JPS58757A - 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的流体又は同様物中の種々の化合物の分
析に関するものであり、そしてより祥しくけある種の新
規表ラベル付けされた分析物及びそのようなラベル付け
された分析物を用いる分析方法に関するものである。

種々の臨床目的、例えば投薬スケジュールの監視（モニ
ター）、ホルモン水準の監視、最近の食物摂取又は生物
有効性のその俵の薬理学的動力学、吸収、分解又は排泄
の検査のためには、種々の薬などの濃度をナノモルもし
くけピコモル水準で測定することが非常に有利である。

周知の如く、放射線免疫検定（試験）によりこの分析を
実施できる。分析を行なうためには、Ｖ容できるキット
又はシステムは抗血清、標準もしくは既知の濃度の測定
しようとする化合物（すなわち分析物）、測定しようと
する化合物の放射線ラベル付きの銹導体及び１種もしく
はそれより多い緩衝剤を含有していなければならない。

抗血清は、例えば測定しようとする化合物に対応するノ
・ゾテンー蛋白質接合体（インミノジエン）を接種をし
て、免疫圧されている動物の採血により製造される。

周知の如く、放射線免疫試験は一般に、放射能でラベル
付けされた分析物とラベルの付いて々い分析物の間の、
抗血清中の抗体上の部位の給金競争を測定する。抗血清
に既知量の試験しようとする分析物及び放射ラベル付き
の類似体を加えることにより、結合又は遊離状分析物対
分析物濃度についての投薬量一応答曲線が設定される。

この免俊−目盛り定めを行なった後に、未知の濃度を次
に検定するため標準投薬量一応答曲線と比較することが
できる。この型の検定で重要なことは非放射性分析物と
効果的に競争する放射性分析物が存在するということで
ある。従って、試験の最大の精度、正確性、感度、特異
性及び再現性を得るためＫは、精製された良く特性の決
められている合成放射性の分析物が必要である。

放射線免疫試験方法ではいくつかの欠陥が確認されてい
る。第一に遊離状の放射ラベル付き分析物から抗体結合
された放射ラベル付き分析物を物１７− 理的に分離することが必要である。さらに、この方法は
どちらかといえば労力がかかると考えられており、そし
て必要な装置にも同様に比較的費用がかかり、均質に入
手できず、しかも該試験を正確に実施するためには高度
に訓練された専門技術者の使用を必要としている。同様
に、放射性同位元素ラベル付き分析物は比較的不安定で
あり＋用がかかり、しかも一般に使用されている放射性
同位元素ラベルに伴なう放射線露呈の危険性に起因する
増々厳しくなる排物廃棄間哩を里子る。これらの欠点く
もかかわらず、放射線免疫試験の使用は相当増え゛てい
る。

しかしながら、臨床研究での放射線免疫試験の使用にお
ける最近の相当な成長は、ここに配されている上うな放
射線免疫試験方法の欠点を克服する変法の開発に刺激を
与えている。これらの欠点を克服するために開発された
処理方法は、放射性同位元素ラベルの代りに酵素又は螢
光ラベルを、好適には物理的分離のための条件を省くよ
うなラベルの付いた分析物の結合された部分及び遊離状
１８− 部分の間の化学的差違を測定できるような条件と組み合
わせて、使用することを主として包含している。後者の
簡単さ及び有利な特徴を有する免疫試験は、物理的分離
を必要とする不均質免疫試験と対照的に均質免疫試験と
称されている。

従って、抗体との複合化が生じるときにラベルの酵素活
性が減じられるような酵素でラベル付けされた分析物の
使用に基いている均ｇ麿免疫試験システムが開発された
。それの濃度を測定しようとするラベルの付いていない
分析物が、抗体と結合している酵素でラベル付けされた
分析物と置換し、その結果酵素活性の増加を生じる。増
加した酵素活性（酵素活性の結果として独特の発色団を
最終的に生成する″′基質”と称されているものを用い
て分光光度計により監視されている）を増加した分析物
濃度に対してプロットすると、標準的置換又は投与量一
応答曲線が作成される。これらを次に未知の分析物濃度
の測定用に使用する。均質酵素免疫試験分野では下記の
米国特許が発行されている：　３．８１７．８３７　；
　３，８５２，１５７　；　３，８７５，０１１　＋３
．９６６．５５６　；　３，９０５，８７１　；　４，
０６５，３５４　；　４，０４３．８７２　；４．０４
０，９０７　；　４，０３９，３８５　；　４，０４６
．６３６　ｉ　４，０６７．７７４　；４．１９１，６
１３及び４，１７１，２４４゜これらの特許では、分析
物のラベルは実質的に５．０００よ抄大きい分子量を有
する酵素であると記されている。この技術の商業化け、
分析物が１０−”Ｍより大舞い分析物の流体濃度におい
て比較的小さい分子寸法であるような用途にだけ限られ
ている。これらの制限は、大きいポリイデチド分析物か
ら誘導された普通使用されている酵素ラベルは抗分析物
抗体との結合によね抑制されないという事実から生じる
。また、感蜜制限は酵素活性から生じる螢光計によるレ
ポーター分子のないこと及び例え′は内因性酵素の如き
低濃度の血清障害の存在から生じる。さらに、酵素ラベ
ルは再現性のあるようにしかも満足のいく純度で製造す
ることが難かしいう 上記の均質酵素免疫試験技術の制限のために、感度のよ
り大きな螢光を用いる均質免疫試験の開発に向かって相
当な努力が払われてきた。それらは主として例えば免疫
グロブリンの如き比較的大きい寸法の分子又は例えばイ
ンシュリンの如きポリイデチドホルモンの検定に関して
いる。下記の米国特許がこの型の試験用に発行されてい
る：３．９９８．９４３　；　３，９９６．３４５　ｉ
　４，１７４．３８４　；　４，１６１．５１５　ｉ４
．２０８．４７９及び４，１６０，０１６゜これらの特
許のほとんどのラベルは分析物又は抗体と結合している
芳香族螢光分子を包含している。螢光消光の種変が試料
中の分析物の量に関係するように、すべてが同様に抗体
又は他の螢光消光剤による種々の螢光消光方法を含んで
いる。これらの方法に基〈検定は多分、満足のいくよう
Ｋｆｆ、ＩＩされた螢光ラベル付き抗体又は分析物又は
関連の消光剤ラベルの付いた物質種の製造の難かしさの
ために商業化されていなかった。また、血清中のパック
グランド螢光並びに血清の誘導する消光が生じるかもし
れない、さらに、該方法は酵素増幅されていないため、
満足のいく感度ということには問題があるかもしれない
。

免疫試験の型に関して容易に分類できないようなこの分
野のさらに他の米国特許には、３，９３５．０７４　＋
２１− ４．１３０．４６２　＋　４．１６０．６４５．７ｊｔ
び４，１９３，９８３が包括される。米国特許４，１６
０．６４５中に示されている方法はラベルとしての電子
転移触媒の使用を包含している。触媒（ラベル）は抗体
との結合により税活性化される。

抗体を製造するために使用されるハプテン接合物の製造
に関するその他の米国特許には、”（、＋１８４，８９
８　；３．８４３，６９６　ｉ　４．０４５．４２０　
ｉ　３，８８８，８６６　；　３，９１７，５８２　；
４．０２５．５０１　＋　４．０４３，９８９　ｉ　４
，０５８．５１１　；　４．ｎ６９．１（’１５ｉ４．
１２３．４３１及び４，１８６．０８１が包括される。

これらの特許の全ては分析物誘導体及び対応する？リセ
デチド接合物に関しており、ここでｆ　ＩＪ　’デチド
は抗原性でありそして５．０００〜１０６の範囲内の分
子量を有する。例えばアルプはン及びグロブリンの如き
蛋白質が特釦示されている。

また、均質酵素免疫試験用の予備処理方法も提唱されて
いる。この分野の米国特許には、：（，８５６，４６９
。

４．０５６．６０８及び４，１２１．９７５が含まれて
いる。

反応物でラベル付けされた螢光免疫試験として記されて
いる他の型の方法は、螢光性生成物が酵２２− 素で加水分解されているときには該生成物が放出される
ように設定されている螢光でラベル付けされた分析物の
使用を包含している。しかしながら分子の分析物部分に
対する抗体が酵素の加水分解を抑制する。従って、質量
作用の法則によ抄、胃換された螢光ラベル付き分析物の
酵素的加水分解のために増加した分析物の存在下では螢
光は強化される。例えば、ラベル付き分析物けβ−ガラ
クトシル−ウンベリフェロン−シソマイシンでアル。

酵素β−ガラクトシダーゼはウンベリフェロン部分から
糖を分裂させ、そこでこれは螢光を発し得ることとなる
。この方法を紀している刊行物には、Ｊ、　Ｆ、　Ｂｕ
ｒｄ、　Ｒ，Ｃ，Ｗｏｎｇ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｆｅｅｎｅ
７＋　Ｒ，Ｊ、　Ｃ’ａｒｒ１ｃ。

７７、５６　（１９７７）及びＦ、　Ｋｏｈｅｎ＋　Ｚ
、　ＨｏｌｌａＭｅｒ及びＢｏｇｕｓｌａｓｋＬ　Ｊｏ
ｕｒ、　ｏｆ　８ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１
．１６１（１９７９）が包括される。

さらに別の型の均質非同位元素免疫試験は米国特許４，
２１３，８９３中に開示されており、それは助因子でラ
ベル付けされた分析物を使用する。これは分析物をＮＡ
Ｄ　（すなわちニコチンアミド−６（２−アミノエチル
アミノ）−ゾリンジヌクレオチド）の誘導体と結合させ
ることによる分析物のラベル付けを包含している。ラベ
ル付けされた助因子は分析物としてのニス）　＋７オー
ルの環化反応においてデヒドロゲナーゼ（例えばアルコ
ールデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、す
なわち人ＤＢ、　ＭＤ）Ｉ　）との反応性を保有してい
る。最終的に、これらの反応で生成し九ＮＡＤＰＴ（を
曽光計により監視し、そしてそれが環化連間の尺度とな
る。

ＮＡＤＰＨはニス）　ＩＪオール抗体存在下ではラベル
付けされた助因子の複合体化により還元する。従って、
環化速度はニス）　ＩＪオールの量と直接関連があり、
そしてエストリオール量の増加につれて直線的に増加す
ることが見出されている。これはＦ、　Ｋｏｈ＠ｎ　ｓ
　Ｚ、　ＨＯｌｌａｎ（１＠ｒ　％Ｔ’、Ｙｅａｇｅｒ
　％Ｆ、Ｊ　−Ｃａｒ　ｒｉｃ。

及びＲ，Ｃ，Ｂｏｇｕｏｌａｓｋｉ、６７〜７９頁、”
　Ｅｎｚｙｍｅ　−１ａｂｅｌｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ　Ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｓｓ　ａｎｄ　Ｉ）ｒｕｇ
ｓ″、編集８．Ｂ、Ｐａｌ、Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒ
ｕｉｔｅｒ　ｓ　　ベルリン及びニューヨークによる１
９７８年の刊行物中に記されている。同様なシステムは
環化用酵素として乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラー
ゼを用いるビオチン及び２．４−ジニトロフルオロベン
ゼン分析物に関して記されている（　Ｒ，Ｊ、　Ｃａｒ
ｒｉｃｏ　、　Ｊ、　Ｅ。

Ｃｈｒｉｓｔｎｅｒ　％Ｒ，Ｃ，Ｂｏｇｕｏｌａｓｋｉ
及びに、　Ｋ、　Ｙｏｕｎｇ　。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２．２７１　（１９
７６）　）。その方法は体液に共通の内因性助因子及び
減成用酵素により妨害を受けることが指摘されている（
　Ｍ、　、ｒ、　Ｏ’５ｕｌｌｉ−ｖａｎ　％Ｊ、　Ｗ
、　Ｂｒｉｄｇｅｓ及びＶ、Ｍａｒｋ、　　Ａｎｎａｌ
ｓ　ｏｆさらに別の型の免疫試験技術はラベルとして酵
素調節剤、すなわち酵素阻害剤又はアロステリック奏効
体を使用する。多数の酵素調節剤がそれらの個別酵素と
共に米国特許４，１３４，７９２中に挙げられている。

個々の抗体が酵素調節剤でラベル付けされた分析物と結
合するときには、酵素調節剤は培養混合物中の酵素の活
性をもはや阻害できないか又はその他の影響を与えるこ
とができない。従って、遊離状分析物による酵素調整剤
ラベル付け２５− された分析物の置換は酵素調節剤の阻害又はアロステリ
ック効果を回復させる。

ケ２カル　ラバー　カンパニーにより１９８０年に発行
されたＴＬｄｗａｒｄ　Ｔ、　Ｍａｇｇｉｏによ抄編集
されている”　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
”　という題の峻近の論文では、１０５〜１３４頁の”
　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｈｏｍｏ　−ｇｅｎｅ
ｏｕｓ　Ｅｎｚｙｍｅ　−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　’
という頌の章は、ヒト免疫グロブリンＧ、用の酵素ラベ
ルとしてのりがヌクレアーゼ人の使用を言及している。

詳細事項は与えられないが、著者は、す、ｙヌクレアー
ゼ人は蛋白質均質酵素免疫試験においてラベルとして使
用する可能性を有すると結論付けている。しかしながら
、著者はまた、残念なことにりがヌクレアーゼ人の偏在
性が血清試験中の内因性酵素からの重大な干渉の可能性
を有しそして工程の実用性を限定していることも記して
いる。

さらに、リケヌクレアーゼの構遺及び性質の研究が相当
行なわれている。例えばり？ヌクレアーゼの触媒活性を
監視するためにこれまでに多くの有機化合物が使用され
てきている。一般的に称さ２６一 れているそのような有機化合物又は基質は、天然基質に
より表わされるものと同一もしくけ同様な構造的拘束を
示すり？核酸自身、環式りん酸塩ジエステル及びモノリ
？ヌクレオチド化合物を包括している。

ワ？ヌクレアーゼ活性を動力学的に壁視するためＫはさ
らに他の化合物も使用されている。そのような化合物に
は、１−ナフトール、５−ヒドロキシナラトール及び１
−４メトキシフエノールの３′−ウリジル嗜ホスホノエ
ステルが含まれる、ＨｏＲｕｂｇｍｅｎ、　Ｒ，Ｋｈａ
ｎｄｌｅｒ及びＨ，Ｗｉｔｚｅｌ　（ＨＯＴ）ｐ８−８
ａｙｌｓｒのＺ、　Ｐｈｙａｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３
５５．６８７　（１９７４）　）。

しかしながら、加水分解生成物は紫外線範囲内〒直接監
視され、これはノナモル又はピコモル範囲での分析に対
して十分感受性でなく、そして臨床試料に由来する干渉
が起きるかもしれない。さらに、これらの基質の製造は
長いクロマトグラフィ工程を含む多数の段階を必要とす
るため製造が困難である。

また、リカヌクレアーゼのポＩＪ−？プチド断片への分
裂も研究されている。例えば牛の膵臓のす、ｙヌクレア
ーゼ（すメヌクレアーゼＡ）に対するバクテリア性プロ
テアーゼであるスジチリシンの活性が知られている。蝮
かい加残基ボリイデチド及び長い１０４残基、ｌ　ＩＪ
イプチドかり？ヌクレアーゼＡのＩ番目のペプチド結合
（アミン末端から数えて）Ｋおける分裂の結果として生
じることが見出されている。前者は８−ペプチドと称さ
れており、一方後者ｔｉｓ−蛋白質と称されている（　
Ｆ、　Ｍ、　Ｒ１−ｃｈａｒｄｇ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
’Ｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、Ｕ、　Ｓ、　ａ、ｊ％１
６２（１９５８）　ｓ　Ｆ、　Ｍ、　Ｒｌｃｈａｒｄ及
びＰ、　Ｊ、　Ｖｉｔｂａｙａｂｉｌ、Ｊ、阻ｏ１．　
Ｃｈｅｒｎ、　２３４．１４５９　（１９５９）　）、
この２種のポＩＪ　、？デチドが容易に結合して非共有
複合体（Ｋｚｔｏ−’Ｍ）を形成し、それは種々の基質
例えばＲＮＡ又はシチジン２／、　３／−りん酸ジエス
テルに対して元の障素であるＩＪ　、ｙヌクレアーゼ人
と同じ触媒活性を保有することも同様に知られている。

しかしながら、わかっている限夛では、との知識は免疫
試験技術の開発においては利用されていない。

均質免疫検定の分野に於けるちかごろの活動がかなシあ
るということにもかかわらず、現在使用されている技術
の種々の欠点を克服できる別の開発に対しての要望が残
っている。このことは多分、明らかに広い可能性がある
にもかかわらず非同位元素免疫検定技術が比較的商業的
使用に制限されていることから明白であろう。従って、
それらの曳ぐ堅繊された欠点にもがかわらず、単に満足
のい〈代シの技術が商業的に入手でき々いため釦、放射
線免疫試験技術が広く用いられ続けている。

従って、本発明の一目的は広範囲の分析物に広く適用で
きる均質免疫試験技術を提供することである。関連する
もつと特定の目的は、比較的小さい分子量の分析物分子
を用いる使用だけに限らない均質免疫試験技術を提供す
ることである。

菊の目的は比較的高分子量のラベルの使用を必要としな
い均質免疫試験方法の提供である。関連目的は、容易に
製造でき、容易に精製されそして比較的安定であるラベ
ル付けされた分析物を提供することである。

本発明の他の目的は、分光光度計又Ｆｉ螢光針検２９− 出方式において、希望によりいずれの方式にも共通する
基質を用いて、操作できる均質免疫試験方法を提供する
ことである。

本発明のさらに別の目的は、優れた感度を得ることので
きる均質免疫試験方法を提供することである。関連する
さらに特定の目的は、基質の触媒による転換により増幅
される螢光計検出方式を用いる検定を包含している。

さらに別の目的は、商業的に入手できる自動的分析器、
例えば１遠心急速分析器”と一般に称されているもの、
の中で使用するのに容易に適している均質免疫試験方法
の提供である。

本発明の他の目的は、自動的データ類別に容謳に適応可
能な均質免疫試験技術を提供することである。関連する
さらに特定の目的は、自動的データ類別用の満足のいく
投薬量応答曲線が得られるような免疫試験技術を提供す
ることである。

本発明の他の目的はその方法が例えば起り侍る妨會など
の如き問題を最少限にするのに充分なほど柔軟性である
ような均質免疫試験技術の提供で３０− ある。

本発明の他の目的及び利点は下記の詳細な説明及び図面
から明白となるであろう。

本発明は種々変更、別の形態にすることができるが、こ
こでは好適態様を詳細に言己載する。しかしながら、本
発明を開示されている特定形に限定しようとするもので
はないことは理解すべきである。反対に、特許請求の範
囲に記されている如き本発明の精神及び範囲内にはいる
全ての改変形を包括しようと意関するもの〒ある。例え
ば、本発明のラベル付けされた分析物は主として均質免
疫試験技術と関連して配されているが、本発明は抗体結
合された及び遊離状のポリペプチドでラベル付けされた
分析物の部分を分光光度計又は螢光計による測定の前に
分離するよう々不均質免疫試験における使用にも同様に
適用できることをｇｉＩｌＩＩすべきである〇 一般に、本発明は一方が分析物用のラベルとして作用し
そして他方が混合物中に存在しているような？リイグチ
ド対を使用することによシ感度の高い免疫試験方法が提
供できるという発見に基いている。これのＩリイデチド
ノヤートナーと組み合わされたときに生じるラベル付け
された分析物は、特定の発色団又は螢光団基質に対する
触媒活性を有する複合体を生成する。さらにそして重要
なことに、そのようなラベル付けされた分析物の触媒活
性は、分析物圧対する抗体の存在下で大きく阻害される
。この阻害は、増加する製産の分析物を混合物に加え石
ときに除かれる。従って、晋換曲線を作成でき、それは
触媒活性又は触媒活性の函数を分析物濃度に関係づけ、
そしてこの参照用又は標準曲線は未知の分析物濃度の測
定を可能にする。

満足のいく感度の良い免疫試験方法の提供能力は以下に
記載されているように、適当なポリ２デチド対、並びに
分析物と抗体との反応及びラベル付けされた分析物とそ
れの／　ＩＪ−？ブチドパートナーとの反応の平衡定数
を含むある種の媒介変数、並びに抗体、ラベル付けされ
た分析物及び？リイゾチドパートナーの相対的濃度の選
択に依存している。

検定案 多種の案が本発明に関連して使用できる。一般に、本発
明の均質免疫試験方法は、（ａ）媒体中で（１）分析物
を含有している試料、（２＋　、ｆｆ　ＩＪペプチドで
ラベル付けされた分析物、（３）分析物に特異的な抗体
、（４）ラベル付けされた分析物の？す（プチドと非共
有結合できて触媒活性を有する複合体を形成する／　Ｉ
Ｊペプチドパートナ−１（５）及び複合体の触媒活性に
よ抄レポーター分子に転化可能な基質を一緒にし、（ｂ
）基質からしＩ−ター分子への転化速度又は転化程度を
測定し、そして（Ｃ）該転化速度又は転化程度を既知量
の分析物を含有する媒体中で得られたものと比較するこ
とからなっている。物質の添加順序は希望によね変化さ
せることができ、そしである場合には培養段階を供する
ことが望ましいＯ 試験は多種の商業的に入手できる装置のいずれかを使用
することＫより有利に実施できる。例えば１分光光度計
技術を用いて分析を行なうために３３− は、ユニオン・カーバイド・コーｆレーション裂のＣｅ
ｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈｅｗ　　４ＱＱ及び５００急速分析
器を使用することが適していると見出されている。一般
に。

この型の分析器けＮｏｒｍａｎ　Ｇ、　Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ　、　”Ａｎａｌｙ　−ｔｉｃａｌ　　Ｊｅｃｈｎｌ
ｑｕｅａ　　ｆｏｒ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｊｒａｃｔｌｏｎ
ｓ　ＩＩ。

Ａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｕｖｅｔ　　Ｔｔｏｔｏｒ　
　ｆｏｒ　　ａ　　ＮｅＷ　Ｍｉｃｒｏａｎａ−１ｙｔ
ｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ”、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　。

