JPS58757A - 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット - Google Patents

同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット

Info

Publication number
JPS58757A
JPS58757A JP57049254A JP4925482A JPS58757A JP S58757 A JPS58757 A JP S58757A JP 57049254 A JP57049254 A JP 57049254A JP 4925482 A JP4925482 A JP 4925482A JP S58757 A JPS58757 A JP S58757A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analyte
labeled
polypeptide
substrate
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP57049254A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0220066B2 (ja
Inventor
ピ−タ−・ア−ル・フアリナ
ゼ−ムス・ア−ル・ゴ−ルケ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biochem Immunosystems US Inc
Original Assignee
Biochem Immunosystems US Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biochem Immunosystems US Inc filed Critical Biochem Immunosystems US Inc
Publication of JPS58757A publication Critical patent/JPS58757A/ja
Publication of JPH0220066B2 publication Critical patent/JPH0220066B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81Packaged device or kit
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/967Standards, controls, materials, e.g. validation studies, buffer systems
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/971Capture of complex after antigen-antibody reaction
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的流体又は同様物中の種々の化合物の分
析に関するものであり、そしてより祥しくけある種の新
規表ラベル付けされた分析物及びそのようなラベル付け
された分析物を用いる分析方法に関するものである。
種々の臨床目的、例えば投薬スケジュールの監視(モニ
ター)、ホルモン水準の監視、最近の食物摂取又は生物
有効性のその俵の薬理学的動力学、吸収、分解又は排泄
の検査のためには、種々の薬などの濃度をナノモルもし
くけピコモル水準で測定することが非常に有利である。
周知の如く、放射線免疫検定(試験)によりこの分析を
実施できる。分析を行なうためには、V容できるキット
又はシステムは抗血清、標準もしくは既知の濃度の測定
しようとする化合物(すなわち分析物)、測定しようと
する化合物の放射線ラベル付きの銹導体及び1種もしく
はそれより多い緩衝剤を含有していなければならない。
抗血清は、例えば測定しようとする化合物に対応するノ
・ゾテンー蛋白質接合体(インミノジエン)を接種をし
て、免疫圧されている動物の採血により製造される。
周知の如く、放射線免疫試験は一般に、放射能でラベル
付けされた分析物とラベルの付いて々い分析物の間の、
抗血清中の抗体上の部位の給金競争を測定する。抗血清
に既知量の試験しようとする分析物及び放射ラベル付き
の類似体を加えることにより、結合又は遊離状分析物対
分析物濃度についての投薬量一応答曲線が設定される。
この免俊−目盛り定めを行なった後に、未知の濃度を次
に検定するため標準投薬量一応答曲線と比較することが
できる。この型の検定で重要なことは非放射性分析物と
効果的に競争する放射性分析物が存在するということで
ある。従って、試験の最大の精度、正確性、感度、特異
性及び再現性を得るためKは、精製された良く特性の決
められている合成放射性の分析物が必要である。
放射線免疫試験方法ではいくつかの欠陥が確認されてい
る。第一に遊離状の放射ラベル付き分析物から抗体結合
された放射ラベル付き分析物を物17− 理的に分離することが必要である。さらに、この方法は
どちらかといえば労力がかかると考えられており、そし
て必要な装置にも同様に比較的費用がかかり、均質に入
手できず、しかも該試験を正確に実施するためには高度
に訓練された専門技術者の使用を必要としている。同様
に、放射性同位元素ラベル付き分析物は比較的不安定で
あり+用がかかり、しかも一般に使用されている放射性
同位元素ラベルに伴なう放射線露呈の危険性に起因する
増々厳しくなる排物廃棄間哩を里子る。これらの欠点く
もかかわらず、放射線免疫試験の使用は相当増え゛てい
る。
しかしながら、臨床研究での放射線免疫試験の使用にお
ける最近の相当な成長は、ここに配されている上うな放
射線免疫試験方法の欠点を克服する変法の開発に刺激を
与えている。これらの欠点を克服するために開発された
処理方法は、放射性同位元素ラベルの代りに酵素又は螢
光ラベルを、好適には物理的分離のための条件を省くよ
うなラベルの付いた分析物の結合された部分及び遊離状
18− 部分の間の化学的差違を測定できるような条件と組み合
わせて、使用することを主として包含している。後者の
簡単さ及び有利な特徴を有する免疫試験は、物理的分離
を必要とする不均質免疫試験と対照的に均質免疫試験と
称されている。
従って、抗体との複合化が生じるときにラベルの酵素活
性が減じられるような酵素でラベル付けされた分析物の
使用に基いている均g麿免疫試験システムが開発された
。それの濃度を測定しようとするラベルの付いていない
分析物が、抗体と結合している酵素でラベル付けされた
分析物と置換し、その結果酵素活性の増加を生じる。増
加した酵素活性(酵素活性の結果として独特の発色団を
最終的に生成する″′基質”と称されているものを用い
て分光光度計により監視されている)を増加した分析物
濃度に対してプロットすると、標準的置換又は投与量一
応答曲線が作成される。これらを次に未知の分析物濃度
の測定用に使用する。均質酵素免疫試験分野では下記の
米国特許が発行されている: 3.817.837 ;
 3,852,157 ; 3,875,011 +3
.966.556 ; 3,905,871 ; 4,
065,354 ; 4,043.872 ;4.04
0,907 ; 4,039,385 ; 4,046
.636 i 4,067.774 ;4.191,6
13及び4,171,244゜これらの特許では、分析
物のラベルは実質的に5.000よ抄大きい分子量を有
する酵素であると記されている。この技術の商業化け、
分析物が10−”Mより大舞い分析物の流体濃度におい
て比較的小さい分子寸法であるような用途にだけ限られ
ている。これらの制限は、大きいポリイデチド分析物か
ら誘導された普通使用されている酵素ラベルは抗分析物
抗体との結合によね抑制されないという事実から生じる
。また、感蜜制限は酵素活性から生じる螢光計によるレ
ポーター分子のないこと及び例え′は内因性酵素の如き
低濃度の血清障害の存在から生じる。さらに、酵素ラベ
ルは再現性のあるようにしかも満足のいく純度で製造す
ることが難かしいう 上記の均質酵素免疫試験技術の制限のために、感度のよ
り大きな螢光を用いる均質免疫試験の開発に向かって相
当な努力が払われてきた。それらは主として例えば免疫
グロブリンの如き比較的大きい寸法の分子又は例えばイ
ンシュリンの如きポリイデチドホルモンの検定に関して
いる。下記の米国特許がこの型の試験用に発行されてい
る:3.998.943 ; 3,996.345 i
 4,174.384 ; 4,161.515 i4
.208.479及び4,160,016゜これらの特
許のほとんどのラベルは分析物又は抗体と結合している
芳香族螢光分子を包含している。螢光消光の種変が試料
中の分析物の量に関係するように、すべてが同様に抗体
又は他の螢光消光剤による種々の螢光消光方法を含んで
いる。これらの方法に基〈検定は多分、満足のいくよう
Kff、IIされた螢光ラベル付き抗体又は分析物又は
関連の消光剤ラベルの付いた物質種の製造の難かしさの
ために商業化されていなかった。また、血清中のパック
グランド螢光並びに血清の誘導する消光が生じるかもし
れない、さらに、該方法は酵素増幅されていないため、
満足のいく感度ということには問題があるかもしれない
免疫試験の型に関して容易に分類できないようなこの分
野のさらに他の米国特許には、3,935.074 +
21− 4.130.462 + 4.160.645.7jt
び4,193,983が包括される。米国特許4,16
0.645中に示されている方法はラベルとしての電子
転移触媒の使用を包含している。触媒(ラベル)は抗体
との結合により税活性化される。
抗体を製造するために使用されるハプテン接合物の製造
に関するその他の米国特許には、”(、+184,89
8 ;3.843,696 i 4.045.420 
i 3,888,866 ; 3,917,582 ;
4.025.501 + 4.043,989 i 4
,058.511 ; 4.n69.1(’15i4.
123.431及び4,186.081が包括される。
これらの特許の全ては分析物誘導体及び対応する?リセ
デチド接合物に関しており、ここでf IJ ’デチド
は抗原性でありそして5.000〜106の範囲内の分
子量を有する。例えばアルプはン及びグロブリンの如き
蛋白質が特釦示されている。
また、均質酵素免疫試験用の予備処理方法も提唱されて
いる。この分野の米国特許には、:(,856,469
4.056.608及び4,121.975が含まれて
いる。
反応物でラベル付けされた螢光免疫試験として記されて
いる他の型の方法は、螢光性生成物が酵22− 素で加水分解されているときには該生成物が放出される
ように設定されている螢光でラベル付けされた分析物の
使用を包含している。しかしながら分子の分析物部分に
対する抗体が酵素の加水分解を抑制する。従って、質量
作用の法則によ抄、胃換された螢光ラベル付き分析物の
酵素的加水分解のために増加した分析物の存在下では螢
光は強化される。例えば、ラベル付き分析物けβ−ガラ
クトシル−ウンベリフェロン−シソマイシンでアル。
酵素β−ガラクトシダーゼはウンベリフェロン部分から
糖を分裂させ、そこでこれは螢光を発し得ることとなる
。この方法を紀している刊行物には、J、 F、 Bu
rd、 R,C,Wong、 J、 E、 Feene
7+ R,J、 C’arr1c。
77、56 (1977)及びF、 Kohen+ Z
、 HollaMer及びBoguslaskL Jo
ur、 of 8teroid Biochem、11
.161(1979)が包括される。
さらに別の型の均質非同位元素免疫試験は米国特許4,
213,893中に開示されており、それは助因子でラ
ベル付けされた分析物を使用する。これは分析物をNA
D (すなわちニコチンアミド−6(2−アミノエチル
アミノ)−ゾリンジヌクレオチド)の誘導体と結合させ
ることによる分析物のラベル付けを包含している。ラベ
ル付けされた助因子は分析物としてのニス) +7オー
ルの環化反応においてデヒドロゲナーゼ(例えばアルコ
ールデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、す
なわち人DB、 MD)I )との反応性を保有してい
る。最終的に、これらの反応で生成し九NADPT(を
曽光計により監視し、そしてそれが環化連間の尺度とな
る。
NADPHはニス) IJオール抗体存在下ではラベル
付けされた助因子の複合体化により還元する。従って、
環化速度はニス) IJオールの量と直接関連があり、
そしてエストリオール量の増加につれて直線的に増加す
ることが見出されている。これはF、 Koh@n s
 Z、 HOllan(1@r %T’、Yeager
 %F、J −Car ric。
及びR,C,Boguolaski、67〜79頁、”
 Enzyme −1abeled Immunoas
say Of Hormonss and I)rug
s″、編集8.B、Pal、Waiter de Gr
uiter s  ベルリン及びニューヨークによる1
978年の刊行物中に記されている。同様なシステムは
環化用酵素として乳酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラー
ゼを用いるビオチン及び2.4−ジニトロフルオロベン
ゼン分析物に関して記されている( R,J、 Car
rico 、 J、 E。
Christner %R,C,Boguolaski
及びに、 K、 Young 。
Anal、 Biochem、 72.271 (19
76) )。その方法は体液に共通の内因性助因子及び
減成用酵素により妨害を受けることが指摘されている(
 M、 、r、 O’5ulli−van %J、 W
、 Bridges及びV、Mark、  Annal
s ofさらに別の型の免疫試験技術はラベルとして酵
素調節剤、すなわち酵素阻害剤又はアロステリック奏効
体を使用する。多数の酵素調節剤がそれらの個別酵素と
共に米国特許4,134,792中に挙げられている。
個々の抗体が酵素調節剤でラベル付けされた分析物と結
合するときには、酵素調節剤は培養混合物中の酵素の活
性をもはや阻害できないか又はその他の影響を与えるこ
とができない。従って、遊離状分析物による酵素調整剤
ラベル付け25− された分析物の置換は酵素調節剤の阻害又はアロステリ
ック効果を回復させる。
ケ2カル ラバー カンパニーにより1980年に発行
されたTLdward T、 Maggioによ抄編集
されている” Enzyme Immunoassay
” という題の峻近の論文では、105〜134頁の”
 Pr1nciples of Homo −gene
ous Enzyme −Immunoassay ’
という頌の章は、ヒト免疫グロブリンG、用の酵素ラベ
ルとしてのりがヌクレアーゼ人の使用を言及している。
詳細事項は与えられないが、著者は、す、yヌクレアー
ゼ人は蛋白質均質酵素免疫試験においてラベルとして使
用する可能性を有すると結論付けている。しかしながら
、著者はまた、残念なことにりがヌクレアーゼ人の偏在
性が血清試験中の内因性酵素からの重大な干渉の可能性
を有しそして工程の実用性を限定していることも記して
いる。
さらに、リケヌクレアーゼの構遺及び性質の研究が相当
行なわれている。例えばり?ヌクレアーゼの触媒活性を
監視するためにこれまでに多くの有機化合物が使用され
てきている。一般的に称さ26一 れているそのような有機化合物又は基質は、天然基質に
より表わされるものと同一もしくけ同様な構造的拘束を
示すり?核酸自身、環式りん酸塩ジエステル及びモノリ
?ヌクレオチド化合物を包括している。
ワ?ヌクレアーゼ活性を動力学的に壁視するためKはさ
らに他の化合物も使用されている。そのような化合物に
は、1−ナフトール、5−ヒドロキシナラトール及び1
−4メトキシフエノールの3′−ウリジル嗜ホスホノエ
ステルが含まれる、HoRubgmen、 R,Kha
ndler及びH,Witzel (HOT)p8−8
aylsrのZ、 Phyaiol、 Chem、 3
55.687 (1974) )。
しかしながら、加水分解生成物は紫外線範囲内〒直接監
視され、これはノナモル又はピコモル範囲での分析に対
して十分感受性でなく、そして臨床試料に由来する干渉
が起きるかもしれない。さらに、これらの基質の製造は
長いクロマトグラフィ工程を含む多数の段階を必要とす
るため製造が困難である。
また、リカヌクレアーゼのポIJ−?プチド断片への分
裂も研究されている。例えば牛の膵臓のす、yヌクレア
ーゼ(すメヌクレアーゼA)に対するバクテリア性プロ
テアーゼであるスジチリシンの活性が知られている。蝮
かい加残基ボリイデチド及び長い104残基、l IJ
イプチドかり?ヌクレアーゼAのI番目のペプチド結合
(アミン末端から数えて)Kおける分裂の結果として生
じることが見出されている。前者は8−ペプチドと称さ
れており、一方後者tis−蛋白質と称されている( 
F、 M、 R1−chardg、Proc、 Nat
’L、 Acad、 8ci、U、 S、 a、j%1
62(1958) s F、 M、 Rlchard及
びP、 J、 Vitbayabil、J、阻o1. 
Chern、 234.1459 (1959) )、
この2種のポIJ 、?デチドが容易に結合して非共有
複合体(Kzto−’M)を形成し、それは種々の基質
例えばRNA又はシチジン2/、 3/−りん酸ジエス
テルに対して元の障素であるIJ 、yヌクレアーゼ人
と同じ触媒活性を保有することも同様に知られている。
しかしながら、わかっている限夛では、との知識は免疫
試験技術の開発においては利用されていない。
均質免疫検定の分野に於けるちかごろの活動がかなシあ
るということにもかかわらず、現在使用されている技術
の種々の欠点を克服できる別の開発に対しての要望が残
っている。このことは多分、明らかに広い可能性がある
にもかかわらず非同位元素免疫検定技術が比較的商業的
使用に制限されていることから明白であろう。従って、
それらの曳ぐ堅繊された欠点にもがかわらず、単に満足
のい〈代シの技術が商業的に入手でき々いため釦、放射
線免疫試験技術が広く用いられ続けている。
従って、本発明の一目的は広範囲の分析物に広く適用で
きる均質免疫試験技術を提供することである。関連する
もつと特定の目的は、比較的小さい分子量の分析物分子
を用いる使用だけに限らない均質免疫試験技術を提供す
ることである。
菊の目的は比較的高分子量のラベルの使用を必要としな
い均質免疫試験方法の提供である。関連目的は、容易に
製造でき、容易に精製されそして比較的安定であるラベ
ル付けされた分析物を提供することである。
本発明の他の目的は、分光光度計又Fi螢光針検29− 出方式において、希望によりいずれの方式にも共通する
基質を用いて、操作できる均質免疫試験方法を提供する
ことである。
本発明のさらに別の目的は、優れた感度を得ることので
きる均質免疫試験方法を提供することである。関連する
さらに特定の目的は、基質の触媒による転換により増幅
される螢光計検出方式を用いる検定を包含している。
さらに別の目的は、商業的に入手できる自動的分析器、
例えば1遠心急速分析器”と一般に称されているもの、
の中で使用するのに容易に適している均質免疫試験方法
の提供である。
本発明の他の目的は、自動的データ類別に容謳に適応可
能な均質免疫試験技術を提供することである。関連する
さらに特定の目的は、自動的データ類別用の満足のいく
投薬量応答曲線が得られるような免疫試験技術を提供す
ることである。
本発明の他の目的はその方法が例えば起り侍る妨會など
の如き問題を最少限にするのに充分なほど柔軟性である
ような均質免疫試験技術の提供で30− ある。
本発明の他の目的及び利点は下記の詳細な説明及び図面
から明白となるであろう。
本発明は種々変更、別の形態にすることができるが、こ
こでは好適態様を詳細に言己載する。しかしながら、本
発明を開示されている特定形に限定しようとするもので
はないことは理解すべきである。反対に、特許請求の範
囲に記されている如き本発明の精神及び範囲内にはいる
全ての改変形を包括しようと意関するもの〒ある。例え
ば、本発明のラベル付けされた分析物は主として均質免
疫試験技術と関連して配されているが、本発明は抗体結
合された及び遊離状のポリペプチドでラベル付けされた
分析物の部分を分光光度計又は螢光計による測定の前に
分離するよう々不均質免疫試験における使用にも同様に
適用できることをgiIlIIすべきである〇 一般に、本発明は一方が分析物用のラベルとして作用し
そして他方が混合物中に存在しているような?リイグチ
ド対を使用することによシ感度の高い免疫試験方法が提
供できるという発見に基いている。これのIリイデチド
ノヤートナーと組み合わされたときに生じるラベル付け
された分析物は、特定の発色団又は螢光団基質に対する
触媒活性を有する複合体を生成する。さらにそして重要
なことに、そのようなラベル付けされた分析物の触媒活
性は、分析物圧対する抗体の存在下で大きく阻害される
。この阻害は、増加する製産の分析物を混合物に加え石
ときに除かれる。従って、晋換曲線を作成でき、それは
触媒活性又は触媒活性の函数を分析物濃度に関係づけ、
そしてこの参照用又は標準曲線は未知の分析物濃度の測
定を可能にする。
満足のいく感度の良い免疫試験方法の提供能力は以下に
記載されているように、適当なポリ2デチド対、並びに
分析物と抗体との反応及びラベル付けされた分析物とそ
れの/ IJ−?ブチドパートナーとの反応の平衡定数
を含むある種の媒介変数、並びに抗体、ラベル付けされ
た分析物及び?リイゾチドパートナーの相対的濃度の選
択に依存している。
検定案 多種の案が本発明に関連して使用できる。一般に、本発
明の均質免疫試験方法は、(a)媒体中で(1)分析物
を含有している試料、(2+ 、ff IJペプチドで
ラベル付けされた分析物、(3)分析物に特異的な抗体
、(4)ラベル付けされた分析物の?す(プチドと非共
有結合できて触媒活性を有する複合体を形成する/ I
Jペプチドパートナ−1(5)及び複合体の触媒活性に
よ抄レポーター分子に転化可能な基質を一緒にし、(b
)基質からしI−ター分子への転化速度又は転化程度を
測定し、そして(C)該転化速度又は転化程度を既知量
の分析物を含有する媒体中で得られたものと比較するこ
とからなっている。物質の添加順序は希望によね変化さ
せることができ、そしである場合には培養段階を供する
ことが望ましいO 試験は多種の商業的に入手できる装置のいずれかを使用
することKより有利に実施できる。例えば1分光光度計
技術を用いて分析を行なうために33− は、ユニオン・カーバイド・コーfレーション裂のCe
ntrifi Chew  4QQ及び500急速分析
器を使用することが適していると見出されている。一般
に。
この型の分析器けNorman G、 Anderso
n 、 ”Analy −tical  Jechnl
quea  for  Ce1l  Jractlon
s II。
A Multiple−Cuvet  Ttotor 
 for  a  NeW Microana−1yt
ical System”、 Analytical 
Biochemistry 。
英、545〜562 (1969)中Kll己されてい
る。適当な螢光計装置も同様圧して商業的に入手できる
例に挙げた急速分析器の使用の際にけ、−掌では、#電
を測定しようとする分析物、抗体、及びボIJ dデチ
ドでラベル付けされた分析物を含有している試料を分析
器の転移ディスクの試料井戸中にピペットで加え、ポリ
イデチドパートナー及び基質を転移ディスクの試薬井戸
中にビ被ットで加え、必要なら混合物を試料井戸中で培
養し、そして転移ディスクを回転させながら例えば分光
光度計技術の如き適当な手段により基質からレポーター
分子への転化速度を監視することによりラベル付けされ
た分析物錯体の触媒活性の回復を分析す34− ることを包括している。
試薬の添加順序は通常臨界的でないことに注目すべきで
ある。従って、希望により、遠心急速分析器の案に関す
る添加順序は質実できる。例えば。
パートナ−ポリペプチド及びラベル付けされた分析物の
添加は相互転換でき、そしてこれは検定感度を強化させ
ることのできるラベル付けされた分析物の遅れた添加に
相当する。これによりビイット効率を増加させることが
でき、その理由は単独試薬成分でなく混合溶液をピRッ
トで加えることができるからである。この場合、3種の
ピイット操作が包含される:(1)分析物試料、(2)
抗体及び?リペデチドパートナー並びに(3)ラベル付
けされた分析物及び基質。従って、前記の市販の急速分
析器を用いると、一つのサイクル中で上記の3種の操作
を実施するために充分な自動的ピペッタ−を利用できる
使用するなら培養段階の時間は主として分析物の性質に
依存して変化するであろう。培養すると。
分析物濃度に関係する。抗体で結合された。及び遊離状
の、ラベル付けされた分析物の平衡又は動力学的分布を
もたらす。抗体との複合体化速度示拡散支配である丸め
に、例えば薬又は薬代謝物の如き小さい分析物は短かい
培養時間を必要とするが1例えば/ IJ−eデチドホ
ルモンの如き比較的大きい分子量の分析物は実質的に比
較的長い培養時間を必要とする。従って、培養時間は約
1分間から約め時間種度までに窒化で六る。さらに、分
析物、ラベル付けされた分析物及び抗体の培養混合物が
平衡に達することは必要ない。全ての培養混合物に対す
る培養時間及び対応するレポーター分子生成物の生成速
度の測定値が一定に保たれておりそして同一であるなら
、運動論的(カイネティツクな)免疫検定が可能である
。運動論的検定は分析用に必要な全時間を短縮させ、そ
して上記のラベル付けされた分析物及びノ辛−トナー?
