増刊 特集第53号 臨床 検査のための仏ノアッセイ−技術と応用昭 和58年２月 日本臨床病理学会 Ｐ．61− 65

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体即ち生物学的興味のある物質を均一系
   免疫試験で定量する方法において、 免疫反応で上記検体と結合可能な抗原、ハプテン又は抗
   体から成り、化学発光反応に関与し得る１つ以上の成分
   から成るラベルに結合されたラベル化−化合物を準備
   し、 該ラベル化−化合物を上記の検体に接触せしめて錯体を
   形成し、化学発光反応によってラベル化−化合物から光
   又はフォトンを発生させ、 化学発光反応が励起状態にある間、すなわち光またはフ
   ォトンの強度が上昇中またはピークに達したときに光ま
   たはフォトンを観測し、同励起状態における光またはフ
   ォトンの発生率を示すサンプルデータを得、このサンプ
   ルデータを、同サンプルデータを得るときと同一の条件
   下で行った標準量または既知量の検体を用いた化学発光
   反応の励起状態における光またはフォトン発生量を示す
   標準データと比較し、検体量を決定することを特徴とす
   る均一系免疫試験で検体を定量する方法。
2. 【請求項２】サンプルデータには光の発生量中のフォト
   ン放射速度を含む特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 【請求項３】サンプルデータには光またはフォトンの発
   生ピークのタイミングを含む特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。
4. 【請求項４】ラベル化−化合物はラベル化抗原又はラベ
   ル化ハプテンより成り、これと競争的に結合する免疫系
   において用いられる特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。
5. 【請求項５】ラベル化−化合物はラベル化抗体である特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。
6. 【請求項６】ラベル化−化合物は検体よりモル数で過剰
   に存在する特許請求の範囲第１項に記載の方法。
7. 【請求項７】ラベル化−化合物に固定抗体を用いて反応
   錯体の寸法を大きくすることによって、測定される差の
   大きさを増大させる特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。
8. 【請求項８】ラベル化−化合物に重合抗体又は固体支持
   物に結合された抗体を用いて反応錯体の寸法を大きくす
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。