英、５４５〜５６２　（１９６９）中Ｋｌｌ己されてい
る。適当な螢光計装置も同様圧して商業的に入手できる
。

例に挙げた急速分析器の使用の際にけ、−掌では、＃電
を測定しようとする分析物、抗体、及びボＩＪ　ｄデチ
ドでラベル付けされた分析物を含有している試料を分析
器の転移ディスクの試料井戸中にピペットで加え、ポリ
イデチドパートナー及び基質を転移ディスクの試薬井戸
中にビ被ットで加え、必要なら混合物を試料井戸中で培
養し、そして転移ディスクを回転させながら例えば分光
光度計技術の如き適当な手段により基質からレポーター
分子への転化速度を監視することによりラベル付けされ
た分析物錯体の触媒活性の回復を分析す３４− ることを包括している。

試薬の添加順序は通常臨界的でないことに注目すべきで
ある。従って、希望により、遠心急速分析器の案に関す
る添加順序は質実できる。例えば。

パートナ−ポリペプチド及びラベル付けされた分析物の
添加は相互転換でき、そしてこれは検定感度を強化させ
ることのできるラベル付けされた分析物の遅れた添加に
相当する。これによりビイット効率を増加させることが
でき、その理由は単独試薬成分でなく混合溶液をピＲッ
トで加えることができるからである。この場合、３種の
ピイット操作が包含される：（１）分析物試料、（２）
抗体及び？リペデチドパートナー並びに（３）ラベル付
けされた分析物及び基質。従って、前記の市販の急速分
析器を用いると、一つのサイクル中で上記の３種の操作
を実施するために充分な自動的ピペッタ−を利用できる
。

使用するなら培養段階の時間は主として分析物の性質に
依存して変化するであろう。培養すると。

分析物濃度に関係する。抗体で結合された。及び遊離状
の、ラベル付けされた分析物の平衡又は動力学的分布を
もたらす。抗体との複合体化速度示拡散支配である丸め
に、例えば薬又は薬代謝物の如き小さい分析物は短かい
培養時間を必要とするが１例えば／　ＩＪ−ｅデチドホ
ルモンの如き比較的大きい分子量の分析物は実質的に比
較的長い培養時間を必要とする。従って、培養時間は約
１分間から約め時間種度までに窒化で六る。さらに、分
析物、ラベル付けされた分析物及び抗体の培養混合物が
平衡に達することは必要ない。全ての培養混合物に対す
る培養時間及び対応するレポーター分子生成物の生成速
度の測定値が一定に保たれておりそして同一であるなら
、運動論的（カイネティツクな）免疫検定が可能である
。運動論的検定は分析用に必要な全時間を短縮させ、そ
して上記のラベル付けされた分析物及びノ辛−トナー？
リイプチドの相互転化を可能にする。

生成物の出現速度、すガわちレポーター分子生成速度は
、分析物の性質に依存しての分光光度計又は螢光計によ
シ監視できる。約ｔｏ−’Ｍより大きい濃度で存在して
いる分析物に対しては分光光度計による検出が好適であ
り、一方低濃度水準で存在している分析物に関しては、
螢光計方法の比較的大きい固有感度のために螢光計によ
る検出が好適である。逆に、比較的長い時間が許容でき
る場合には例えばあ分以上の比較的長時間にわたって速
度を監視することによす、１０−’Ｍ以下の濃度の分析
物に対して分光光電計による検出を利用できる。

本発明の代表的な検定率に従うことによりそして増加す
る既知の分析物ｉｌｌ’を使用するととＫよね、触媒活
性（例えばレポーター分子の生成速度）の標準的すなわ
ち参照曲線、又は分析物濃度に対する触媒活性の函数、
を作成できる。この標準的すなわち参照曲線を次に、標
準的曲線を作成するために使用されたものと同一の条件
においてレポーター分子の生成速度を測定した後に未知
の分析物濃度を測定するために使用できる。

ラベル付けされた分析物、パートナ−ポリペプチド及び
抗体が試料中に一緒に存在しているときＫは、／リベプ
チドでラベル付けされた分析物は３７− 抗体又は？リイプチドパートナーのいずれかと競争して
結合できる。ポリペプチドでラベル付けされた分析物が
それのポリイデチドパートナーと結合すると１！には触
媒活性が与えられるが１．ｄ　リイデチドでラベル付け
された分析物が抗体と結合するときＫは触媒活性は阻害
される（すなわち現われないか又は与えられかい）。幀
システムの平衡反応のためにそして質量作用の法則によ
り１分析物は抗体と結合されているポリペプチドでラベ
ル付けされた分析物と置換し、そしてその結果、試料中
に、それの−り４デチドパートナーと結合可能な未結合
のラベル付けされた分析物が得られる。

従って１分析物の不存在下では、減じられた触媒活性が
現われる。しかしながら１分析物が試料中に存在してい
るなら、増加した触墜活性が生じそれは監視できる。ラ
ベル付けされた分析物が抗体と結合して釣るときには触
媒活性は減じられるか又は抑制されるが分析物の存在下
では回復するため、ｓ液の触媒活性は試料中に存在して
いる分析物の濃度に直接関連するであろう。

３８− 本発明の方法は基本的には６種の反応式の考察を包含し
ている。どんな免疫試験技術を用いる場合もそうである
様に該方法の基礎は、ラベル付けされた及びラベル付け
されていない分析物に対する抗体の反応（又は平衡化）
速度が一般に同一であることである。これらの２種の反
応を以下に示す： 人士Ａｂ；Ａ′Ａｂ（１） Ａ　−ＰＰよ＋Ａｂ：Ａ−ｐｐ、°＊ｂ　　　　　　　
　（２）〔式中１人は分析物であり、Ａｂは分析物に対
して特異的な抗体又はレポーター蛋白質であり。

Ａ°人すは分析物及び抗体の反応により生成した複合体
であり、Ａ−ＰＰよけ？リイデチド・９−トナーの一方
でラベル付けされた分析物又は分析物類似体であり、セ
してＡ−ＰＰ□”ＡＩ）　　はラベル付けされた分析物
及び抗体の反応により生成した複合体である〕。

明らかに、反応（１）及び（２）の速度が一般に同一で
たいなら、競争による結合は生じないであろう。

上記の如く、試料中の分析物の存在は抗体と結合してい
る／　ＩＪ　、ｅプチドでラベル付けされ九分析物と置
換し、その結果未結合のラベル付けされた分析物は次に
それのポリイデチドノ１−トナーと結合できる。後者の
反応を以下に記す： Ａ−ＰＰ１＋ＰＰ、　、−Ａ−ＰＰ１°ＰＰ禽　　　　
（３）〔式中、人−ｐｐよけ前記の如きラベル付けされ
た分析物であり、ＰＰ、けＩリイデチドパートナーであ
り、そしてＡ−ＰＰユ°ＰＰ、け非共有触媒複合体であ
る〕。

非共有触媒複合体は、以下ＫＩ１５されている如き、基
質からレポーター分子への転化に触媒作用を与える： ｓ　　Ａ−ＰＰ１’ＰＰｓ　ｐ　　　　　　　　　　　
（４）〔式中、８は基質であ抄、そしてＰけＳから触媒
により誘導されたレポーター分子である〕。

概念的に、考慮すべき他の二反応を以下に紀す：Ａ−Ｐ
Ｐｌ”人ｂ＋ＰＰ、、−Ａ−ＰＰ、’Ａｂ’ＰＰ、　　
　　　ｆｆｉ＋ｓ　Ａ−ＰＰ１”Ａｂ’　ＰＰ詔ｐ　　
　　　　　　（６１〔式中、Ａ−ＰＰｌｏ人すは結合さ
れたラベル付けされた分析物であり、　ｐｐ、は／　リ
、ｅデチドパートナーであり、　Ａ−ＰＰ□°人ｂ’Ｐ
りｖけラベル付けされた分析物、抗体及び／　ＩＪペプ
チド・１−トナーの反応により生成した理論的な三元複
合体であり、Ｓけ基質であ抄、そしてＰけレポーター分
子である〕。

漕足のいく感鷹を与えるためには、反応（５）における
三元複合体の生成を最少にするか、又は反応（６）Ｋ従
って三元複合体が基質を生成物に相当種度まで触媒によ
抄転化させてはならない。換言すると。

いずれかの量の三元複合体が反応（５）で生成すると。

相当量のレポーター分子Ｐが反応（６）により生成し。

反応（４）で生成したＰの量は存在する分析物の種々の
量に適切に関連しないであろう。

これらの６種の反応の効果の考察においては。

抗体、／リベデチドパートナー及びラベル付けされた分
析物の濃度は特定の試験では、基質からのレポーター分
子への転化において異なる量の分析物が反映されるよう
に選択すべきである。反応（１１〜（３）Ｋ対する平衡
定数も考慮にいれるべきである。

特定の試験を計画する指針として望ましい関係４１− は下肥の不等式により説明され、それＦｉある種の簡単
にするための仮定を加えである式の数学的分析から誘導
される： Ｋｓ　ＣＡｂ　〕／に１〉Ｃｐｐｍ　〕〉ｒＡ−ｐｐよ
〕十に３Ｃ式中、に１及びに、け反応（１１及び（３）
Ｋ対する平衡定数であね、〔Ａｂ〕は抗体の濃度であり
、ｒｐｐ２１けＩリイデチドパートナーのＩＩ賓であり
、そしてＣ＊−ｐｐｌ）はラベル付けされた分析物の！
Ｉ闇である〕。

この数学的分析け％　Ｋ１及びＫｍ（反応（２）に対す
る平衡定数）は同一であね、そして反応（５）及び（６
）け全く進行しないと仮定している。

Ｋｌ、　［”Ａｂ　１／Ｋｘという表現に関しては、Ｃ
ＰＰ、〕より小さい１の係数よりはるかに小さい全体値
は、抗体との結合がほとんど生じないという結果のため
に１分析物濃度の変化量に関してほんの最少の応答しか
与えない。換言すると１反応（３）で生成した触媒種は
分析物濃度とは独立して生成し、その結果よくても分析
物濃度Ｋかかわりなく存在する分析物の変化量を区別す
ることは難かしいであろう。

４２− これは、反応（２）の生成物は最少量しか生成しないか
らであろう。一方、抗体の濃度が高すぎるか又は平衡定
数が上記の表現の全体値が［ｐｐ、１０１．０００倍過
剰量と浸るようなものであるなら５反Ｅ　（３）　Ｋお
ける触媒活性種は、変化する分析物濃度に応答するのに
満足のいく量では生成されないであろう。

従ッテ、　表現に３１１”Ａｂ”）／に１カｒＰＰ、１
　ノ約２〜１００倍。

好適には約５〜２５倍、であるように試験を計画するこ
とが一般に望ましい。

さらに、ラベル付けされた分析物とそれのポリペプチド
・４−トナーとの反応、すなわち反応（３）。

はそれの抗体との反応、すなわち反応（２）と比べてあ
まりに大糧度管で進められるであろうために。

ＰＰ、の濃度が表現に、〔Ａｂ〕／ＫＩＫ関して高す°
ぎるときには感度はほとんどなくなるであろう。その結
果、この場合も分析物濃度の変化量は満足のいくように
区別できないであろう。ポリイデチドパートナーの濃度
が表現Ｋｓ［Ａｂ〕／に□に関して低すぎるなら、逆の
状況が起きる。分析物濃度忙関係なく。

反応（３）において不適当な量の生成物が生じるであろ
う。従って、ポリイプチドノ量−トナーの濃度を。

表現Ｋｌ（Ａｂ）／に、の値よシ約２〜１００倍低い、
好適には約５〜５倍低い、範囲内に保つことが一般に望
ましい。

同様に、ラベル付けされた分析物の濃度及びＫ。

Ｋ関してＦｉ、ラベル付けされた分析物の濃度が予期さ
れる分析物濃度のものの約１０〜１００倍以内であるべ
きである。

本発明に従う検定の計画は一般に、典型的な免疫試験の
計画に含まれるものと一同様である。本発明に従う試験
の計画例七して記すと、準備出発点は（１）包含される
分析物用の適当な抗血清又は抗体。

（２）ラベル付けされた分析物Ａ−ＰＰ□及び（３）ポ
リイプチド／豐−トナーＰＰ震の入手である。

Ａ−ＰＰ１の濃度を最初に、予測される分析物濃度のも
のと一般に同一に定める。次に、ＰＰ、の濃度をに、と
同一もしくはそれよりわずかに高く設定する。はとんど
の場合、ラベル付けされ九Ｓ−ペプチド及び８−蛋白質
からなるポリペプチド対に対してはこれは約１０−一で
あろう。基質８の量は、検ｒｒＪ用に分光光度計方式を
用いるなら毎分少なくとも約１０　ｆ　＋７吸収単位の
線状速度を与えるのに充分なほど高く選択すべきである
。

次に、適当（ラベル付けされた分析物及び上記で測定さ
れたｐｐ、　６度を用いて抗体希釈に対する抑制率を測
定して、抗体に関する一般的滴定曲線を作成する。典型
的には、抗体の濃度は約５０４（＋９もしくは３０チ）
の抑制率を与えるように選択されるが、ｔｏｓｓ曜の低
い抑制率も使用できる。

分析物に対する予測濃度範囲を模する標準的濃度の分析
物を製造し、そして次にあらかじめ定められている媒介
変数と共に使用して、参照用置換曲線を与える。この曲
線は、予測濃度範囲にゎたって適当な感度が与えられて
いるかどうかを決めるため試験されなければ）らない。

濃度範囲の比較的高い部分において比較的大きい感度を
希望するなら、これは一般に、抗体濃度を増すととくよ
シ与えられる。以上で指針として記されている定性的不
等式を用いてどんな増加選択量でも決めるべきである。

４５− 濃度範囲の比較的低い部分において比較的高い感度を希
望するときには、抗体濃度の減少は役立つべきである。

さらに、そして再び指針としての定性的不等式を用いる
と、ＰＰ、及びラベル付けされた分析物の濃度を減少さ
せることも有用である。

希望するなら、分析物（及びラベル付けされた分析物）
Ｋ対する抗体の結合及び／又はポリペプチドＡ　＋　）
ナーに対するうはル付けされた分析物の非共有結合を増
加もしくけ減少させるように平衡定数に１、−及びに３
を改変させることにより、さらに細かい調整が得られる
。本発明により加えられる別の媒介変数、すなわちＰＰ
、の濃度及びム−ＰＰｌ及びＰＰ、の反応は別の追加手
段、多分全部に対してではないかもしれないが、本発明
の多用性に寄与する細かい調整のための追加手段を、先
行の免疫検定接衝の多くを越゛える−のとして与えるも
のである。

ここで論議されている媒介変数に適切に注目することに
より、特定の試験が分析物濃度の変化量に対し光希望す
る感度を確実に得ることができる。

４６− 、ｉ−」Ｌ−１一 本発明の免疫試験方法は、多種の分析物の量的存在量を
測定する際に利用出来る。本発明の方法により測定する
ために適している可能な分析物には一般に、水性媒体中
に少なくとも約１０−１ｍ　Ｍの濃度水準で存在してい
るか又はその中に抽出可能である複雑な有機分子が包含
される。螢光性レポーター分子の存在する実際的検出限
度及び抗分析物抗体どん欲さ即ち結合力定数から濃度限
界が生じる。

実際に、本発明は今までの免疫試験を利用できた分析物
に対して使用できる。さらに、概念的には、本発明はそ
れに対して特定のレセプターもしくは結合用蛋白質が入
手できるような分析物の濃度を測定するために使用でき
る。そのようなレセプター又は結合用蛋白質を得ること
は、例えば約１００以下の如き極端に低い分子量の分析
物を用い゛　ると非常に−かしくなシはじめる。一方、
例えば１０６の如き比較的大きい分子量の分析物を用い
ると、本発明に従う分析物のラベル付けの際には触媒活
性の満足のいく抑制が確実に与えられるように注意を払
うべきである。

本発明の方法を利用できしかもそれ用の特定のレセプタ
ー又は結合用蛋白質が入手できるような分析物には例え
ば、薬及び薬代謝物、鎮静剤、麻酔物、ステロイド、ビ
タｉン、ポリペプチドホルモンを含むホルモン、抗原を
伴なう膣瘍、免疫グロブリン、酵素、工業的汚染物質、
殺虫剤及びそれらの代−物、食品添加物、除軍剤及びそ
れらの代紺物、香味剤及び食品有毒物が包括される。よ
り詳しくは、本発明の免疫試験方法はそれぞれの濃度の
下記の分析物の全範囲を試験するために便用できる暮約
１０＝’　Ｍ〜約１０−＠Ｍの濃度範囲（ヒト血清中）
、のりランチン、カンナピノイド、ゲンタマイシン、ト
ブラマイシン、メトトレキセート、リリトキシン、チロ
キシン、テストステロン、コルチソル及び免疫グロブリ
ン；約１０１Ｍ〜約１０−９Ｍの濃度ｍＮ＜ヒト血清中
）のトリアイオドチロニ　　　　□ン、ジ：／Ｓ？シン
、１ＩｉｉＩ！、７７ジオテンシン■、プロゲステ四ン
及びプロスタグランジンＦ’ＪＬ　ｒ約１０１Ｍ〜約１
０−１０　Ｍの濃度範囲（ヒト血清中）のエストラジオ
ール、ビタｉンＢｘｓ及び成長ホルモン＋　約１０−”
Ｍ〜約１０−　Ｍの濃度範囲（ヒト血清中）のインシュ
リン、ノツチロイドホルモン、チロイド刺激ホルモン、
カルシトニン、ガストリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホ
ルモン、グルカゴン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、及び
アルドステロン；並びに約１０−１１Ｍ〜約１０−！Ｉ
Ｍの濃度（ヒト血清中）の袷生期癌抗原。

現在では、上記の分析物の大部分は不均質工程を用いる
臨床的放射線免疫試験により一般に測定されている。本
発明の免疫試験方法は前記の分析物の全範囲を、費用が
かがり、有害なそして不安定な款射性核種ラベルの使用
を必要とせずに検定することが出来る可能性を有する。

複雑なガンマ又はシンチレーシ冒ン計数器の使用も同様
に省略できる。

ポリペプチドパートナ− 適切なポリペプチド対は下記の機能的特徴に合致しなけ
ればならない：（１）少なくとも一員は分析物又は分析
物類似体と共有結合できてポリペブチ４９− ドでラベル付けされた分析物を形威しなければならない
、（２）ラベル付けされた分析物は抗体用につき分析物
と競争するものでなければならない、（３）ラベル付け
された分析物は、ポリペプチドパートナ−と組み合わさ
れ九ときに、基質をレポーター分子に適当な検出可能量
で転化させるのく充分な触媒活性を与える、及び（４）
均質免疫試験用には、ラベル付けされた分析物とそれの
ポリペプチドパートナ−との組み合わせ物により付与さ
れる触媒活性の回復がラベル付けされた分析物の抗体と
の複合体化により阻害される。

概念的には、上記の条件（３）に紀されている組み合わ
せ現象には酵素性蛋白質内の複数の鎖内相互作用が伴な
われ、それは安定な三次元構造及び特別な活性場所の生
成をもたらす。大部分非共有性であるそのような複数の
鎖内相互作用は、好適には骨組のペプチド鎖に湿っての
共有結合の不存在下においてすら活性場所の再構成を可
能にするのに充分な一体化結合強度を有するものである
。

本発明の−画く従う適当なポリペプチド対は、５０− 種々の酵素を分裂させて２個の部分を与えることＫより
得られる。例えば、ブドウ球菌ヌクレアーゼの酵素によ
ゐ分裂並びにウシ、ネズミ、ヒトコブラクダ及びカンガ
ル−の膵臓リボヌクレアーゼの例えばスブチリシン、ペ
プシン及びカルボキシペプチダーゼの如き種々の酵素を
用いる酵素による分裂により生成物が生成される。

一方、大腸菌（Ｉｇｃｈ＠ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）
からの２−削険突然変異体菌株からのＭ１５蛋白質の場
合の如く、適当なポリペプチド対の一方のパートナ−は
集熱変異体細菌株から遺伝学的に得られる。この蛋白質
はβ−ガラクトシダーゼ（ＣＢ２と称されている）の小
さい熱による又は臭化シアン発生部分の存在下でβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を回復する。

この現象は試験管内補足と称される。

（ウシの）リボヌクレアーゼＡのスチリシン誘導分裂か
ら誘導されたポリペプチド対は日−ペブチＰすなわち加
ア建ノ酸部分、及びそれによりさらに複雑な１０４アき
ノ酸残基からなる８−蛋白質からなってｂる。これらの
部分は、リボヌクレアーゼのアミノ末端から数えて加番
目のペプチド結合のところのりボヌクレアーゼムの分裂
から生じる。８−ペプチドは下記の構造を有する（Ｆ、
Ｍ。

Ｒｌｃｈａｒｄ−及びＩｌｉ、Ｍｌｙｃｋｏｆｆ、　Ｔ
ｈｅ　ｆｆｉｎｇｙｍｅｓ、Ｂｏｙｅｒ。

ア、Ｄ３編、３版、４巻、６４７〜８０６頁、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃＰｒ・１１０ンドン及びニューヨーク市）：Ｈ
Ｌｙｅ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　ム１ａ　ム１ａ　ムｌ
ａ　　Ｌｙｅ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ１２３４
５６　　　７　　８　　９　　１０Ｇｌｎ　Ｈｌｍ　Ｍ
＠ｔム−ｐ　Ｂａｒ　８ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒムｌａ　
Ａｌａ　０Ｈ１１１２１３１４１５１ｆ３　　１７　　
１８　　１９　　２０８−ペプチド１−２０、 同様に周知である８−蛋白質は下記の構造を有する： ＨＢａｒ　ｓ＠ｒ　８＋ｅｒムａｎ　Ｔｙｒ　ｃｙｓｌ
ｏｌ　Ｇ４ｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ２１　　２２　　２３　
　２４　　２５　　２６　　２〒　　２８　　２９　　
３０ＩＪ７＠　８ｓｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＬｅｕＴｈｒ
　Ｌｙ−ムｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ３１　３２　３３　３
４　３５　３６　３７　３８　３９　４０Ｌｙｓ　Ｐｒ
ｏ　Ｖａｌ　Ａａｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠Ｖａ１Ｈ１ｓ　Ｇ
ｌｕ　８ｅｒ４１　４１　４５　４４　４５　４６　４
７４８　４９　５０シ１ム１ａムｇｐ　ＶａｌＧｉｎ　
Ａｌａ　Ｖａ１Ｃ７＠　８＠ｒ　Ｇ１ｎ５１　　５２　
　５５　　５４　　５５　　５６　　５フ　　１５８　
　５９　　６０ｂｙ−ムｓｎ　ＶａｌＡｌａ　Ｃｙｓ　
Ｌｙｓ　Ａ１１ｎＧａｙ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ６１　６２　
６５　６４　６５　６６　６’／　　６８　６９　　’
１０ムｓｎ　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　８ｅｒ　Ｔｈ
ｙ　８ｒｒ　’ｒｈｒ　Ｍｅｔ　８ｓｒ’７１　　　’
１２　　７３　　　’７４　　７５　　　ｌｙ６　　７
’７　　７８　　１９　　８０工Ｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ
　Ｃｙ−ムｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　８ｅｒ　Ｅ
ｌｏｒ８１　８２　８３　８４　８５　８６　８７　８
８　８９　９０Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ムｓｎ　Ｃ７
１１ムｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ９１　９
２　９３　９４　９５　９６　９’７　９８　９９　１
１００Ｇ１　　ムユａ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｈｌ−
工Ｉｓ　　工Ｉｓ　　Ｖａｌ　　ムｌａ　　ｃｙｓｌｏ
ｌ　　１０２１０３１０４１０５　１０６　１０’７　
　’１０８１０９　１１０Ｇｌｕ　　Ｇ４ｙ　　ムｓｎ
　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ
　　Ｈｌｓ　　Ｐｈａ’１１１　１１　１１３　１１４
　１１５　１１６　１フ　１１８　１１９　１２０ムａ
ｐ　ムｌａ　　８ｅｒ　　Ｖａｎ　　０Ｈ１２１１２２
１２３１２４ ８−蛋白質（２１−１２４）。