リイプチドの相互転化を可能にする。
生成物の出現速度、すガわちレポーター分子生成速度は
、分析物の性質に依存しての分光光度計又は螢光計によ
シ監視できる。約to−’Mより大きい濃度で存在して
いる分析物に対しては分光光度計による検出が好適であ
り、一方低濃度水準で存在している分析物に関しては、
螢光計方法の比較的大きい固有感度のために螢光計によ
る検出が好適である。逆に、比較的長い時間が許容でき
る場合には例えばあ分以上の比較的長時間にわたって速
度を監視することによす、10−’M以下の濃度の分析
物に対して分光光電計による検出を利用できる。
本発明の代表的な検定率に従うことによりそして増加す
る既知の分析物ill’を使用するととKよね、触媒活
性(例えばレポーター分子の生成速度)の標準的すなわ
ち参照曲線、又は分析物濃度に対する触媒活性の函数、
を作成できる。この標準的すなわち参照曲線を次に、標
準的曲線を作成するために使用されたものと同一の条件
においてレポーター分子の生成速度を測定した後に未知
の分析物濃度を測定するために使用できる。
ラベル付けされた分析物、パートナ−ポリペプチド及び
抗体が試料中に一緒に存在しているときKは、/リベプ
チドでラベル付けされた分析物は37− 抗体又は?リイプチドパートナーのいずれかと競争して
結合できる。ポリペプチドでラベル付けされた分析物が
それのポリイデチドパートナーと結合すると1!には触
媒活性が与えられるが1.d リイデチドでラベル付け
された分析物が抗体と結合するときKは触媒活性は阻害
される(すなわち現われないか又は与えられかい)。幀
システムの平衡反応のためにそして質量作用の法則によ
り1分析物は抗体と結合されているポリペプチドでラベ
ル付けされた分析物と置換し、そしてその結果、試料中
に、それの−り4デチドパートナーと結合可能な未結合
のラベル付けされた分析物が得られる。
従って1分析物の不存在下では、減じられた触媒活性が
現われる。しかしながら1分析物が試料中に存在してい
るなら、増加した触墜活性が生じそれは監視できる。ラ
ベル付けされた分析物が抗体と結合して釣るときには触
媒活性は減じられるか又は抑制されるが分析物の存在下
では回復するため、s液の触媒活性は試料中に存在して
いる分析物の濃度に直接関連するであろう。
38− 本発明の方法は基本的には6種の反応式の考察を包含し
ている。どんな免疫試験技術を用いる場合もそうである
様に該方法の基礎は、ラベル付けされた及びラベル付け
されていない分析物に対する抗体の反応(又は平衡化)
速度が一般に同一であることである。これらの2種の反
応を以下に示す: 人士Ab;A′Ab(1) A −PPよ+Ab:A−pp、°*b       
 (2)〔式中1人は分析物であり、Abは分析物に対
して特異的な抗体又はレポーター蛋白質であり。
A°人すは分析物及び抗体の反応により生成した複合体
であり、A−PPよけ?リイデチド・9−トナーの一方
でラベル付けされた分析物又は分析物類似体であり、セ
してA−PP□”AI)  はラベル付けされた分析物
及び抗体の反応により生成した複合体である〕。
明らかに、反応(1)及び(2)の速度が一般に同一で
たいなら、競争による結合は生じないであろう。
上記の如く、試料中の分析物の存在は抗体と結合してい
る/ IJ 、eプチドでラベル付けされ九分析物と置
換し、その結果未結合のラベル付けされた分析物は次に
それのポリイデチドノ1−トナーと結合できる。後者の
反応を以下に記す: A−PP1+PP、 、−A−PP1°PP禽    
(3)〔式中、人−ppよけ前記の如きラベル付けされ
た分析物であり、PP、けIリイデチドパートナーであ
り、そしてA−PPユ°PP、け非共有触媒複合体であ
る〕。
非共有触媒複合体は、以下KI15されている如き、基
質からレポーター分子への転化に触媒作用を与える: s  A−PP1’PPs p           
(4)〔式中、8は基質であ抄、そしてPけSから触媒
により誘導されたレポーター分子である〕。
概念的に、考慮すべき他の二反応を以下に紀す:A−P
Pl”人b+PP、、−A−PP、’Ab’PP、  
   ffi+s A−PP1”Ab’ PP詔p  
      (61〔式中、A−PPlo人すは結合さ
れたラベル付けされた分析物であり、 pp、は/ リ
、eデチドパートナーであり、 A−PP□°人b’P
りvけラベル付けされた分析物、抗体及び/ IJペプ
チド・1−トナーの反応により生成した理論的な三元複
合体であり、Sけ基質であ抄、そしてPけレポーター分
子である〕。
漕足のいく感鷹を与えるためには、反応(5)における
三元複合体の生成を最少にするか、又は反応(6)K従
って三元複合体が基質を生成物に相当種度まで触媒によ
抄転化させてはならない。換言すると。
いずれかの量の三元複合体が反応(5)で生成すると。
相当量のレポーター分子Pが反応(6)により生成し。
反応(4)で生成したPの量は存在する分析物の種々の
量に適切に関連しないであろう。
これらの6種の反応の効果の考察においては。
抗体、/リベデチドパートナー及びラベル付けされた分
析物の濃度は特定の試験では、基質からのレポーター分
子への転化において異なる量の分析物が反映されるよう
に選択すべきである。反応(11〜(3)K対する平衡
定数も考慮にいれるべきである。
特定の試験を計画する指針として望ましい関係41− は下肥の不等式により説明され、それFiある種の簡単
にするための仮定を加えである式の数学的分析から誘導
される: Ks CAb 〕/に1〉Cppm 〕〉rA−ppよ
〕十に3C式中、に1及びに、け反応(11及び(3)
K対する平衡定数であね、〔Ab〕は抗体の濃度であり
、rpp21けIリイデチドパートナーのII賓であり
、そしてC*−ppl)はラベル付けされた分析物の!
I闇である〕。
この数学的分析け% K1及びKm(反応(2)に対す
る平衡定数)は同一であね、そして反応(5)及び(6
)け全く進行しないと仮定している。
Kl、 [”Ab 1/Kxという表現に関しては、C
PP、〕より小さい1の係数よりはるかに小さい全体値
は、抗体との結合がほとんど生じないという結果のため
に1分析物濃度の変化量に関してほんの最少の応答しか
与えない。換言すると1反応(3)で生成した触媒種は
分析物濃度とは独立して生成し、その結果よくても分析
物濃度Kかかわりなく存在する分析物の変化量を区別す
ることは難かしいであろう。
42− これは、反応(2)の生成物は最少量しか生成しないか
らであろう。一方、抗体の濃度が高すぎるか又は平衡定
数が上記の表現の全体値が[pp、101.000倍過
剰量と浸るようなものであるなら5反E (3) Kお
ける触媒活性種は、変化する分析物濃度に応答するのに
満足のいく量では生成されないであろう。
従ッテ、 表現に311”Ab”)/に1カrPP、1
 ノ約2〜100倍。
好適には約5〜25倍、であるように試験を計画するこ
とが一般に望ましい。
さらに、ラベル付けされた分析物とそれのポリペプチド
・4−トナーとの反応、すなわち反応(3)。
はそれの抗体との反応、すなわち反応(2)と比べてあ
まりに大糧度管で進められるであろうために。
PP、の濃度が表現に、〔Ab〕/KIK関して高す°
ぎるときには感度はほとんどなくなるであろう。その結
果、この場合も分析物濃度の変化量は満足のいくように
区別できないであろう。ポリイデチドパートナーの濃度
が表現Ks[Ab〕/に□に関して低すぎるなら、逆の
状況が起きる。分析物濃度忙関係なく。
反応(3)において不適当な量の生成物が生じるであろ
う。従って、ポリイプチドノ量−トナーの濃度を。
表現Kl(Ab)/に、の値よシ約2〜100倍低い、
好適には約5〜5倍低い、範囲内に保つことが一般に望
ましい。
同様に、ラベル付けされた分析物の濃度及びK。
K関してFi、ラベル付けされた分析物の濃度が予期さ
れる分析物濃度のものの約10〜100倍以内であるべ
きである。
本発明に従う検定の計画は一般に、典型的な免疫試験の
計画に含まれるものと一同様である。本発明に従う試験
の計画例七して記すと、準備出発点は(1)包含される
分析物用の適当な抗血清又は抗体。
(2)ラベル付けされた分析物A−PP□及び(3)ポ
リイプチド/豐−トナーPP震の入手である。
A−PP1の濃度を最初に、予測される分析物濃度のも
のと一般に同一に定める。次に、PP、の濃度をに、と
同一もしくはそれよりわずかに高く設定する。はとんど
の場合、ラベル付けされ九S−ペプチド及び8−蛋白質
からなるポリペプチド対に対してはこれは約10−一で
あろう。基質8の量は、検rrJ用に分光光度計方式を
用いるなら毎分少なくとも約10 f +7吸収単位の
線状速度を与えるのに充分なほど高く選択すべきである
次に、適当(ラベル付けされた分析物及び上記で測定さ
れたpp、 6度を用いて抗体希釈に対する抑制率を測
定して、抗体に関する一般的滴定曲線を作成する。典型
的には、抗体の濃度は約504(+9もしくは30チ)
の抑制率を与えるように選択されるが、toss曜の低
い抑制率も使用できる。
分析物に対する予測濃度範囲を模する標準的濃度の分析
物を製造し、そして次にあらかじめ定められている媒介
変数と共に使用して、参照用置換曲線を与える。この曲
線は、予測濃度範囲にゎたって適当な感度が与えられて
いるかどうかを決めるため試験されなければ)らない。
濃度範囲の比較的高い部分において比較的大きい感度を
希望するなら、これは一般に、抗体濃度を増すととくよ
シ与えられる。以上で指針として記されている定性的不
等式を用いてどんな増加選択量でも決めるべきである。
45− 濃度範囲の比較的低い部分において比較的高い感度を希
望するときには、抗体濃度の減少は役立つべきである。
さらに、そして再び指針としての定性的不等式を用いる
と、PP、及びラベル付けされた分析物の濃度を減少さ
せることも有用である。
希望するなら、分析物(及びラベル付けされた分析物)
K対する抗体の結合及び/又はポリペプチドA + )
ナーに対するうはル付けされた分析物の非共有結合を増
加もしくけ減少させるように平衡定数に1、−及びに3
を改変させることにより、さらに細かい調整が得られる
。本発明により加えられる別の媒介変数、すなわちPP
、の濃度及びム−PPl及びPP、の反応は別の追加手
段、多分全部に対してではないかもしれないが、本発明
の多用性に寄与する細かい調整のための追加手段を、先
行の免疫検定接衝の多くを越゛える−のとして与えるも
のである。
ここで論議されている媒介変数に適切に注目することに
より、特定の試験が分析物濃度の変化量に対し光希望す
る感度を確実に得ることができる。
46− 、i−」L−1一 本発明の免疫試験方法は、多種の分析物の量的存在量を
測定する際に利用出来る。本発明の方法により測定する
ために適している可能な分析物には一般に、水性媒体中
に少なくとも約10−1m Mの濃度水準で存在してい
るか又はその中に抽出可能である複雑な有機分子が包含
される。螢光性レポーター分子の存在する実際的検出限
度及び抗分析物抗体どん欲さ即ち結合力定数から濃度限
界が生じる。
実際に、本発明は今までの免疫試験を利用できた分析物
に対して使用できる。さらに、概念的には、本発明はそ
れに対して特定のレセプターもしくは結合用蛋白質が入
手できるような分析物の濃度を測定するために使用でき
る。そのようなレセプター又は結合用蛋白質を得ること
は、例えば約100以下の如き極端に低い分子量の分析
物を用い゛ ると非常に−かしくなシはじめる。一方、
例えば106の如き比較的大きい分子量の分析物を用い
ると、本発明に従う分析物のラベル付けの際には触媒活
性の満足のいく抑制が確実に与えられるように注意を払
うべきである。
本発明の方法を利用できしかもそれ用の特定のレセプタ
ー又は結合用蛋白質が入手できるような分析物には例え
ば、薬及び薬代謝物、鎮静剤、麻酔物、ステロイド、ビ
タiン、ポリペプチドホルモンを含むホルモン、抗原を
伴なう膣瘍、免疫グロブリン、酵素、工業的汚染物質、
殺虫剤及びそれらの代−物、食品添加物、除軍剤及びそ
れらの代紺物、香味剤及び食品有毒物が包括される。よ
り詳しくは、本発明の免疫試験方法はそれぞれの濃度の
下記の分析物の全範囲を試験するために便用できる暮約
10=’ M〜約10−@Mの濃度範囲(ヒト血清中)
、のりランチン、カンナピノイド、ゲンタマイシン、ト
ブラマイシン、メトトレキセート、リリトキシン、チロ
キシン、テストステロン、コルチソル及び免疫グロブリ
ン;約101M〜約10−9Mの濃度mN<ヒト血清中
)のトリアイオドチロニ    □ン、ジ:/S?シン
、1IiiI!、77ジオテンシン■、プロゲステ四ン
及びプロスタグランジンF’JL r約101M〜約1
0−10 Mの濃度範囲(ヒト血清中)のエストラジオ
ール、ビタiンBxs及び成長ホルモン+ 約10−”
M〜約10− Mの濃度範囲(ヒト血清中)のインシュ
リン、ノツチロイドホルモン、チロイド刺激ホルモン、
カルシトニン、ガストリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホ
ルモン、グルカゴン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、及び
アルドステロン;並びに約10−11M〜約10−!I
Mの濃度(ヒト血清中)の袷生期癌抗原。
現在では、上記の分析物の大部分は不均質工程を用いる
臨床的放射線免疫試験により一般に測定されている。本
発明の免疫試験方法は前記の分析物の全範囲を、費用が
かがり、有害なそして不安定な款射性核種ラベルの使用
を必要とせずに検定することが出来る可能性を有する。
複雑なガンマ又はシンチレーシ冒ン計数器の使用も同様
に省略できる。
ポリペプチドパートナ− 適切なポリペプチド対は下記の機能的特徴に合致しなけ
ればならない:(1)少なくとも一員は分析物又は分析
物類似体と共有結合できてポリペブチ49− ドでラベル付けされた分析物を形威しなければならない
、(2)ラベル付けされた分析物は抗体用につき分析物
と競争するものでなければならない、(3)ラベル付け
された分析物は、ポリペプチドパートナ−と組み合わさ
れ九ときに、基質をレポーター分子に適当な検出可能量
で転化させるのく充分な触媒活性を与える、及び(4)
均質免疫試験用には、ラベル付けされた分析物とそれの
ポリペプチドパートナ−との組み合わせ物により付与さ
れる触媒活性の回復がラベル付けされた分析物の抗体と
の複合体化により阻害される。
概念的には、上記の条件(3)に紀されている組み合わ
せ現象には酵素性蛋白質内の複数の鎖内相互作用が伴な
われ、それは安定な三次元構造及び特別な活性場所の生
成をもたらす。大部分非共有性であるそのような複数の
鎖内相互作用は、好適には骨組のペプチド鎖に湿っての
共有結合の不存在下においてすら活性場所の再構成を可
能にするのに充分な一体化結合強度を有するものである
本発明の−画く従う適当なポリペプチド対は、50− 種々の酵素を分裂させて2個の部分を与えることKより
得られる。例えば、ブドウ球菌ヌクレアーゼの酵素によ
ゐ分裂並びにウシ、ネズミ、ヒトコブラクダ及びカンガ
ル−の膵臓リボヌクレアーゼの例えばスブチリシン、ペ
プシン及びカルボキシペプチダーゼの如き種々の酵素を
用いる酵素による分裂により生成物が生成される。
一方、大腸菌(Igch@richia coli )
からの2−削険突然変異体菌株からのM15蛋白質の場
合の如く、適当なポリペプチド対の一方のパートナ−は
集熱変異体細菌株から遺伝学的に得られる。この蛋白質
はβ−ガラクトシダーゼ(CB2と称されている)の小
さい熱による又は臭化シアン発生部分の存在下でβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を回復する。
この現象は試験管内補足と称される。
(ウシの)リボヌクレアーゼAのスチリシン誘導分裂か
ら誘導されたポリペプチド対は日−ペブチPすなわち加
ア建ノ酸部分、及びそれによりさらに複雑な104アき
ノ酸残基からなる8−蛋白質からなってbる。これらの
部分は、リボヌクレアーゼのアミノ末端から数えて加番
目のペプチド結合のところのりボヌクレアーゼムの分裂
から生じる。8−ペプチドは下記の構造を有する(F、
M。
Rlchard−及びIli、Mlyckoff、 T
he ffingymes、Boyer。
ア、D3編、3版、4巻、647〜806頁、Acad
emicPr・110ンドン及びニューヨーク市):H
Lye  Gln  Thr  ム1a ム1a ムl
a  Lye  Phe  Glu  Arg1234
56   7  8  9  10Gln Hlm M
@tム−p Bar 8er Thr Sirムla 
Ala 0H11121314151f3  17  
18  19  208−ペプチド1−20、 同様に周知である8−蛋白質は下記の構造を有する: HBar s@r 8+erムan Tyr cysl
ol G4n Met Met21  22  23 
 24  25  26  2〒  28  29  
30IJ7@ 8sr Arg Asn LeuThr
 Ly−ムsp Arg Cys31 32 33 3
4 35 36 37 38 39 40Lys Pr
o Val Aan Thr Ph@Va1H1s G
lu 8er41 41 45 44 45 46 4
748 49 50シ1ム1aムgp ValGin 
Ala Va1C7@ 8@r G1n51  52 
 55  54  55  56  5フ  158 
 59  60by−ムsn ValAla Cys 
Lys A11nGay Gln Thr61 62 
65 64 65 66 6’/  68 69  ’
10ムsn Cys  Tyr Gin 8er Th
y 8rr ’rhr Met 8sr’71   ’
12  73   ’74  75   ly6  7
’7  78  19  80工Is Thr Asp
 Cy−ムrg Glu Thr Gly 8er E
lor81 82 83 84 85 86 87 8
8 89 90Lye Tyr Pro ムsn C7
11ムla Tyr Lye Thr Thr91 9
2 93 94 95 96 9’7 98 99 1
100G1  ムユa  Asn  Lys  Hl−
工Is  工Is  Val  ムla  cyslo
l  102103104105 106 10’7 
 ’108109 110Glu  G4y  ムsn
  Pro  Tyr  Val  Pro  Val
  Hls  Pha’111 11 113 114
 115 116 1フ 118 119 120ムa
p ムla  8er  Van  0H121122
123124 8−蛋白質(21−124)。
上記の8−ペプチド及びS−蛋白質の記載では、簡単な
略語を使用した。
種間ハイブリッドも適しており、例えばPPlは53− PPl用のものとは同一でない動物種からの酵素から誘
導される。例えば、ヒトコブラクダ、カンガル−及びネ
ズ電から誘導される8−−eプチドも8−蛋白質、峙に
ウシのB−蛋白質又はヒトコデラクダのS−蛋白質の存
在下で触媒活性を有することが見出されているoCJ、
ム、Lenstra%Jj、Be1n−t@ma、FI
B8 Letters%競891976 ; G、 W
、felling 1G、 GrO・n%D、Gaks
ユ、W、 Gaastra、及びJ、 J、Beint
sma1FKB8 Letters、40134 19
74)。これらノ種ノボリアきノ酸を以下に示す: ヒトコプラクダの8−ベプチP H8er Glu Thr Alaムla Gln L
ys Phe Gln Arglnil    :5 
  4   5   6    ’/    8   
9    :LOG4n  Hls  Met  As
p  8sr  Tyr  Ser  Bar  8e
r  0H11121s   14  15   ’1
6  1’7  18  19カンガル−のS−ペプチ
ド HGlu Thr Proムla Glu Lye P
he Gin Arg G1n2    !S    
4   5   6    ’7   8   9  
 10  11H1m M@tム−p Thr Gin
 Thr Her Thr Ala Sar 0H11
i!  13  X4 15 16 17 18 19
 20 2154− ネズtの13残基 E Glu Ser 8srム1aムap Lys P
h@Ly−ムrg G1n2 3 4 5 6 7 8
 9 10 11H1s Met Asp 0H 12131 ネズミの17残基 HGly Gln Bar Arg Gln 8er 
8ar Aha Asp LysPhe Lyeムap
 Gln Hls Met Asp OH前記の文献中
で論じられている如く、これらの種からのりボヌクレア
ーゼから誘導された8−ペプチド又Fis−蛋白質が本
発明に従う触媒性ポリペプチド対の成分として使用でき
るよう圧するのに充分な相似性が種の間に存在している
さらに、前記の如く、スプチリシン以外の酵素からのり
ボヌクレアーゼム分裂生成物をポリペプチド対源として
使用できる。リボヌクレアーゼAの連続的なペプシン及
びカルボキシペプチダーゼ処理が6個のアミノ酸だけ短
縮されたポリペプチド鎖を与えることは周知である( 
RMas・1−118)。
(M、C,Lin、 J”5iol、Chem、 24
56726.1970)。このボリイプチPを元のR)
ia−・の残基111〜124に相当する合成テトラデ
カペプチドと組み合わせたときには、本質的にRNa−
・の完全な触媒活性が回復される。(M、 C6L1n
、 B、 Gutte、 B、 Moors及びR9B
、 M@rrifi*1c1%、T、B111.Che
m、 245.5169.1970 +M、C,Lin
%B、Guth、 D、G、Ca1di、80M0Or
1!及びR,B。
M@rrifisla、 、T、Biol、Chew9
g47.4648.1972 )。
また、上記の如く、リボヌクレアーゼム以外の酵素は酵
素により分裂してポリペプチド部分を与え、それは非共
有的に再び組み合わされると触媒活性を再取得する。ブ
ドウ球菌ヌクレアーゼがそのような酵素の一例である。
このポリペプチド対は、ヌクレアーゼT −P(a−4
m)と称されている427オノ酸ポリペプチド及びヌク
レアーゼTP(4s、s。−1,、)と称されている1
00アミノ酸残基である。(HlJa−miuchi 
及びC,B、ムnfingsn、 J、Biol、Ch
em、244.3864.1969 )。
適蟲なポリペプチド対を得るための別の方法は突然変異
体微生物によるものである。例えば、上記の如く、大腸
菌の2−削除集熱変異体は、酵素β−ガラクトシダーゼ
のアミノ酸残基11〜41が欠落しているM15蛋白質
と命名される蛋白を生じる。
K、 l+Langlay、 M、 R1Villar
@go、ム、■、νowlsr、 P、、T。
Z&ll@nhof  及び1.Zabin Proc
@elings Nationalムcad@my o
f fllcienc@721254 (1g75 )
。M15蛋白質は、正常なβ−ガラクトシダーゼの臭化
シアン誘導分裂から誘導された小さいポリペプチド部分
(CB2と称されている)と組み合わされたときKは、
本質的に完全なβ−ガラクトシダーゼ活性を回復する(
 K、 llj、 Langley及び工、 Zabi
n Bioohem、 154866 (197g )
 ; 8.Lin、 M、Villarego、工、Z
abinBibchem、 Biophys、Rs+5
earch Commun、4Q、249 (1970
)。
1% D、V、Marinkovic、 J1M8Ma
rinkovic、 Biochem。
b遅慢、209 (1976)参照)。同様に、740
0の分子量を有するオートクレーブにかけられたβ−ガ
ラクトシダーゼからの小さい部分も、M15蛋白質と混
合したときにはβ−ガラクトシダーゼ活性の1復をもた
らす(8,L、 Morrson及びり、Zipser
 J、Mol。
且1o1.50.359頁(1970)。他の大腸菌突
然変異体蛋白質も、正常酵素の化学的に誘導されたポリ
イー5ツー プチド部分の存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性の回復
の同一現象を示す。例えば大腸菌の1acZX9Q突然
変異体は、CNBr24と称されている(個のアミノ酸
ポリペプチドの存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性を回
復する蛋白質を与える。後者はβ−ガラクトシダーゼの
臭化シアン分裂から得られる( J、V、Wslply
、 WoMandealic、ム、V、Fouler、
工、Zabin。
Biochem、Biophys、 Res、Comm
um、 g3.223 (1980)。
CBg及びM 15蛋白質の再組み合わせ用の会合定数
は1−1−2x109” であると評価されること及び
CB2 ill:対する抗体がM 15蛋白負を用いる
活性の回復を抑制することに注目すべきである。F、c
exaaa、1、Zabin、 Bioahem 18
.404 (1979)。従って、この及び関連すゐポ
リペプチド対はここに記されている免疫試験方法で使用
しようとする目的に特に適している候補である。
好適なポリペプチド対はリボヌクレアーゼムのスブチリ
Vン誘導分裂から誘導され、セして8−ペプチド及び8
−蛋白質からなっている。8−′4プチド及び8−蛋白
質の構造はこれまでに記されs8− ている。B−蛋白質では、残基加−混、切−%、58−
110及び6−720関に、ジスルフィド結合が存在し
ており、それらがポリペプチドの相当なコイル化を生じ
ている。これらのジスルフィド結合が分裂される力ら、
触媒活性も同様に損失されるであろう。これらの結合は
従って元の酵素のものに相当する8−蛋白質に対する三
次元構造を与えゐのを助けている。この構造は実際に、
活性場所の回復をもたらす会合するB−ペプチド用の鋳
型を提供する。
分裂した酵素は、非共有的に再び組み合わされると、元
の酵素の触媒活性の本質的に全てを望ましくは回復すべ
きである。最少でも、基質を検出可能量のレポーター分
子に、媒体又は他の非特定媒体で誘導される方法の速度
よシ集質的に大きい速度で転化させて、希望する感度及
び正確さを与えるのに充分な活性が回復されなければな
らない。
多分10又は5チ以下の如き低い触媒回復率でも満足で
ある。ま九、解離用の平衡定数は一般に少なくとも約1
01そして約1い1M−1よシ小さいものであるぺきで
ある。S−ペプチド、S−蛋白ポリペプチド対の望まし
い性質の−っは、該対がほとんどの分析物と、再び組み
合わされ九改質8−ペプチド°、8−蛋白質対の触媒活
性を実質的忙感じることなく、結合する多種の結合部位
にある。対中の多くのりリン残基中のエプシロンアZノ
基は、分析物又は分析物類似体の8−ペプチド又は8−
蛋白質と都合よく共有カップリングさせるための多数の
部位を与える。リジン残基は8−−eプチド中の位置1
及び7にあり、そして8−蛋白質中の位[31、詳、4
1.61、艶、91、郭、及び104 Kある。さらに
、各ポリペプチドにおける骨組に由来する単一アルファ
ーアξ)基が分析物へのカップリング用に利用できる6
さらに、これらのポリペプチドパートナ−には、結合用
場所として利用できる下記の基が含まれている:カルボ
キシル、グルメメート、アメ2ルテート、ヒスチリン及
びチロシン。
しかしながら、8−ペプチド又はS−蛋白質構造を例え
ば分析物のラベル付性の如き目的用に改変するときKは
、触媒回復に対する効果を考慮にいれるべきである。例
えばアミノ基を考えると、8−ペプチドのエプシロンー
アずノ基の全部又は一部のグアニジノ化又はアセチル化
は触媒活性の回復を相当遅蔦させないはずである。さら
に18−蛋白質のりシン残基41の保護は触媒活性の保
有に関して重大であろう。例えばグアニジノ、アセチル
、トリフルオロアセチル、ジニトロフェニル及び種々の
ボリア2ノ酸鎖の如き基の、種々のりジン残基に対する
結合は、リジン41上のニブシロン−アミノ基が改変さ
れているとき以外は、8−ペプチド、S−蛋白質再組み
合わせ対の触媒活性を相当遅らせるものでないはずであ
る( Rloharclg及びVyakOffの前記引
用文献、678頁)。従って、ニブシロン−アミノリジ
ン基の結合による有用なラベル付けされた分析物の生成
用に8−蛋白質を使用することは、位置41に訃けるリ
ジン基が未修飾の1まであるなら、有効であるはずであ
る。
8−ペプチドの位置2及び9にお叶るグルタメート残基
又は位置14におけるアスパルテート残基でのメチルエ
ステル生成は、触媒活性を相当保有61− する生成物を与えるはずである。しかしながら、全ての
カルボキシル基の完全なり導化け、それが触媒活性を完
全に減じるため、避けなければならない。B−蛋白質で
は、位置簡におけるアスパルテート残基に相当する1個
のカルボキシル基の改変は多分触媒活性を減じないであ
ろう。
8−ペプチドの位置12及び8−蛋白質の位置119に
おけるヒスチジン基は触媒活性の保有に関して臨界的で
あろう。これらのヒスチジン基は、ここで論じようとし
ている天然基質(RNA )又は種々の合成ヌクレオチ
ド基質の加水分解によるりん酸エステル結合分裂を促進
する求核種として触媒位置内で良く関与していると信じ
られている。、)? ジペプチド部分中のヒスチジン基
の改変は触媒活性の完全損失を生じるであろう。従って
、アルキル化又はジアゾニウム塩反応によるヒスチジン
残基の改変は多分避けな妙ればならない。
分析物との結合がポリペプチドラベル上の官能基の一部
の改変又は誘導化の九めの主な理由であるが、これは他
の理由のためKも望ましいという6g− ことは認識すべきである。例えば、生成したラベル付け
された分析物の負荷に影響を与えるためポリペブチドラ
にルを修飾することが有用であり得る。従って、−例と
して、8−ペプチドのニブシロン−アミノ基の全て又は
一部のグアニジノ化は酸性のより少ないラベル化された
分析物を与えるであろう。このことは検定感度を強める
ための抗体及びB−蛋白質の間の競争平衡を変化させる
一方法を提供する際の助けKなる。
リポヌクレアーゼムの分裂から誘導される8−ペプチド
、8−蛋白質ポリペプチド対以外のポリペプチド対電、
本発明で使用するために逼している。そのような対は望
ましい接触活性を与えるような方法で再び組み合わせら
れるであろう、4?に、ある種のポリペプチドは8−蛋
白質とそのように再組み合わせすることが見出されてい
る。そのような対には例えば、8−ペプチドの残基1〜
13及び2〜13からなるポリペプチドが含まれる。ま
た、下記のポリアミノ酸が8−蛋白質用の有用なポリペ
プチドパートナ−であるはずである:l又は2〜14目
又は2〜15+I又Fi2〜16;1又け2〜17i1
又け2〜18目又は2〜19、及び1又は2〜20(F
、M、νinn及びに、Hotmann1ムccoun
ts Of Chem。
ussearah、 6.170 (1973) )。
さらに、ラベル付けされた分析物の生成用に使用できる
広い範囲の合成8−ペプチド類似体がある。そのような
類似体Fis−蛋白質の存在下で触媒活性を示しそして
分析物に対するカップリング用に適する官能基を与える
べきである。従って、文献に鑑みて、8−ペプチド沿い
のある種の残基が他のアンノ酸と置換でき、そして8−
蛋白質の存在下で依然として望ましい触媒活性を与える
であろう。例えば、リジン又はオルニチン残基は位置l
Oにお−てアルギニンと置換できなくてはならない(ム
、Rochi、F、 Marohiori、L、 Ma
rodsr、 A。
yontana及び!、 8coffone、Gang
 Chim、Ital、 96.1537、1966 
)。lO−オルニチン置換されたペプチドは位置4及び
5において、これらの位置におけるアラニン残基の代り
にセリン残基にょ多置換されていることもできるはずで
ある。(L、 Marod@r、ム、 Roahi、F
、 MarahiOri、ム、νontana及び1.
8co−ffOns、J、ム−er、 Ch@mp、B
oa、 91.3921.1961 )。同様に、チ四
シン残基は同じオルニチン置換されたポリアミノ酸中で
8位置におけるフェニルアラニンと置換されていること
4できるはずである。(RlROOht、L、Maro
dsr、 F、Marchiori、1. Ferra
r@s*、及び1.8coffone、 J、ムm@r
、Chew、 Boa、 90.5885.1968 
; F、Marchiori、R,ROchi、L、 
Maro+1sr、及びE。
8coffone1GaMg、Chim、工tag、 
96.1549.1966 )。
好適なポリペプチドパートナ−(すなわちS−ペプチド
及びS−蛋白質)に関しては、等モル量混合物の培警が
、例えばリボ核酸(RNム)及びシチジン2/、 3/
 −J)ん酸ジエステルの如き種々の物質に対する天然
蛋白質であるリポヌクレアーゼムの酵素活性の本質的に
完全な回復をもたらすことが見出されている。さらに、
8−ペプチドでラベル付けされた分析物とそれのポリペ
プチドパートナ−である日−蛋白質との再組み合わせか
ら生成したラベル付けされ九分析智複合体が、基質であ
るモノヌクレオチド3′−ホスホジエステルに対する6
5− 8−ペプチド、B−蛋白質複合体の触媒活性を回復する
ことが見出されている。
フィル付けされた分析物 機能的には、本発明で使用する九めに適するラベル付け
された分析物は、ポリペプチドパートナ−に露呈された
ときの触媒活性を与えるそれらの能力によ抄、そして結
合時の触媒活性の随伴損失を伴なう分析物に対して特定
な抗体又は特定なレセプター蛋白質と組み合わされるそ
れらの能力により特像づけられている。また、そのよう
なラベル付けされた分析物が例えば製造及び使用時に遭
遇するような種々の反応条件下で種々の試薬に対して良
好な安定性を示し、そして容易に精製されることが望ま
しい。
化学的には、本発明のラベル付けされた分析物は一般に
ポリペプチドパートナ−の一方と化学的に結合している
分析物からなっている。ある場合には、分析物もしくは
ポリペプチドパートナ−又は両者が結合を実施するため
に適している官能基を含有している。分析物に対してよ
り典型的な他66一 の状態では、1糧以上の官能基を分子中に加えることK
より類似体を生成することが望ましいか又は必要である
。実際に、ラベル付けされた分析物の生成を促進するた
め又は望ましい触媒活性を確実に保有させるためには、
官能基が存在していてもなお結合を実施する類似体を生
成することが望ましいか又は必須である。さらに、ある
状況下では分析物とポリペプチドパートナ−を空間的に
分離しまた結合させるための結合のための基を利用する
ことが適している。本発明で使用されるポリペブチドラ
ばル、例えばB−ペプチド、が酵素ラベルより小さい分
子である傾向がありその結果特性の決定及び正確な構造
決定が促進されるということも注目すべきである。最後
に、ある種の検定では1個よシ多い分析物分子を単独の
ポリペプチドラベル分子に結合させることが望ましいが
、他の試験では1個より多いポリペプチドラベル分子を
単独の分析物分子に結合させることが好ましい。
一般に、本発明のポリペプチドでラベル付けされた分析
物は式 %式%) 〔式中、ムけ結合から生じる分析物類似体であり、 Xはム及び2又はYと結合している成分であり、2は存
在しているならX及びYと結合している架橋基であり、 YはPPl及び2又はXと結合している成分であり、 PP、はポリペプチドパートナ−であり、m%n及びp
は1〜約8の整数であり、そして0は0又は1〜約8の
整数でありそれは通常の場合nと同じ値を有する〕 により表わされる。
1個より多い分析物分子が単独のポリペプチド分子と結
合しているときKは、ラベル付けされた分析物は式 %式% 〔式中、ム、X、 Z、 Y 及びpp、は前の式中と
同じ意味を有し、0は0又Filであり、セしてnは1
より大きい整数である〕 Kよ抄表わされる。一般に、nは約8より大きい値を越
えずそしてより一般的には3より大きくないであろう。
1個より多いポリペプチド分子が単独の分析物分子と結
合しているなら、式は ム−(1ニー(zo) Y−PPx)n〔式中、ム、x
、1z、y、 PPl、 n 及(joFifり前の式
中に記されている意味を有する(すなわち、1個より多
い分析物分子が単独の、t? 1Jペプチド分子と結合
している)〕 となる。
本発明のラベル付けされた分析物の製造においては、m
、n及びpのうちの最も小さい値が、分析物及びラベル
の両者の和尚する構造決定物の破壊を最少にするために
、免疫反応性及び触媒活性■復の両者の保持を一般的に
与えている。一方、免疫反応性又は触媒回復の抗体に基
〈抑制が強化されるなら、比較的高い値が有利となり得
る。最適値社、包含される特定の試験に対して実験によ
り容易に決定できる。
69− 多くの分析物は分子中の適当が位置に、持合可能な1個
以上の官能基を含有している。しかしながら、ある分析
物に対しては、分析物分子に例えばアミノ、カルボキシ
ル、ヒドロキシル及びチオールの如き官能基を加えるこ
とが必要である。同様に、ポリペプチドラベルは一般に
、−例として、部分Yを与える結合に適している多くの
遊離アミノ基を含んでいるであろう。従って、8−−!