上記の８−ペプチド及びＳ−蛋白質の記載では、簡単な
略語を使用した。

種間ハイブリッドも適しており、例えばＰＰｌは５３− ＰＰｌ用のものとは同一でない動物種からの酵素から誘
導される。例えば、ヒトコブラクダ、カンガル−及びネ
ズ電から誘導される８−−ｅプチドも８−蛋白質、峙に
ウシのＢ−蛋白質又はヒトコデラクダのＳ−蛋白質の存
在下で触媒活性を有することが見出されているｏＣＪ、
ム、Ｌｅｎｓｔｒａ％Ｊｊ、Ｂｅ１ｎ−ｔ＠ｍａ、ＦＩ
Ｂ８　Ｌｅｔｔｅｒｓ％競８９１９７６　；　Ｇ、　Ｗ
、ｆｅｌｌｉｎｇ　１Ｇ、　ＧｒＯ・ｎ％Ｄ、Ｇａｋｓ
ユ、Ｗ、　Ｇａａｓｔｒａ、及びＪ、　Ｊ、Ｂｅｉｎｔ
ｓｍａ１ＦＫＢ８　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０１３４　１９
７４）。これらノ種ノボリアきノ酸を以下に示す： ヒトコプラクダの８−ベプチＰ Ｈ８ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａムｌａ　Ｇｌｎ　Ｌ
ｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ａｒｇｌｎｉｌ　　　　：５　
　　４　　　５　　　６　　　　’／　　　　８　　　
９　　　　：ＬＯＧ４ｎ　　Ｈｌｓ　　Ｍｅｔ　　Ａｓ
ｐ　　８ｓｒ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｂａｒ　　８ｅ
ｒ　　０Ｈ１１１２１ｓ　　　１４　　１５　　　’１
６　　１’７　　１８　　１９カンガル−のＳ−ペプチ
ド ＨＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏムｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｐ
ｈｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇ１ｎ２　　　　！Ｓ　　　　
４　　　５　　　６　　　　’７　　　８　　　９　　
　１０　　１１Ｈ１ｍ　Ｍ＠ｔム−ｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ
　Ｔｈｒ　Ｈｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓａｒ　０Ｈ１１
ｉ！　　１３　　Ｘ４　１５　１６　１７　１８　１９
　２０　２１５４− ネズｔの１３残基 Ｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　８ｓｒム１ａムａｐ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｈ＠Ｌｙ−ムｒｇ　Ｇ１ｎ２　３　４　５　６　７　８
　９　１０　１１Ｈ１ｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　０Ｈ １２１３１ ネズミの１７残基 ＨＧｌｙ　Ｇｌｎ　Ｂａｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　８ｅｒ　
８ａｒ　Ａｈａ　Ａｓｐ　ＬｙｓＰｈｅ　Ｌｙｅムａｐ
　Ｇｌｎ　Ｈｌｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　ＯＨ前記の文献中
で論じられている如く、これらの種からのりボヌクレア
ーゼから誘導された８−ペプチド又Ｆｉｓ−蛋白質が本
発明に従う触媒性ポリペプチド対の成分として使用でき
るよう圧するのに充分な相似性が種の間に存在している
。

さらに、前記の如く、スプチリシン以外の酵素からのり
ボヌクレアーゼム分裂生成物をポリペプチド対源として
使用できる。リボヌクレアーゼＡの連続的なペプシン及
びカルボキシペプチダーゼ処理が６個のアミノ酸だけ短
縮されたポリペプチド鎖を与えることは周知である（　
ＲＭａｓ・１−１１８）。

（Ｍ、Ｃ，Ｌｉｎ、　Ｊ”５ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４
５６７２６．１９７０）。このボリイプチＰを元のＲ）
ｉａ−・の残基１１１〜１２４に相当する合成テトラデ
カペプチドと組み合わせたときには、本質的にＲＮａ−
・の完全な触媒活性が回復される。（Ｍ、　Ｃ６Ｌ１ｎ
、　Ｂ、　Ｇｕｔｔｅ、　Ｂ、　Ｍｏｏｒｓ及びＲ９Ｂ
、　Ｍ＠ｒｒｉｆｉ＊１ｃ１％、Ｔ、Ｂ１１１．Ｃｈｅ
ｍ、　２４５．５１６９．１９７０　＋Ｍ、Ｃ，Ｌｉｎ
％Ｂ、Ｇｕｔｈ、　Ｄ、Ｇ、Ｃａ１ｄｉ、８０Ｍ０Ｏｒ
１！及びＲ，Ｂ。

Ｍ＠ｒｒｉｆｉｓｌａ、　、Ｔ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ９
ｇ４７．４６４８．１９７２　）。

また、上記の如く、リボヌクレアーゼム以外の酵素は酵
素により分裂してポリペプチド部分を与え、それは非共
有的に再び組み合わされると触媒活性を再取得する。ブ
ドウ球菌ヌクレアーゼがそのような酵素の一例である。

このポリペプチド対は、ヌクレアーゼＴ　−Ｐ（ａ−４
ｍ）と称されている４２７オノ酸ポリペプチド及びヌク
レアーゼＴＰ（４ｓ、ｓ。−１，、）と称されている１
００アミノ酸残基である。（ＨｌＪａ−ｍｉｕｃｈｉ　
及びＣ，Ｂ、ムｎｆｉｎｇｓｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、２４４．３８６４．１９６９　）。

適蟲なポリペプチド対を得るための別の方法は突然変異
体微生物によるものである。例えば、上記の如く、大腸
菌の２−削除集熱変異体は、酵素β−ガラクトシダーゼ
のアミノ酸残基１１〜４１が欠落しているＭ１５蛋白質
と命名される蛋白を生じる。

Ｋ、　ｌ＋Ｌａｎｇｌａｙ、　Ｍ、　Ｒ１Ｖｉｌｌａｒ
＠ｇｏ、ム、■、νｏｗｌｓｒ、　Ｐ、、Ｔ。

Ｚ＆ｌｌ＠ｎｈｏｆ　　及び１．Ｚａｂｉｎ　Ｐｒｏｃ
＠ｅｌｉｎｇｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌムｃａｄ＠ｍｙ　ｏ
ｆ　ｆｌｌｃｉｅｎｃ＠７２１２５４　（１ｇ７５　）
。Ｍ１５蛋白質は、正常なβ−ガラクトシダーゼの臭化
シアン誘導分裂から誘導された小さいポリペプチド部分
（ＣＢ２と称されている）と組み合わされたときＫは、
本質的に完全なβ−ガラクトシダーゼ活性を回復する（
　Ｋ、　ｌｌｊ、　Ｌａｎｇｌｅｙ及び工、　Ｚａｂｉ
ｎ　Ｂｉｏｏｈｅｍ、　１５４８６６　（１９７ｇ　）
　；　８．Ｌｉｎ、　Ｍ、Ｖｉｌｌａｒｅｇｏ、工、Ｚ
ａｂｉｎＢｉｂｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｓ＋５
ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎ、４Ｑ、２４９　（１９７０
）。

１％　Ｄ、Ｖ、Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃ、　Ｊ１Ｍ８Ｍａ
ｒｉｎｋｏｖｉｃ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

ｂ遅慢、２０９　（１９７６）参照）。同様に、７４０
０の分子量を有するオートクレーブにかけられたβ−ガ
ラクトシダーゼからの小さい部分も、Ｍ１５蛋白質と混
合したときにはβ−ガラクトシダーゼ活性の１復をもた
らす（８，Ｌ、　Ｍｏｒｒｓｏｎ及びり、Ｚｉｐｓｅｒ
　Ｊ、Ｍｏｌ。

且１ｏ１．５０．３５９頁（１９７０）。他の大腸菌突
然変異体蛋白質も、正常酵素の化学的に誘導されたポリ
イー５ツー プチド部分の存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性の回復
の同一現象を示す。例えば大腸菌の１ａｃＺＸ９Ｑ突然
変異体は、ＣＮＢｒ２４と称されている（個のアミノ酸
ポリペプチドの存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性を回
復する蛋白質を与える。後者はβ−ガラクトシダーゼの
臭化シアン分裂から得られる（　Ｊ、Ｖ、Ｗｓｌｐｌｙ
、　ＷｏＭａｎｄｅａｌｉｃ、ム、Ｖ、Ｆｏｕｌｅｒ、
工、Ｚａｂｉｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
ｕｍ、　ｇ３．２２３　（１９８０）。

ＣＢｇ及びＭ　１５蛋白質の再組み合わせ用の会合定数
は１−１−２ｘ１０９”　であると評価されること及び
ＣＢ２　ｉｌｌ：対する抗体がＭ　１５蛋白負を用いる
活性の回復を抑制することに注目すべきである。Ｆ、ｃ
ｅｘａａａ、１、Ｚａｂｉｎ、　Ｂｉｏａｈｅｍ　１８
．４０４　（１９７９）。従って、この及び関連すゐポ
リペプチド対はここに記されている免疫試験方法で使用
しようとする目的に特に適している候補である。

好適なポリペプチド対はリボヌクレアーゼムのスブチリ
Ｖン誘導分裂から誘導され、セして８−ペプチド及び８
−蛋白質からなっている。８−′４プチド及び８−蛋白
質の構造はこれまでに記されｓ８− ている。Ｂ−蛋白質では、残基加−混、切−％、５８−
１１０及び６−７２０関に、ジスルフィド結合が存在し
ており、それらがポリペプチドの相当なコイル化を生じ
ている。これらのジスルフィド結合が分裂される力ら、
触媒活性も同様に損失されるであろう。これらの結合は
従って元の酵素のものに相当する８−蛋白質に対する三
次元構造を与えゐのを助けている。この構造は実際に、
活性場所の回復をもたらす会合するＢ−ペプチド用の鋳
型を提供する。

分裂した酵素は、非共有的に再び組み合わされると、元
の酵素の触媒活性の本質的に全てを望ましくは回復すべ
きである。最少でも、基質を検出可能量のレポーター分
子に、媒体又は他の非特定媒体で誘導される方法の速度
よシ集質的に大きい速度で転化させて、希望する感度及
び正確さを与えるのに充分な活性が回復されなければな
らない。

多分１０又は５チ以下の如き低い触媒回復率でも満足で
ある。ま九、解離用の平衡定数は一般に少なくとも約１
０１そして約１い１Ｍ−１よシ小さいものであるぺきで
ある。Ｓ−ペプチド、Ｓ−蛋白ポリペプチド対の望まし
い性質の−っは、該対がほとんどの分析物と、再び組み
合わされ九改質８−ペプチド°、８−蛋白質対の触媒活
性を実質的忙感じることなく、結合する多種の結合部位
にある。対中の多くのりリン残基中のエプシロンアＺノ
基は、分析物又は分析物類似体の８−ペプチド又は８−
蛋白質と都合よく共有カップリングさせるための多数の
部位を与える。リジン残基は８−−ｅプチド中の位置１
及び７にあり、そして８−蛋白質中の位［３１、詳、４
１．６１、艶、９１、郭、及び１０４　Ｋある。さらに
、各ポリペプチドにおける骨組に由来する単一アルファ
ーアξ）基が分析物へのカップリング用に利用できる６
さらに、これらのポリペプチドパートナ−には、結合用
場所として利用できる下記の基が含まれている：カルボ
キシル、グルメメート、アメ２ルテート、ヒスチリン及
びチロシン。

しかしながら、８−ペプチド又はＳ−蛋白質構造を例え
ば分析物のラベル付性の如き目的用に改変するときＫは
、触媒回復に対する効果を考慮にいれるべきである。例
えばアミノ基を考えると、８−ペプチドのエプシロンー
アずノ基の全部又は一部のグアニジノ化又はアセチル化
は触媒活性の回復を相当遅蔦させないはずである。さら
に１８−蛋白質のりシン残基４１の保護は触媒活性の保
有に関して重大であろう。例えばグアニジノ、アセチル
、トリフルオロアセチル、ジニトロフェニル及び種々の
ボリア２ノ酸鎖の如き基の、種々のりジン残基に対する
結合は、リジン４１上のニブシロン−アミノ基が改変さ
れているとき以外は、８−ペプチド、Ｓ−蛋白質再組み
合わせ対の触媒活性を相当遅らせるものでないはずであ
る（　Ｒｌｏｈａｒｃｌｇ及びＶｙａｋＯｆｆの前記引
用文献、６７８頁）。従って、ニブシロン−アミノリジ
ン基の結合による有用なラベル付けされた分析物の生成
用に８−蛋白質を使用することは、位置４１に訃けるリ
ジン基が未修飾の１まであるなら、有効であるはずであ
る。

８−ペプチドの位置２及び９にお叶るグルタメート残基
又は位置１４におけるアスパルテート残基でのメチルエ
ステル生成は、触媒活性を相当保有６１− する生成物を与えるはずである。しかしながら、全ての
カルボキシル基の完全なり導化け、それが触媒活性を完
全に減じるため、避けなければならない。Ｂ−蛋白質で
は、位置簡におけるアスパルテート残基に相当する１個
のカルボキシル基の改変は多分触媒活性を減じないであ
ろう。

８−ペプチドの位置１２及び８−蛋白質の位置１１９に
おけるヒスチジン基は触媒活性の保有に関して臨界的で
あろう。これらのヒスチジン基は、ここで論じようとし
ている天然基質（ＲＮＡ　）又は種々の合成ヌクレオチ
ド基質の加水分解によるりん酸エステル結合分裂を促進
する求核種として触媒位置内で良く関与していると信じ
られている。、）？　ジペプチド部分中のヒスチジン基
の改変は触媒活性の完全損失を生じるであろう。従って
、アルキル化又はジアゾニウム塩反応によるヒスチジン
残基の改変は多分避けな妙ればならない。

分析物との結合がポリペプチドラベル上の官能基の一部
の改変又は誘導化の九めの主な理由であるが、これは他
の理由のためＫも望ましいという６ｇ− ことは認識すべきである。例えば、生成したラベル付け
された分析物の負荷に影響を与えるためポリペブチドラ
にルを修飾することが有用であり得る。従って、−例と
して、８−ペプチドのニブシロン−アミノ基の全て又は
一部のグアニジノ化は酸性のより少ないラベル化された
分析物を与えるであろう。このことは検定感度を強める
ための抗体及びＢ−蛋白質の間の競争平衡を変化させる
一方法を提供する際の助けＫなる。

リポヌクレアーゼムの分裂から誘導される８−ペプチド
、８−蛋白質ポリペプチド対以外のポリペプチド対電、
本発明で使用するために逼している。そのような対は望
ましい接触活性を与えるような方法で再び組み合わせら
れるであろう、４？に、ある種のポリペプチドは８−蛋
白質とそのように再組み合わせすることが見出されてい
る。そのような対には例えば、８−ペプチドの残基１〜
１３及び２〜１３からなるポリペプチドが含まれる。ま
た、下記のポリアミノ酸が８−蛋白質用の有用なポリペ
プチドパートナ−であるはずである：ｌ又は２〜１４目
又は２〜１５＋Ｉ又Ｆｉ２〜１６；１又け２〜１７ｉ１
又け２〜１８目又は２〜１９、及び１又は２〜２０（Ｆ
、Ｍ、νｉｎｎ及びに、Ｈｏｔｍａｎｎ１ムｃｃｏｕｎ
ｔｓ　Ｏｆ　Ｃｈｅｍ。

ｕｓｓｅａｒａｈ、　６．１７０　（１９７３）　）。

さらに、ラベル付けされた分析物の生成用に使用できる
広い範囲の合成８−ペプチド類似体がある。そのような
類似体Ｆｉｓ−蛋白質の存在下で触媒活性を示しそして
分析物に対するカップリング用に適する官能基を与える
べきである。従って、文献に鑑みて、８−ペプチド沿い
のある種の残基が他のアンノ酸と置換でき、そして８−
蛋白質の存在下で依然として望ましい触媒活性を与える
であろう。例えば、リジン又はオルニチン残基は位置ｌ
Ｏにお−てアルギニンと置換できなくてはならない（ム
、Ｒｏｃｈｉ、Ｆ、　Ｍａｒｏｈｉｏｒｉ、Ｌ、　Ｍａ
ｒｏｄｓｒ、　Ａ。

ｙｏｎｔａｎａ及び！、　８ｃｏｆｆｏｎｅ、Ｇａｎｇ
　Ｃｈｉｍ、Ｉｔａｌ、　９６．１５３７、１９６６　
）。ｌＯ−オルニチン置換されたペプチドは位置４及び
５において、これらの位置におけるアラニン残基の代り
にセリン残基にょ多置換されていることもできるはずで
ある。（Ｌ、　Ｍａｒｏｄ＠ｒ、ム、　Ｒｏａｈｉ、Ｆ
、　ＭａｒａｈｉＯｒｉ、ム、νｏｎｔａｎａ及び１．
８ｃｏ−ｆｆＯｎｓ、Ｊ、ム−ｅｒ、　Ｃｈ＠ｍｐ、Ｂ
ｏａ、　９１．３９２１．１９６１　）。同様に、チ四
シン残基は同じオルニチン置換されたポリアミノ酸中で
８位置におけるフェニルアラニンと置換されていること
４できるはずである。（ＲｌＲＯＯｈｔ、Ｌ、Ｍａｒｏ
ｄｓｒ、　Ｆ、Ｍａｒｃｈｉｏｒｉ、１．　Ｆｅｒｒａ
ｒ＠ｓ＊、及び１．８ｃｏｆｆｏｎｅ、　Ｊ、ムｍ＠ｒ
、Ｃｈｅｗ、　Ｂｏａ、　９０．５８８５．１９６８　
；　Ｆ、Ｍａｒｃｈｉｏｒｉ、Ｒ，ＲＯｃｈｉ、Ｌ、　
Ｍａｒｏ＋１ｓｒ、及びＥ。

８ｃｏｆｆｏｎｅ１ＧａＭｇ、Ｃｈｉｍ、工ｔａｇ、　
９６．１５４９．１９６６　）。

好適なポリペプチドパートナ−（すなわちＳ−ペプチド
及びＳ−蛋白質）に関しては、等モル量混合物の培警が
、例えばリボ核酸（ＲＮム）及びシチジン２／、　３／
　−Ｊ）ん酸ジエステルの如き種々の物質に対する天然
蛋白質であるリポヌクレアーゼムの酵素活性の本質的に
完全な回復をもたらすことが見出されている。さらに、
８−ペプチドでラベル付けされた分析物とそれのポリペ
プチドパートナ−である日−蛋白質との再組み合わせか
ら生成したラベル付けされ九分析智複合体が、基質であ
るモノヌクレオチド３′−ホスホジエステルに対する６
５− ８−ペプチド、Ｂ−蛋白質複合体の触媒活性を回復する
ことが見出されている。

フィル付けされた分析物 機能的には、本発明で使用する九めに適するラベル付け
された分析物は、ポリペプチドパートナ−に露呈された
ときの触媒活性を与えるそれらの能力によ抄、そして結
合時の触媒活性の随伴損失を伴なう分析物に対して特定
な抗体又は特定なレセプター蛋白質と組み合わされるそ
れらの能力により特像づけられている。また、そのよう
なラベル付けされた分析物が例えば製造及び使用時に遭
遇するような種々の反応条件下で種々の試薬に対して良
好な安定性を示し、そして容易に精製されることが望ま
しい。

化学的には、本発明のラベル付けされた分析物は一般に
ポリペプチドパートナ−の一方と化学的に結合している
分析物からなっている。ある場合には、分析物もしくは
ポリペプチドパートナ−又は両者が結合を実施するため
に適している官能基を含有している。分析物に対してよ
り典型的な他６６一 の状態では、１糧以上の官能基を分子中に加えることＫ
より類似体を生成することが望ましいか又は必要である
。実際に、ラベル付けされた分析物の生成を促進するた
め又は望ましい触媒活性を確実に保有させるためには、
官能基が存在していてもなお結合を実施する類似体を生
成することが望ましいか又は必須である。さらに、ある
状況下では分析物とポリペプチドパートナ−を空間的に
分離しまた結合させるための結合のための基を利用する
ことが適している。本発明で使用されるポリペブチドラ
ばル、例えばＢ−ペプチド、が酵素ラベルより小さい分
子である傾向がありその結果特性の決定及び正確な構造
決定が促進されるということも注目すべきである。最後
に、ある種の検定では１個よシ多い分析物分子を単独の
ポリペプチドラベル分子に結合させることが望ましいが
、他の試験では１個より多いポリペプチドラベル分子を
単独の分析物分子に結合させることが好ましい。

一般に、本発明のポリペプチドでラベル付けされた分析
物は式 ％式％） 〔式中、ムけ結合から生じる分析物類似体であり、 Ｘはム及び２又はＹと結合している成分であり、２は存
在しているならＸ及びＹと結合している架橋基であり、 ＹはＰＰｌ及び２又はＸと結合している成分であり、 ＰＰ、はポリペプチドパートナ−であり、ｍ％ｎ及びｐ
は１〜約８の整数であり、そして０は０又は１〜約８の
整数でありそれは通常の場合ｎと同じ値を有する〕 により表わされる。