プチドをラベルとして使用するときには、3個のアミノ
基が存在しており、そしてこれらのうちの1個もしくは
全てを、S−蛋白質の存在下で接触活性の損失を伴なわ
ずに結合に使用できる。しかしながら、ある場合には、
しばしば遭遇するカルボキシル、ヒドロキシル及びチオ
ール官能基を包含するような他のポリペプチド官能基を
使用することが有用である。例えば、そのような他の官
能基は、fllにの反応平衡1例えばち及び−1が関与
している隈りにおいて杜、望ましく使用されて有利な結
果が生じる。
分析物及びd(IJペプチドラベル用に使用される70
− 官能基の性質に従って好適であり、そして同一であって
もよい部分X及びYを以下に示す。
結合基の例 NH,−NH−C− −Nl(−C−NH− −NH−C−NH− 〇 CO,H−C−0− 儒 C−NH ? OHO−C− 欄 0−C−IJH −1,0−CH2− ム、PPl上)官能基        X、Y〇 8H−8−C− ロ ー8−C−NH −B−C−NH 歳費に示されている例では、リアゾニウム塩は、72ノ
基と酸性亜硝酸ナトリウム又は他の適当な試薬との反応
及びその後の例えばチロシルなどの如きヒドロキシルフ
ェニル成分との反応により生成できる。ヒドロキシル基
は示されているパラ位置及びオルト位置に置かれ、そし
て残りの結合(/ソラ位置に示されている)は環上の他
の位置に置か12− れている。
基2は結合基!及びYを架橋している。それは全ての場
合に必ずしも必要ではなく、その理由は分析物及びポリ
ペブチドライル用の特定の官能基はある場合には架橋基
の介入の必要なしく適当に一緒に結合できるからである
。一般に、架橋基2は、存在しているときには、炭素数
が1〜10のアルキレン基、炭素数が1〜約10のアル
ケニレン基、炭素数が約4〜約10のシクロアルキレン
基、炭素数が約2〜約10のオキンアルキレン基及び炭
素数が6〜約10のアリーレン基である。
架橋基2の機能は、それにより免疫反応性、触媒活性の
回復及び抗−分析物抗体による触媒活性の抑制が最適に
されるような他の構造的パラメーターを与えることであ
る。従って、架橋基は、官能基的な意味では、分析物及
びラベルを分離するための化学的に不活性な空間的腕を
供する。さらに、以下で論じられている如く、これは2
官能性試薬の使用時には製造を助ける。例えば、炭素数
が(資)の如き比較的長い鎖の架橋基の使用は最初の二
つの官能基条件を満たすが、ラベルが抗体から13− はるかく遠ざけられているため第三の条件は満九さない
。一方、ある場合には極端に短かい鎖長の架橋基は免疫
反応性及び多分触媒活性の損失をもたらすであろう。
本発明の一面に従うと、分析物及びポリペプチドラベル
は、分析物及びボIJ 、eブチトラベル分子の両者と
両立し得る反応性を有する官能基を含んでいるある種の
二官能性分子を使用することにより、−緒に結合できる
。多くのそのような二官能性分子が知られており、そし
て適当な例にはグルタルアルデヒド、ビスイソチオシア
ネート、ビスインシアネート、インチオシアナトーイン
シアネート、ハロビン−インシアネート及びインチオシ
アネート、トリメチルシリルで封鎖したヒドロキシイン
シアネートなどが含まれる。特に有用な二官能性分子は
、米!il!許4,064,151に示されている方法
に従って製造される6−インチオシアナトーカブロイル
クロライドであるL H,L Kr1chaldOrf
Ang@y、Ch@ll、 87.515 (1975
)も参照せよ)。この化合物の酸塩化物基はイソチオシ
アナト基よ抄反−’F4− 応性であり、そして好適には分析物分子上のアミン又は
ヒドロキシル官能基と反応する。生成したインチオシア
ナト誘導化された分析物類似体を次にポリペプチドの遊
離アンノ基と反応させてポリペプチドでラベル付けされ
九分析物を生成で惠る。
このようKして生成されたラベル付けされた分析−にお
いて、 Xは一〇−C(−o )−又は−MH−C(=o )−
であ抄、2は−(CH2)Is であり、そしてYは−
1[−C(8)−H)I−である。
ラベル付けされた分析物を生成するための他の一般的方
法は、分析物又はポリペプチドラベル上の残存官能基の
活性化及びその後の生成した生成物と他の成分との反応
を包括している。−例として、ポリペプチドラベル上の
カルボキシル基はゲンタマイシン分子上の官能基とより
反応性である誘導体に転化でき、そして生成した生成物
を次にゲンタマイシンと縮合させてラベル付けされた分
析物を生成できる。一方、シランチンにラベル付けする
九めには、シランチン分子に加えられているカルボキシ
ル基を誘導体化でき、そして生成した生成物を次にポリ
ペプチドラベルと反応させる。
誘導体化を実施するための適当な物質の例には、イソブ
チリルクロライド、N−ヒドロキシこはく酸イ2ド又は
水溶性カルボジイミドが包括される。
種々の分析物のラベル付は案を以下に示す。
鎮痙剤 シランチン、フエノバルビタール、プリミドン及びエト
サクシオドから々る鎮痙剤群用の好適なラベル付けされ
た分析物はバルビッール酸構造を反映しており、そして
以下に一般的に示されている如く6又は5員環内に環式
アミド又は環式ラクタム官能基を含んでいる: 分析物   R シランチン   −C(C’、H,)、−NH−C。
フエノバルビタール  →rHCo−C(Cabs )
 (Cabs )−CO−エトこけ〈酸イ2ド  −C
Hm−C(Cm’s ) (CHl )−co −プリ
2ドy     −c(c、p、’)(CsH,)−c
o−NH−cH,−特に、シランチン用の好適なラベル
付けされた分析物は下記のものである: 〔ここで、XはN−CH,であり、Yけ−C〇−間であ
り、そして2は(C島)、である〕。
ある種の免疫試験では、ラベル付けされた分析物中に遊
離NH−基を保有することが有利である。
そのような場合、シランチンの誘導体はラベル付けされ
九分析物として使用できる。従って、例えば、そのよう
なラベル付けされた分析物は、ア?7基をフェニル環に
それのニトロ化及び遺児によ一マフー り加え、6−インチオシアナトカブロイルクロライドと
反応させ、そして最後にシランチンインチオシアナト誘
導体をポリペプチドラベルの遊離アンノ基と反応させる
ことにより供給される。生成したラベル付けされた分析
物を以下に示す;この場合、Xは−NH−CO−であり
、Yけ−NH−C8−NH−であり、セして2け−(C
Hl )Fl−である。
チロキシン及びドリアイオドチロニン チロキシン用の好適外ラベル付けされた分析物を以下に
示す・ 1〜3 これは6−インチオシアナトカプロイルクロライ78− ドを使用することにより製造でき、そしてX、 Y及び
2はこの二官能性試薬を用いてラベル付けされたシラン
チン生成物に関して紀されている屯のと同じである。
チロキシンでラベル付けされた分析物は、ア2ノ基が例
えばトリフルオロアセチルの如き容易に除去される封鎖
基によや保護されているようなチロキシンを8−−eデ
チド又は他のポリペプチドラベルと縮合させることによ
っても直接得られる。
下記のチロキシンでラベル付けされた分析物が最終的に
得られる: 1〜S この場合、架橋基はなく、そしてX及びYは−Co−N
Hである。
トリアイオドチロニンでラベル付けされた分析物も同様
にして製造できる。
リドケイン リドケインの免疫試験用に適しているラベル付けされた
分析物は、p−アミノリドケインと6−インチオシアナ
トカプロイルクロライドの反応及びその後のIリベデチ
ドラベルとの反応から製造できる。生じた生成物の構造
を以下に示す:テオフイリン並びにそれの異性体である
カフェイン及びテ第11ンけ、それらの構造が似ている
ため並びに紅茶及びコーヒー中のカフェインの存在のた
めに、妨害問題が生じる。特定のテオフィリン抗体との
反応性を確実にするために、テオフィリンでラベル付け
されたポリペプチドは、5及び7位置が1換されていな
いようなテオフィリン中に存在しているメチル!換様式
を保有すべきである。テオフイリ/、カフェイン及びチ
オプロ電ンに対するの構造を以下に示す: 0           0           0
従って、テオフィリンに対する位fitlのメチル基の
ところにおけるIリイデチドラベルの結合は、適当カテ
オフイリンでラベル付けされたぼりイデチドを与えるは
ずである。これは位t5及び7における区別された未置
換窒素原子が、ラベル付けされた分析物中に保持される
という事実から生じる。この状況下で検定に使用される
抗体はノ・ブチ/のテオフィリン基が位#5及び7に未
置換窒素原子を保有しているインミュノジエンからも誘
導されるはずである。この構造を以下に示す:81− 同様に、3−メチル位置及び多分6位置におけるテオフ
ィリンの誘導体も上記と同じ理由のために使用できる。
アンフェタミン アン7エタ2ンでラベル付けされた分析物は例えば6−
インチオシアナトカプロイルクロライドの如き二官能性
カップリング剤の使甲により直接誘導できる。生成した
構造を以下に示す。
モルフイネ、ヘロイン及びコディンからなる群の麻酔剤
アルカロイドは以下に示されている如き関連構造を有す
る; 82− 適当なモルフイネ及びコディンでラベル付けされたポリ
ペプチドはモルフイネ又はコディンと二官能性試薬との
反応により供されるべきである。
例えば、モルフイネ又はコディンと6−インチオシアナ
トカプロイルクロライドの反応は、生じる遊離インチオ
シアナト官能性(よりIリペデチドラベルと結合可卵な
誘導体を与える。さらに、モルフイネ及びコディンの誘
導体はポリペプチドでラベル付けするための分析物類似
体として適当に使用できる。例えば、モルフイネ及びコ
ディンけp−アζ)安息香酸からのジアゾニウム塩と結
合でき、そして生成した生成物を次に4リペデチドラベ
ルと縮合させる。同様に、この方法はヘロインは遊離ヒ
ドロキシル基を有していないためにヘロイン用にも提案
される。
抗生物質アミノグルコシド 抗生物質であるアミノグルコシド、ゲンタマイシン、シ
ンマイシン及びトブラマイシンに717 、eデチドを
、二官能性試薬の使用によりラベル付けできる。ゲンタ
マイシン、シンマイシン及びドブ2マイシンは全て、例
えば6−インチオシアナトカプロイルクロライドの如き
二官能性試薬を用いてポリペプチドラベルと直接カップ
リングさせるための給金場所を与える多数の遊離ア2ノ
基を有している。ゲンタマイシンは、Iリイグチド上の
遊離カル−キシル基をN−ヒドロキシこけ〈酸イミド又
は水溶性カルがジイミドとの反応により活性化しそして
次にゲンタマイシンと縮合させてラベル付けされた分析
物を生成することによってもラベル付けされる。
心嘩薬グリコシド 心嘩薬グリコシドジゴキシン及びジジトギシン用のラベ
ル付けされた分析物は二官能性試薬の使用により製造で
きる。ジゴキシン及びジジトキシンの両者は多数の遊離
ヒドロキシル基を有し、それは二官能性試薬である6−
インチオシアナトカプロイルクロライドと反応すると、
インチオシアナト誘導体を与え、それはポリペプチドの
遊離アギノ基と反応してラベル付けされた分析物を生成
する。提唱される構造を以下に示す: コルチゾル ジゴキシン及びジジトキシンに関する王妃の方法管コル
チゾルにも同様に適用出来るべきである。
;ルチゾルの適当な構造を以下に示す:85− テストステロン ぼりペプチドでラベル付けされたテストステロンに提唱
される組成物はコルチゾル用に示されているのと同じ禦
の合成により得られる。この組成物を以下に示す。
一方、活性化された6−カルがキシメチルオキシム誘導
体はテストステロンをポリペプチドラベルにカップリン
グさせるために使用できる。
グログステロン グログステロンでラベル付けされた分析物は、Iリペデ
チドラベルを用いて、プロゲステロンの活性化され九6
−カル?キシメチルオキシム誘導体とポリペプチドとの
反応により供されて下肥の組成を与える; 86− CH。
1 C。
ラベル付けされた/ IJア電ノ酸分析物、例えばイン
シュリン、バラチロイドホルモン、チロイド刺激ホルモ
ン、黄体刺激ホルモン、アンジオテンシン■、成長ホル
モン、免疫グロブリン及び酵素、は数種の方法により供
される。
一方法は分析物のアミノ基をIリイデチドラベルと結合
させるための例えばグルタルアルデヒドの如き二官能性
剤の使用を包含している。生成する一般的構造を以下に
示す: 〔Iリアミノ酸分析物)−(N=cu−(cH,)、−
CN州〕。−PPl他の方法は例えばイソブチリルクロ
ライド又はドーヒドロキシこはく酸インド/カルlシイ
イドの如き試薬を用いる遊離カルがキシル基の活性化を
包括している。分析物又は、fす4デチドラペルのカル
フキシル基は活性化されそしてその後第二成分(すなわ
ちいずれも誘導化されていない分析物又はラベル)とカ
ップリング反応させる。二種の生成物の構造はこのよう
にして得られる:〔fす7?/II分析物1− c (
=o ) −m−(pp□1゜〔fす7 t /酸分折
物”!。−N)T−C’(=O)−rPP、1後者の構
造は、特K例えば活性化出来る3個だけのア2ノ基があ
るような8−−4デチドの如き比較的小さいIリベプチ
ドラベルを用いると、ラベル化された分析物の性質のよ
り多くの調節を行なうべきである。
第三の方法はマレイミド基を有する二官能性基を用いる
Iリベデチドラベルの改変を包含している。これらの基
は次K / IJア電ノ酸分析物のSH基と反応するこ
とができる。下肥の型の組成物がこのようにして得られ
る: 基質 前記の如く基質は / Q 、eデチド対又はより正確
にはラベル付けされた分析物複合体により作用を受ける
ため、その後必然的に基質の実際の性質け/ +7ベデ
チド対の触媒性質に依存する。機能的には、基質は発色
団及び/又は螢光発生量生成物を4リベデチド対で誘導
される触媒放出を受け、該生成物は対応する分光光度計
又は螢光計により特に検出できる。さらに、基質からの
生成物(すなわちしI−ター分子)への触媒による転化
が例えば1時間以下の如き比較的短時間にわたって生成
物の出現を運動論的に監視できるほど充分急速であるこ
とが望ましい。これには一般に、発色団基質は10”−
より大きい濃度で存在している分析物用に使用され、一
方螢光発生基質は10− ’M以下の分析物濃度に利用
することが望ましい。
89− レポーター分子の出現速度が、測定期間にわたる時間の
線状もしくははソ線状の函数であることが望ましい。基
質が容易に製造で無ること及び緩衝液媒体中又は凍結乾
燥形で最低1週間、そして好適には少なくとも3ケ月間
にわたって貯賊できるのに充分な安定性を有することも
さらに望ましいO 試験では、基質製電は試験工程中に基質の枯渇が生じな
いほど充分高くなければならない。換言すると、基質の
転換速度は試験期間中に基質Stと独立してなければな
らない。一般に、10”’ M〜10−2Mの間の基質
の濃度が認容で舞るはずである。
好適なヂリイグチド対と共に用いるためには、リボヌク
レアーゼAKよりし4−ター分子へ酵素的に転化される
基質を使用することが好適である。
酵素ブドウ球菌ヌクレアーゼから誘導されるポリIfチ
ド対には、適当な基質は天然酵素によりし?−ター分子
に転化されるものである。例えば、デオキシチ建ジン5
′−9ん酸のバラニトロフェニルエステル誘導体を利用
できる。p、 Cuatrecasas、90− M Wilchek  及びC,B、 Anfinse
n 、  ” The Actionof 8taph
ylocral Nucleasa on Elynt
hetic 8ubst−ratss ” 、  8y
nthstic 5ubstrate of 8tap
hyloccasNuelaase 、  8巻、Nn
6,2277−83頁、1969年6月。!−ガラクト
シドに関するIリペプチド対用には、適当な基質は商業
的に入手できる0−ニトロフェニルβ−ガラクトシドで
ある。
しかしながら、S−ペプチド及びS−蛋白質ヂリイデチ
ド用には、基質として一般的に好適な構造は以下の如く
である。
S′    OH R”0−P=0 R 〔大中二Bはヌクレオチドペース、例えばビリ建ジン類
似体、例えばウラシルであり、それは31位置における
りん酸エステルの触媒もしくは酵素による加水分解を助
けることができる〕。
Rはランベリフェロニル、4−メチルランヘリ7 x 
o 二k 、 3−7 ラホニル、0−ニトロフェニル
、m−ニトロフェニル、p−ニトロフェニル、ジニトロ
フェニル、シアノフェニル、アシルフェニル、カルボキ
シフェニル、フヱニルスルホネート、フェニルスルホニ
ル及ヒフェニルスルホキシドからなる群から選択される
部分であり、R′は水素、アルキル、アルケニル、シク
ロアルキル、アリール、アラアルキル、アシル、オキサ
アルキル、チオアルキル、オキサシクロアルキル及びチ
オシフ胃アルキルからなる群から選択された成分であ抄
、 rは水素又はカルシウム、バリウム、リチウム、ナトリ
ウム、゛アンモニウム、置換されたアンモニウム及び♂
リジエウムからなる群から選択されたカチオンである。
一般に、好適な基質の製造方法は数種ある。一方法は中
間生成物としての2′−0−テトラヒドロピラニル−5
/−Q−アセチル−ウリシリン酸の合成を包括しており
、それを次に遊離アルコール性螢光団又は発色団と縮合
させ、一方第二の方法はt−ブチルジメチルクリル封鎖
基の使用を包含してお沙、そしてウリジンを直接シリル
化して2/、5/−封鎖され走ウリジンを生成すること
に基いている。好適な基質及びそれらの製造方法は、こ
れと同一日付で出願されたすでに確認された共に出願中
の出願においてよ秒完全に記されている。
ま免、適当な基質はさらに、Rがナフチルである上記の
構造からなっている。この場合、基質の触媒による加水
分解で得られる遊離ナフチルはジアゾニウム塩との反応
により検出され、核塩はスルファニル酸から誘導される
。最終的生成物は500ナノメートルにおける可視範囲
内の強い吸収を有するアゾ染料である。この基質はチロ
キシンの比色計試験用に有用であることが見出されてい
る。
グリンベース、例えばアデノシン及びグアニジン、は(
上記の構造においてぎりンジンベース用に置換されてい
るときには)リボヌクレアーゼ八93− 又は関連がリペグチド対の触媒活性を監視する丸めに適
当な基質を与えないであろうが、グリンペースを含有し
ている基質は、他のIリペデチド対の使用時には有用で
あるべきである。例えば、後者は微生物で誘導されたり
ボヌクレアーゼT3の活性を監視するためKは有用であ
ろうし、T1はグリンベース又けTIから誘導されたI
リ−(プチド・f −トナーに対する活性を有する。
他のIリイプチド対によ抄供される特定の触媒活性のた
めに有用である基質は周知である。1らに、現存の文献
の鑑み、特定の/ +7 、eプチド対により発現され
る酵素活性に対する適当な基質が設計される。
ここに記載の好適な基質はある壇の環境下では媒体誘導
加水分解をうけ得るものであり、そしてこれは基質のし
I−ター分子への望ましくないバックグラウンドとして
の変換を与える。この媒体誘導加水分解戻応はある基質
中では高いpHすなわち約8以上では急速に起きるが、
それよ抄低いpHでは非常にゆっくりしか起きない。こ
れらの−94= 基質の長期貯蔵(すなわち1日以上)をしようとすると
きには、このことは関心事となる。低いpH及び比較的
低い温fKおける貯蔵は加水分解を最少とするであろう
しかしながら、2′置換基を容易に除去できる封鎖基で
誘導するととKより媒体誘導加水分解が本質的に防がれ
るということが見出された。従って、長期貯蔵をしよう
とするときの、好適な組成は下記の式 〔式中、fは封鎖基であり、そして R,R’、!及びBは基質に関する前記の式に関連して
配されているのと同じ部分である〕により表わされる。
95− 適当な1−封鎖基は下記の基準に合致しなければならな
い;(1)他の重要な官能基に影響を与えることなく容
易に加えられ、(2)その後の合成段階と適合性がib
#)、そしてより特定すると該段階における望ましくな
い副反応を最少にするかもしくけ無しにすべきであり、
(3)悪い有害な影響を与えずに長期貯蔵できるほど充
分に安定であり、そして(4)ホスホジエステル暗合を
分裂させずに容易に除去される。これらの基準、特に@
Sのもの、け酸触媒反応によ妙加えられそして除去で負
る封鎖基の使用によ抄最も容易に満たされる。
従って、適当な封鎖基ビはシリル、オキサアルキル、チ
オアルキル、オキサシクロアルキル及びチオアルキルが
含まれる。より特定すると、テトラヒドロピラニル、4
−メトキシテトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル
、t−プチルジメトシリル、が使用できる。最初の3個
の週蔽基、すなわちテトラヒドロピラニル、4−メトキ
シテトラヒドロピラニル及び1−エトキシエチル、を使
用するとケタール構造を与える。これらの封鎖基96− は、弱酸、例えば希塩酸もしくは希酢酸、により、基質
分子中の他の重要な官能基を分裂させることなく、容易
に除去される。同様に、シリル封鎖基は例えばテトラブ
チルアンモニウムフルオライドの如き試薬により容易に
除去される。
′R#封鎖基は基質自身の合成工程中にフラノサイド環
の2′位置に挿入できる。しかしながら、満足のいく長
期貯蔵特性用に必須であるとけ信じられていないが、5
′−位置における封鎖は介幌中に必要である。合曖中の
2′−及び5′−位置における封鎖はこのようにして合
成中間生峻物の早すゲる加水分堺並びにグー及び5′−
位置における望ましくない反応の発生を防ぐ。5′−ヤ
シの封鎖基は基質の使用前に除去する必要はなく、その
ため2′−位置の封鎖の場合のように容易に除去できる
ことという条件は存在しない。
他  の  成  分 試験の実施においては、種々の理由のために他の成分を
加えることが有用である。多くのそのような添加物が知
られている。これらの中で下記の97− ものが挙げられる:試薬の貯蔵性を改良するための静菌
剤;例えば免疫反応性を改良するためもしくは触媒活性
を変化させるための緩衝液:免疫反応性を強化するため
の例えばNaclの如きイオン性強化剤;例えば内因性
の酵素活性を減じるか又は除去するための阻害剤の如き
試薬;触媒活性強化剤、及び内因性蛋白質用の封鎖剤。
今!での免疫試験方法で使用されている数種の添加物を
希望によ抄本発明と共に使用することもできる。しかし
ながら、そのような追加成分が本発明に従う検定を実施
するためKことで示されて匹る基準に悪彰響を与えない
点を確聴するために注量を払うべきである。例えば、い
くらか阻害も同様に生じるので使用される/ジペプチド
対がRNass活性を示すような抄ん酸緩衝液を使用す
ることは普通は望ましくない。
ある場合又は全ての場合には、使用する試薬を精製する
ことが有用であり、そして実際に必要である。例えば、
内因性酵素活性を除くための、例98− えば8−蛋白質の如き市阪級/ 17 、e fチドパ
ートナーPPIBの精製が一般に必要である。ベグチド
ラ□ベルPP、の精製は実施できるが、単に生成したラ
ベル付けされた分析物を精製することが一般に満足であ
る。精製技術は良く知られてお怜、そしてクロマトグラ
フィ技術が適している。基質も精製できるが、ここに記
されている好適な基質ではこれは必要ないことが見出さ
れでいる。
改喪された貯蔵条件が必要から、試験試薬の一部の凍結
乾燥化が必要である。適当な技術は聞知である。
本発明に従う検定を室温条件下で行なうことが一般Ki
tましい。しかしながら、反応平衡に工、K2及びちの
強化又は遅延は、製電を変化させると生じる。これは、
本発明の方法用に融通性を付与するためには考慮にいれ
られるであろう他のAラメ−ターである。
試験に対するpHの効果も同様に考慮すべきである。I
’l工ば、チロキシンの試験では、pHが5から約7に
高まるにつれて免疫反応性が減じられることが見出され
ている。ここに記されているりん酸ナフチル基質は5の
pHにおいて適当に便用できるが、好適なウンベリフェ
ロン型基質は、比色計方式での有用な操作用には、約6
〜約8の範囲内のpHを必要とする。pT(K関する感
変は、分析物分子により塩基性の大きい基を加えながら
、ラベル付けされた分析物の負荷特性を変化させること
により多分克服できるであろう。またチロキシン用のさ
らに強い抗血清の使用は助けとなるはずである。
結合化学性(例えば結合基の場所、型)を改変すること
も助けとなる。
主な試薬(すなわち抗体、基質、ラベル付けされた分析
物及びぼり−4fチドΔ−トナー)は、例えば特定の分
析物用の予期される製電範囲を模するか又は包括する一
連の標準的分析物溶液の如き必要なもしくは望!しい追
加成分と一緒になって特定の試験用のキットの形に典型
的に包装されるであろう。さらに、そして使用する特定
の基質の条件によや、下記のものが包含される:(1)
封鎖形で輸送するために包装する場合には基質用の封鎖
解除試薬、(2Lj!した試薬の希釈用又はpH調節用
の緩衝液、及び(3)必要なら、染料生成剤(例えばと
こく記されているシん酸ナフチル基質を使用するならジ
アゾニウム塩)。さらに、例えば内因性の分析物結合用
蛋白質の如き可能な干渉を最少北本しくは除去するため
に必要なら、予備処理溶液が供される。
種々の成分を、安定性、輸送及び他の条件により、溶液
又は凍結乾燥形でキット中に包装できる。
各成分又は試薬を別個に包装できる。一方、(1)試験
の正確性が相当悪影響されず(例えばラベル付けされた
分析物及び/ vAブチトノ臂−トナーを触媒活性種の
早過ぎる生成をもたらすであろうll壇下で一緒にする
ときKは生じるであろう)、そして(2)成分がなんら
かの方法で分解されない(例えば過変の媒体誘導加水分
解による基質の転化)限9.2種以上の成分を1個の包
装物中で一緒にすることができる。
一緒にする包装の一形式は、ラベル付けされた分析物及
び基質を一緒に包装しそして抗体及び4101− リペデチドパートナーを第二の包装物中で一緒にするこ
とを包含しているう典型的にはウンベリフェロン型の好
適な基質を使用するときの如く、この方式における基質
は過度の媒体誘導加水分解を防止するための適当に緩衝
された封鎖解除形であること本できる。6以下のpT’
(を使用すべきであり、約5の値が満足のいく−のであ
る。比色計検出方式用には、試験で6以上のpHを与え
るために適する緩衝液の別個の包装物がこの場合必要で
ある。
別の−@にする包装方式は、ラベル付けされた分析物及
び基質を別個に包装しながら抗体及びIリペデチドパー
トナーを一緒にすることを包含している。これは、前記
の急速分析器中で使用できるよう案に融通性を与えるた
め又は基質を封鎖形で包装するととくより基質の媒体誘
導加水分解を最少化するために有用である。後者の場合
、別個に包装され九封鎖解除剤が必要であろう。また、
適当な試験pHを与える丸めの緩衝液包装物も必要であ
る。
他の一緒にする包装様式は、抗体及び基質を一102− 緒にすることを包含している。ラベル付けされた分析物
及びポリペグチトノ量−トナーは、他の追加成分もそう
であるように別個に包装される。
種々の成分をキット中に別個に包装するか又はある様式
で一緒にするかどうかにかかわらず、ここKEされてい
る補助成分(例えば靜薗剤)を適当な成分包装物に加え
ることができる。
ここで記されている技術の評論は均質免疫試験用の方法
の提供時に向けられているが、A −PPI/ PPm
免疫試験ラベル系用に不均質方式も使用できることに注
目すべきである。これは融通性、製造の容易さ、安定性
及び例えばB−−eプチドから誘導されたものの如きA
 −PPiでラベル付けされた分析物の検出能力のため
に現在の不均質酵素免疫試験と比べて有利である。さら
に、不均質方式が均質方式より好適であるなら特別な状
況が生じるかもしれない。例えば、不均質方式は例えば
内因性酵素活性の如き血清に基〈妨害を除くために他の
選択を行なうこともできる。また、不均質免疫試験用に
独自の自動化装置を利用でき、そしてAPP>/PPm
免疫試験ラベル系はその系のより完全な有用性の表現を
可能にできる。
不均質免疫試験集は下記の段階を包含している=(1)
適当な緩衝液媒体中での分析物、/ IJベゾチドでラ
ベル付けされた分析物及び抗−分析物抗血清の培養; (2)  抗体結合された及び遊離状の/ IJ 、e
プチドでラベル付けされた分析物の物理的分離;及び(
3)対応するPP2及び基質を加えそして基質からのし
f−ター分子への転化を測定することくよる、抗体結合
されたラベル付けされた分析物及びl又は遊離状のラベ
ル付けされた分析物の測定。
段階(2)は、分析物抗体に対する固相第二抗体の使用
、例えば/ 1.1エチレングリコールの如き試薬を用
いてのAt)”A −PP、複合体の沈殿、又はおそら
くクロマトグラフィによ抄、容易に達成される。
遊離状A −PP工部分の測定は均質方式で実施される
が、結合された部分の測定は固相抗体複合体からのラベ
ル付けされた分析物のストリッピングを必要とする(な
ぜならA −PPxは通常結合されているときには触媒
活性を回復しないからである)。
これは過剰のPP2の添加により又は尿素の如き他の試
薬の使用により達成され、それらは抗体複合体の解離用
に普通使用されている。一方、A−PPよけ、抗体を複
合体化することにより、抑制されないように計画できる
。これは実際にppエラベルを抗体との分析物の複合体
化の影響から絶縁するような非常に大角い2基を用いる
ことにより行なわれる。比色計及び螢光計検出方式の両
者が、均質免々試験を用いるときの如く、可能である。
下肥のlI施例は本発明を単に説明するだめのものであ
抄、そしてそれの範囲を限定しようとするものではない
。簡単に云うと、実施例■〜■は一般にチロキシン、8
−(デチドでラベル付けされた分析物の製造及び特性決
定に関している。実施例vN■バ一般に5,5−ジフヱ
ニルヒダントイン−(シランチン) −9−−eプチド
でラベル付けされた分析物の製造及び特性決定に関して
いる。実施例■〜Xはコル−ゾル−8−イグチドでラベ
ル付けされた分析物の製造及び特性決定に関してい10
5− る。実施例■はS−蛋白質の存在下でのチロ上フン−3
−−tデチドでラベル付けされた分析物の触媒活性を説
明する。実施例xn〜xvrは抗体の存在により生じる
触媒回復の抑制を説明する。実施例X■〜XXは一般に
、標準的又は参照用曲線の製造に関している。実施例X
XIは対照用及び1宋用試料の免俊試険に関している。
実施例Xmは不均質方式免疫試駆に関している。断わら
ない限り製電は摂氏1賓である。
実施例では、下記の略語が使用されている。
a、u、=吸収単位 9=ダラム d=ヤリリットル 岬=ミリグラム m moles =xミリモル ul−マイクロリットル minコ分 nm−ナノメートル チツノ々−セント M=モル −:1oe− 函=センチメートル n&−ナノアン! maエイリアンプ m劃、U、=ンり吸収単位 ?、 一温度 人BB、=吸光変 N=規定 ng−ナノグラム MV=ンリボルト μ!=マイクログラム TIC=薄聯りロマトグラフィー u、V、=x紫外線 i 、 r 、=赤外線 n、m、r、=核磁気共鳴 実施例! この実施例は、ラベル付けされた分析物の製造において
結合基として使用するための二官能性試薬である6−イ
ンチオシアナトカブロイルクロライドの製造を説明する
二官能性化合物は二官能性インシアネートが得られてい
る米国特許4,130,526中に示されている方法と
同様な方法に従って製造され九。下記の反応が使われた
: (CH3)a81(N((GIm )6C<181(%
 )s→許)N(CHs )aC−O8i(CH3)s
へ オーブン乾燥されそして9素冷却された2を丸底フラス
コは窒素入口、圧力均等化滴下ろうと及び機械的スタラ
ーが備えられていた。500−のテトラヒドロフラン(
9724人分子ふるい土で乾燥)中の6−アンノカプロ
ン酸(66,02F、0.5モル)の混合物をフラスコ
に加え九。混合物を窒素下で9分間攪拌した後に、24
0mのトリエチルアミン(1,7モル、9724人分子
ふるい上で乾燥)を攪拌しながら加えた。蜀分間攪拌し
た後に、315dの二硫化炭素(0,6モル)を6分間
にわたって滴々添加した。反応混合物を一夜攪拌し、そ
して250dのテトラヒドロ7ランで希釈した6次に2
25dのトリメチルシリルクロライドを2.5時間にわ
たって滴々添加した。白色沈殿が生成した。反応混合物
を7時間にわたって攪拌しながら静かK”ll流させた
。冷却後に、反応混合物を空気の不存在下で濾過した。
沈殿を乾燥テトラヒドロフランで洗浄し、そして赤金色
のP液を集めた。このテトラヒト四フラン溶液を真空中
で室温において濃縮して、溶媒を除去した。残漬を50
0 d丸底フラスコ中にいれ、そして250 dの塩化
メチレン中に溶解させた。塩化チオニル(70d>を攪
拌しながらI分間にわたって加えた。−夜攪拌した後に
、溶媒を回転蒸発器上で除去して粗生成物を与えた。
これを110〜11!5″(0,2)ル)において2回
蒸留して、317Fの6−インチオシアナトカブロイル
クロライドを与え、それは4.6〜4.8u(N=C−
8)xoe− 及び5.5u (C0Cj )における赤外吸収帯、並
びに構造的に一散する面積比で3.4.2.8及び1.
5ppmKおけるn、m、r、共鳴(CDCJ3溶媒)
を有していた。
実施例■ この実施例は、例えばS−ベグチドの如きポリペグチト
ラベルに対するカップリング用に適しているチロキシン
の誘導体を生成するための6−インチオシアナトカブロ
イルクロライドとチロキシンの反応を説明する。
1ミリモル、すなわち77611q、のチロキシンを1
0TILlの塩化メチレン中に懸濁させた。これに0.
5−のピリジンを加え、そして混合物を水浴中で冷却し
た。攪拌されている混合物を次K O,2lE/の6−
インチオシアナトカグロン酸クりライドと一緒にし、そ
して攪拌を一夜続けた。溶媒の約半分反び他の揮発物質
を回転蒸発器中で除去し、そして残漬を最少量のテトラ
ヒドロフラン(THF )中に溶解さ、せた。THF混
合物を分離ろうと中に移した。
混合物を水で2II抽出することにより無機塩及び未反
応物質を除去した。有機−を無水Na、SO,上で11
0− 乾燥し九。溶媒を蒸発器上で除去すると、生成物である
)f−(6−インチオシアナトカプロイル)チロキシy
から々る残清か残り、それは薄1−クロマトグラフィ及
び元素分析により同定された。
実施例■ この実施例は、実施例■のN−(6−インチオシアナト
カプロイル)チロキシンと8−−4デチドの反応によ妙
生成される8−ペプチドでラベル付けされたチロキシン
の製造を説明する。
2.94岬、す々わち1.36 X 10−99モル、
の布板の8−ペプチド(Sigma Lot + 99
0−8055 )を1.5−のpH9の0.2Mはう酸
塩緩衝液中に溶解させ、そして溶液を1!温で領分間攪
拌した。この溶液に、IQOulのジメチルホルムアミ
ド中の2.o9η(9,6X10−リリモル)のN−(
6−インチオシアナトカプロイル)チロキシンを加えた
。さらに50ulのジメチルホルムアfドを加え・友。
混合物を一夜攪拌し友。
チロキシン−8−ペプチド誘導体R,5’−0−アセチ
ルウリジン3’−(4−メチルウンベリフェロン−γ−
イルホスフェート)基質を用いて試験したときに触媒活
性及び免疫反応性の両者を示すことが見出されたが、そ
れはさらに以下の実施例■に従って精製され九。
実施例■ この実施例は、実施例■で製造されたS−ペプチドでラ
ベル付けされたチロキシンの精整を説明する。
セファデックスG−25F’カラム(IX’)”4m)
を製造しそして0.02%ナトリウムアジドを含有して
いる約T)H9,5の0.05Mはう酸塩緩衝液で平衡
化した。実施例■からの反応生成物の一部分(0,5,
d)をカラムに遠用した。緩衝液を1直//分の流速で
溶離し、セして1dフラクシランを集めた。フラクシヲ
ン14〜25は324nm Kおけるチロキシンによる
吸収に基く望ましい接合体、実施例道に示されている如
き8−*白質及び基質の存在下でのM媒活性、及びl!
施例11に示されている如き免疫反応   ・性(チロ
キシン抗体の存在下での抑制)を有することが見出され
た。
実施例V〜■は5,5−ジフェニルヒダントイン(シラ
ンチン)8−ペプチドでラベル付けされた分析物の製造
に関している。実施例中に配されている合成では、シラ
ンチンは改変されて、N−ヒト四キシこはく酸イ建ドで
誘導された縮合によね8−ペプチドにカップリング可能
となる。
実施例V この実施例は、8−−4デチドとカップリングすル、5
.5−ジフェニルヒダントイン3− (5−4草酸)、
C,Cook 、 J、A、 Kepler 、 H,
Dix Chri−stiangen%Ras、 Co
mm、 Chem、 Path、 Pharma、5.
767 (1973’)、の製造を説明する。
ナトリウム5.5−ジフェニルヒダントイン(81gm
aLot # 64C−0027、1,65N 、6.
01 Xl0−3モル)を、乾燥ジメチルホルムア2ド
(3oIILl)を有する100dの丸底フラスコに加
えた。混合物を攪拌しながら60mに加熱し、そしテ1
.20 Ji’ (6,15xlo−’−v−ル) ノ
5−ブロモ吉草酸メチルを加えた。反応混合物を3時間
にわたって攪拌しながら(イ)℃に保った。それを次に
450 dの30チ飽和硫酸アンモニウム中に113− 注いだ。5@に一夜攪拌した後にゴム状沈瞬が生成した
。上澄み液を一過し、そして残漬を5 mlの冷メタノ
ールですり砕い友。粗生成物を一過し、そして熱いメタ
ノールから再結晶化させた。合計収量1,41 g(6
44)の生成物である5、5−ジフェニルとダントイン
3−(5−吉軍酸メチルエステル)を得た。
0.8911 (2,43ギリモル)の5,5−ジフェ
ニルヒダントイン3−(5−吉軍W1)メチルエステル
を104ジオキサy / H,O中の0.5Nt!!酸
50+t/ノ中で3時間速流した。反応混合物を冷却し
、そしてダにおいて一夜貯蔵した。粗製結晶性生成物を
一過によ抄集め、そして酢酸エチル/ヘキサンから再結
晶化させた。合計収量0.639(744)の生成物で
ある5、5ジ7ヱニルヒダントイン3−(5−吉軍酸)
が得られ、それは150〜15τの軸点(文献融点16
1〜163)を有していた。生成物を再び再結晶化させ
て、152〜153°の融点を有する精製された物質を
与えた。
実施例■ 114− この実施例は5,5−ジフェニル−ヒダントイン−B−
−<グチドでラベル付けされた分析物の製造で使用され
た5、5−ジフェニルヒダントイン3−(5−吉草酸N
−ヒドロキシサクシンインジルエステル)の製造を説明
する。
21.36岬、すなわち5.8 x 10−”?リモル
、の実施例■の5.5−ジフェニルヒダントイン3−(
5−青草酸)を0.66dの乾燥テトラヒドロフラン中
で8 ”F (7,Ox 104aリモル)のN−ヒド
ロキシこけく酸イミド及び15119のジシクロへキシ
ルカルボシイミドと一緒にした。混合物を一夜放電した
。反応混合物を10dの酢酸エチルで希釈し、そしてr
逼して、ジシクロヘキシル尿素を分離し念。溶液を0.
5tjの0.5M炭酸水素ナトリウムで2回、0.5−
の水で1回、そして0.5−の麹和塩化ナトリウムで1
回洗浄した。溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、
そして回転蒸発器上で濃縮した。緒晶性残漬を塩化メチ
レン/ヘキサンから再結晶化させて、16111Fの生
成物を与えた。
実施例■ この実施例は実施例■で得られ九反応生成物かう17)
 5.5−ジフェニルヒダントイン(シラフチ/)8−
ペプチドでラベル付けされた分析物の製造を説明する。
商業的に得られたS−ペプチド(Sigma Lot 
#99C−8055,0,85”P、  3.9 x 
10−’ミリモル)を0.25dの乾燥ジメチルホルム
アミド中に溶解させた。
F3−−efチドジメチルホルムアミド溶液に、0.1
0dの乾燥ジメチルホルムアミド中の0.92q、すな
わち20 X 1n−’ミリモルの5,5−ジフヱニル
ヒダント4 :/3−(5−VIE酸) N−ヒドロキ
シサクシンイ2ジルエステルを加え、その後40ulの
乾燥ジメチルホルムアミド中の0.1811ipのN−
メチルモルホリンを添加した。この反応混合物を室温で
1週間攪拌し、そして次に5°において貯蔵した。
シランチン5−−eプチドでラベル付けされた分析物は
、5′−〇−アセチルウリジンー3’−(4−lfルウ
ンペリフヱロン−7−イルホスフェート)基質を用いて
試験するときには、触媒活性及び免疫反応性の両者を示
すことが見出されたが、それをさらに以下の実施例糧に
従って精製した。
実施例■ この実施例は実施例■で得られた5、5−ジフェニルヒ
ダントイン(シランチン)S−ペプチドでラベル付けさ
れた分析物の精製を説明する。
シランチンS−ペプチドでラベル付けされた分析物をセ
ファデックスG−15カラム上のクロマトグラフィによ
り精製した。セファデックスG−15(20g)を0.
14ナトリウムアジドを含有している150−の0.0
5MのpH約8のトリエタノールアミン緩衝液中で再び
水和させ、そしてlX4Lff!のカラム中に注いだ。
カラムを緩衝液で平衡化させ、そして100ulの前記
の如くして製造されたラベル付けされた分析物をカラム
上で小部分の緩衝液で洗浄した。フラクション(1−)
を集め、そして触媒的及び免疫反応性に関して監視した
。200ul部分の希釈したフラツタ97を200ul
の酢酸ナトリウム緩衝液又はシランチン抗体、1900
ulの封鎖されていない基質である5′−〇−アセチル
ウリジン3’−(4メチルウンベリフヱロンー7−イル
ホ11アー スフエート)及び200ulのS−蛋白質溶液と一緒に
した。
螢光の増加速度を325nmに設定され九励起及び44
0nmにおける放射を有する商業的に人手で舞るFar
rand Mark 1 螢光針を用いて監視した。指
されている7ラクシヨンに対して下記の結果が得られた
: =118− 表   1 14 0.5 − − 15 17.5 9 48,6 16 26.0 8 69.0 17 36.0 6 83.0 18 14.5 3.5 78.0 19 15.0 2.5 83.0 20 11.0 1.5 86.0 21 8.5 1.5 82.0 22 8.0 1.0 87,0 234.5 − − 24 4.5 − − 25 4.5 − − 26 6.0 1 83.0 2B  4.0 − − 35 1.5 − − 63 1.5 − − フラクション15〜19及び2o−5を別個に貯蔵した
。貯蔵された7ラクシヨン15〜19を次に実施例XV
、X■及び届に記されている免疫試験で使用した。
実施例■ この実施例はコルチゾルB−−eグチドでラベル付けさ
れた分析物の製造で使用された2】−コルチゾルー(6
−イツチオシアナトカプロエート)の製造を説明する。
トリエチルア建ン(0,2d)を注射器を用いて0.3
621のコルチゾルの2dのN、N−ジメチルホルムア
建ド中溶液に加えた。混合物を大気水分を除いたフラス
コ中で攪拌し、そして氷水冷却浴中に浸した。混合物に
0.22911の6−イツチオシアナト酸クロライドを
3分間にわたって嫡々添加した。反応をシリカゲル薄層
クロマトグラフィにより溶離溶媒として酢酸エチル中の
101メタノールを用いて監視した。生成物は0.7の
Rf値を有し、それに比べてコルチゾル自身は0.5の
Rf値を示し   □た。3時間の反応後に、TLCは
少量のコルチゾルを示すか又は食〈示さなかった。混合
物を次に箪のメタノールで処塩し、そして蒸発乾固した
。残漬をメタノール/エーテルから2回結晶化させて、
21119の白色の針状物(融点105〜108)を与
えた。構造と一致した赤外線及びn、m、r、データが
得られた。
実施例X この実施例は実施例■で得られた反応生成物からのコル
−ゾル−8−ペプチドでラベル付けされた分析物の製造
を説明する。
0.3519の8−イデチドを0.3−のpT(9,8
の0.2M#′l!う酸ナトリウム緩衝液中に溶鱗させ
た。攪拌されている溶液に、0.02g/のジオギサン
中の0.5岬の4−コルチゾル−(6−イツチオシアナ
トカグロエート)を加えた。さらに0.075 dのジ
オキサンを加えて、反応混合物を均質とした。室温にお
いて4日間攪拌した後に、混合物を1.OX50mの奄
ファデックスG−10カラムを通して、0.05Mトリ
エタノ−ルアオン−HCl緩衝液、pH8,0,1% 
NaCjで溶離して、精製した。2.45mの72クシ
W/を集めた。溶離剤をu、v、検出器を用いて監視1
21− し丸。
主要なバンドはフラクション7.8及び9に溶離し丸。
実施例糟で使用された方法による、S−蛋白質及びクン
ベリフエロン基質(グー0−アセチルウリジン−3’−
(4−メチルウ/ベリ7エaン−7−イルホスフヱート
)の存在下における触媒活性の試験は、これらの7ラク
シヨンが約97優の溶離され九S−ペプチド活性を有し
ていたことを示した。
これらのフラクションの触媒活性はコルチゾル抗血清の
存在下では5〜80チ抑制された。ラベル付けされた分
析物の紫外線スイクトルは240nmにおけゐ特性コル
チゾル吸収を有し、そしてこれ及びコルチゾル自身の吸
収ヱプシロン(11,998)からラベル付けされた分
析物の濃度は7 X 10−’Mと推定された。
実施例■ この実施例は実施例■で製造されたチロキシン−8−−
4fチドで2ベル付けされた分析物の、S−蛋向質の存
在下での、触媒活性を説明し、そし122− てラベル付けされ九分析物の濃度に対する触媒活性の相
互関係を示す。
チロキシン−8−ペゾチドでラベル付けされた分析物の
回収された触媒活性をそれの濃度の関数として、8−蛋
白質の存在下で監視するためにユニオン・カーバイド・
コー?レーション、モデル500 CentrifiC
hsm R分析器を使用した。ウリジン−3′−α−ナ
フチルホスフェート/p−ジアゾスルファニル酸を、触
媒活性を管視するための基質/染料組み合わせ物として
使用した。下肥の試薬を製造しft、: a、緩衝液: 0.I M酢酸ナトリウム(pHs、o
)b、  s−蛋白質:酢酸ナトリウム緩衝液中1.5
×10−’M C9基質:10,7dの酢酸ナトリウム緩衝液中の16
19の新たに封鎖除去されたウリジン+ 3/ −(α
−ナフチルホスフェート)、d、染料:1,0+jの0
.1 N HCI 1Lot #031814中の51
119のジアゾ−p−スルファニル酸の1,5−ナフタ
レンジスルホン酸安定化塩、 e、チロキシン−8−イデチドでラベル付けされ九分析
物:実施例■で製造されたクロマトグラフィ貯蔵フラク
ション14〜25精製されたラベル付けされた分析物の
、酢酸 ナトリウム緩衝液中の、1:40希釈、t & b チ
t、o X 10−’M、[1゜Centrifi C
hew R分析器は下肥の調整値を有していた:ロータ
一温度、r;フィルター、52Qnm ;試験方式、T
ERM;プリントアウト、ABS ; ABS 11、
Ou;ブランク、8口1d;濃変因子、0;テストコー
ド、0;T、1分。
5.55sE/の酢酸ナトリウム緩衝液、840ulの
基質、70u1の染料、及び140ulの8−蛋白質か
らなる混合物を製造し、そして400ul部分の混合物
をCeCen−1rifiChe分析器の転移ディスク
のみぞ3〜12の試薬井戸中にピペットで加えた。それ
ぞれ5ul〜40u1の種々の量のチロキシ/8−4プ
チド溶液を転移ディスクの対応する試料井戸中にピペッ
トで加え、各井戸中の全量を酢酸す) IJウム緩衝液
で40ulとした。装填したディスクをローター上に置
き回転させた。各みすに対して1分間隔で吸光度の読み
をプリントアウトし九。これらを最少2乗法線状回帰分
析により、ナフトール及び染料試薬との反応から誘導さ
れた発色団生成物の生成速IIK転化した。データを下
fl!2に示す。一般に、側々の速度側室に対して相関
係数は0.995より大負かった。
表   2 u1チロキシン8−Wチド  吸収業位の速11 (P
X、u)、毎分5         0.0086. 