１個より多い分析物分子が単独のポリペプチド分子と結
合しているときＫは、ラベル付けされた分析物は式 ％式％ 〔式中、ム、Ｘ、　Ｚ、　Ｙ　及びｐｐ、は前の式中と
同じ意味を有し、０は０又Ｆｉｌであり、セしてｎは１
より大きい整数である〕 Ｋよ抄表わされる。一般に、ｎは約８より大きい値を越
えずそしてより一般的には３より大きくないであろう。

１個より多いポリペプチド分子が単独の分析物分子と結
合しているなら、式は ム−（１ニー（ｚｏ）　Ｙ−ＰＰｘ）ｎ〔式中、ム、ｘ
、１ｚ、ｙ、　ＰＰｌ、　ｎ　及（ｊｏＦｉｆり前の式
中に記されている意味を有する（すなわち、１個より多
い分析物分子が単独の、ｔ？　１Ｊペプチド分子と結合
している）〕 となる。

本発明のラベル付けされた分析物の製造においては、ｍ
、ｎ及びｐのうちの最も小さい値が、分析物及びラベル
の両者の和尚する構造決定物の破壊を最少にするために
、免疫反応性及び触媒活性■復の両者の保持を一般的に
与えている。一方、免疫反応性又は触媒回復の抗体に基
〈抑制が強化されるなら、比較的高い値が有利となり得
る。最適値社、包含される特定の試験に対して実験によ
り容易に決定できる。

６９− 多くの分析物は分子中の適当が位置に、持合可能な１個
以上の官能基を含有している。しかしながら、ある分析
物に対しては、分析物分子に例えばアミノ、カルボキシ
ル、ヒドロキシル及びチオールの如き官能基を加えるこ
とが必要である。同様に、ポリペプチドラベルは一般に
、−例として、部分Ｙを与える結合に適している多くの
遊離アミノ基を含んでいるであろう。従って、８−−！
プチドをラベルとして使用するときには、３個のアミノ
基が存在しており、そしてこれらのうちの１個もしくは
全てを、Ｓ−蛋白質の存在下で接触活性の損失を伴なわ
ずに結合に使用できる。しかしながら、ある場合には、
しばしば遭遇するカルボキシル、ヒドロキシル及びチオ
ール官能基を包含するような他のポリペプチド官能基を
使用することが有用である。例えば、そのような他の官
能基は、ｆｌｌにの反応平衡１例えばち及び−１が関与
している隈りにおいて杜、望ましく使用されて有利な結
果が生じる。

分析物及びｄ（ＩＪペプチドラベル用に使用される７０
− 官能基の性質に従って好適であり、そして同一であって
もよい部分Ｘ及びＹを以下に示す。

結合基の例 ＮＨ，−ＮＨ−Ｃ− −Ｎｌ（−Ｃ−ＮＨ− −ＮＨ−Ｃ−ＮＨ− 〇 ＣＯ，Ｈ−Ｃ−０− 儒 Ｃ−ＮＨ ？ ＯＨＯ−Ｃ− 欄 ０−Ｃ−ＩＪＨ −１，０−ＣＨ２− ム、ＰＰｌ上）官能基　　　　　　　　Ｘ、Ｙ〇 ８Ｈ−８−Ｃ− ロ ー８−Ｃ−ＮＨ −Ｂ−Ｃ−ＮＨ 歳費に示されている例では、リアゾニウム塩は、７２ノ
基と酸性亜硝酸ナトリウム又は他の適当な試薬との反応
及びその後の例えばチロシルなどの如きヒドロキシルフ
ェニル成分との反応により生成できる。ヒドロキシル基
は示されているパラ位置及びオルト位置に置かれ、そし
て残りの結合（／ソラ位置に示されている）は環上の他
の位置に置か１２− れている。

基２は結合基！及びＹを架橋している。それは全ての場
合に必ずしも必要ではなく、その理由は分析物及びポリ
ペブチドライル用の特定の官能基はある場合には架橋基
の介入の必要なしく適当に一緒に結合できるからである
。一般に、架橋基２は、存在しているときには、炭素数
が１〜１０のアルキレン基、炭素数が１〜約１０のアル
ケニレン基、炭素数が約４〜約１０のシクロアルキレン
基、炭素数が約２〜約１０のオキンアルキレン基及び炭
素数が６〜約１０のアリーレン基である。

架橋基２の機能は、それにより免疫反応性、触媒活性の
回復及び抗−分析物抗体による触媒活性の抑制が最適に
されるような他の構造的パラメーターを与えることであ
る。従って、架橋基は、官能基的な意味では、分析物及
びラベルを分離するための化学的に不活性な空間的腕を
供する。さらに、以下で論じられている如く、これは２
官能性試薬の使用時には製造を助ける。例えば、炭素数
が（資）の如き比較的長い鎖の架橋基の使用は最初の二
つの官能基条件を満たすが、ラベルが抗体から１３− はるかく遠ざけられているため第三の条件は満九さない
。一方、ある場合には極端に短かい鎖長の架橋基は免疫
反応性及び多分触媒活性の損失をもたらすであろう。

本発明の一面に従うと、分析物及びポリペプチドラベル
は、分析物及びボＩＪ　、ｅブチトラベル分子の両者と
両立し得る反応性を有する官能基を含んでいるある種の
二官能性分子を使用することにより、−緒に結合できる
。多くのそのような二官能性分子が知られており、そし
て適当な例にはグルタルアルデヒド、ビスイソチオシア
ネート、ビスインシアネート、インチオシアナトーイン
シアネート、ハロビン−インシアネート及びインチオシ
アネート、トリメチルシリルで封鎖したヒドロキシイン
シアネートなどが含まれる。特に有用な二官能性分子は
、米！ｉｌ！許４，０６４，１５１に示されている方法
に従って製造される６−インチオシアナトーカブロイル
クロライドであるＬ　Ｈ，Ｌ　Ｋｒ１ｃｈａｌｄＯｒｆ
。

Ａｎｇ＠ｙ、Ｃｈ＠ｌｌ、　８７．５１５　（１９７５
）も参照せよ）。この化合物の酸塩化物基はイソチオシ
アナト基よ抄反−’Ｆ４− 応性であり、そして好適には分析物分子上のアミン又は
ヒドロキシル官能基と反応する。生成したインチオシア
ナト誘導化された分析物類似体を次にポリペプチドの遊
離アンノ基と反応させてポリペプチドでラベル付けされ
九分析物を生成で惠る。

このようＫして生成されたラベル付けされた分析−にお
いて、 Ｘは一〇−Ｃ（−ｏ　）−又は−ＭＨ−Ｃ（＝ｏ　）−
であ抄、２は−（ＣＨ２）Ｉｓ　であり、そしてＹは−
１［−Ｃ（８）−Ｈ）Ｉ−である。

ラベル付けされた分析物を生成するための他の一般的方
法は、分析物又はポリペプチドラベル上の残存官能基の
活性化及びその後の生成した生成物と他の成分との反応
を包括している。−例として、ポリペプチドラベル上の
カルボキシル基はゲンタマイシン分子上の官能基とより
反応性である誘導体に転化でき、そして生成した生成物
を次にゲンタマイシンと縮合させてラベル付けされた分
析物を生成できる。一方、シランチンにラベル付けする
九めには、シランチン分子に加えられているカルボキシ
ル基を誘導体化でき、そして生成した生成物を次にポリ
ペプチドラベルと反応させる。

誘導体化を実施するための適当な物質の例には、イソブ
チリルクロライド、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イ２ド又は
水溶性カルボジイミドが包括される。

種々の分析物のラベル付は案を以下に示す。

鎮痙剤 シランチン、フエノバルビタール、プリミドン及びエト
サクシオドから々る鎮痙剤群用の好適なラベル付けされ
た分析物はバルビッール酸構造を反映しており、そして
以下に一般的に示されている如く６又は５員環内に環式
アミド又は環式ラクタム官能基を含んでいる： 分析物　　　Ｒ シランチン　　　−Ｃ（Ｃ’、Ｈ，）、−ＮＨ−Ｃ。

フエノバルビタール　　→ｒＨＣｏ−Ｃ（Ｃａｂｓ　）
　（Ｃａｂｓ　）−ＣＯ−エトこけ〈酸イ２ド　　−Ｃ
Ｈｍ−Ｃ（Ｃｍ’ｓ　）　（ＣＨｌ　）−ｃｏ　−プリ
２ドｙ　　　　　−ｃ（ｃ、ｐ、’）（ＣｓＨ，）−ｃ
ｏ−ＮＨ−ｃＨ，−特に、シランチン用の好適なラベル
付けされた分析物は下記のものである： 〔ここで、ＸはＮ−ＣＨ，であり、Ｙけ−Ｃ〇−間であ
り、そして２は（Ｃ島）、である〕。

ある種の免疫試験では、ラベル付けされた分析物中に遊
離ＮＨ−基を保有することが有利である。

そのような場合、シランチンの誘導体はラベル付けされ
九分析物として使用できる。従って、例えば、そのよう
なラベル付けされた分析物は、ア？７基をフェニル環に
それのニトロ化及び遺児によ一マフー り加え、６−インチオシアナトカブロイルクロライドと
反応させ、そして最後にシランチンインチオシアナト誘
導体をポリペプチドラベルの遊離アンノ基と反応させる
ことにより供給される。生成したラベル付けされた分析
物を以下に示す；この場合、Ｘは−ＮＨ−ＣＯ−であり
、Ｙけ−ＮＨ−Ｃ８−ＮＨ−であり、セして２け−（Ｃ
Ｈｌ　）Ｆｌ−である。

チロキシン及びドリアイオドチロニン チロキシン用の好適外ラベル付けされた分析物を以下に
示す・ １〜３ これは６−インチオシアナトカプロイルクロライ７８− ドを使用することにより製造でき、そしてＸ、　Ｙ及び
２はこの二官能性試薬を用いてラベル付けされたシラン
チン生成物に関して紀されている屯のと同じである。

チロキシンでラベル付けされた分析物は、ア２ノ基が例
えばトリフルオロアセチルの如き容易に除去される封鎖
基によや保護されているようなチロキシンを８−−ｅデ
チド又は他のポリペプチドラベルと縮合させることによ
っても直接得られる。

下記のチロキシンでラベル付けされた分析物が最終的に
得られる： １〜Ｓ この場合、架橋基はなく、そしてＸ及びＹは−Ｃｏ−Ｎ
Ｈである。

トリアイオドチロニンでラベル付けされた分析物も同様
にして製造できる。

リドケイン リドケインの免疫試験用に適しているラベル付けされた
分析物は、ｐ−アミノリドケインと６−インチオシアナ
トカプロイルクロライドの反応及びその後のＩリベデチ
ドラベルとの反応から製造できる。生じた生成物の構造
を以下に示す：テオフイリン並びにそれの異性体である
カフェイン及びテ第１１ンけ、それらの構造が似ている
ため並びに紅茶及びコーヒー中のカフェインの存在のた
めに、妨害問題が生じる。特定のテオフィリン抗体との
反応性を確実にするために、テオフィリンでラベル付け
されたポリペプチドは、５及び７位置が１換されていな
いようなテオフィリン中に存在しているメチル！換様式
を保有すべきである。テオフイリ／、カフェイン及びチ
オプロ電ンに対するの構造を以下に示す： ０　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　０
従って、テオフィリンに対する位ｆｉｔｌのメチル基の
ところにおけるＩリイデチドラベルの結合は、適当カテ
オフイリンでラベル付けされたぼりイデチドを与えるは
ずである。これは位ｔ５及び７における区別された未置
換窒素原子が、ラベル付けされた分析物中に保持される
という事実から生じる。この状況下で検定に使用される
抗体はノ・ブチ／のテオフィリン基が位＃５及び７に未
置換窒素原子を保有しているインミュノジエンからも誘
導されるはずである。この構造を以下に示す：８１− 同様に、３−メチル位置及び多分６位置におけるテオフ
ィリンの誘導体も上記と同じ理由のために使用できる。

アンフェタミン アン７エタ２ンでラベル付けされた分析物は例えば６−
インチオシアナトカプロイルクロライドの如き二官能性
カップリング剤の使甲により直接誘導できる。生成した
構造を以下に示す。

モルフイネ、ヘロイン及びコディンからなる群の麻酔剤
アルカロイドは以下に示されている如き関連構造を有す
る； ８２− 適当なモルフイネ及びコディンでラベル付けされたポリ
ペプチドはモルフイネ又はコディンと二官能性試薬との
反応により供されるべきである。

例えば、モルフイネ又はコディンと６−インチオシアナ
トカプロイルクロライドの反応は、生じる遊離インチオ
シアナト官能性（よりＩリペデチドラベルと結合可卵な
誘導体を与える。さらに、モルフイネ及びコディンの誘
導体はポリペプチドでラベル付けするための分析物類似
体として適当に使用できる。例えば、モルフイネ及びコ
ディンけｐ−アζ）安息香酸からのジアゾニウム塩と結
合でき、そして生成した生成物を次に４リペデチドラベ
ルと縮合させる。同様に、この方法はヘロインは遊離ヒ
ドロキシル基を有していないためにヘロイン用にも提案
される。

抗生物質アミノグルコシド 抗生物質であるアミノグルコシド、ゲンタマイシン、シ
ンマイシン及びトブラマイシンに７１７　、ｅデチドを
、二官能性試薬の使用によりラベル付けできる。ゲンタ
マイシン、シンマイシン及びドブ２マイシンは全て、例
えば６−インチオシアナトカプロイルクロライドの如き
二官能性試薬を用いてポリペプチドラベルと直接カップ
リングさせるための給金場所を与える多数の遊離ア２ノ
基を有している。ゲンタマイシンは、Ｉリイグチド上の
遊離カル−キシル基をＮ−ヒドロキシこけ〈酸イミド又
は水溶性カルがジイミドとの反応により活性化しそして
次にゲンタマイシンと縮合させてラベル付けされた分析
物を生成することによってもラベル付けされる。

心嘩薬グリコシド 心嘩薬グリコシドジゴキシン及びジジトギシン用のラベ
ル付けされた分析物は二官能性試薬の使用により製造で
きる。ジゴキシン及びジジトキシンの両者は多数の遊離
ヒドロキシル基を有し、それは二官能性試薬である６−
インチオシアナトカプロイルクロライドと反応すると、
インチオシアナト誘導体を与え、それはポリペプチドの
遊離アギノ基と反応してラベル付けされた分析物を生成
する。提唱される構造を以下に示す： コルチゾル ジゴキシン及びジジトキシンに関する王妃の方法管コル
チゾルにも同様に適用出来るべきである。

；ルチゾルの適当な構造を以下に示す：８５− テストステロン ぼりペプチドでラベル付けされたテストステロンに提唱
される組成物はコルチゾル用に示されているのと同じ禦
の合成により得られる。この組成物を以下に示す。

一方、活性化された６−カルがキシメチルオキシム誘導
体はテストステロンをポリペプチドラベルにカップリン
グさせるために使用できる。

グログステロン グログステロンでラベル付けされた分析物は、Ｉリペデ
チドラベルを用いて、プロゲステロンの活性化され九６
−カル？キシメチルオキシム誘導体とポリペプチドとの
反応により供されて下肥の組成を与える； ８６− ＣＨ。

１ Ｃ。

ラベル付けされた／　ＩＪア電ノ酸分析物、例えばイン
シュリン、バラチロイドホルモン、チロイド刺激ホルモ
ン、黄体刺激ホルモン、アンジオテンシン■、成長ホル
モン、免疫グロブリン及び酵素、は数種の方法により供
される。

一方法は分析物のアミノ基をＩリイデチドラベルと結合
させるための例えばグルタルアルデヒドの如き二官能性
剤の使用を包含している。生成する一般的構造を以下に
示す： 〔Ｉリアミノ酸分析物）−（Ｎ＝ｃｕ−（ｃＨ，）、−
ＣＮ州〕。−ＰＰｌ他の方法は例えばイソブチリルクロ
ライド又はドーヒドロキシこはく酸インド／カルｌシイ
イドの如き試薬を用いる遊離カルがキシル基の活性化を
包括している。分析物又は、ｆす４デチドラペルのカル
フキシル基は活性化されそしてその後第二成分（すなわ
ちいずれも誘導化されていない分析物又はラベル）とカ
ップリング反応させる。二種の生成物の構造はこのよう
にして得られる：〔ｆす７？／ＩＩ分析物１−　ｃ　（
＝ｏ　）　−ｍ−（ｐｐ□１゜〔ｆす７　ｔ　／酸分折
物”！。−Ｎ）Ｔ−Ｃ’（＝Ｏ）−ｒＰＰ、１後者の構
造は、特Ｋ例えば活性化出来る３個だけのア２ノ基があ
るような８−−４デチドの如き比較的小さいＩリベプチ
ドラベルを用いると、ラベル化された分析物の性質のよ
り多くの調節を行なうべきである。

第三の方法はマレイミド基を有する二官能性基を用いる
Ｉリベデチドラベルの改変を包含している。これらの基
は次Ｋ　／　ＩＪア電ノ酸分析物のＳＨ基と反応するこ
とができる。下肥の型の組成物がこのようにして得られ
る： 基質 前記の如く基質は　／　Ｑ　、ｅデチド対又はより正確
にはラベル付けされた分析物複合体により作用を受ける
ため、その後必然的に基質の実際の性質け／　＋７ベデ
チド対の触媒性質に依存する。機能的には、基質は発色
団及び／又は螢光発生量生成物を４リベデチド対で誘導
される触媒放出を受け、該生成物は対応する分光光度計
又は螢光計により特に検出できる。さらに、基質からの
生成物（すなわちしＩ−ター分子）への触媒による転化
が例えば１時間以下の如き比較的短時間にわたって生成
物の出現を運動論的に監視できるほど充分急速であるこ
とが望ましい。これには一般に、発色団基質は１０”−
より大きい濃度で存在している分析物用に使用され、一
方螢光発生基質は１０−　’Ｍ以下の分析物濃度に利用
することが望ましい。

８９− レポーター分子の出現速度が、測定期間にわたる時間の
線状もしくははソ線状の函数であることが望ましい。基
質が容易に製造で無ること及び緩衝液媒体中又は凍結乾
燥形で最低１週間、そして好適には少なくとも３ケ月間
にわたって貯賊できるのに充分な安定性を有することも
さらに望ましいＯ 試験では、基質製電は試験工程中に基質の枯渇が生じな
いほど充分高くなければならない。換言すると、基質の
転換速度は試験期間中に基質Ｓｔと独立してなければな
らない。一般に、１０”’　Ｍ〜１０−２Ｍの間の基質
の濃度が認容で舞るはずである。

好適なヂリイグチド対と共に用いるためには、リボヌク
レアーゼＡＫよりし４−ター分子へ酵素的に転化される
基質を使用することが好適である。

酵素ブドウ球菌ヌクレアーゼから誘導されるポリＩｆチ
ド対には、適当な基質は天然酵素によりし？−ター分子
に転化されるものである。例えば、デオキシチ建ジン５
′−９ん酸のバラニトロフェニルエステル誘導体を利用
できる。ｐ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、９０− Ｍ　Ｗｉｌｃｈｅｋ　　及びＣ，Ｂ、　Ａｎｆｉｎｓｅ
ｎ　、　　”　Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｏｎｏｆ　８ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｒａｌ　Ｎｕｃｌｅａｓａ　ｏｎ　Ｅｌｙｎｔ
ｈｅｔｉｃ　８ｕｂｓｔ−ｒａｔｓｓ　”　、　　８ｙ
ｎｔｈｓｔｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｏｆ　８ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｃａｓＮｕｅｌａａｓｅ　、　　８巻、Ｎｎ
６，２２７７−８３頁、１９６９年６月。！−ガラクト
シドに関するＩリペプチド対用には、適当な基質は商業
的に入手できる０−ニトロフェニルβ−ガラクトシドで
ある。

しかしながら、Ｓ−ペプチド及びＳ−蛋白質ヂリイデチ
ド用には、基質として一般的に好適な構造は以下の如く
である。

Ｓ′ 　　　ＯＨ Ｒ”０−Ｐ＝０ Ｒ 〔大中二Ｂはヌクレオチドペース、例えばビリ建ジン類
似体、例えばウラシルであり、それは３１位置における
りん酸エステルの触媒もしくは酵素による加水分解を助
けることができる〕。

Ｒはランベリフェロニル、４−メチルランヘリ７　ｘ　
ｏ　二ｋ　、　３−７　ラホニル、０−ニトロフェニル
、ｍ−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ジニトロ
フェニル、シアノフェニル、アシルフェニル、カルボキ
シフェニル、フヱニルスルホネート、フェニルスルホニ
ル及ヒフェニルスルホキシドからなる群から選択される
部分であり、Ｒ′は水素、アルキル、アルケニル、シク
ロアルキル、アリール、アラアルキル、アシル、オキサ
アルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル及びチ
オシフ胃アルキルからなる群から選択された成分であ抄
、 ｒは水素又はカルシウム、バリウム、リチウム、ナトリ
ウム、゛アンモニウム、置換されたアンモニウム及び♂
リジエウムからなる群から選択されたカチオンである。

一般に、好適な基質の製造方法は数種ある。一方法は中
間生成物としての２′−０−テトラヒドロピラニル−５
／−Ｑ−アセチル−ウリシリン酸の合成を包括しており
、それを次に遊離アルコール性螢光団又は発色団と縮合
させ、一方第二の方法はｔ−ブチルジメチルクリル封鎖
基の使用を包含してお沙、そしてウリジンを直接シリル
化して２／、５／−封鎖され走ウリジンを生成すること
に基いている。好適な基質及びそれらの製造方法は、こ
れと同一日付で出願されたすでに確認された共に出願中
の出願においてよ秒完全に記されている。

ま免、適当な基質はさらに、Ｒがナフチルである上記の
構造からなっている。この場合、基質の触媒による加水
分解で得られる遊離ナフチルはジアゾニウム塩との反応
により検出され、核塩はスルファニル酸から誘導される
。最終的生成物は５００ナノメートルにおける可視範囲
内の強い吸収を有するアゾ染料である。この基質はチロ
キシンの比色計試験用に有用であることが見出されてい
る。

グリンベース、例えばアデノシン及びグアニジン、は（
上記の構造においてぎりンジンベース用に置換されてい
るときには）リボヌクレアーゼ八９３− 又は関連がリペグチド対の触媒活性を監視する丸めに適
当な基質を与えないであろうが、グリンペースを含有し
ている基質は、他のＩリペデチド対の使用時には有用で
あるべきである。例えば、後者は微生物で誘導されたり
ボヌクレアーゼＴ３の活性を監視するためＫは有用であ
ろうし、Ｔ１はグリンベース又けＴＩから誘導されたＩ
リ−（プチド・ｆ　−トナーに対する活性を有する。

他のＩリイプチド対によ抄供される特定の触媒活性のた
めに有用である基質は周知である。１らに、現存の文献
の鑑み、特定の／　＋７　、ｅプチド対により発現され
る酵素活性に対する適当な基質が設計される。

ここに記載の好適な基質はある壇の環境下では媒体誘導
加水分解をうけ得るものであり、そしてこれは基質のし
Ｉ−ター分子への望ましくないバックグラウンドとして
の変換を与える。この媒体誘導加水分解戻応はある基質
中では高いｐＨすなわち約８以上では急速に起きるが、
それよ抄低いｐＨでは非常にゆっくりしか起きない。こ
れらの−９４＝ 基質の長期貯蔵（すなわち１日以上）をしようとすると
きには、このことは関心事となる。低いｐＨ及び比較的
低い温ｆＫおける貯蔵は加水分解を最少とするであろう
。

しかしながら、２′置換基を容易に除去できる封鎖基で
誘導するととＫより媒体誘導加水分解が本質的に防がれ
るということが見出された。従って、長期貯蔵をしよう
とするときの、好適な組成は下記の式 〔式中、ｆは封鎖基であり、そして Ｒ，Ｒ’、！及びＢは基質に関する前記の式に関連して
配されているのと同じ部分である〕により表わされる。

９５− 適当な１−封鎖基は下記の基準に合致しなければならな
い；（１）他の重要な官能基に影響を与えることなく容
易に加えられ、（２）その後の合成段階と適合性がｉｂ
＃）、そしてより特定すると該段階における望ましくな
い副反応を最少にするかもしくけ無しにすべきであり、
（３）悪い有害な影響を与えずに長期貯蔵できるほど充
分に安定であり、そして（４）ホスホジエステル暗合を
分裂させずに容易に除去される。これらの基準、特に＠
Ｓのもの、け酸触媒反応によ妙加えられそして除去で負
る封鎖基の使用によ抄最も容易に満たされる。

従って、適当な封鎖基ビはシリル、オキサアルキル、チ
オアルキル、オキサシクロアルキル及びチオアルキルが
含まれる。より特定すると、テトラヒドロピラニル、４
−メトキシテトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル
、ｔ−プチルジメトシリル、が使用できる。最初の３個
の週蔽基、すなわちテトラヒドロピラニル、４−メトキ
シテトラヒドロピラニル及び１−エトキシエチル、を使
用するとケタール構造を与える。これらの封鎖基９６− は、弱酸、例えば希塩酸もしくは希酢酸、により、基質
分子中の他の重要な官能基を分裂させることなく、容易
に除去される。同様に、シリル封鎖基は例えばテトラブ
チルアンモニウムフルオライドの如き試薬により容易に
除去される。

′Ｒ＃封鎖基は基質自身の合成工程中にフラノサイド環
の２′位置に挿入できる。しかしながら、満足のいく長
期貯蔵特性用に必須であるとけ信じられていないが、５
′−位置における封鎖は介幌中に必要である。合曖中の
２′−及び５′−位置における封鎖はこのようにして合
成中間生峻物の早すゲる加水分堺並びにグー及び５′−
位置における望ましくない反応の発生を防ぐ。５′−ヤ
シの封鎖基は基質の使用前に除去する必要はなく、その
ため２′−位置の封鎖の場合のように容易に除去できる
ことという条件は存在しない。

他　　の　　成　　分 試験の実施においては、種々の理由のために他の成分を
加えることが有用である。多くのそのような添加物が知
られている。これらの中で下記の９７− ものが挙げられる：試薬の貯蔵性を改良するための静菌
剤；例えば免疫反応性を改良するためもしくは触媒活性
を変化させるための緩衝液：免疫反応性を強化するため
の例えばＮａｃｌの如きイオン性強化剤；例えば内因性
の酵素活性を減じるか又は除去するための阻害剤の如き
試薬；触媒活性強化剤、及び内因性蛋白質用の封鎖剤。

今！での免疫試験方法で使用されている数種の添加物を
希望によ抄本発明と共に使用することもできる。しかし
ながら、そのような追加成分が本発明に従う検定を実施
するためＫことで示されて匹る基準に悪彰響を与えない
点を確聴するために注量を払うべきである。例えば、い
くらか阻害も同様に生じるので使用される／ジペプチド
対がＲＮａｓｓ活性を示すような抄ん酸緩衝液を使用す
ることは普通は望ましくない。

ある場合又は全ての場合には、使用する試薬を精製する
ことが有用であり、そして実際に必要である。例えば、
内因性酵素活性を除くための、例９８− えば８−蛋白質の如き市阪級／　１７　、ｅ　ｆチドパ
ートナーＰＰＩＢの精製が一般に必要である。ベグチド
ラ□ベルＰＰ、の精製は実施できるが、単に生成したラ
ベル付けされた分析物を精製することが一般に満足であ
る。精製技術は良く知られてお怜、そしてクロマトグラ
フィ技術が適している。基質も精製できるが、ここに記
されている好適な基質ではこれは必要ないことが見出さ
れでいる。

改喪された貯蔵条件が必要から、試験試薬の一部の凍結
乾燥化が必要である。適当な技術は聞知である。

本発明に従う検定を室温条件下で行なうことが一般Ｋｉ
ｔましい。しかしながら、反応平衡に工、Ｋ２及びちの
強化又は遅延は、製電を変化させると生じる。これは、
本発明の方法用に融通性を付与するためには考慮にいれ
られるであろう他のＡラメ−ターである。

試験に対するｐＨの効果も同様に考慮すべきである。Ｉ
’ｌ工ば、チロキシンの試験では、ｐＨが５から約７に
高まるにつれて免疫反応性が減じられることが見出され
ている。ここに記されているりん酸ナフチル基質は５の
ｐＨにおいて適当に便用できるが、好適なウンベリフェ
ロン型基質は、比色計方式での有用な操作用には、約６
〜約８の範囲内のｐＨを必要とする。ｐＴ（Ｋ関する感
変は、分析物分子により塩基性の大きい基を加えながら
、ラベル付けされた分析物の負荷特性を変化させること
により多分克服できるであろう。またチロキシン用のさ
らに強い抗血清の使用は助けとなるはずである。

結合化学性（例えば結合基の場所、型）を改変すること
も助けとなる。

主な試薬（すなわち抗体、基質、ラベル付けされた分析
物及びぼり−４ｆチドΔ−トナー）は、例えば特定の分
析物用の予期される製電範囲を模するか又は包括する一
連の標準的分析物溶液の如き必要なもしくは望！しい追
加成分と一緒になって特定の試験用のキットの形に典型
的に包装されるであろう。さらに、そして使用する特定
の基質の条件によや、下記のものが包含される：（１）
封鎖形で輸送するために包装する場合には基質用の封鎖
解除試薬、（２Ｌｊ！した試薬の希釈用又はｐＨ調節用
の緩衝液、及び（３）必要なら、染料生成剤（例えばと
こく記されているシん酸ナフチル基質を使用するならジ
アゾニウム塩）。さらに、例えば内因性の分析物結合用
蛋白質の如き可能な干渉を最少北本しくは除去するため
に必要なら、予備処理溶液が供される。

種々の成分を、安定性、輸送及び他の条件により、溶液
又は凍結乾燥形でキット中に包装できる。

各成分又は試薬を別個に包装できる。一方、（１）試験
の正確性が相当悪影響されず（例えばラベル付けされた
分析物及び／　ｖＡブチトノ臂−トナーを触媒活性種の
早過ぎる生成をもたらすであろうｌｌ壇下で一緒にする
ときＫは生じるであろう）、そして（２）成分がなんら
かの方法で分解されない（例えば過変の媒体誘導加水分
解による基質の転化）限９．２種以上の成分を１個の包
装物中で一緒にすることができる。

一緒にする包装の一形式は、ラベル付けされた分析物及
び基質を一緒に包装しそして抗体及び４１０１− リペデチドパートナーを第二の包装物中で一緒にするこ
とを包含しているう典型的にはウンベリフェロン型の好
適な基質を使用するときの如く、この方式における基質
は過度の媒体誘導加水分解を防止するための適当に緩衝
された封鎖解除形であること本できる。６以下のｐＴ’
（を使用すべきであり、約５の値が満足のいく−のであ
る。比色計検出方式用には、試験で６以上のｐＨを与え
るために適する緩衝液の別個の包装物がこの場合必要で
ある。

別の−＠にする包装方式は、ラベル付けされた分析物及
び基質を別個に包装しながら抗体及びＩリペデチドパー
トナーを一緒にすることを包含している。これは、前記
の急速分析器中で使用できるよう案に融通性を与えるた
め又は基質を封鎖形で包装するととくより基質の媒体誘
導加水分解を最少化するために有用である。後者の場合
、別個に包装され九封鎖解除剤が必要であろう。また、
適当な試験ｐＨを与える丸めの緩衝液包装物も必要であ
る。

他の一緒にする包装様式は、抗体及び基質を一１０２− 緒にすることを包含している。ラベル付けされた分析物
及びポリペグチトノ量−トナーは、他の追加成分もそう
であるように別個に包装される。

種々の成分をキット中に別個に包装するか又はある様式
で一緒にするかどうかにかかわらず、ここＫＥされてい
る補助成分（例えば靜薗剤）を適当な成分包装物に加え
ることができる。

ここで記されている技術の評論は均質免疫試験用の方法
の提供時に向けられているが、Ａ　−ＰＰＩ／　ＰＰｍ
免疫試験ラベル系用に不均質方式も使用できることに注
目すべきである。これは融通性、製造の容易さ、安定性
及び例えばＢ−−ｅプチドから誘導されたものの如きＡ
　−ＰＰｉでラベル付けされた分析物の検出能力のため
に現在の不均質酵素免疫試験と比べて有利である。さら
に、不均質方式が均質方式より好適であるなら特別な状
況が生じるかもしれない。例えば、不均質方式は例えば
内因性酵素活性の如き血清に基〈妨害を除くために他の
選択を行なうこともできる。また、不均質免疫試験用に
独自の自動化装置を利用でき、そしてＡＰＰ＞／ＰＰｍ
免疫試験ラベル系はその系のより完全な有用性の表現を
可能にできる。

不均質免疫試験集は下記の段階を包含している＝（１）
適当な緩衝液媒体中での分析物、／　ＩＪベゾチドでラ
ベル付けされた分析物及び抗−分析物抗血清の培養； （２）　　抗体結合された及び遊離状の／　ＩＪ　、ｅ
プチドでラベル付けされた分析物の物理的分離；及び（
３）対応するＰＰ２及び基質を加えそして基質からのし
ｆ−ター分子への転化を測定することくよる、抗体結合
されたラベル付けされた分析物及びｌ又は遊離状のラベ
ル付けされた分析物の測定。

段階（２）は、分析物抗体に対する固相第二抗体の使用
、例えば／　１．１エチレングリコールの如き試薬を用
いてのＡｔ）”Ａ　−ＰＰ、複合体の沈殿、又はおそら
くクロマトグラフィによ抄、容易に達成される。

遊離状Ａ　−ＰＰ工部分の測定は均質方式で実施される
が、結合された部分の測定は固相抗体複合体からのラベ
ル付けされた分析物のストリッピングを必要とする（な
ぜならＡ　−ＰＰｘは通常結合されているときには触媒
活性を回復しないからである）。

これは過剰のＰＰ２の添加により又は尿素の如き他の試
薬の使用により達成され、それらは抗体複合体の解離用
に普通使用されている。一方、Ａ−ＰＰよけ、抗体を複
合体化することにより、抑制されないように計画できる
。これは実際にｐｐエラベルを抗体との分析物の複合体
化の影響から絶縁するような非常に大角い２基を用いる
ことにより行なわれる。比色計及び螢光計検出方式の両
者が、均質免々試験を用いるときの如く、可能である。

下肥のｌＩ施例は本発明を単に説明するだめのものであ
抄、そしてそれの範囲を限定しようとするものではない
。簡単に云うと、実施例■〜■は一般にチロキシン、８
−（デチドでラベル付けされた分析物の製造及び特性決
定に関している。実施例ｖＮ■バ一般に５，５−ジフヱ
ニルヒダントイン−（シランチン）　−９−−ｅプチド
でラベル付けされた分析物の製造及び特性決定に関して
いる。実施例■〜Ｘはコル−ゾル−８−イグチドでラベ
ル付けされた分析物の製造及び特性決定に関してい１０
５− る。実施例■はＳ−蛋白質の存在下でのチロ上フン−３
−−ｔデチドでラベル付けされた分析物の触媒活性を説
明する。実施例ｘｎ〜ｘｖｒは抗体の存在により生じる
触媒回復の抑制を説明する。実施例Ｘ■〜ＸＸは一般に
、標準的又は参照用曲線の製造に関している。実施例Ｘ
ＸＩは対照用及び１宋用試料の免俊試険に関している。

実施例Ｘｍは不均質方式免疫試駆に関している。断わら
ない限り製電は摂氏１賓である。

実施例では、下記の略語が使用されている。

ａ、ｕ、＝吸収単位 ９＝ダラム ｄ＝ヤリリットル 岬＝ミリグラム ｍ　ｍｏｌｅｓ　＝ｘミリモル ｕｌ−マイクロリットル ｍｉｎコ分 ｎｍ−ナノメートル チツノ々−セント Ｍ＝モル −：１ｏｅ− 函＝センチメートル ｎ＆−ナノアン！ ｍａエイリアンプ ｍ劃、Ｕ、＝ンり吸収単位 ？、　一温度 人ＢＢ、＝吸光変 Ｎ＝規定 ｎｇ−ナノグラム ＭＶ＝ンリボルト μ！＝マイクログラム ＴＩＣ＝薄聯りロマトグラフィー ｕ、Ｖ、＝ｘ紫外線 ｉ　、　ｒ　、＝赤外線 ｎ、ｍ、ｒ、＝核磁気共鳴 実施例！ この実施例は、ラベル付けされた分析物の製造において
結合基として使用するための二官能性試薬である６−イ
ンチオシアナトカブロイルクロライドの製造を説明する
。

二官能性化合物は二官能性インシアネートが得られてい
る米国特許４，１３０，５２６中に示されている方法と
同様な方法に従って製造され九。下記の反応が使われた
： （ＣＨ３）ａ８１（Ｎ（（ＧＩｍ　）６Ｃ＜１８１（％
　）ｓ→許）Ｎ（ＣＨｓ　）ａＣ−Ｏ８ｉ（ＣＨ３）ｓ
へ オーブン乾燥されそして９素冷却された２を丸底フラス
コは窒素入口、圧力均等化滴下ろうと及び機械的スタラ
ーが備えられていた。５００−のテトラヒドロフラン（
９７２４人分子ふるい土で乾燥）中の６−アンノカプロ
ン酸（６６，０２Ｆ、０．５モル）の混合物をフラスコ
に加え九。混合物を窒素下で９分間攪拌した後に、２４
０ｍのトリエチルアミン（１，７モル、９７２４人分子
ふるい上で乾燥）を攪拌しながら加えた。蜀分間攪拌し
た後に、３１５ｄの二硫化炭素（０，６モル）を６分間
にわたって滴々添加した。反応混合物を一夜攪拌し、そ
して２５０ｄのテトラヒドロ７ランで希釈した６次に２
２５ｄのトリメチルシリルクロライドを２．５時間にわ
たって滴々添加した。白色沈殿が生成した。反応混合物
を７時間にわたって攪拌しながら静かＫ”ｌｌ流させた
。冷却後に、反応混合物を空気の不存在下で濾過した。

沈殿を乾燥テトラヒドロフランで洗浄し、そして赤金色
のＰ液を集めた。このテトラヒト四フラン溶液を真空中
で室温において濃縮して、溶媒を除去した。残漬を５０
０　ｄ丸底フラスコ中にいれ、そして２５０　ｄの塩化
メチレン中に溶解させた。塩化チオニル（７０ｄ＞を攪
拌しながらＩ分間にわたって加えた。−夜攪拌した後に
、溶媒を回転蒸発器上で除去して粗生成物を与えた。

これを１１０〜１１！５″（０，２）ル）において２回
蒸留して、３１７Ｆの６−インチオシアナトカブロイル
クロライドを与え、それは４．６〜４．８ｕ（Ｎ＝Ｃ−
８）ｘｏｅ− 及び５．５ｕ　（Ｃ０Ｃｊ　）における赤外吸収帯、並
びに構造的に一散する面積比で３．４．２．８及び１．
５ｐｐｍＫおけるｎ、ｍ、ｒ、共鳴（ＣＤＣＪ３溶媒）
を有していた。

実施例■ この実施例は、例えばＳ−ベグチドの如きポリペグチト
ラベルに対するカップリング用に適しているチロキシン
の誘導体を生成するための６−インチオシアナトカブロ
イルクロライドとチロキシンの反応を説明する。

１ミリモル、すなわち７７６１１ｑ、のチロキシンを１
０ＴＩＬｌの塩化メチレン中に懸濁させた。これに０．
５−のピリジンを加え、そして混合物を水浴中で冷却し
た。攪拌されている混合物を次Ｋ　Ｏ，２ｌＥ／の６−
インチオシアナトカグロン酸クりライドと一緒にし、そ
して攪拌を一夜続けた。溶媒の約半分反び他の揮発物質
を回転蒸発器中で除去し、そして残漬を最少量のテトラ
ヒドロフラン（ＴＨＦ　）中に溶解さ、せた。ＴＨＦ混
合物を分離ろうと中に移した。

混合物を水で２ＩＩ抽出することにより無機塩及び未反
応物質を除去した。有機−を無水Ｎａ、ＳＯ，上で１１
０− 乾燥し九。溶媒を蒸発器上で除去すると、生成物である
）ｆ−（６−インチオシアナトカプロイル）チロキシｙ
から々る残清か残り、それは薄１−クロマトグラフィ及
び元素分析により同定された。

実施例■ この実施例は、実施例■のＮ−（６−インチオシアナト
カプロイル）チロキシンと８−−４デチドの反応によ妙
生成される８−ペプチドでラベル付けされたチロキシン
の製造を説明する。

２．９４岬、す々わち１．３６　Ｘ　１０−９９モル、
の布板の８−ペプチド（Ｓｉｇｍａ　Ｌｏｔ　＋　９９
０−８０５５　）を１．５−のｐＨ９の０．２Ｍはう酸
塩緩衝液中に溶解させ、そして溶液を１！温で領分間攪
拌した。この溶液に、ＩＱＯｕｌのジメチルホルムアミ
ド中の２．ｏ９η（９，６Ｘ１０−リリモル）のＮ−（
６−インチオシアナトカプロイル）チロキシンを加えた
。さらに５０ｕｌのジメチルホルムアｆドを加え・友。

混合物を一夜攪拌し友。

チロキシン−８−ペプチド誘導体Ｒ，５’−０−アセチ
ルウリジン３’−（４−メチルウンベリフェロン−γ−
イルホスフェート）基質を用いて試験したときに触媒活
性及び免疫反応性の両者を示すことが見出されたが、そ
れはさらに以下の実施例■に従って精製され九。

実施例■ この実施例は、実施例■で製造されたＳ−ペプチドでラ
ベル付けされたチロキシンの精整を説明する。

セファデックスＧ−２５Ｆ’カラム（ＩＸ’）”４ｍ）
を製造しそして０．０２％ナトリウムアジドを含有して
いる約Ｔ）Ｈ９，５の０．０５Ｍはう酸塩緩衝液で平衡
化した。実施例■からの反応生成物の一部分（０，５，
ｄ）をカラムに遠用した。緩衝液を１直／／分の流速で
溶離し、セして１ｄフラクシランを集めた。フラクシヲ
ン１４〜２５は３２４ｎｍ　Ｋおけるチロキシンによる
吸収に基く望ましい接合体、実施例道に示されている如
き８−＊白質及び基質の存在下でのＭ媒活性、及びｌ！
施例１１に示されている如き免疫反応　　　・性（チロ
キシン抗体の存在下での抑制）を有することが見出され
た。

実施例Ｖ〜■は５，５−ジフェニルヒダントイン（シラ
ンチン）８−ペプチドでラベル付けされた分析物の製造
に関している。実施例中に配されている合成では、シラ
ンチンは改変されて、Ｎ−ヒト四キシこはく酸イ建ドで
誘導された縮合によね８−ペプチドにカップリング可能
となる。

実施例Ｖ この実施例は、８−−４デチドとカップリングすル、５
．５−ジフェニルヒダントイン３−　（５−４草酸）、
Ｃ，Ｃｏｏｋ　、　Ｊ、Ａ、　Ｋｅｐｌｅｒ　、　Ｈ，
Ｄｉｘ　Ｃｈｒｉ−ｓｔｉａｎｇｅｎ％Ｒａｓ、　Ｃｏ
ｍｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐａｔｈ、　Ｐｈａｒｍａ、５．
７６７　（１９７３’）、の製造を説明する。

ナトリウム５．５−ジフェニルヒダントイン（８１ｇｍ
ａＬｏｔ　＃　６４Ｃ−００２７、１，６５Ｎ　、６．
０１　Ｘｌ０−３モル）を、乾燥ジメチルホルムア２ド
（３ｏＩＩＬｌ）を有する１００ｄの丸底フラスコに加
えた。混合物を攪拌しながら６０ｍに加熱し、そしテ１
．２０　Ｊｉ’　（６，１５ｘｌｏ−’−ｖ−ル）　ノ
５−ブロモ吉草酸メチルを加えた。反応混合物を３時間
にわたって攪拌しながら（イ）℃に保った。それを次に
４５０　ｄの３０チ飽和硫酸アンモニウム中に１１３− 注いだ。５＠に一夜攪拌した後にゴム状沈瞬が生成した
。上澄み液を一過し、そして残漬を５　ｍｌの冷メタノ
ールですり砕い友。粗生成物を一過し、そして熱いメタ
ノールから再結晶化させた。合計収量１，４１　ｇ（６
４４）の生成物である５、５−ジフェニルとダントイン
３−（５−吉軍酸メチルエステル）を得た。