0.008010         0.0184.0
.018420         0.0429. 0
.047430         0.0697.0.
072140         0.0923,0.0
949チロキシン−8−イプチドの濃度は下式による発
色団生成物の生成速度と直線的関係であった2速[(a
、u、 /win、 ) = 0.00245 (ul
チロキシン−8−ベグチド) −0,0048! 125− 0.9995の相関係数。
これらのデータは、基質の触媒による転化がラベル付け
された分析物の濃度に直接関係していること及びこの方
法の速度は遠心急速分析器中で、測定期間にわたる吸光
廖及び時間の間の線状関係に従って簡便にしかも正確に
測定できる。
実施何重〜■は、S蛋白質の存在下でのラベル付けされ
た分析物の触媒活性の回復に関する分析物に対する抗体
の抑制効果を示している。言eされているように、螢光
及び比色試験の両者が使用される。
実施例璽 この実施例は螢光試験を用いての、チロキシン抗体によ
るチロキシン8−−C7”チドの触媒活性の回復抑制を
示している。下肥の試薬を製造した:a、テロ中シンー
8−−4グチドでラベル付けされた分析物:実施例■で
製造され九生成物を0.05M )リエタノールアZン
(’f’RA ’)緩衝液、pFI8を用匹て1 /2
000の率で希釈した。
)、b、チロキシン抗体:抗血清をTgA緩衝液を用い
126− てI/200の率で希釈した。
c、  8−蛋白質:精製された商業用物質を’I’E
A緩衝液中で2 X 10−’Mまでとした。
d、基質: 50.751117の0.1M酢酸塩緩衝
液、pH5,0中の約17119の基質の濃度の新たに
封鎖除去された5′−0−アセチルウリジン−3’−(
4−メ+ルウンベリ7エロン−7−イルホスフエ − 
ト ) 。
この基質を触媒により加水分解して、螢光性生成物であ
る(4−メチルウンベリフェロン)ヲ与えた。 Far
rand Mark I 螢光計を0.1に設定されて
いる目盛りで、速度測定用に使用した。励起は325u
mであす、そして放射け440umで監視され走。
表3は示されている試薬を一緒圧した後に得られたデー
タを示す。
127− 溶液1及び2に対するデータはへチロキシン−8−4f
チドを8−蛋白質と一緒にしたときには触媒活性が回復
されること、及び触媒活性がS−蛋白質濃度に関して飽
和されているようであることを示している。溶液3に対
するデータは、触媒活性が8−蛋白質の不存在下で表わ
されないことを示している。溶液4及び5に対するデー
タは、チロキシン抗体の存在によるチロキシン−8−イ
デチドの触媒活性の抑制された回復を示している。
抑制率け534であった。
実施例扇 この実施例は、比色計試験を用いての、チロキシン抗体
によるチロキシン−8−ベグチドの触媒活性の回復の抑
制を説明する。
この実施例で使用された試薬は、実施例でで使用された
ものと同一である。5.55dの酢酸塩緩衝液、840
u−1の基質、70ulの染料及び140ulの8−蛋
白質からなる混合溶液を実施例XIK記されている如く
して製造した。また吸光度の増加速度をCentrif
i Chem R500分析器を用いて実施例■に記1
29− 128− されている調整値において監視した。チロキシン抗体を
減少していく量の酢酸塩緩衝液で希釈するととKより種
々の濃度の抗体溶液が得られた。
400ulの混合溶液を分析器のみぞ2〜12の試薬井
戸中にピペットで加えた。それぞれ】Oulの減少して
いく抗体希釈物を試料井戸4〜12の中に、加u1のチ
ロキシン8−−(プチドでラベル付けされた分析物と共
に、ピペットで加えた。増加していく吸光度を装量ロー
ター上に転移ディスクを置きそして回転させた後に1分
間隔で監視した。表4は結果を記骨して込る: 表   4 み ぞ    抗体希釈    速妾(a、u、 /m
1n)4      1:50       0.06
375      1 :40       0.06
226      1 :30       0.05
647      1 :20       0.05
238      1 :10       0.04
909      1:6.6      0.047
110      1:5        0.043
111        1 :3.3        
0.049512       1 :2.5    
    0.0479130− データは、1:1抗体希釈付近で!ラドー化されている
抗体の抑制効果を示している。上記のデータをグロツト
すると、1:3Dよ妙幾分大きい抗体希釈度における5
0慢抑制があるS−形の滴定曲[が出きる。
実権例■ この実施例は螢光針試験を用いるシランチン抗体による
シランチン8−−4デチドの触媒活性の回復の抑制を説
明する。
下肥の試薬を使用した: a、シランチンS−ペプチドでラベル付けされた分析物
:実施例v−vat中に記されている如くして製造され
た物質、これはpH5の0.1 M酢陵ナトリウム緩衝
液で1 /6000の率で希釈されていた。
b、  8−蛋白質: Sigma精製された商業用物
質をpH5の0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液中で1,
47x10°1Mの濃度にした。
C,シランチン抗体:抗血清を0.1 M酢酸ナトリウ
ム緩衝液中で1:50の率で希釈した。
d、基質:新しく封鎖除去された5′−o−アセチルウ
リジン−3’−(,4−メチルウンベリフェロン−7−
イルホスフェート)。
Farrand Mark I螢光計を、0.1に設定
されている目盛で、速変測定用に使用した。励起け32
5nmであり、そして放射け440nmで監視された。
示されている試薬に150ulの8−蛋白質を加え、そ
して溶液をI分間培養した。データを表5に4碌する。
(33− データはシランチン抗体の存在によるシランチン−8−
ペグチドの触媒活性の抑制された回復を示している。溶
液1及び2に対しては抑制率は67嗟であり、そして溶
液3及び4に対しては抑制率は48−である。
実施例XV この実権例は比色計試験を用いての、シランチン抗体に
よるS−蛋白質の存在下でのシランチン−8−−4fチ
ドの触媒活性の回復の抑制を説明する。
この実施例では、抗体比色計法での触媒活性の抑制監視
用の基質/染料組み合わせ物としてウリジン−37−(
α−ナフチルホスフェート/p−ジアゾ)スルファニル
酸を使用した。下肥の試薬が製造された: a、シランチン−8−−4デチドでラベル付けされた分
析物:pH5,0の0.1M酢酸す) IJウム緩衝液
を用いて1 : 600 K希釈された、−* 榴例■
〜vtnに記されている方法で製造された物質。
b、  s−蛋白質:pH5,0の0.1M酢酸ナトリ
ウム(34− 緩衝液中で1.53 X 10−’Mtでにされ九8i
gma精製された商業用物質。
C0基質:新しく封鎖除去されたウリジン−3′−(α
−ナフチルホスフェート)。
d、抗体ニジランチン抗体を0.1 M酢酸ナトリウム
緩衝液を用いて1:15の率で希釈した。
e、染料:p−ジアゾスルファニル酸の安定化された1
、5−ナフタレンジスルホン酸塩(2511)を1肩l
の0.1NH(J中に溶解させた。
50ulのシランチン−8−イプチド、20ulのS−
蛋白質、200ulの基質及び?5ulの染料からなる
溶液をpH5,0の2052 ulの0.1M酢酸ナト
リウム緩衝液pR5,0で最終的量とした。470nm
 Kおける溶液吸光変を、Cary Model 11
8分光光電計を用すて速度方式で時々監視した。吸収増
加速度(1分当りの吸収単位、a、u、で測定)は0.
05a、u、 /min、であることが見出された。
第二溶液を製造し、そこでは1llulの抗体を対応す
る量の酢酸ナトリウム緩衝液用に置換した。
吸収増加速度は0.02a、u、 /min、であ抄、
それはシランチン抗体の存在によるシランチン−13−
−J!グチドの触媒活性の回復の60チの抑制率に相当
してい友。
実施例XVI この実施例は遠心急速分析器を用いての、S−蛋白質の
存在下でのシランチン抗体によるシランチンS−ペプチ
ドの触媒活性の回復の抑制を説明する。
この実験は、ナフチル基質の代りに比色計基質としてウ
リジン−3’−(4−メチルウンベリフェロン−7−イ
ルホスフェート)を使用しそして分光光電計の代りに吸
収増加速度を彎視するために遠心急速分析器(Cent
rifi Chsm ’ 500 )を使用するため、
実施例Wとは異なっている。
下記の試薬を使用した: a、シランチン−9−4プチドでラベル付けされた分析
物:実施例V〜■に配されでいる如くして製造された物
質を未希釈形で使用した。
b、抗体:pH7,1の0.1 M )リエタノールア
ミン(TEA ) −HCI緩衝液で1:40の率で希
釈された抗血清。
c、  8−蛋白質:精製された物質をpH7,1の0
.IM TWk−HCI緩衝液で1 : 100の率で
希釈して、1.53X10−’Mの最終的濃度を与えた
4、基質:1711Fの5′−〇−アセチルー2’−〇
−(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジン3′−(
4メチルウンベリフェロン−7−イルアンモニウムホス
フェート)を750ulの0.05NHClでI分間封
鎖除去することにより5′−〇−アセチルウQ−//−
3’−(4−メチルウンベリフェロン−7−イルホスフ
ェート)基質が得うした。
反応混合物を次に、 1880ulのpus、oの0.
1 M酢酸ナトリウムを加えることKよ炒緩衝した。使
用の直前1/C,300ulのこの濃縮基質を5094
ulの0.01 MTIA−HClに加えた。
C5ntrifi Chem R500分析器に対する
下記の調整値を使用した二ロータ一温度、笥;フィルタ
ー340nm ; To、 10秒;T、2分; AB
8 、1.Ou ;ブランク、ホールド;試験方式、T
erm ;グリントアウト、人B8;濃変係数、O;試
験コード、O0ヲベル付けされた分析物及び抗体又は緩
衝液を一13フ− それぞれ、分析器の転移ディスクのみぞ3〜6の試料井
戸中にビイットで加え、その後16.6ulの0.02
5 N水酸化ナトリウムを添加した。S−蛋白質及び基
質を転移ディスクの同じみぞの試料井戸中にピイットで
加えた。みぞO及び1には対応する量及び等しい量のT
EA緩衝液が充填されていた。
みぞ2では、シランチン8−−4fチド及び抗体をTE
人緩衝液で置換して、基質ブランクを与えた。
ディスクをローター上に置き、そして回転させたつ吸収
を2分間隔で璧視し、そしてプリントした。
時間の函数としての吸収の最少2乗法線状回帰分析によ
り速度が得られた。
表6はデータをまとめたものである: 138− データは、シランチン抗体の存在によるシランチン−8
−−eデチドの触媒活性の抑制された回復を示している
。抑制率は31チである。
上記の実施例■〜川は標準的又は参照着換曲線を作成す
るための基礎を提供する本のであり、該曲線から未知の
分析物濃度が測定できる。下肥の実施例1〜xxIけ対
応する基質での種々の比色計又は螢光計装蓋を利用する
標準的置換曲線を説明する。
実施例■ この実施例はラベル付けされた分析物々してチロキシン
−8−イプチドをそして螢光性基質として5′−〇−ア
セチルウリジンー3’−(4−メチルウンベリフェロン
−7−イル)ホスフェ−トラ用いる対照置換曲線の作成
を説明テする。
下肥の試薬を製造した: a、チロキシン−8−、eデチドでラベル付けされた分
析物:実施例1〜■に配されている方法で製造され九物
質をpH5,0の0.1M酢酸す) IJウム緩衝液中
で1 : 2000の率で希釈した。
b、抗体:抗血清をpH5,0の0.1M酢酸す) I
Jウム緩衝液を用いて1 : 2000の率で希釈した
C,S−蛋白質:精製された物質をT)H5,0の0.
1M酢酸ナトリウム緩衝液を用いて2 X 10−’M
とした。
d、基質: 1711F+7) 5’ −o −7セチ
ルー2’−0−(テトラヒドロビラン−2−イル)ウリ
ジン3’−(4−メチルウンペリ7ヱロンー7−イル)
アンモニウムホスフェートを0.01HCt中で45分
間攪拌し、セして次にエーテルで抽出した。pH6の関
dの0.OIM ar酸す) IJウム緩衝液を次に加
えて基質溶液を与えた。
・、チロキシン抗体規準 ヒト血清を含んでいる水性媒体中でO017ul。
30nf/sl、60 nf/m1120017ul及
び240nf/dのチロキシン濃度を与えるようなチロ
キシン溶液を新しく製造した。
75マイクpリツトルの標準的チロキシン溶液を20u
1の0.5N水酸化す) IJウムで室温で10分子備
処理した。100マイクロリツトルの抗体及び300u
lのチロキシン−8−イプチドでラベル付けされ141
− た分析物溶液を次に加え、そして混合物を室温でI分間
培養した。1.8 dの基質及び100ulの8−蛋白
質からなる混合物を次に加えた。5分間培養した後に、
螢光性の増加速賓を10分間にわたって費視した。
自動的I試料チェンジャー(モデル047−67059
 )を備えたλm1nco  フィルター螢光計(モデ
ル、■4−7440 )を、325nmの励起及び44
0nmの放射で用いた。データ点は自動的データ採取シ
ステムにより0.5及び10分の時に各試料に対して採
取された。
表7に結果をまとめる。
142− 上記のデータは、結合されているラベル付けされた分析
物の置換がチロキシン分析物の濃度の増加につれておき
るということを示している。着換曲線を得る九めKは、
2ケ所の点に対するデータを平均し、ナしてチ結合分数
(IB/Bo)を下記の式から計算する: 合計速度一連魔B。
〔速度Bnは0でない基準に相当する速度であり、そし
て速度Ba1iO基準婢液に相当するものである〕。
結果を下表8に示す。
表     8 総合              14.95Bo  
      O12,4610011h       
30         13.28      67B
1      60         13.35  
    64Bg       120       
  1348      51B&       ’f
240         14.16      32
上記のデータは対照肴換曲線を作成するために使用でき
、そこでは速度、−B/Bo  又はロジット変形が標
準濃度の函数としてプロットされている。
実施何重 この実施例は、比色計基質を遠心免速分析器と共に使用
する場合の未知の濃度の分析物チロキサンの測定用の対
at換曲線の作成を説明する。
下記の試薬を使用した: a、チロキシン8−4デチドでラベル付けされた分析物
:実施例■〜mVKleされている方法で製造された物
質をpH5,0の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液で17
400の率で希釈した。
b、抗体:抗血清をpi 5.0の0.1M酢酸す) 
IJウム緩僑液で1 : 300の率で希釈した。
C,S質:ウリジン3′−α−ナフチルホスフェート。
d、  8−蛋白質: 81gmm精製された高業用物
質を0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液中で2.5 X 
10−’Mとし喪。
・、染料;ジアゾ−p−スルファニル酸の1,5−14
5− ナフタレンジスルホン酸安定化塩(25Ilv)を1d
の0.I N HQt中に溶隼させた。
f、標準物:o、40、(資)、120及び200 n
P/wl f)!I変のチロキシン標準物をヒト面清含
賓婢液中で#造し走。
下記の調整値をC5ntrifi C’hem  50
0遠心急速分析器に対して使用した:ローター温J30
’;フィルター、520nm I To、 10秒;t
、2分i ABSl、Ou ;ブランク、ホールド;試
験方式、Term fプリントアウト、ABS+!1m
係数0+試瞬コード0 標準物(20ut)、抗体及びIリイデチドでラベル付
けされた分析物をピペットで転移ディスクのみぞ3〜1
4の試料井戸中に加え喪。5utの染料、3QQutの
基質、及び21Julの8−蛋白質の混合物を対応する
試薬中に10utの酢酸塩緩衝液と共にピペットで加え
た。充填されている転移ディスクをローター上に蓋き、
そして装置を回転させ友。吸収の読みを2分間隔で10
分間にわ走って行ない、そしてこれらをC・n−1ri
fi Ch@w  データ採用方式により示し喪。これ
146− らのデータを最少2乗法回帰分析によに速度(a、u。
7w1m)に転化し九。表9はデータをまとめたもので
ある: 表     9 30     20            0.02
864     0     20         
   0.0304!SO200,0195 60200,0200 740200,0208 840200,0222 980200,0217 1080200,021g 11    120             20 
    0.022412    120      
       20     0.022413   
 200             20     0
.023014    200           
  20     0.0230各標準濃度に関しての
吸収対時間のプロットを第1図に示す。速度増加すなわ
ち増加する標準濃度での曲線の傾斜、はチロキシンによ
る抗体からのチロキシy−s−−4デチドでラベル付け
された分析物の置換を説明する。またデータの直線性も
優れており、相関係数は0.9995 以上である。対
照置換曲1/sは上記のデータから容易に得られる。
第2図は連間対標準物の濃度のプロットを示す。
速度データは実施例1にrされている如<’4B/B。
にも転化できる。第3図は−B/Bo対標1!+!If
t″の対数のプロットを示している。
表9中のデータは標準濃度における変化に対し満足のい
く速度応答を反映しているが、実際の商業的試験用には
表9から誘導されるものよね実質的に大きい動的応答を
供することが一般的にさらK11f t、いであろう。
特K)標準及び200 nf/ d標準の間の速度応答
は3.5 fil劃、u、/minであり、そして約1
0.0m、a、u、/min の値が好適である。
種々の試薬の濃度の適切な考察により、動的応答範囲が
強化できる。
実施例■ この実施例はチロキシンでラベル付けされ九分析物及び
B−蛋白質の相互転化を説明し、そこではS−蛋白質を
試料井戸中にビRットで加え、そしてラベル付けされた
分析物を試薬井戸中にピRットで加え、それは逆のとり
そろえが使用された前の実施例とは対照的である。さら
K、この実施例は自動的ビイツタ−(Centrifi
 Chem  モデルP−500ピはツタ−)を用いる
転移ディスクの試料及び試薬井戸中への直接的ピはット
添加用の2種の試薬溶液の調合を説明する。第三に、こ
の実施例は、抗体及びS−蛋白質の濃度を増加させるこ
とKより実施例■で得られたものに比較しての動的範囲
の強化を説明する。
下記の試薬を使用した: a、チロ會シンー8−堅プチドでラベル付けされた分析
物:実施例■〜IVK記されている方法で製造された物
質をpgs、oの0.1M酢酸す) +7ウム緩衝液で
1:50の率で希釈した。
)、抗体:抗血清をpH5,0の0.1 M酢酸す) 
IJウム緩衝液で1:30の率で希釈した。
C0基質;ウリジンa/  (α−ナフチルホスフェ1
49− 一ト) (1,8−蛋白質: 81gma精製された商業用物質
を0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液中で6 X 10−
’Mに1またO e、染料:実施例XWの如き本のり f、標準物:実施何重の如きものり 500 utの基質、100u/!、の染料、及び25
Qu/−の接合物(コンジューr−h)の混合物を製造
した、(#薬A)。
300 utの抗体、試薬、300 utの日−蛋白質
及び150utの0.1M酢酸す) IJウム緩衝液を
一緒にすることによシ第二の溶液(試薬B)を製造j7
た。
試験用には下記の案を利用した書標準物(2f)u4)
及び65uzノ脱イオン化H,Oを? −500ピ2ツ
タ−の試料プローブにより転移ディスクの試料井戸に分
配させた。試薬B(5tlut)をビイツタ−の第三の
試薬プローブを用いて試薬井戸に分配させた。
試薬A(250uA)t−ビイツタ−の最初の試薬プロ
ーブを用いて転移ディスクの試薬井7’に分配させた。
全部で3回のビはット操作を同時に1サイク(50− ル中で行なった、転移ディスクを次に分析するためKC
@ntrifi Ch@mR400上に置いた。Cen
trifiChemR用には下記の調整値を使用した:
温穿、閏°;フィルター、520 nll : To、
 to秒:T、2分; Abs、LOuニブランク、ホ
ールド;試験方式、Term ;プリントアウト、Ab
s ;濃度係数、O:テストコード、0゜下記のデータ
が得られた: 表     10 2 a      ()        66−93a
065.9 4     0       53.85     0
       54.86     40      
 57.87     40       58.38
     80       60.49     8
0       59.510    120    
   62.011    120       64
.812    200       65.3a=抗
体不存在 これらのデータは表9中の亀のと比較して強化された動
的範囲を示す。ここでけ0〜200(nsF/m)の標
準的濃度範Hを包括する速度のひろが抄は、12ミリ吸
収単位/分であり、それは実施例■で得られたものの約
4倍大きい。さらに、データはある面で診断キットの実
用的デザインに比較的良く適してい為試薬混合物の調合
本説明している。さらに、この実施例は1個のピはット
サイクルを利用する商業用遠心急速分析器を伴なう自動
的ピばツタ−の使用を説明する。
実施例■に説明されている様に、表わされているデータ
から対照曲線を作成で負る。
実施例■ この実施例はCentrifi Ch@ff15QQ遠
心急速分析器に対するシランチン分析物用の対照置換曲
線の作成を説明する。比色計基質である5′−o−アセ
チル−ウリジン−3’−(4−メチルウンベリフェロン
−7−イルホスフェート)lL用L*。
下記の試薬を製造した: a、シランチン−8−試プチドでラベル付けされ1)1
?物: o、t M )リエタノールアミン(テ!ム)
−HCt緩衝液中の、実施例V−■に記されていゐ方法
で製造された物質を使用した。
b、抗体:抗シランチン抗血清をpH7,1の0.1M
T!ムーHC4緩衝液で1/20の率により希釈した。
C0基質:17Ngの5′−〇−アセチル2’−0−(
+トラヒドロピランー2−イル)ウリジン3’−(4−
メチルウンベリフェロン−7−イルアンモニウムホスフ
ェート)を750 utの0.05 M HCl K加
え、そして室温でI分間攪拌した。酢酸ナトリウム緩衝
液(1,880wIl、 0.1 M 、 1)H5,
O)を加えた。使用直前に、300 utのこの溶液を
5.094mf)TiH2,177) 0.1 M ’
!”llA −HC1緩衝液と一緒にした。
a、  s−蛋白質: 51gm&精製商業用物質をp
H7,1ノ0.I M TEA −HCA緩衝液で1 
: 100の率により希釈して1゜53X10−’Mの
濃度を有する溶液を与えた。
・、シランチン標準+ 5.5−ジフェニルヒダントイ
ンナトリウム塩(Sigma oシト64C−0027
)の−1)3− 貯菫溶液を、48Ng+7)I A(Do、025 N
水酸化ナトリウム中に溶解させるととKより、製造した
とれを0.025 N水酸化ナトリウムで1:10の率
により希釈して4.8 uf/−を有する溶液を与えた
。これをさらに希釈して、19.1.47.8.95.