０．８９１１　（２，４３ギリモル）の５，５−ジフェ
ニルヒダントイン３−（５−吉軍Ｗ１）メチルエステル
を１０４ジオキサｙ　／　Ｈ，Ｏ中の０．５Ｎｔ！！酸
５０＋ｔ／ノ中で３時間速流した。反応混合物を冷却し
、そしてダにおいて一夜貯蔵した。粗製結晶性生成物を
一過によ抄集め、そして酢酸エチル／ヘキサンから再結
晶化させた。合計収量０．６３９（７４４）の生成物で
ある５、５ジ７ヱニルヒダントイン３−（５−吉軍酸）
が得られ、それは１５０〜１５τの軸点（文献融点１６
１〜１６３）を有していた。生成物を再び再結晶化させ
て、１５２〜１５３°の融点を有する精製された物質を
与えた。

実施例■ １１４− この実施例は５，５−ジフェニル−ヒダントイン−Ｂ−
−＜グチドでラベル付けされた分析物の製造で使用され
た５、５−ジフェニルヒダントイン３−（５−吉草酸Ｎ
−ヒドロキシサクシンインジルエステル）の製造を説明
する。

２１．３６岬、すなわち５．８　ｘ　１０−”？リモル
、の実施例■の５．５−ジフェニルヒダントイン３−（
５−青草酸）を０．６６ｄの乾燥テトラヒドロフラン中
で８　”Ｆ　（７，Ｏｘ　１０４ａリモル）のＮ−ヒド
ロキシこけく酸イミド及び１５１１９のジシクロへキシ
ルカルボシイミドと一緒にした。混合物を一夜放電した
。反応混合物を１０ｄの酢酸エチルで希釈し、そしてｒ
逼して、ジシクロヘキシル尿素を分離し念。溶液を０．
５ｔｊの０．５Ｍ炭酸水素ナトリウムで２回、０．５−
の水で１回、そして０．５−の麹和塩化ナトリウムで１
回洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、
そして回転蒸発器上で濃縮した。緒晶性残漬を塩化メチ
レン／ヘキサンから再結晶化させて、１６１１１Ｆの生
成物を与えた。

実施例■ この実施例は実施例■で得られ九反応生成物かう１７）
　５．５−ジフェニルヒダントイン（シラフチ／）８−
ペプチドでラベル付けされた分析物の製造を説明する。

商業的に得られたＳ−ペプチド（Ｓｉｇｍａ　Ｌｏｔ　
＃９９Ｃ−８０５５，０，８５”Ｐ、　　３．９　ｘ　
１０−’ミリモル）を０．２５ｄの乾燥ジメチルホルム
アミド中に溶解させた。

Ｆ３−−ｅｆチドジメチルホルムアミド溶液に、０．１
０ｄの乾燥ジメチルホルムアミド中の０．９２ｑ、すな
わち２０　Ｘ　１ｎ−’ミリモルの５，５−ジフヱニル
ヒダント４　：／３−（５−ＶＩＥ酸）　Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイ２ジルエステルを加え、その後４０ｕｌの
乾燥ジメチルホルムアミド中の０．１８１１ｉｐのＮ−
メチルモルホリンを添加した。この反応混合物を室温で
１週間攪拌し、そして次に５°において貯蔵した。

シランチン５−−ｅプチドでラベル付けされた分析物は
、５′−〇−アセチルウリジンー３’−（４−ｌｆルウ
ンペリフヱロン−７−イルホスフェート）基質を用いて
試験するときには、触媒活性及び免疫反応性の両者を示
すことが見出されたが、それをさらに以下の実施例糧に
従って精製した。

実施例■ この実施例は実施例■で得られた５、５−ジフェニルヒ
ダントイン（シランチン）Ｓ−ペプチドでラベル付けさ
れた分析物の精製を説明する。

シランチンＳ−ペプチドでラベル付けされた分析物をセ
ファデックスＧ−１５カラム上のクロマトグラフィによ
り精製した。セファデックスＧ−１５（２０ｇ）を０．
１４ナトリウムアジドを含有している１５０−の０．０
５ＭのｐＨ約８のトリエタノールアミン緩衝液中で再び
水和させ、そしてｌＸ４Ｌｆｆ！のカラム中に注いだ。

カラムを緩衝液で平衡化させ、そして１００ｕｌの前記
の如くして製造されたラベル付けされた分析物をカラム
上で小部分の緩衝液で洗浄した。フラクション（１−）
を集め、そして触媒的及び免疫反応性に関して監視した
。２００ｕｌ部分の希釈したフラツタ９７を２００ｕｌ
の酢酸ナトリウム緩衝液又はシランチン抗体、１９００
ｕｌの封鎖されていない基質である５′−〇−アセチル
ウリジン３’−（４メチルウンベリフヱロンー７−イル
ホ１１アー スフエート）及び２００ｕｌのＳ−蛋白質溶液と一緒に
した。

螢光の増加速度を３２５ｎｍに設定され九励起及び４４
０ｎｍにおける放射を有する商業的に人手で舞るＦａｒ
ｒａｎｄ　Ｍａｒｋ　１　螢光針を用いて監視した。指
されている７ラクシヨンに対して下記の結果が得られた
： ＝１１８− 表　　　１ １４　０．５　−　− １５　１７．５　９　４８，６ １６　２６．０　８　６９．０ １７　３６．０　６　８３．０ １８　１４．５　３．５　７８．０ １９　１５．０　２．５　８３．０ ２０　１１．０　１．５　８６．０ ２１　８．５　１．５　８２．０ ２２　８．０　１．０　８７，０ ２３４．５　−　− ２４　４．５　−　− ２５　４．５　−　− ２６　６．０　１　８３．０ ２Ｂ　　４．０　−　− ３５　１．５　−　− ６３　１．５　−　− フラクション１５〜１９及び２ｏ−５を別個に貯蔵した
。貯蔵された７ラクシヨン１５〜１９を次に実施例ＸＶ
、Ｘ■及び届に記されている免疫試験で使用した。

実施例■ この実施例はコルチゾルＢ−−ｅグチドでラベル付けさ
れた分析物の製造で使用された２】−コルチゾルー（６
−イツチオシアナトカプロエート）の製造を説明する。

トリエチルア建ン（０，２ｄ）を注射器を用いて０．３
６２１のコルチゾルの２ｄのＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
建ド中溶液に加えた。混合物を大気水分を除いたフラス
コ中で攪拌し、そして氷水冷却浴中に浸した。混合物に
０．２２９１１の６−イツチオシアナト酸クロライドを
３分間にわたって嫡々添加した。反応をシリカゲル薄層
クロマトグラフィにより溶離溶媒として酢酸エチル中の
１０１メタノールを用いて監視した。生成物は０．７の
Ｒｆ値を有し、それに比べてコルチゾル自身は０．５の
Ｒｆ値を示し　　　□た。３時間の反応後に、ＴＬＣは
少量のコルチゾルを示すか又は食〈示さなかった。混合
物を次に箪のメタノールで処塩し、そして蒸発乾固した
。残漬をメタノール／エーテルから２回結晶化させて、
２１１１９の白色の針状物（融点１０５〜１０８）を与
えた。構造と一致した赤外線及びｎ、ｍ、ｒ、データが
得られた。

実施例Ｘ この実施例は実施例■で得られた反応生成物からのコル
−ゾル−８−ペプチドでラベル付けされた分析物の製造
を説明する。

０．３５１９の８−イデチドを０．３−のｐＴ（９，８
の０．２Ｍ＃′ｌ！う酸ナトリウム緩衝液中に溶鱗させ
た。攪拌されている溶液に、０．０２ｇ／のジオギサン
中の０．５岬の４−コルチゾル−（６−イツチオシアナ
トカグロエート）を加えた。さらに０．０７５　ｄのジ
オキサンを加えて、反応混合物を均質とした。室温にお
いて４日間攪拌した後に、混合物を１．ＯＸ５０ｍの奄
ファデックスＧ−１０カラムを通して、０．０５Ｍトリ
エタノ−ルアオン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，０，１％　
ＮａＣｊで溶離して、精製した。２．４５ｍの７２クシ
Ｗ／を集めた。溶離剤をｕ、ｖ、検出器を用いて監視１
２１− し丸。

主要なバンドはフラクション７．８及び９に溶離し丸。

実施例糟で使用された方法による、Ｓ−蛋白質及びクン
ベリフエロン基質（グー０−アセチルウリジン−３’−
（４−メチルウ／ベリ７エａン−７−イルホスフヱート
）の存在下における触媒活性の試験は、これらの７ラク
シヨンが約９７優の溶離され九Ｓ−ペプチド活性を有し
ていたことを示した。

これらのフラクションの触媒活性はコルチゾル抗血清の
存在下では５〜８０チ抑制された。ラベル付けされた分
析物の紫外線スイクトルは２４０ｎｍにおけゐ特性コル
チゾル吸収を有し、そしてこれ及びコルチゾル自身の吸
収ヱプシロン（１１，９９８）からラベル付けされた分
析物の濃度は７　Ｘ　１０−’Ｍと推定された。

実施例■ この実施例は実施例■で製造されたチロキシン−８−−
４ｆチドで２ベル付けされた分析物の、Ｓ−蛋向質の存
在下での、触媒活性を説明し、そし１２２− てラベル付けされ九分析物の濃度に対する触媒活性の相
互関係を示す。

チロキシン−８−ペゾチドでラベル付けされた分析物の
回収された触媒活性をそれの濃度の関数として、８−蛋
白質の存在下で監視するためにユニオン・カーバイド・
コー？レーション、モデル５００　ＣｅｎｔｒｉｆｉＣ
ｈｓｍ　Ｒ分析器を使用した。ウリジン−３′−α−ナ
フチルホスフェート／ｐ−ジアゾスルファニル酸を、触
媒活性を管視するための基質／染料組み合わせ物として
使用した。下肥の試薬を製造しｆｔ、： ａ、緩衝液：　０．Ｉ　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨｓ、ｏ
）ｂ、　　ｓ−蛋白質：酢酸ナトリウム緩衝液中１．５
×１０−’Ｍ Ｃ９基質：１０，７ｄの酢酸ナトリウム緩衝液中の１６
１９の新たに封鎖除去されたウリジン＋　３／　−（α
−ナフチルホスフェート）、ｄ、染料：１，０＋ｊの０
．１　Ｎ　ＨＣＩ　１Ｌｏｔ　＃０３１８１４中の５１
１１９のジアゾ−ｐ−スルファニル酸の１，５−ナフタ
レンジスルホン酸安定化塩、 ｅ、チロキシン−８−イデチドでラベル付けされ九分析
物：実施例■で製造されたクロマトグラフィ貯蔵フラク
ション１４〜２５精製されたラベル付けされた分析物の
、酢酸 ナトリウム緩衝液中の、１：４０希釈、ｔ　＆　ｂ　チ
ｔ、ｏ　Ｘ　１０−’Ｍ、［１゜Ｃｅｎｔｒｉｆｉ　Ｃ
ｈｅｗ　Ｒ分析器は下肥の調整値を有していた：ロータ
一温度、ｒ；フィルター、５２Ｑｎｍ　；試験方式、Ｔ
ＥＲＭ；プリントアウト、ＡＢＳ　；　ＡＢＳ　１１、
Ｏｕ；ブランク、８口１ｄ；濃変因子、０；テストコー
ド、０；Ｔ、１分。

５．５５ｓＥ／の酢酸ナトリウム緩衝液、８４０ｕｌの
基質、７０ｕ１の染料、及び１４０ｕｌの８−蛋白質か
らなる混合物を製造し、そして４００ｕｌ部分の混合物
をＣｅＣｅｎ−１ｒｉｆｉＣｈｅ分析器の転移ディスク
のみぞ３〜１２の試薬井戸中にピペットで加えた。それ
ぞれ５ｕｌ〜４０ｕ１の種々の量のチロキシ／８−４プ
チド溶液を転移ディスクの対応する試料井戸中にピペッ
トで加え、各井戸中の全量を酢酸す）　ＩＪウム緩衝液
で４０ｕｌとした。装填したディスクをローター上に置
き回転させた。各みすに対して１分間隔で吸光度の読み
をプリントアウトし九。これらを最少２乗法線状回帰分
析により、ナフトール及び染料試薬との反応から誘導さ
れた発色団生成物の生成速ＩＩＫ転化した。データを下
ｆｌ！２に示す。一般に、側々の速度側室に対して相関
係数は０．９９５より大負かった。

表　　　２ ｕ１チロキシン８−Ｗチド　　吸収業位の速１１　（Ｐ
Ｘ、ｕ）、毎分５　　　　　　　　　０．００８６．　
０．００８０１０　　　　　　　　　０．０１８４．０
．０１８４２０　　　　　　　　　０．０４２９．　０
．０４７４３０　　　　　　　　　０．０６９７．０．
０７２１４０　　　　　　　　　０．０９２３，０．０
９４９チロキシン−８−イプチドの濃度は下式による発
色団生成物の生成速度と直線的関係であった２速［（ａ
、ｕ、　／ｗｉｎ、　）　＝　０．００２４５　（ｕｌ
チロキシン−８−ベグチド）　−０，００４８！ １２５− ０．９９９５の相関係数。

これらのデータは、基質の触媒による転化がラベル付け
された分析物の濃度に直接関係していること及びこの方
法の速度は遠心急速分析器中で、測定期間にわたる吸光
廖及び時間の間の線状関係に従って簡便にしかも正確に
測定できる。

実施何重〜■は、Ｓ蛋白質の存在下でのラベル付けされ
た分析物の触媒活性の回復に関する分析物に対する抗体
の抑制効果を示している。言ｅされているように、螢光
及び比色試験の両者が使用される。

実施例璽 この実施例は螢光試験を用いての、チロキシン抗体によ
るチロキシン８−−Ｃ７”チドの触媒活性の回復抑制を
示している。下肥の試薬を製造した：ａ、テロ中シンー
８−−４グチドでラベル付けされた分析物：実施例■で
製造され九生成物を０．０５Ｍ　）リエタノールアＺン
（’ｆ’ＲＡ　’）緩衝液、ｐＦＩ８を用匹て１　／２
０００の率で希釈した。

）、ｂ、チロキシン抗体：抗血清をＴｇＡ緩衝液を用い
１２６− てＩ／２００の率で希釈した。

ｃ、　　８−蛋白質：精製された商業用物質を’Ｉ’Ｅ
Ａ緩衝液中で２　Ｘ　１０−’Ｍまでとした。

ｄ、基質：　５０．７５１１１７の０．１Ｍ酢酸塩緩衝
液、ｐＨ５，０中の約１７１１９の基質の濃度の新たに
封鎖除去された５′−０−アセチルウリジン−３’−（
４−メ＋ルウンベリ７エロン−７−イルホスフエ　−　
ト　）　。

この基質を触媒により加水分解して、螢光性生成物であ
る（４−メチルウンベリフェロン）ヲ与えた。　Ｆａｒ
ｒａｎｄ　Ｍａｒｋ　Ｉ　螢光計を０．１に設定されて
いる目盛りで、速度測定用に使用した。励起は３２５ｕ
ｍであす、そして放射け４４０ｕｍで監視され走。

表３は示されている試薬を一緒圧した後に得られたデー
タを示す。

１２７− 溶液１及び２に対するデータはへチロキシン−８−４ｆ
チドを８−蛋白質と一緒にしたときには触媒活性が回復
されること、及び触媒活性がＳ−蛋白質濃度に関して飽
和されているようであることを示している。溶液３に対
するデータは、触媒活性が８−蛋白質の不存在下で表わ
されないことを示している。溶液４及び５に対するデー
タは、チロキシン抗体の存在によるチロキシン−８−イ
デチドの触媒活性の抑制された回復を示している。

抑制率け５３４であった。

実施例扇 この実施例は、比色計試験を用いての、チロキシン抗体
によるチロキシン−８−ベグチドの触媒活性の回復の抑
制を説明する。

この実施例で使用された試薬は、実施例でで使用された
ものと同一である。５．５５ｄの酢酸塩緩衝液、８４０
ｕ−１の基質、７０ｕｌの染料及び１４０ｕｌの８−蛋
白質からなる混合溶液を実施例ＸＩＫ記されている如く
して製造した。また吸光度の増加速度をＣｅｎｔｒｉｆ
ｉ　Ｃｈｅｍ　Ｒ５００分析器を用いて実施例■に記１
２９− １２８− されている調整値において監視した。チロキシン抗体を
減少していく量の酢酸塩緩衝液で希釈するととＫより種
々の濃度の抗体溶液が得られた。

４００ｕｌの混合溶液を分析器のみぞ２〜１２の試薬井
戸中にピペットで加えた。それぞれ】Ｏｕｌの減少して
いく抗体希釈物を試料井戸４〜１２の中に、加ｕ１のチ
ロキシン８−−（プチドでラベル付けされた分析物と共
に、ピペットで加えた。増加していく吸光度を装量ロー
ター上に転移ディスクを置きそして回転させた後に１分
間隔で監視した。表４は結果を記骨して込る： 表　　　４ み　ぞ　　　　抗体希釈　　　　速妾（ａ、ｕ、　／ｍ
１ｎ）４　　　　　　１：５０　　　　　　　０．０６
３７５　　　　　　１　：４０　　　　　　　０．０６
２２６　　　　　　１　：３０　　　　　　　０．０５
６４７　　　　　　１　：２０　　　　　　　０．０５
２３８　　　　　　１　：１０　　　　　　　０．０４
９０９　　　　　　１：６．６　　　　　　０．０４７
１１０　　　　　　１：５　　　　　　　　０．０４３
１１１　　　　　　　　１　：３．３　　　　　　　　
０．０４９５１２　　　　　　　１　：２．５　　　　
　　　　０．０４７９１３０− データは、１：１抗体希釈付近で！ラドー化されている
抗体の抑制効果を示している。上記のデータをグロツト
すると、１：３Ｄよ妙幾分大きい抗体希釈度における５
０慢抑制があるＳ−形の滴定曲［が出きる。

実権例■ この実施例は螢光針試験を用いるシランチン抗体による
シランチン８−−４デチドの触媒活性の回復の抑制を説
明する。

下肥の試薬を使用した： ａ、シランチンＳ−ペプチドでラベル付けされた分析物
：実施例ｖ−ｖａｔ中に記されている如くして製造され
た物質、これはｐＨ５の０．１　Ｍ酢陵ナトリウム緩衝
液で１　／６０００の率で希釈されていた。

ｂ、　　８−蛋白質：　Ｓｉｇｍａ精製された商業用物
質をｐＨ５の０．１　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中で１，
４７ｘ１０°１Ｍの濃度にした。

Ｃ，シランチン抗体：抗血清を０．１　Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液中で１：５０の率で希釈した。

ｄ、基質：新しく封鎖除去された５′−ｏ−アセチルウ
リジン−３’−（，４−メチルウンベリフェロン−７−
イルホスフェート）。

Ｆａｒｒａｎｄ　Ｍａｒｋ　Ｉ螢光計を、０．１に設定
されている目盛で、速変測定用に使用した。励起け３２
５ｎｍであり、そして放射け４４０ｎｍで監視された。

示されている試薬に１５０ｕｌの８−蛋白質を加え、そ
して溶液をＩ分間培養した。データを表５に４碌する。

（３３− データはシランチン抗体の存在によるシランチン−８−
ペグチドの触媒活性の抑制された回復を示している。溶
液１及び２に対しては抑制率は６７嗟であり、そして溶
液３及び４に対しては抑制率は４８−である。

実施例ＸＶ この実権例は比色計試験を用いての、シランチン抗体に
よるＳ−蛋白質の存在下でのシランチン−８−−４ｆチ
ドの触媒活性の回復の抑制を説明する。

この実施例では、抗体比色計法での触媒活性の抑制監視
用の基質／染料組み合わせ物としてウリジン−３７−（
α−ナフチルホスフェート／ｐ−ジアゾ）スルファニル
酸を使用した。下肥の試薬が製造された： ａ、シランチン−８−−４デチドでラベル付けされた分
析物：ｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝液
を用いて１　：　６００　Ｋ希釈された、−＊　榴例■
〜ｖｔｎに記されている方法で製造された物質。

ｂ、　　ｓ−蛋白質：ｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（３４− 緩衝液中で１．５３　Ｘ　１０−’Ｍｔでにされ九８ｉ
ｇｍａ精製された商業用物質。

Ｃ０基質：新しく封鎖除去されたウリジン−３′−（α
−ナフチルホスフェート）。

ｄ、抗体ニジランチン抗体を０．１　Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液を用いて１：１５の率で希釈した。

ｅ、染料：ｐ−ジアゾスルファニル酸の安定化された１
、５−ナフタレンジスルホン酸塩（２５１１）を１肩ｌ
の０．１ＮＨ（Ｊ中に溶解させた。

５０ｕｌのシランチン−８−イプチド、２０ｕｌのＳ−
蛋白質、２００ｕｌの基質及び？５ｕｌの染料からなる
溶液をｐＨ５，０の２０５２　ｕｌの０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液ｐＲ５，０で最終的量とした。４７０ｎｍ
　Ｋおける溶液吸光変を、Ｃａｒｙ　Ｍｏｄｅｌ　１１
８分光光電計を用すて速度方式で時々監視した。吸収増
加速度（１分当りの吸収単位、ａ、ｕ、で測定）は０．
０５ａ、ｕ、　／ｍｉｎ、であることが見出された。

第二溶液を製造し、そこでは１ｌｌｕｌの抗体を対応す
る量の酢酸ナトリウム緩衝液用に置換した。

吸収増加速度は０．０２ａ、ｕ、　／ｍｉｎ、であ抄、
それはシランチン抗体の存在によるシランチン−１３−
−Ｊ！グチドの触媒活性の回復の６０チの抑制率に相当
してい友。

実施例ＸＶＩ この実施例は遠心急速分析器を用いての、Ｓ−蛋白質の
存在下でのシランチン抗体によるシランチンＳ−ペプチ
ドの触媒活性の回復の抑制を説明する。

この実験は、ナフチル基質の代りに比色計基質としてウ
リジン−３’−（４−メチルウンベリフェロン−７−イ
ルホスフェート）を使用しそして分光光電計の代りに吸
収増加速度を彎視するために遠心急速分析器（Ｃｅｎｔ
ｒｉｆｉ　Ｃｈｓｍ　’　５００　）を使用するため、
実施例Ｗとは異なっている。