8.143.6及び191.5 nf/weの濃度を布
する**溶液を与えた。
Centrifi Ch@m 5QQ遠心急速分析器は
下Fの装置調整値を有していた:ローター?!!闇、式
;フィルター、340 nm ; To、10秒;T1
1分; ABS 1.Ou ニブランク、ホールド:献
験方式、’rerm ;プリントアウト、ABS ;濃
度係数、0;試験コードo8抗体、シランチン−8−1
デチド及び16.fi 111の標準溶液を転移ディス
クのみぞ3〜16の試料井戸の中にピズットで加えた。
S−蛋白質及び300UZの基質を転移ディスクの対応
する試薬井戸のそれぞれの中にビはットで加えた。転移
ディスクをローター上に置きそして回転させた。吸収の
−みを1分間隔で5分間にわたって測定し、そしてCe
ntrifi CherrrRデータ採取単位により示
した。触154− 媒活性速度(a、u、 /win、 )が吸収の最少2
乗法回帰分析から時間の函数として得られた。
データを下表11に:fとめるー 155− 第4図祉速度対標準シランチン濃度のプロットを示して
いる。パーセント結合分数(IG B/BO)も実施例
1の如く計算された。第5図は標準製炭に対するパーセ
ント結合分数のプロットを示しているt、第S図の対照
置換曲線は、データのロゾット/ロツダ転換の使用によ
り直線化できる。直線化され九に5図の置換曲線を笥6
図に示す。
第4.5及び6図に示されているデータは大きさが一つ
のオー〆にわたるシランチン(対する広い濃度範囲の感
度を与える。しかしながら、との濃度範囲はヒト血清で
普通あられれるものより小さい。その結果、血清試料は
ここに誘導されている対照置換曲線を用いることにより
測定するためには希釈しなければならない。
実施例■ この実施例は臨床試料を直接試験できる試験の構想、(
C5ntr1fi CMm R500)遠心急速分析器
に付いている自動的ピペッタ−(モデルP −500)
の使用、及び自動的データ類別の使用を説明する。
下記の試薬を使用した: 156− 龜、ラベル付けされた分析物:実施例V−糟に配されて
いる方法で製造された、0.1M)IJエタノ−ルアZ
ン(TIA ) −HCI、緩衝液中の、ノラyチンー
B−−eデチドでラベル付けされた分析物を使用した。
b、抗体:抗−シランチン抗血清(150ut)を90
0utのpHr7.1の0.I M T!!A −HC
Lで希釈した。
C0基質;5’−0−アセチル2′−〇−(テトラヒド
ロビラン−2−イル)ウリジン3’−(4−メチルウン
ヘリフエロンー7−イルアンモニウムホス7エー))(
6,411F)を285.2111の0.05NHCI
 K加え、そして室温で(資)分間攪拌した。次に酢酸
ナトリウム緩衝液(714,8ut、 0.1M、pi
(5,o )を加えた。
d、ト1白質: Slgma 8−蛋白質の12.3X
10−5M溶液を0.IM lr私−HC1緩衝液(p
H7,1)中で製造した。
e、シランチン標準物: 5.5− ・ジフェニルヒダ
ントインナトリウム塩(Slgma oシト64cm0
02フ)をヒトの血清中で2.5.5.0.10.0.
20.0及158− び30.0ut/mlの濃度で製造した。
16uLの8−ペプチドでラベル付けされ九分析物、1
0utのヒトの血清アルプ2ン、1430utLv’r
EA−HC1緩衝液及び(c)に記されている基質溶液
の混合物を製造した(試薬1と称する)。150aの抗
血清、5outの8−蛋白質及び1937.5 utの
TP!A@衝液からなる第二の混合物を製造した(試薬
2と称する)。
C@ntrifi Ch@w  P −500自動的ピ
ペッタ−を用いて4dの適壱な基準溶液を同時に45 
ulの脱イオン化されたR20で希釈しそして転移ディ
スクの試料井戸の中にピペットで加えた。同時にピペッ
タ−Fi250 ulの試薬1を試薬井戸の中にそして
100utの試薬2を試料井戸の中に分配させ虎。Ce
ntrifiCh@1flR50G遠心装置の要素・は
、試験コード四を用い九こと以外は、実施例xxOもの
と同一であった。
これはC@ntrifi Chem R500装置のマ
イクロプロセッサ−ユニットにより自動的なデータ類別
を与えた。
下記のデータが得られた。
表    12 0       215       00     
  218       02、5     230 
      3.12.5     231     
  3.35       252       5.
05       256       5.210 
     358       9.610     
 373      10.220       51
2      23.020      494   
   19.130      525      2
8.530       524      27、9
マイクロプロセッサ−ユニット中に貯破されているレジ
ットーロッグ基準曲Sは、7.4の憾樟準偏差を有して
ぃ走。一般に貯蔵されている曲線か   □ら誘導され
る計算され九標準濃度は表12に示されている如く分析
物の濃度範囲にゎ九って実際の標準濃度と満足のいくよ
うに合致した。
王妃の案を対照用及び臨床用の両者の試料の直接的試験
用に使用できる。例えば、気体液体クロiトグラフイ(
glc )測定を基にして23.4uf/dのシランチ
ン濃度を有する臨床的試料が王妃の対の試験により5士
、7uf/s/の濃度を有していることが見出され念。
同様にglcにより2.Ouf/ydの濃度を有する臨
床用試料が3.1±、1uf/mlの濃度を有している
ことも見出された。このことけ臨床用試料において予想
される分析物mI変範囲にわ喪る良好な正確さ及び感度
を示している。さらにデータは自動的ピペット添加及び
データ類別に対する試験の適合性を示してお炒、従って
使用した遠心急速分析器システムの全能力の利点を利用
している。最後に、データは抗体、8−蛋白質及びジラ
ンチy−s−蛋白質でラベル付けされ九分析物の濃度ヲ
、P −500ビイツタ−によシ自動的に実施されるも
のよシ良好に、あらかじめ希釈することなく臨床用試料
の直接測定ができるように調節できることを示している
161一 実施例■ この実施例は二重抗体固相方法の使用によるシランチン
分析物及び8−−4デチドでラベル付けされ喪シランチ
ン分析物の抗体で結合され九部分の分離を説明し、そし
て遊離状の(結合されていない)相の投薬量応答触媒活
性も示す。対照用血清の分析物濃度の測定用の螢光発生
基質として5′−〇−アセチルウリジルー3’−(4−
メチルウンイリフエロンー7−イル)ホスフェートを使
用する触媒活性測定から、標準置換曲線を作故する。従
ってこれらのデータは不均質方式試験を例示している。
下記の試薬を製造した: a、シランチン−9−−eデチドでラベル付けされた分
析物: TIIA −HC1緩衝液中のラベル付けされ
九分析物を奥施例V−■中KEされている方法で製造し
、120uAを2860 ulの’rKA −HCt緩
衝液で希釈し友。
b、抗体:抗−シランチン抗血清(300ut)を18
00uAのTIIA −H(4緩衝液で希釈した。
162− C6固相の固定された第二の抗体:5019のBio 
−Rad IMMnNOBKAD  、 Lot 17
003、を50−のTEA−)T(l緩衝液を用いて復
元した。
d、基質:35WIIの5′−〇−アセチルー2′−〇
−(テトラヒドロピラン−2−イル)ウリジル−3′−
(4−IPルウンヘリフエロン−7−イル)アンモニウ
ムホスフェートを1.5dの0.025M HClを用
いて和分間にわた委室濡で封鎖除去し、そして5dのエ
ーテルで2回抽出した。残存エーテルを空気流により除
去し、そして酸性溶液を酢崎塩緩衝液で緩衝して100
m/とじた。
e、酢酸塩緩贅液:酢酸ナトリウム緩衝液、0.1M、
p)I !5.0゜ f、  TEA−HC1緩衝@ニトリエタノールアミン
−HC1緩衝液、0.05M、pl’l 7.5゜g、
シランチン標準物:5.5−ジフェニルヒダントインナ
トリウム塩の溶液をヒト血清中で実施例XXI中の如く
して2.5.5.0.10,0.20.0゜30.0及
び40.Ouf/dの濃度で製造した。
h、  8−蛋白質: Sigma精製され光溶液を酢
酸塩緩衝液中で1/2OK希釈した。
適轟なシランチン標準物(それぞれ8u1)を、Ouf
! 、  2.5ul 、 5u、F 、 10u!1
%20ug、IuI標準物としてマークされている二重
試験の試験管中に2−eットで加えた。 100ulの
抗体部分を標準物の各二重検定管中にピペットで加え、
そして生成した混合物を攪拌しそして室温で加分間培警
した。それソtL 100ulのシランチン−8−−e
デチドでラベル付けされた分析物部分を次に全試験背中
(ピペットで加え九、生成した混合物を室温で加分間培
饗した。
TT!、に−HCl Jll衝液(108ul )及び
シランチン−8−イデチドでラベル付けされた分析物(
100ul )を総合的にラベル付けされている二重検
定管中にピペットで加えた。生成した混合物を攪拌によ
抄混合し、そして室温においてに分間培讐した。
次にそれぞれ500ulの第二の抗体溶液を総合的試験
管以外の全ての管中にピペットで加えた。
TFJ−)ICJ緩衝液(500ul )をピペットで
総合的試験管中に加え丸、生成し九混合物を攪拌により
混合し、そして室温でω分間培養した。総合的以外の食
ての試験管を3000 rpmで5〜10℃において5
分関連心した。
各管の上澄み液(遊離相)を対応してマークされである
新しい管中に移しだ。固相を各管中で0.5dのTB人
緩衝液で再懸濁させ、そして上記の女口〈遠心した。上
澄み液を傾斜させた。
投与量応答触媒活性を以下の如く測定した。
遊嶋相及び−合の部分試料(それぞれ50ul)をそれ
ぞれ1.8 dの基質及び50ulのS−蛋白質を用い
て、混合物が325nmにおいて励起されたときの44
0nmにおける放射によ咬ファーランドマーク1(Fa
rrand Mar)c 1 ) ’l光計を使用して
II定して試験し九。
データを下表じにまとめる。もとのデータは改変された
ロッグーロジット・アルボ1)ズムによ抄合わせられ、
そこでは無限の及び0標準濃窒における速度は反復方法
により得られる。表中の各データ点は二点の平均を表わ
している。
165− 表   13 0          8.5           
0.542.5       10.0       
    3.025.0       10.5   
        4.0010.0       14
.0          11.1120.0    
  16.5          19.833Q、0
      19.0         30.864
0.0      20.5         40.
36総合   33.5 表中のデータにより分析物浸室の範囲にわたる許容でき
る標準自振を作故される。
【図面の簡単な説明】
@1図は分析物チロキシンの種々の濃度に関する吸収性
対時間のグラフであ抄、そしてそれは連間測定の直線性
並びにチロキシン製電の増加に伜なう速W(傾斜)の増
加を説明する。 y42図は分析物チロキシンに関するレポーター分子の
生成連間対濃度のグラフである。 166− 第3図は分析物チロキシンに関する、抗体結合されたラ
ベル付けされた分析物・々−セント対標準濃度の対数の
グラフである。 第4図は分析物シランチンに関するレポーター分子の生
成速度対濃度のグラフである。 第5図は分析物シランチンに関する抗体結合されたラベ
ル付けされた分析物・ぐ−セント対標準浸窒の対数のグ
ラフである。 第6図は第5図からのデータのロジット/ロッグ転換を
用いることにより得られた、第5図のIK線状置鷹曲線
のグラフである。 出1人  ベーカー インストラメンツコーポレインヨ
/ 、τ (lJか、:V1多、)・ ’ニー’(’i::。 −□ 1 167− 7遍=4・ (電11i”#11r、?+−殿) l 事例のノ〈示           昭和sフイ目
旨′1願第49254−’:3 補正をする渚 事件との関係    出願人 4代理人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、既知の分析物を未知の濃度で含有している試料中の
    分析物の量を測定する方法において、(at媒体中で、
    (1)該試料、f21 、j? リJプチドでラベル付
    けされた分析物類似体、(3)該分析物用に特異的な抗
    体、(4)ポリペプチドでラベル付けされた分析物と非
    共有結合できて触媒活性を有する複合体を生成するポリ
    ペプチドパートナ−、及び(5)該複合体の触媒活性に
    よりレポーター分子に転化可能な基質を一緒にし、ここ
    で該ポリペプチドでラベル付けされた分析物類似体社該
    抗体及び該ポリペプチドパートナ−と結合でき、該抗体
    は分析物の不存在下で触媒活性複合体の生成を抑制し、
    該抗体、ぼりペプチドパートナ−及びポリペプチドでラ
    ベル付けされた分析物の濃度は分析物の変化量が該基質
    から該し?−ター分子への転化に直接関係させるような
    ものであり、 (bl該基質からの該しI−ター分子への転化を測定し
    、そして (C)該基質からの核レポーター分子への転化を既知の
    濃度の該分析物を用いて得られた転化と比較することか
    らなる方法。 2、 ポリペプチドパートナ−とポリぜデチドでラベル
    付けされた分析物の非共有結合により生成した複合体が
    リゾヌクレアーゼの触媒活性特性を示す、特許請求の範
    囲第1項記載の方法。 3、該複合体がリゾヌクレアーゼ人の触媒活性特性を示
    す、特許請求の範囲第2項記載の方法。 4、分析物のポリペプチドラベルがS−ペプチド又はそ
    れの類似体であり、そしてポリペプチドパ−トナーが8
    −蛋白質又はそれの類似体である。特許請求の範囲第2
    項E載の方法。 5、分析物の/ IJ dゾチドラペルが8−蛋白質又
    はそれの類似体であり、そして/ IJペゾチドノ平−
    トナーが8−ペプチド又はそれの類似体である、特許請
    求の範囲第2項記載の方法。 6、/リベデチドラベル及びポリベデチドノ臂−トナー
    の少なくとも一方が酵素を分裂させて得られる、特許請
    求の範囲第1項記載の方法。 7、f!リベデチドラベル及びポリペプチドパートナ−
    が元の酵素の分裂断片である、特許請求の範囲第6項記
    載の方法。 8、ポリ被デチドパートナーと?リイデチドでラベル付
    けされた分析物の非共有結合(より生成した複合体が該
    元の酵素の触媒活性の少なくとも5優を回復している、
    特許請求の範囲第7項記載の方法。 9、該複合体の平衡定数が約105M−”〜約1011
    M−”である、特許請求の範囲第1項記載の方法。 10、該分析物が少なくとも約100〜約106の分子
    量を有する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 11、該分析物が薬もしくはそれの代榴産物、鎮静剤、
    麻酔剤、ホルモン、ステロイド、ビタンン、Iリイデチ
    ドホルモン、抗原を伴なう腫瘍、免疫グロブリン、酵素
    、工業的汚染物質、殺虫剤もしくはそれの代謝産物、食
    品添加物、除草剤もしくけそれの代電産物、香味剤、又
    は食品毒物からなる群から選択される一員である、特許
    請求の範囲第1項記載の方法。 12、該分析物がシランチン、エトサクシミド、フエノ
    パルビタール、プリ2トン、リドケイン、テオフィリン
    、モルフイン、コディン、ヘロイン、大麻、rンタマイ
    シン、トブラマイシン、メトトレキモート、ジジトキシ
    ン、チロキシン、テストステロン、コルチンル、免疫グ
    ロブリン、トリアイオドチロニン、ジfキシノ、葉酸、
    アンジオテンシン■、プログステロン、プロスタグラン
    ジンF2.  ニストロダン類、ビタミンB□* 、成
    長ホszモン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニン、ガ
    ストリン、黄体ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グルカデ
    ン、ヒト腋毛膜ゴナドトロピン、アルドステロン又は胎
    生期癌抗原からなる群から選択される、特許請求の範囲
    第1項記載の方法。 13、該分析物がシランチンである、特許請求の範囲第
    12項記載の方法。 14、#分析物がチロキシンである、特許請求の範囲第
    12項記載の方法。 15、核分析物がコルチソルである、特許請求の範囲第
    12項記載の方法。 16、#分析物がシランチンであり、シランチン用のポ
    リ4ブチトラベルが8−ペプチド又はそれの類似体であ
    り、そしてポリイデチドパートナーが8−蛋白質又はそ
    れの類似体である、特許請求の範囲第1項記載の方法。 17、該分析物がチロキシンであり、チロキシンのため
    の/ リペデチドラベルが8−ペプチド又はそれの類似
    体であシ、そしてプリペプチドパートナ−が8−蛋白質
    又はそれの類似体 5− である、特許請求の範囲第1項記載の方法。 18、該分析物がコルチンルであり、コルチンル用の?