下記の試薬を使用した： ａ、シランチン−９−４プチドでラベル付けされた分析
物：実施例Ｖ〜■に配されでいる如くして製造された物
質を未希釈形で使用した。

ｂ、抗体：ｐＨ７，１の０．１　Ｍ　）リエタノールア
ミン（ＴＥＡ　）　−ＨＣＩ緩衝液で１：４０の率で希
釈された抗血清。

ｃ、　　８−蛋白質：精製された物質をｐＨ７，１の０
．ＩＭ　ＴＷｋ−ＨＣＩ緩衝液で１　：　１００の率で
希釈して、１．５３Ｘ１０−’Ｍの最終的濃度を与えた
。

４、基質：１７１１Ｆの５′−〇−アセチルー２’−〇
−（テトラヒドロピラン−２−イル）ウリジン３′−（
４メチルウンベリフェロン−７−イルアンモニウムホス
フェート）を７５０ｕｌの０．０５ＮＨＣｌでＩ分間封
鎖除去することにより５′−〇−アセチルウＱ−／／−
３’−（４−メチルウンベリフェロン−７−イルホスフ
ェート）基質が得うした。

反応混合物を次に、　１８８０ｕｌのｐｕｓ、ｏの０．
１　Ｍ酢酸ナトリウムを加えることＫよ炒緩衝した。使
用の直前１／Ｃ，３００ｕｌのこの濃縮基質を５０９４
ｕｌの０．０１　ＭＴＩＡ−ＨＣｌに加えた。

Ｃ５ｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈｅｍ　Ｒ５００分析器に対する
下記の調整値を使用した二ロータ一温度、笥；フィルタ
ー３４０ｎｍ　；　Ｔｏ、　１０秒；Ｔ、２分；　ＡＢ
８　、１．Ｏｕ　；ブランク、ホールド；試験方式、Ｔ
ｅｒｍ　；グリントアウト、人Ｂ８；濃変係数、Ｏ；試
験コード、Ｏ０ヲベル付けされた分析物及び抗体又は緩
衝液を一１３フ− それぞれ、分析器の転移ディスクのみぞ３〜６の試料井
戸中にビイットで加え、その後１６．６ｕｌの０．０２
５　Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。Ｓ−蛋白質及び基
質を転移ディスクの同じみぞの試料井戸中にピイットで
加えた。みぞＯ及び１には対応する量及び等しい量のＴ
ＥＡ緩衝液が充填されていた。

みぞ２では、シランチン８−−４ｆチド及び抗体をＴＥ
人緩衝液で置換して、基質ブランクを与えた。

ディスクをローター上に置き、そして回転させたつ吸収
を２分間隔で璧視し、そしてプリントした。

時間の函数としての吸収の最少２乗法線状回帰分析によ
り速度が得られた。

表６はデータをまとめたものである： １３８− データは、シランチン抗体の存在によるシランチン−８
−−ｅデチドの触媒活性の抑制された回復を示している
。抑制率は３１チである。

上記の実施例■〜川は標準的又は参照着換曲線を作成す
るための基礎を提供する本のであり、該曲線から未知の
分析物濃度が測定できる。下肥の実施例１〜ｘｘＩけ対
応する基質での種々の比色計又は螢光計装蓋を利用する
標準的置換曲線を説明する。

実施例■ この実施例はラベル付けされた分析物々してチロキシン
−８−イプチドをそして螢光性基質として５′−〇−ア
セチルウリジンー３’−（４−メチルウンベリフェロン
−７−イル）ホスフェ−トラ用いる対照置換曲線の作成
を説明テする。

下肥の試薬を製造した： ａ、チロキシン−８−、ｅデチドでラベル付けされた分
析物：実施例１〜■に配されている方法で製造され九物
質をｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝液中
で１　：　２０００の率で希釈した。

ｂ、抗体：抗血清をｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸す）　Ｉ
Ｊウム緩衝液を用いて１　：　２０００の率で希釈した
。

Ｃ，Ｓ−蛋白質：精製された物質をＴ）Ｈ５，０の０．
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて２　Ｘ　１０−’Ｍ
とした。

ｄ、基質：　１７１１Ｆ＋７）　５’　−ｏ　−７セチ
ルー２’−０−（テトラヒドロビラン−２−イル）ウリ
ジン３’−（４−メチルウンペリ７ヱロンー７−イル）
アンモニウムホスフェートを０．０１ＨＣｔ中で４５分
間攪拌し、セして次にエーテルで抽出した。ｐＨ６の関
ｄの０．ＯＩＭ　ａｒ酸す）　ＩＪウム緩衝液を次に加
えて基質溶液を与えた。

・、チロキシン抗体規準 ヒト血清を含んでいる水性媒体中でＯ０１７ｕｌ。

３０ｎｆ／ｓｌ、６０　ｎｆ／ｍ１１２００１７ｕｌ及
び２４０ｎｆ／ｄのチロキシン濃度を与えるようなチロ
キシン溶液を新しく製造した。

７５マイクｐリツトルの標準的チロキシン溶液を２０ｕ
１の０．５Ｎ水酸化す）　ＩＪウムで室温で１０分子備
処理した。１００マイクロリツトルの抗体及び３００ｕ
ｌのチロキシン−８−イプチドでラベル付けされ１４１
− た分析物溶液を次に加え、そして混合物を室温でＩ分間
培養した。１．８　ｄの基質及び１００ｕｌの８−蛋白
質からなる混合物を次に加えた。５分間培養した後に、
螢光性の増加速賓を１０分間にわたって費視した。

自動的Ｉ試料チェンジャー（モデル０４７−６７０５９
　）を備えたλｍ１ｎｃｏ　　フィルター螢光計（モデ
ル、■４−７４４０　）を、３２５ｎｍの励起及び４４
０ｎｍの放射で用いた。データ点は自動的データ採取シ
ステムにより０．５及び１０分の時に各試料に対して採
取された。

表７に結果をまとめる。

１４２− 上記のデータは、結合されているラベル付けされた分析
物の置換がチロキシン分析物の濃度の増加につれておき
るということを示している。着換曲線を得る九めＫは、
２ケ所の点に対するデータを平均し、ナしてチ結合分数
（ＩＢ／Ｂｏ）を下記の式から計算する： 合計速度一連魔Ｂ。

〔速度Ｂｎは０でない基準に相当する速度であり、そし
て速度Ｂａ１ｉＯ基準婢液に相当するものである〕。

結果を下表８に示す。

表　　　　　８ 総合　　　　　　　　　　　　　　１４．９５Ｂｏ　　
　　　　　　Ｏ１２，４６１００１１ｈ　　　　　　　
３０　　　　　　　　　１３．２８　　　　　　６７Ｂ
１　　　　　　６０　　　　　　　　　１３．３５　　
　　　　６４Ｂｇ　　　　　　　１２０　　　　　　　
　　１３４８　　　　　　５１Ｂ＆　　　　　　　’ｆ
２４０　　　　　　　　　１４．１６　　　　　　３２
上記のデータは対照肴換曲線を作成するために使用でき
、そこでは速度、−Ｂ／Ｂｏ　　又はロジット変形が標
準濃度の函数としてプロットされている。

実施何重 この実施例は、比色計基質を遠心免速分析器と共に使用
する場合の未知の濃度の分析物チロキサンの測定用の対
ａｔ換曲線の作成を説明する。

下記の試薬を使用した： ａ、チロキシン８−４デチドでラベル付けされた分析物
：実施例■〜ｍＶＫｌｅされている方法で製造された物
質をｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で１７
４００の率で希釈した。

ｂ、抗体：抗血清をｐｉ　５．０の０．１Ｍ酢酸す）　
ＩＪウム緩僑液で１　：　３００の率で希釈した。

Ｃ，Ｓ質：ウリジン３′−α−ナフチルホスフェート。

ｄ、　　８−蛋白質：　８１ｇｍｍ精製された高業用物
質を０．１　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中で２．５　Ｘ　
１０−’Ｍとし喪。

・、染料；ジアゾ−ｐ−スルファニル酸の１，５−１４
５− ナフタレンジスルホン酸安定化塩（２５Ｉｌｖ）を１ｄ
の０．Ｉ　Ｎ　ＨＱｔ中に溶隼させた。

ｆ、標準物：ｏ、４０、（資）、１２０及び２００　ｎ
Ｐ／ｗｌ　ｆ）！Ｉ変のチロキシン標準物をヒト面清含
賓婢液中で＃造し走。

下記の調整値をＣ５ｎｔｒｉｆｉ　Ｃ’ｈｅｍ　　５０
０遠心急速分析器に対して使用した：ローター温Ｊ３０
’；フィルター、５２０ｎｍ　Ｉ　Ｔｏ、　１０秒；ｔ
、２分ｉ　ＡＢＳｌ、Ｏｕ　；ブランク、ホールド；試
験方式、Ｔｅｒｍ　ｆプリントアウト、ＡＢＳ＋！１ｍ
係数０＋試瞬コード０ 標準物（２０ｕｔ）、抗体及びＩリイデチドでラベル付
けされた分析物をピペットで転移ディスクのみぞ３〜１
４の試料井戸中に加え喪。５ｕｔの染料、３ＱＱｕｔの
基質、及び２１Ｊｕｌの８−蛋白質の混合物を対応する
試薬中に１０ｕｔの酢酸塩緩衝液と共にピペットで加え
た。充填されている転移ディスクをローター上に蓋き、
そして装置を回転させ友。吸収の読みを２分間隔で１０
分間にわ走って行ない、そしてこれらをＣ・ｎ−１ｒｉ
ｆｉ　Ｃｈ＠ｗ　　データ採用方式により示し喪。これ
１４６− らのデータを最少２乗法回帰分析によに速度（ａ、ｕ。

７ｗ１ｍ）に転化し九。表９はデータをまとめたもので
ある： 表　　　　　９ ３０　　　　　２０　　　　　　　　　　　　０．０２
８６４　　　　　０　　　　　２０　　　　　　　　　
　　　０．０３０４！ＳＯ２００，０１９５ ６０２００，０２００ ７４０２００，０２０８ ８４０２００，０２２２ ９８０２００，０２１７ １０８０２００，０２１ｇ １１　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　２０　
　　　　０．０２２４１２　　　　１２０　　　　　　
　　　　　　　２０　　　　　０．０２２４１３　　　
　２００　　　　　　　　　　　　　２０　　　　　０
．０２３０１４　　　　２００　　　　　　　　　　　
　　２０　　　　　０．０２３０各標準濃度に関しての
吸収対時間のプロットを第１図に示す。速度増加すなわ
ち増加する標準濃度での曲線の傾斜、はチロキシンによ
る抗体からのチロキシｙ−ｓ−−４デチドでラベル付け
された分析物の置換を説明する。またデータの直線性も
優れており、相関係数は０．９９９５　以上である。対
照置換曲１／ｓは上記のデータから容易に得られる。

第２図は連間対標準物の濃度のプロットを示す。

速度データは実施例１にｒされている如＜’４Ｂ／Ｂ。

にも転化できる。第３図は−Ｂ／Ｂｏ対標１！＋！Ｉｆ
ｔ″の対数のプロットを示している。

表９中のデータは標準濃度における変化に対し満足のい
く速度応答を反映しているが、実際の商業的試験用には
表９から誘導されるものよね実質的に大きい動的応答を
供することが一般的にさらＫ１１ｆ　ｔ、いであろう。

特Ｋ）標準及び２００　ｎｆ／　ｄ標準の間の速度応答
は３．５　ｆｉｌ劃、ｕ、／ｍｉｎであり、そして約１
０．０ｍ、ａ、ｕ、／ｍｉｎ　の値が好適である。

種々の試薬の濃度の適切な考察により、動的応答範囲が
強化できる。

実施例■ この実施例はチロキシンでラベル付けされ九分析物及び
Ｂ−蛋白質の相互転化を説明し、そこではＳ−蛋白質を
試料井戸中にビＲットで加え、そしてラベル付けされた
分析物を試薬井戸中にピＲットで加え、それは逆のとり
そろえが使用された前の実施例とは対照的である。さら
Ｋ、この実施例は自動的ビイツタ−（Ｃｅｎｔｒｉｆｉ
　Ｃｈｅｍ　　モデルＰ−５００ピはツタ−）を用いる
転移ディスクの試料及び試薬井戸中への直接的ピはット
添加用の２種の試薬溶液の調合を説明する。第三に、こ
の実施例は、抗体及びＳ−蛋白質の濃度を増加させるこ
とＫより実施例■で得られたものに比較しての動的範囲
の強化を説明する。

下記の試薬を使用した： ａ、チロ會シンー８−堅プチドでラベル付けされた分析
物：実施例■〜ＩＶＫ記されている方法で製造された物
質をｐｇｓ、ｏの０．１Ｍ酢酸す）　＋７ウム緩衝液で
１：５０の率で希釈した。

）、抗体：抗血清をｐＨ５，０の０．１　Ｍ酢酸す）　
ＩＪウム緩衝液で１：３０の率で希釈した。

Ｃ０基質；ウリジンａ／　　（α−ナフチルホスフェ１
４９− 一ト） （１，８−蛋白質：　８１ｇｍａ精製された商業用物質
を０．１　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中で６　Ｘ　１０−
’Ｍに１またＯ ｅ、染料：実施例ＸＷの如き本のり ｆ、標準物：実施何重の如きものり ５００　ｕｔの基質、１００ｕ／！、の染料、及び２５
Ｑｕ／−の接合物（コンジューｒ−ｈ）の混合物を製造
した、（＃薬Ａ）。

３００　ｕｔの抗体、試薬、３００　ｕｔの日−蛋白質
及び１５０ｕｔの０．１Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝液を
一緒にすることによシ第二の溶液（試薬Ｂ）を製造ｊ７
た。

試験用には下記の案を利用した書標準物（２ｆ）ｕ４）
及び６５ｕｚノ脱イオン化Ｈ，Ｏを？　−５００ピ２ツ
タ−の試料プローブにより転移ディスクの試料井戸に分
配させた。試薬Ｂ（５ｔｌｕｔ）をビイツタ−の第三の
試薬プローブを用いて試薬井戸に分配させた。

試薬Ａ（２５０ｕＡ）ｔ−ビイツタ−の最初の試薬プロ
ーブを用いて転移ディスクの試薬井７’に分配させた。

全部で３回のビはット操作を同時に１サイク（５０− ル中で行なった、転移ディスクを次に分析するためＫＣ
＠ｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈ＠ｍＲ４００上に置いた。Ｃｅｎ
ｔｒｉｆｉＣｈｅｍＲ用には下記の調整値を使用した：
温穿、閏°；フィルター、５２０　ｎｌｌ　：　Ｔｏ、
　ｔｏ秒：Ｔ、２分；　Ａｂｓ、ＬＯｕニブランク、ホ
ールド；試験方式、Ｔｅｒｍ　；プリントアウト、Ａｂ
ｓ　；濃度係数、Ｏ：テストコード、０゜下記のデータ
が得られた： 表　　　　　１０ ２　ａ　　　　　　（）　　　　　　　　６６−９３ａ
０６５．９ ４　　　　　０　　　　　　　５３．８５　　　　　０
　　　　　　　５４．８６　　　　　４０　　　　　　
　５７．８７　　　　　４０　　　　　　　５８．３８
　　　　　８０　　　　　　　６０．４９　　　　　８
０　　　　　　　５９．５１０　　　　１２０　　　　
　　　６２．０１１　　　　１２０　　　　　　　６４
．８１２　　　　２００　　　　　　　６５．３ａ＝抗
体不存在 これらのデータは表９中の亀のと比較して強化された動
的範囲を示す。ここでけ０〜２００（ｎｓＦ／ｍ）の標
準的濃度範Ｈを包括する速度のひろが抄は、１２ミリ吸
収単位／分であり、それは実施例■で得られたものの約
４倍大きい。さらに、データはある面で診断キットの実
用的デザインに比較的良く適してい為試薬混合物の調合
本説明している。さらに、この実施例は１個のピはット
サイクルを利用する商業用遠心急速分析器を伴なう自動
的ピばツタ−の使用を説明する。

実施例■に説明されている様に、表わされているデータ
から対照曲線を作成で負る。

実施例■ この実施例はＣｅｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈ＠ｆｆ１５ＱＱ遠
心急速分析器に対するシランチン分析物用の対照置換曲
線の作成を説明する。比色計基質である５′−ｏ−アセ
チル−ウリジン−３’−（４−メチルウンベリフェロン
−７−イルホスフェート）ｌＬ用Ｌ＊。

下記の試薬を製造した： ａ、シランチン−８−試プチドでラベル付けされ１）１
？物：　ｏ、ｔ　Ｍ　）リエタノールアミン（テ！ム）
−ＨＣｔ緩衝液中の、実施例Ｖ−■に記されていゐ方法
で製造された物質を使用した。

ｂ、抗体：抗シランチン抗血清をｐＨ７，１の０．１Ｍ
Ｔ！ムーＨＣ４緩衝液で１／２０の率により希釈した。

Ｃ０基質：１７Ｎｇの５′−〇−アセチル２’−０−（
＋トラヒドロピランー２−イル）ウリジン３’−（４−
メチルウンベリフェロン−７−イルアンモニウムホスフ
ェート）を７５０　ｕｔの０．０５　Ｍ　ＨＣｌ　Ｋ加
え、そして室温でＩ分間攪拌した。酢酸ナトリウム緩衝
液（１，８８０ｗＩｌ、　０．１　Ｍ　、　１）Ｈ５，
Ｏ）を加えた。使用直前に、３００　ｕｔのこの溶液を
５．０９４ｍｆ）ＴｉＨ２，１７７）　０．１　Ｍ　’
！”ｌｌＡ　−ＨＣ１緩衝液と一緒にした。

ａ、　　ｓ−蛋白質：　５１ｇｍ＆精製商業用物質をｐ
Ｈ７，１ノ０．Ｉ　Ｍ　ＴＥＡ　−ＨＣＡ緩衝液で１　
：　１００の率により希釈して１゜５３Ｘ１０−’Ｍの
濃度を有する溶液を与えた。

・、シランチン標準＋　５．５−ジフェニルヒダントイ
ンナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ　ｏシト６４Ｃ−００２７
）の−１）３− 貯菫溶液を、４８Ｎｇ＋７）Ｉ　Ａ（Ｄｏ、０２５　Ｎ
水酸化ナトリウム中に溶解させるととＫより、製造した
。

とれを０．０２５　Ｎ水酸化ナトリウムで１：１０の率
により希釈して４．８　ｕｆ／−を有する溶液を与えた
。これをさらに希釈して、１９．１．４７．８．９５．
８．１４３．６及び１９１．５　ｎｆ／ｗｅの濃度を布
する＊＊溶液を与えた。

Ｃｅｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈ＠ｍ　５ＱＱ遠心急速分析器は
下Ｆの装置調整値を有していた：ローター？！！闇、式
；フィルター、３４０　ｎｍ　；　Ｔｏ、１０秒；Ｔ１
１分；　ＡＢＳ　１．Ｏｕ　ニブランク、ホールド：献
験方式、’ｒｅｒｍ　；プリントアウト、ＡＢＳ　；濃
度係数、０；試験コードｏ８抗体、シランチン−８−１
デチド及び１６．ｆｉ　１１１の標準溶液を転移ディス
クのみぞ３〜１６の試料井戸の中にピズットで加えた。

Ｓ−蛋白質及び３００ＵＺの基質を転移ディスクの対応
する試薬井戸のそれぞれの中にビはットで加えた。転移
ディスクをローター上に置きそして回転させた。吸収の
−みを１分間隔で５分間にわたって測定し、そしてＣｅ
ｎｔｒｉｆｉ　ＣｈｅｒｒｒＲデータ採取単位により示
した。触１５４− 媒活性速度（ａ、ｕ、　／ｗｉｎ、　）が吸収の最少２
乗法回帰分析から時間の函数として得られた。

データを下表１１に：ｆとめるー １５５− 第４図祉速度対標準シランチン濃度のプロットを示して
いる。パーセント結合分数（ＩＧ　Ｂ／ＢＯ）も実施例
１の如く計算された。第５図は標準製炭に対するパーセ
ント結合分数のプロットを示しているｔ、第Ｓ図の対照
置換曲線は、データのロゾット／ロツダ転換の使用によ
り直線化できる。直線化され九に５図の置換曲線を笥６
図に示す。

第４．５及び６図に示されているデータは大きさが一つ
のオー〆にわたるシランチン（対する広い濃度範囲の感
度を与える。しかしながら、との濃度範囲はヒト血清で
普通あられれるものより小さい。その結果、血清試料は
ここに誘導されている対照置換曲線を用いることにより
測定するためには希釈しなければならない。

実施例■ この実施例は臨床試料を直接試験できる試験の構想、（
Ｃ５ｎｔｒ１ｆｉ　ＣＭｍ　Ｒ５００）遠心急速分析器
に付いている自動的ピペッタ−（モデルＰ　−５００）
の使用、及び自動的データ類別の使用を説明する。

下記の試薬を使用した： １５６− 龜、ラベル付けされた分析物：実施例Ｖ−糟に配されて
いる方法で製造された、０．１Ｍ）ＩＪエタノ−ルアＺ
ン（ＴＩＡ　）　−ＨＣＩ、緩衝液中の、ノラｙチンー
Ｂ−−ｅデチドでラベル付けされた分析物を使用した。

ｂ、抗体：抗−シランチン抗血清（１５０ｕｔ）を９０
０ｕｔのｐＨｒ７．１の０．Ｉ　Ｍ　Ｔ！！Ａ　−ＨＣ
Ｌで希釈した。

Ｃ０基質；５’−０−アセチル２′−〇−（テトラヒド
ロビラン−２−イル）ウリジン３’−（４−メチルウン
ヘリフエロンー７−イルアンモニウムホス７エー））（
６，４１１Ｆ）を２８５．２１１１の０．０５ＮＨＣＩ
　Ｋ加え、そして室温で（資）分間攪拌した。次に酢酸
ナトリウム緩衝液（７１４，８ｕｔ、　０．１Ｍ、ｐｉ
（５，ｏ　）を加えた。

ｄ、ト１白質：　Ｓｌｇｍａ　８−蛋白質の１２．３Ｘ
１０−５Ｍ溶液を０．ＩＭ　ｌｒ私−ＨＣ１緩衝液（ｐ
Ｈ７，１）中で製造した。

ｅ、シランチン標準物：　５．５−　・ジフェニルヒダ
ントインナトリウム塩（Ｓｌｇｍａ　ｏシト６４ｃｍ０
０２フ）をヒトの血清中で２．５．５．０．１０．０．
２０．０及１５８− び３０．０ｕｔ／ｍｌの濃度で製造した。

１６ｕＬの８−ペプチドでラベル付けされ九分析物、１
０ｕｔのヒトの血清アルプ２ン、１４３０ｕｔＬｖ’ｒ
ＥＡ−ＨＣ１緩衝液及び（ｃ）に記されている基質溶液
の混合物を製造した（試薬１と称する）。１５０ａの抗
血清、５ｏｕｔの８−蛋白質及び１９３７．５　ｕｔの
ＴＰ！Ａ＠衝液からなる第二の混合物を製造した（試薬
２と称する）。

Ｃ＠ｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈ＠ｗ　　Ｐ　−５００自動的ピ
ペッタ−を用いて４ｄの適壱な基準溶液を同時に４５　
ｕｌの脱イオン化されたＲ２０で希釈しそして転移ディ
スクの試料井戸の中にピペットで加えた。同時にピペッ
タ−Ｆｉ２５０　ｕｌの試薬１を試薬井戸の中にそして
１００ｕｔの試薬２を試料井戸の中に分配させ虎。Ｃｅ
ｎｔｒｉｆｉＣｈ＠１ｆｌＲ５０Ｇ遠心装置の要素・は
、試験コード四を用い九こと以外は、実施例ｘｘＯもの
と同一であった。

これはＣ＠ｎｔｒｉｆｉ　Ｃｈｅｍ　Ｒ５００装置のマ
イクロプロセッサ−ユニットにより自動的なデータ類別
を与えた。

下記のデータが得られた。

表　　　　１２ ０　　　　　　　２１５　　　　　　　００　　　　　
　　２１８　　　　　　　０２、５　　　　　２３０　
　　　　　　３．１２．５　　　　　２３１　　　　　
　　３．３５　　　　　　　２５２　　　　　　　５．
０５　　　　　　　２５６　　　　　　　５．２１０　
　　　　　３５８　　　　　　　９．６１０　　　　　
　３７３　　　　　　１０．２２０　　　　　　　５１
２　　　　　　２３．０２０　　　　　　４９４　　　
　　　１９．１３０　　　　　　５２５　　　　　　２
８．５３０　　　　　　　５２４　　　　　　２７、９
マイクロプロセッサ−ユニット中に貯破されているレジ
ットーロッグ基準曲Ｓは、７．４の憾樟準偏差を有して
ぃ走。一般に貯蔵されている曲線か　　　□ら誘導され
る計算され九標準濃度は表１２に示されている如く分析
物の濃度範囲にゎ九って実際の標準濃度と満足のいくよ
うに合致した。

王妃の案を対照用及び臨床用の両者の試料の直接的試験
用に使用できる。例えば、気体液体クロｉトグラフイ（
ｇｌｃ　）測定を基にして２３．４ｕｆ／ｄのシランチ
ン濃度を有する臨床的試料が王妃の対の試験により５士
、７ｕｆ／ｓ／の濃度を有していることが見出され念。

同様にｇｌｃにより２．Ｏｕｆ／ｙｄの濃度を有する臨
床用試料が３．１±、１ｕｆ／ｍｌの濃度を有している
ことも見出された。このことけ臨床用試料において予想
される分析物ｍＩ変範囲にわ喪る良好な正確さ及び感度
を示している。さらにデータは自動的ピペット添加及び
データ類別に対する試験の適合性を示してお炒、従って
使用した遠心急速分析器システムの全能力の利点を利用
している。最後に、データは抗体、８−蛋白質及びジラ
ンチｙ−ｓ−蛋白質でラベル付けされ九分析物の濃度ヲ
、Ｐ　−５００ビイツタ−によシ自動的に実施されるも
のよシ良好に、あらかじめ希釈することなく臨床用試料
の直接測定ができるように調節できることを示している
。

１６１一 実施例■ この実施例は二重抗体固相方法の使用によるシランチン
分析物及び８−−４デチドでラベル付けされ喪シランチ
ン分析物の抗体で結合され九部分の分離を説明し、そし
て遊離状の（結合されていない）相の投薬量応答触媒活
性も示す。対照用血清の分析物濃度の測定用の螢光発生
基質として５′−〇−アセチルウリジルー３’−（４−
メチルウンイリフエロンー７−イル）ホスフェートを使
用する触媒活性測定から、標準置換曲線を作故する。従
ってこれらのデータは不均質方式試験を例示している。

下記の試薬を製造した： ａ、シランチン−９−−ｅデチドでラベル付けされた分
析物：　ＴＩＩＡ　−ＨＣ１緩衝液中のラベル付けされ
九分析物を奥施例Ｖ−■中ＫＥされている方法で製造し
、１２０ｕＡを２８６０　ｕｌの’ｒＫＡ　−ＨＣｔ緩
衝液で希釈し友。

ｂ、抗体：抗−シランチン抗血清（３００ｕｔ）を１８
００ｕＡのＴＩＩＡ　−Ｈ（４緩衝液で希釈した。

１６２− Ｃ６固相の固定された第二の抗体：５０１９のＢｉｏ　
−Ｒａｄ　ＩＭＭｎＮＯＢＫＡＤ　　、　Ｌｏｔ　１７
００３、を５０−のＴＥＡ−）Ｔ（ｌ緩衝液を用いて復
元した。

ｄ、基質：３５ＷＩＩの５′−〇−アセチルー２′−〇
−（テトラヒドロピラン−２−イル）ウリジル−３′−
（４−ＩＰルウンヘリフエロン−７−イル）アンモニウ
ムホスフェートを１．５ｄの０．０２５Ｍ　ＨＣｌを用
いて和分間にわた委室濡で封鎖除去し、そして５ｄのエ
ーテルで２回抽出した。残存エーテルを空気流により除
去し、そして酸性溶液を酢崎塩緩衝液で緩衝して１００
ｍ／とじた。

ｅ、酢酸塩緩贅液：酢酸ナトリウム緩衝液、０．１Ｍ、
ｐ）Ｉ　！５．０゜ ｆ、　　ＴＥＡ−ＨＣ１緩衝＠ニトリエタノールアミン
−ＨＣ１緩衝液、０．０５Ｍ、ｐｌ’ｌ　７．５゜ｇ、
シランチン標準物：５．５−ジフェニルヒダントインナ
トリウム塩の溶液をヒト血清中で実施例ＸＸＩ中の如く
して２．５．５．０．１０，０．２０．０゜３０．０及
び４０．Ｏｕｆ／ｄの濃度で製造した。

ｈ、　　８−蛋白質：　Ｓｉｇｍａ精製され光溶液を酢
酸塩緩衝液中で１／２ＯＫ希釈した。

適轟なシランチン標準物（それぞれ８ｕ１）を、Ｏｕｆ
！　、　　２．５ｕｌ　、　５ｕ、Ｆ　、　１０ｕ！１
％２０ｕｇ、ＩｕＩ標準物としてマークされている二重
試験の試験管中に２−ｅットで加えた。　１００ｕｌの
抗体部分を標準物の各二重検定管中にピペットで加え、
そして生成した混合物を攪拌しそして室温で加分間培警
した。それソｔＬ　１００ｕｌのシランチン−８−−ｅ
デチドでラベル付けされた分析物部分を次に全試験背中
（ピペットで加え九、生成した混合物を室温で加分間培
饗した。

ＴＴ！、に−ＨＣｌ　Ｊｌｌ衝液（１０８ｕｌ　）及び
シランチン−８−イデチドでラベル付けされた分析物（
１００ｕｌ　）を総合的にラベル付けされている二重検
定管中にピペットで加えた。生成した混合物を攪拌によ
抄混合し、そして室温においてに分間培讐した。

次にそれぞれ５００ｕｌの第二の抗体溶液を総合的試験
管以外の全ての管中にピペットで加えた。

ＴＦＪ−）ＩＣＪ緩衝液（５００ｕｌ　）をピペットで
総合的試験管中に加え丸、生成し九混合物を攪拌により
混合し、そして室温でω分間培養した。総合的以外の食
ての試験管を３０００　ｒｐｍで５〜１０℃において５
分関連心した。

各管の上澄み液（遊離相）を対応してマークされである
新しい管中に移しだ。固相を各管中で０．５ｄのＴＢ人
緩衝液で再懸濁させ、そして上記の女口〈遠心した。上
澄み液を傾斜させた。

投与量応答触媒活性を以下の如く測定した。

遊嶋相及び−合の部分試料（それぞれ５０ｕｌ）をそれ
ぞれ１．８　ｄの基質及び５０ｕｌのＳ−蛋白質を用い
て、混合物が３２５ｎｍにおいて励起されたときの４４
０ｎｍにおける放射によ咬ファーランドマーク１（Ｆａ
ｒｒａｎｄ　Ｍａｒ）ｃ　１　）　’ｌ光計を使用して
ＩＩ定して試験し九。

データを下表じにまとめる。もとのデータは改変された
ロッグーロジット・アルボ１）ズムによ抄合わせられ、
そこでは無限の及び０標準濃窒における速度は反復方法
により得られる。表中の各データ点は二点の平均を表わ
している。

１６５− 表　　　１３ ０　　　　　　　　　　８．５　　　　　　　　　　　
０．５４２．５　　　　　　　１０．０　　　　　　　
　　　　３．０２５．０　　　　　　　１０．５　　　
　　　　　　　　４．００１０．０　　　　　　　１４
．０　　　　　　　　　　１１．１１２０．０　　　　
　　１６．５　　　　　　　　　　１９．８３３Ｑ、０
　　　　　　１９．０　　　　　　　　　３０．８６４
０．０　　　　　　２０．５　　　　　　　　　４０．
３６総合　　　３３．５ 表中のデータにより分析物浸室の範囲にわたる許容でき
る標準自振を作故される。

【図面の簡単な説明】

＠１図は分析物チロキシンの種々の濃度に関する吸収性
対時間のグラフであ抄、そしてそれは連間測定の直線性
並びにチロキシン製電の増加に伜なう速Ｗ（傾斜）の増
加を説明する。 ｙ４２図は分析物チロキシンに関するレポーター分子の
生成連間対濃度のグラフである。 １６６− 第３図は分析物チロキシンに関する、抗体結合されたラ
ベル付けされた分析物・々−セント対標準濃度の対数の
グラフである。 第４図は分析物シランチンに関するレポーター分子の生
成速度対濃度のグラフである。 第５図は分析物シランチンに関する抗体結合されたラベ
ル付けされた分析物・ぐ−セント対標準浸窒の対数のグ
ラフである。 第６図は第５図からのデータのロジット／ロッグ転換を
用いることにより得られた、第５図のＩＫ線状置鷹曲線
のグラフである。 出１人　　ベーカー　インストラメンツコーポレインヨ
／ 、τ （ｌＪか、：Ｖ１多、）・ ’ニー’（’ｉ：：。 −□　１ １６７− ７遍＝４・ （電１１ｉ”＃１１ｒ、？＋−殿） ｌ　事例のノ〈示　　　　　　　　　　　昭和ｓフイ目
旨′１願第４９２５４−’：３　補正をする渚 事件との関係　　　　出願人 ４代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、既知の分析物を未知の濃度で含有している試料中の
   分析物の量を測定する方法において、（ａｔ媒体中で、
   （１）該試料、ｆ２１　、ｊ？　リＪプチドでラベル付
   けされた分析物類似体、（３）該分析物用に特異的な抗
   体、（４）ポリペプチドでラベル付けされた分析物と非
   共有結合できて触媒活性を有する複合体を生成するポリ
   ペプチドパートナ−、及び（５）該複合体の触媒活性に
   よりレポーター分子に転化可能な基質を一緒にし、ここ
   で該ポリペプチドでラベル付けされた分析物類似体社該
   抗体及び該ポリペプチドパートナ−と結合でき、該抗体
   は分析物の不存在下で触媒活性複合体の生成を抑制し、
   該抗体、ぼりペプチドパートナ−及びポリペプチドでラ
   ベル付けされた分析物の濃度は分析物の変化量が該基質
   から該し？−ター分子への転化に直接関係させるような
   ものであり、 （ｂｌ該基質からの該しＩ−ター分子への転化を測定し
   、そして （Ｃ）該基質からの核レポーター分子への転化を既知の
   濃度の該分析物を用いて得られた転化と比較することか
   らなる方法。 ２、　ポリペプチドパートナ−とポリぜデチドでラベル
   付けされた分析物の非共有結合により生成した複合体が
   リゾヌクレアーゼの触媒活性特性を示す、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、該複合体がリゾヌクレアーゼ人の触媒活性特性を示
   す、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、分析物のポリペプチドラベルがＳ−ペプチド又はそ
   れの類似体であり、そしてポリペプチドパ−トナーが８
   −蛋白質又はそれの類似体である。特許請求の範囲第２
   項Ｅ載の方法。 ５、分析物の／　ＩＪ　ｄゾチドラペルが８−蛋白質又
   はそれの類似体であり、そして／　ＩＪペゾチドノ平−
   トナーが８−ペプチド又はそれの類似体である、特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ６、／リベデチドラベル及びポリベデチドノ臂−トナー
   の少なくとも一方が酵素を分裂させて得られる、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ７、ｆ！リベデチドラベル及びポリペプチドパートナ−
   が元の酵素の分裂断片である、特許請求の範囲第６項記
   載の方法。 ８、ポリ被デチドパートナーと？リイデチドでラベル付
   けされた分析物の非共有結合（より生成した複合体が該
   元の酵素の触媒活性の少なくとも５優を回復している、
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、該複合体の平衡定数が約１０５Ｍ−”〜約１０１１
   Ｍ−”である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、該分析物が少なくとも約１００〜約１０６の分子
   量を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、該分析物が薬もしくはそれの代榴産物、鎮静剤、
   麻酔剤、ホルモン、ステロイド、ビタンン、Ｉリイデチ
   ドホルモン、抗原を伴なう腫瘍、免疫グロブリン、酵素
   、工業的汚染物質、殺虫剤もしくはそれの代謝産物、食
   品添加物、除草剤もしくけそれの代電産物、香味剤、又
   は食品毒物からなる群から選択される一員である、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １２、該分析物がシランチン、エトサクシミド、フエノ
   パルビタール、プリ２トン、リドケイン、テオフィリン
   、モルフイン、コディン、ヘロイン、大麻、ｒンタマイ
   シン、トブラマイシン、メトトレキモート、ジジトキシ
   ン、チロキシン、テストステロン、コルチンル、免疫グ
   ロブリン、トリアイオドチロニン、ジｆキシノ、葉酸、
   アンジオテンシン■、プログステロン、プロスタグラン
   ジンＦ２．　　ニストロダン類、ビタミンＢ□＊　、成
   長ホｓｚモン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニン、ガ
   ストリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グルカデ
   ン、ヒト腋毛膜ゴナドトロピン、アルドステロン又は胎
   生期癌抗原からなる群から選択される、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 １３、該分析物がシランチンである、特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １４、＃分析物がチロキシンである、特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １５、核分析物がコルチソルである、特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １６、＃分析物がシランチンであり、シランチン用のポ
   リ４ブチトラベルが８−ペプチド又はそれの類似体であ
   り、そしてポリイデチドパートナーが８−蛋白質又はそ
   れの類似体である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７、該分析物がチロキシンであり、チロキシンのため
   の／　リペデチドラベルが８−ペプチド又はそれの類似
   体であシ、そしてプリペプチドパートナ−が８−蛋白質
   又はそれの類似体　５− である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １８、該分析物がコルチンルであり、コルチンル用の？
   リイデチドラペルがＢ　　、４１デチド又けそれの類似
   体であり、そしてＩリイデチド・中−トナーが８−蛋白
   質又はそれの類似体である、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 １９、抗体が、少なくとも約１０４の抑制を与えるのに
   充分な製電で、存在している、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １、抗体が、少なくとも約５４の抑制を与えるのに充分
   な濃度で、存在している、特許請求の範囲第１９項記載
   の方法。 ２１、基質が、速度測定期間にわたって本質的に直線的
   な速度を与えるような、濃度で存在している、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ｎ、基質が約１０−’〜約１０−”モルの濃度で存在し
   ている、特許請求の範囲第１項記載の方法。 る、基質が下記の構造式： 噺 ＯＲ 〔式中、Ｂけ３′−位置におけるりん夢エステルの加水
   分解を助けることのできるヌクレオチド塩基であり、 Ｒはランペリフェロニル、４−メチルランベリフェロニ
   ル、３″−７う？ニル、０−ニトロフェニル、ｍ−ニト
   ロフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ジニトロフェニル、
   シアノフェニル、アシルフェニル、カル〆キシフェニル
   、フェニルスルホネート、フェニルスルホニル及ヒフェ
   ニルスルホキシドからなる群から選択された成分であ如
   、 Ｒ′は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、
   アリール、アラアルキル、アシル、オキサアルキル、チ
   オアルキル、オキサフクロアルキル及びチオシクロアル
   キルからなる群から選択された成分であり、セして Ｒ”は水素又はカルシウム、バリウム、リチウム、ナト
   リウム、アンモニウム、１ｆＪＩ！されたアンモニウム
   及びピリジニウムからなる群から選択されたカチオンで
   ある］ を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法、２４、　
   　Ｂがウラシルであり、Ｂが４−メチルランペリフェロ
   ニルであり　Ｈ／がアセチルであり、そしてｙ′がカル
   シウム、ピリジニウム又はナトリウムからなる群から選
   択された一員である、特許請求の範囲第５項記載の方法
   。 ５、基質からレポーター分子への転化速度を測定する、
   特許請求の範囲＠１１項記載方法。 加、＃速度を分光光度針で測定する、特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 １、該速度を螢光針により測定する、特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 公、王妃の成分：（１）１１！リペプチドでラベル付ケ
   された分析物類似体、（２）分析物に特異的な抗体、１
   ３）　／　リペデチドでラベル付けされた分析物と非共
   有結合できて触媒活性を有する複合体を形成するＩリペ
   デチドパートナー及び（４）複合体の触媒活性によりレ
   ポーター分子に転化可能な基質、を含んでおり分析物の
   検定を実施するさいに使用するためのキット。 四１分析物に対する予測されるａｔ範囲を包括している
   一組の標準分析物溶液を含んでいる、特許請求の範囲第
   ６項記載のキット。 １、検定のためのｐＨ嘴節用緩衝液を含んでいる、特許
   請求の範囲第公項記載のキット。 ３１、各成分が別個に包装されている、特許請求の範囲
   第３項１５蛾のキット。 羽、ノリペプチドでラベル付けされた分析物及び基質を
   一緒に包装し、そして抗体及びポリペプチドパートナ−
   を−緒に包装した、特許請求の範囲第公項記載のキット
   。 ３ｊ、抗体及びポリペプチドパートナ−を一緒に包装し
   た、特許請求の範囲第６項記載のキラ　９− ト。 Ｍ、抗体及び基質を一緒に包装した、特許請求の範囲第
   ｙ項記載のキット。 ３．５．　　（ａ）媒体中で（１１試料ｓ　（２）　＄
   　ジ−２ゾチドでラベル付けされた分析物類似体及び（
   ３）該分析物に特異的な抗体を一緒にし、 ｆｂ）抗体と結合されたポリペプチドでラベル付けされ
   た分析物を遊離のポリペプチドでラベル付けされた分析
   物から分離し、 （ｃ）　ポリペプチドでラベル付けされた分析物と非共
   有的に結合して触媒活性を有する複合体を生成できるぼ
   りイデチドパートナーと、該複合体の触媒活性によりし
   Ｉ−ター分子に転化可能な基質とを加え、該基質からし
   ？−ター分子への転化を測定することにより、（１）抗
   体と結合されたポリペプチドでラベル付けされている分
   析物と（２）遊離のポリペプチドでラベル付けされた分
   析物とのうちの少なくとも一方の量を測定し、そして （（１）該基質からレポーター分子への転化を既知１０
   − の濃度の該分析物を用いて得られた転化と比較する ことからなる、未知の濃度で存在している既知の分析物
   を含有している試料の均質免疫検定の実施方法。 ｙ０分析物を含有している試料の検定の実施において使
   用するための、下記式 ％式％ 〔式中、人は分析物類似体であり、 ＸはＡ及びＺ又はＹと結合している部分であ抄、ＹはＰ
   Ｐ１及び２又はＸと結合している部分であり；２はＸ及
   びＹと結合している架橋基でありｌ　ＰＰ□はＩリペプ
   チドノぐ一トナーであり、ｉ、ｎ及びｐは１〜約８の整
   数であり、そして０は０又は１〜約８の整数であり、該
   ポリペプチドでラベル付けされた類似体は分析物に対し
   て特異的な抗体との結合に関して分析物と競争でき、そ
   して該Ｉリペプチドでラベル付けされた分析物類似体は
   第二のポリイデチドパートナーｐｐ、と非共有結合でき
   て、基質を検出可能なし４−ター分子に転化させ得る触
   媒活性を有する複合体を生成する〕を有するＩリイデチ
   ドでラベル付けされた分析物類似体。 ３７、Ｘ及びＹが １ ＮＨ−Ｃ− １ −ＮＨ−Ｃ−ＮＨ− −ＮＨ−Ｃ−ＮＨ− １ Ｃ−０− １ Ｃ−ＮＨ １ −Ｃ− 〇 斡 ０−Ｃ−ＮＨ ０−ＣＨｌｌ− １ ５−Ｃ− ○ ｌ −８−Ｃ−ＮＨ ｌ −８−Ｃ−ＮＨ かもなる群から選択された員であり、そして２が炭素数
   が１〜約ｌＯのアルキレン、炭素数が１〜約ｌＯのアル
   ケニレン、炭素数が約４〜約１０のシクロアルキレン、
   炭素数が約２〜約１０のオキンアルキレン及び炭素数が
   約６〜約ｌＯのアリーレ／からなる群から選択された一
   １３− 負である、ポリにグチドでラベル付けされた分析物類似
   体。 ’＋８．　　Ｘが １ ＮＨ−Ｃ− １ −ＮＨ−Ｃ−ＮＨ− １ −ＮＨ−Ｃ−Ｎ）ｌ− １ Ｃ−０− １ Ｃ−ＮＨ １ −Ｃ− 〇 １ −Ｃ−ＮＨ ＯＣＲ２− １４− ５−Ｃ− ０ ｌ −８−Ｃ−ＮＨ １ −ｓ−Ｃ，−ＮＨ からなる群から選択された一員である、特許請求の範囲
   第３７項記載のポリペプチドでラベル付けされた分析物
   類似体。 ３ｇ、　　ｐｐ□が８−ペプチド類似体であり、セして
   ＰＰ５ｌがＳ−蛋白質又はそれの類似体である、特許請
   求の範囲第３７項記載のポリペプチドでラベル付けされ
   た分析物類似体。