    リイデチドラペルがB  、41デチド又けそれの類似
    体であり、そしてIリイデチド・中−トナーが8−蛋白
    質又はそれの類似体である、特許請求の範囲第1項記載
    の方法。 19、抗体が、少なくとも約104の抑制を与えるのに
    充分な製電で、存在している、特許請求の範囲第1項記
    載の方法。 1、抗体が、少なくとも約54の抑制を与えるのに充分
    な濃度で、存在している、特許請求の範囲第19項記載
    の方法。 21、基質が、速度測定期間にわたって本質的に直線的
    な速度を与えるような、濃度で存在している、特許請求
    の範囲第1項記載の方法。 n、基質が約10−’〜約10−”モルの濃度で存在し
    ている、特許請求の範囲第1項記載の方法。 る、基質が下記の構造式: 噺 OR 〔式中、Bけ3′−位置におけるりん夢エステルの加水
    分解を助けることのできるヌクレオチド塩基であり、 Rはランペリフェロニル、4−メチルランベリフェロニ
    ル、3″−7う?ニル、0−ニトロフェニル、m−ニト
    ロフェニル、p−ニトロフェニル、ジニトロフェニル、
    シアノフェニル、アシルフェニル、カル〆キシフェニル
    、フェニルスルホネート、フェニルスルホニル及ヒフェ
    ニルスルホキシドからなる群から選択された成分であ如
    、 R′は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、
    アリール、アラアルキル、アシル、オキサアルキル、チ
    オアルキル、オキサフクロアルキル及びチオシクロアル
    キルからなる群から選択された成分であり、セして R”は水素又はカルシウム、バリウム、リチウム、ナト
    リウム、アンモニウム、1fJI!されたアンモニウム
    及びピリジニウムからなる群から選択されたカチオンで
    ある] を有する、特許請求の範囲第1項記載の方法、24、 
     Bがウラシルであり、Bが4−メチルランペリフェロ
    ニルであり H/がアセチルであり、そしてy′がカル
    シウム、ピリジニウム又はナトリウムからなる群から選
    択された一員である、特許請求の範囲第5項記載の方法
    。 5、基質からレポーター分子への転化速度を測定する、
    特許請求の範囲@11項記載方法。 加、#速度を分光光度針で測定する、特許請求の範囲第
    6項記載の方法。 1、該速度を螢光針により測定する、特許請求の範囲第
    5項記載の方法。 公、王妃の成分:(1)11!リペプチドでラベル付ケ
    された分析物類似体、(2)分析物に特異的な抗体、1
    3) / リペデチドでラベル付けされた分析物と非共
    有結合できて触媒活性を有する複合体を形成するIリペ
    デチドパートナー及び(4)複合体の触媒活性によりレ
    ポーター分子に転化可能な基質、を含んでおり分析物の
    検定を実施するさいに使用するためのキット。 四1分析物に対する予測されるat範囲を包括している
    一組の標準分析物溶液を含んでいる、特許請求の範囲第
    6項記載のキット。 1、検定のためのpH嘴節用緩衝液を含んでいる、特許
    請求の範囲第公項記載のキット。 31、各成分が別個に包装されている、特許請求の範囲
    第3項15蛾のキット。 羽、ノリペプチドでラベル付けされた分析物及び基質を
    一緒に包装し、そして抗体及びポリペプチドパートナ−
    を−緒に包装した、特許請求の範囲第公項記載のキット
    。 3j、抗体及びポリペプチドパートナ−を一緒に包装し
    た、特許請求の範囲第6項記載のキラ 9− ト。 M、抗体及び基質を一緒に包装した、特許請求の範囲第
    y項記載のキット。 3.5.  (a)媒体中で(11試料s (2) $
     ジ−2ゾチドでラベル付けされた分析物類似体及び(
    3)該分析物に特異的な抗体を一緒にし、 fb)抗体と結合されたポリペプチドでラベル付けされ
    た分析物を遊離のポリペプチドでラベル付けされた分析
    物から分離し、 (c) ポリペプチドでラベル付けされた分析物と非共
    有的に結合して触媒活性を有する複合体を生成できるぼ
    りイデチドパートナーと、該複合体の触媒活性によりし
    I−ター分子に転化可能な基質とを加え、該基質からし
    ?−ター分子への転化を測定することにより、(1)抗
    体と結合されたポリペプチドでラベル付けされている分
    析物と(2)遊離のポリペプチドでラベル付けされた分
    析物とのうちの少なくとも一方の量を測定し、そして ((1)該基質からレポーター分子への転化を既知10
    − の濃度の該分析物を用いて得られた転化と比較する ことからなる、未知の濃度で存在している既知の分析物
    を含有している試料の均質免疫検定の実施方法。 y0分析物を含有している試料の検定の実施において使
    用するための、下記式 %式% 〔式中、人は分析物類似体であり、 XはA及びZ又はYと結合している部分であ抄、YはP
    P1及び2又はXと結合している部分であり;2はX及
    びYと結合している架橋基でありl PP□はIリペプ
    チドノぐ一トナーであり、i、n及びpは1〜約8の整
    数であり、そして0は0又は1〜約8の整数であり、該
    ポリペプチドでラベル付けされた類似体は分析物に対し
    て特異的な抗体との結合に関して分析物と競争でき、そ
    して該Iリペプチドでラベル付けされた分析物類似体は
    第二のポリイデチドパートナーpp、と非共有結合でき
    て、基質を検出可能なし4−ター分子に転化させ得る触
    媒活性を有する複合体を生成する〕を有するIリイデチ
    ドでラベル付けされた分析物類似体。 37、X及びYが 1 NH−C− 1 −NH−C−NH− −NH−C−NH− 1 C−0− 1 C−NH 1 −C− 〇 斡 0−C−NH 0−CHll− 1 5−C− ○ l −8−C−NH l −8−C−NH かもなる群から選択された員であり、そして2が炭素数
    が1〜約lOのアルキレン、炭素数が1〜約lOのアル
    ケニレン、炭素数が約4〜約10のシクロアルキレン、
    炭素数が約2〜約10のオキンアルキレン及び炭素数が
    約6〜約lOのアリーレ/からなる群から選択された一
    13− 負である、ポリにグチドでラベル付けされた分析物類似
    体。 ’+8.  Xが 1 NH−C− 1 −NH−C−NH− 1 −NH−C−N)l− 1 C−0− 1 C−NH 1 −C− 〇 1 −C−NH OCR2− 14− 5−C− 0 l −8−C−NH 1 −s−C,−NH からなる群から選択された一員である、特許請求の範囲
    第37項記載のポリペプチドでラベル付けされた分析物
    類似体。 3g、  pp□が8−ペプチド類似体であり、セして
    PP5lがS−蛋白質又はそれの類似体である、特許請
    求の範囲第37項記載のポリペプチドでラベル付けされ
    た分析物類似体。
JP57049254A 1981-03-30 1982-03-29 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット Granted JPS58757A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/248,689 US4378428A (en) 1981-03-30 1981-03-30 Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays
US248689 1981-03-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS58757A true JPS58757A (ja) 1983-01-05
JPH0220066B2 JPH0220066B2 (ja) 1990-05-08

Family

ID=22940245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP57049254A Granted JPS58757A (ja) 1981-03-30 1982-03-29 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4378428A (ja)
EP (1) EP0062277B1 (ja)
JP (1) JPS58757A (ja)
AT (1) ATE15275T1 (ja)
CA (1) CA1199868A (ja)
DE (1) DE3265736D1 (ja)
IE (1) IE52423B1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62222096A (ja) * 1986-03-25 1987-09-30 Nippon Kagaku Sangyo Kk 黒色合金電気めつき浴
JPH01257262A (ja) * 1987-10-02 1989-10-13 Microgenics Corp 均質なt−4取込み分析法
JPH07179495A (ja) * 1984-10-29 1995-07-18 Microgenics Corp 酵素ドナーポリペプチドおよび酵素アクセプターポリペプチド
JP2011046644A (ja) * 2009-08-26 2011-03-10 Bridgestone Corp 有機ケイ素化合物、それを含む有機ケイ素化合物組成物、ゴム組成物、プライマー組成物、塗料組成物、接着剤、及びタイヤ

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5106950A (en) * 1981-03-30 1992-04-21 Biopharma S.A. Polypeptide-labeled analyte analog for carrying out an immunoassay
GB2116979B (en) * 1982-02-25 1985-05-15 Ward Page Faulk Conjugates of proteins with anti-tumour agents
USRE34405E (en) * 1983-08-01 1993-10-12 Abbott Laboratories Determination of analytes in particle-containing medium
US4595656A (en) * 1984-01-06 1986-06-17 Becton Dickinson & Company Coupling agents and products produced therefrom
US5604091A (en) * 1984-03-01 1997-02-18 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation
US4708929A (en) * 1984-10-29 1987-11-24 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation assays
US5120653A (en) * 1985-04-08 1992-06-09 Microgenics Corporation Vector comprising DNA sequence coding for enzyme-donor polypeptide
GB8407736D0 (en) * 1984-03-26 1984-05-02 Univ London Detecting specific polynucleotide sequences
US4820630A (en) * 1984-11-23 1989-04-11 Digene Diagnostics, Incorporated Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels
US4935339A (en) * 1985-05-07 1990-06-19 Nichols Institute Diagnostics Delayed solid phase immunologic assay
US4617145A (en) * 1985-11-21 1986-10-14 International Flavors & Fragrances Inc. 1-methyl-2(2-methylbutyl) cyclohexanol derivatives and organoleptic uses thereof
DE3624464A1 (de) * 1986-07-19 1988-01-28 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel
US4833073A (en) * 1987-01-27 1989-05-23 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoassay for tetrahydrocannabinol metabolites
US4956274A (en) * 1987-04-06 1990-09-11 Microgenics Corporation Reagent stabilization in enzyme-donor and acceptor assay
AU610281B2 (en) * 1987-09-21 1991-05-16 Roche Diagnostics Corporation Solid-phase non-separation enzyme assay
US5212064A (en) * 1987-09-21 1993-05-18 Microgenics Corporation Solid phase non-separation enzyme complementation assay
US4912034A (en) * 1987-09-21 1990-03-27 Biogenex Laboratories Immunoassay test device and method
US5244786A (en) * 1987-10-02 1993-09-14 Microgenics Corporation Method of measuring available free thyroxine bending sites
DE3802060A1 (de) * 1988-01-25 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Hapten-protein-konjugate und ihre verwendung
US6326136B1 (en) * 1988-04-01 2001-12-04 Digene Corporation Macromolecular conjugate made using unsaturated aldehydes
US5037735A (en) * 1988-06-24 1991-08-06 Microgenics Corporation Visual discrimination qualitative enzyme complementation assay
US6287793B1 (en) 1988-08-19 2001-09-11 Elan Pharmaceuticals, Inc. Diagnostic methods for alzheimer's disease
ES2093026T3 (es) * 1989-05-05 1996-12-16 Microgenics Corp Procedimiento de ensayo de complementacion enzimatico de enlace e proteinas.
EP0419081A3 (en) * 1989-09-22 1992-07-22 Microgenics Corporation Method for protein binding enzyme complementation assays
US5532135A (en) * 1990-02-02 1996-07-02 Cancer Research Fund Of Contra Costa Solid-phase competitive assay utilizing a fusion protein
US5212081A (en) * 1990-04-03 1993-05-18 Microgenics Corporation Stabilization of polypeptide fragments against proteolytic degradation
US5223393A (en) * 1990-06-12 1993-06-29 Microgenics Corporation Detection of analytes having binding sites for at least two binding moieties
CA2068190C (en) * 1991-05-15 1996-12-17 Microgenics Corporation Methods and compositions for enzyme complementation assays using the omega region of beta-galactosidase
DE69232002T2 (de) * 1991-06-07 2002-06-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassays unter Verwendung von markierten Hapten-Analogen
WO1993003379A1 (en) * 1991-07-26 1993-02-18 E.I. Du Pont De Nemours And Company An assay with signal detection in the presence of a suspended solid support
CA2128320A1 (en) * 1992-01-22 1993-08-05 Shanfun Ching Calibration reagents for semi-quantitative binding assays and devices
US5382582A (en) * 1993-03-26 1995-01-17 Chan; Carcy L. Methotrexate analogs and methods of using same
US5427912A (en) * 1993-08-27 1995-06-27 Boehringer Mannheim Corporation Electrochemical enzymatic complementation immunoassay
US6365334B1 (en) 1993-10-22 2002-04-02 Eastman Kodak Company Photographic elements containing aryloxypyrazolone couplers and sulfur containing stabilizers
WO1996019732A1 (en) * 1994-12-19 1996-06-27 Microgenics Corporation Competitive binding assays having improved linearity
US5698556A (en) * 1995-06-07 1997-12-16 Chan; Carcy L. Methotrexate analogs and methods of using same
US8148110B2 (en) * 1999-03-15 2012-04-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by β-lactamase reporter fragment complementation
AU2003301583A1 (en) * 2002-10-21 2004-05-13 Discoverx, Inc. Ip3 protein binding assay
CA2544688A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-26 Discoverx Corporation Cellular membrane protein assay
JP2005172694A (ja) * 2003-12-12 2005-06-30 Fuji Photo Film Co Ltd タンパク質の検出方法
JP4632400B2 (ja) * 2003-12-16 2011-02-16 キヤノン株式会社 細胞培養用基板、その製造方法、それを用いた細胞スクリーニング法
US7608415B2 (en) * 2004-06-30 2009-10-27 Discoverx Corporation Analysis of intracellular modifications
JP2009512460A (ja) * 2005-10-24 2009-03-26 ディスカヴァーエックス インコーポレイテッド 細胞内の酵素複合体の検出方法
EP1994178A4 (en) * 2006-03-13 2009-11-11 Univ Leland Stanford Junior MOLECULAR INTERACTION DETECTION USING A REDUCED AFFINITY ENZYMATIC COMPLEMENTATION RAPPORTEUR SYSTEM
US8101373B2 (en) * 2007-10-12 2012-01-24 Discoverx Corporation β-galactosidase donor fragments
US8569057B2 (en) 2011-06-23 2013-10-29 Discoverx Corporation Monitoring protein trafficking using beta-galactosidase reporter fragment complementation
EP2812695A4 (en) 2012-02-06 2015-12-02 Discoverx Corp DETECTION OF INTRA-CELLULAR BINDING EVENTS BY MEASUREMENT OF THE PROTEIN FILL
US9393177B2 (en) 2013-08-20 2016-07-19 Anutra Medical, Inc. Cassette assembly for syringe fill system
USD774182S1 (en) 2014-06-06 2016-12-13 Anutra Medical, Inc. Anesthetic delivery device
USD750768S1 (en) 2014-06-06 2016-03-01 Anutra Medical, Inc. Fluid administration syringe
USD763433S1 (en) 2014-06-06 2016-08-09 Anutra Medical, Inc. Delivery system cassette
CN114166706A (zh) * 2021-10-22 2022-03-11 中国辐射防护研究院 一种工作场所铀气溶胶浓度的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS552997A (en) * 1978-06-22 1980-01-10 Miles Lab Specif combination analysis using prosthetic group as labelling component* reagent and composition for same* test kit* and ligand

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4191613A (en) * 1971-05-14 1980-03-04 Syva Company Malate dehydrogenase conjugates for enzyme immunoassays
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3852157A (en) * 1971-05-14 1974-12-03 Syva Corp Compounds for enzyme amplification assay
US3905871A (en) * 1971-05-14 1975-09-16 Syva Co Lactam conjugates to enzymes
US4046636A (en) * 1974-06-20 1977-09-06 Syva Company Diazepam enzyme conjugates
US4067774A (en) * 1971-05-14 1978-01-10 Syva Company Compounds for enzyme amplification assay
US4039385A (en) * 1972-05-08 1977-08-02 Syva Company Cardiac glycoside enzyme conjugates
US3884898A (en) * 1972-08-18 1975-05-20 Syva Co Normorphine derivatives bonded to proteins
US3843696A (en) * 1972-09-05 1974-10-22 Syva Co Methadone analog compounds
US3966556A (en) * 1972-11-06 1976-06-29 Syva Company Compounds for enzyme amplification assay methadone analogs
US3875011A (en) * 1972-11-06 1975-04-01 Syva Co Enzyme immunoassays with glucose-6-phosphate dehydrogenase
US3856469A (en) * 1973-01-02 1974-12-24 Syva Corp Interferant removal from amphetamine immunoassay
US4045420A (en) * 1973-05-29 1977-08-30 Syva Company Non-oxo-carbonyl containing benzoyl ecgonine and cocaine compounds polypeptide and derivatives thereof
US3888866A (en) * 1973-06-01 1975-06-10 Syva Co Nitrogen derivatives of benzoyl ecgonine
US3917582A (en) * 1973-06-13 1975-11-04 Syva Corp Isothiocyanate and thiourea derivatives of benzoyl ecgonine conjugated to polypeptides
US3998943A (en) * 1973-10-02 1976-12-21 Syva Company Double receptor fluorescent immunoassay
US4161515A (en) * 1973-10-02 1979-07-17 Syva Company Double receptor fluorescent immunoassay
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US4040907A (en) * 1974-06-20 1977-08-09 Syva Company Iodothyronine enzyme conjugates
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4065354A (en) * 1974-10-10 1977-12-27 Syva Company Lysozyme conjugates for enzyme immunoassays
US4002532A (en) * 1974-10-21 1977-01-11 Weltman Joel K Enzyme conjugates
US4043872A (en) * 1975-02-20 1977-08-23 Syva Company Polyiodothyronine immunoassay
US4171244A (en) * 1975-02-20 1979-10-16 Syva Company Enzyme-bound-polyidothyronine
US4025501A (en) * 1975-03-20 1977-05-24 Syva Company Polypeptide propoxyphene derivatives for immunoassay reagents
US4064151A (en) * 1976-05-17 1977-12-20 United Carbide Corporation Halosilyl carbamates
US4174384A (en) * 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4043989A (en) * 1975-09-11 1977-08-23 Syva Company Oxazepam derivatives for immunoassay reagents
US4058511A (en) * 1976-01-12 1977-11-15 Syva Company Tegretol antigens and antibodies
US4056608A (en) * 1976-04-08 1977-11-01 Syva Company Cardiac glycoside or aglycone assays
US4121975A (en) * 1976-08-20 1978-10-24 Syva Company Pretreatment of samples for polyiodothyronine assays
US4134792A (en) * 1976-12-06 1979-01-16 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance
US4130462A (en) * 1976-12-16 1978-12-19 Syva Company Receptor steric hindrance immunoassay for receptor determination
US4069105A (en) * 1977-03-03 1978-01-17 Syva Company Lidocaine antigens and antibodies
US4156081A (en) * 1977-04-15 1979-05-22 Syva Company Theophylline antigens and antibodies
IT1079045B (it) * 1977-05-16 1985-05-08 Syva Co Analisi imuunologica fluorescente a doppio ricettore
US4233401A (en) * 1977-07-14 1980-11-11 Syva Company Antienzyme homogeneous competitive binding assay
US4160645A (en) * 1977-07-14 1979-07-10 Syva Company Catalyst mediated competitive protein binding assay
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4318980A (en) * 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4193983A (en) * 1978-05-16 1980-03-18 Syva Company Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith
US4213893A (en) * 1978-10-12 1980-07-22 Miles Laboratories, Inc. Flavin adenine dinucleotide-labeled conjugates for use in specific binding assays
US4318983A (en) * 1979-06-04 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Fad-labeled specific binding assay monitored with apoglutathione reductase or apolipoamide dehydrogenase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS552997A (en) * 1978-06-22 1980-01-10 Miles Lab Specif combination analysis using prosthetic group as labelling component* reagent and composition for same* test kit* and ligand

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07179495A (ja) * 1984-10-29 1995-07-18 Microgenics Corp 酵素ドナーポリペプチドおよび酵素アクセプターポリペプチド
JPH0779717B2 (ja) * 1984-10-29 1995-08-30 マイクロジエニツクス コ−ポレ−シヨン タンパク質結合酵素相補性検定に関する方法
JPH0882624A (ja) * 1984-10-29 1996-03-26 Microgenics Corp タンパク質結合酵素相補性検定に関する方法
JPS62222096A (ja) * 1986-03-25 1987-09-30 Nippon Kagaku Sangyo Kk 黒色合金電気めつき浴
JPH0364600B2 (ja) * 1986-03-25 1991-10-07 Nippon Kagaku Sangyo Kk
JPH01257262A (ja) * 1987-10-02 1989-10-13 Microgenics Corp 均質なt−4取込み分析法
JP2011046644A (ja) * 2009-08-26 2011-03-10 Bridgestone Corp 有機ケイ素化合物、それを含む有機ケイ素化合物組成物、ゴム組成物、プライマー組成物、塗料組成物、接着剤、及びタイヤ

Also Published As

Publication number Publication date
IE820574L (en) 1982-09-30
CA1199868A (en) 1986-01-28
DE3265736D1 (en) 1985-10-03
ATE15275T1 (de) 1985-09-15
EP0062277A1 (en) 1982-10-13
EP0062277B1 (en) 1985-08-28
IE52423B1 (en) 1987-10-28
JPH0220066B2 (ja) 1990-05-08
US4378428A (en) 1983-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS58757A (ja) 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット
US4404366A (en) Beta-galactosyl-umbelliferone-labeled hapten conjugates
US4279992A (en) Specific binding assay employing an enzyme-cleavable substrate as label
US4331590A (en) β-Galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates
US4214048A (en) Reagent suitable for enzyme immuno assay
US5464741A (en) Palladium (II) octaethylporphine alpha-isothiocyanate as a phosphorescent label for immunoassays
CA1133474A (en) Specific binding assay employing an enzyme cleavable substrate as label
JPH0137693B2 (ja)
US4043872A (en) Polyiodothyronine immunoassay
CA1146937A (en) Chemiluminescent aminophthalhydrazide-labeled conjugates for use in specific binding assays
US4785080A (en) Labeled analytes
JPS6240662B2 (ja)
EP0977766A1 (en) Glycoconjugated fluorescent labeling reagents
JPS63501571A (ja) D−ルシフェリン誘導体、および生化学物質定量に当っての酵素標識リガンド検出へのその利用および利用法
IE920778A1 (en) Method for specific binding assays using a releasable ligand
JPS59104554A (ja) 螢光偏光技術を用いる不飽和チロキシン結合性蛋白位置の測定法
US5614368A (en) Chromophoric reagents for incorporation of biotin or other haptens into macromolecules
Carrico et al. A method for monitoring specific binding reactions with cofactor labeled ligands
US4171244A (en) Enzyme-bound-polyidothyronine
GB2041921A (en) Intermediates useful in the synthesis of chemiluminescent phthalhydrazidelabelled conjugates
EP0204523B1 (en) Glucose-6-phosphate dehydrogenase conjugates, their preparation and use
US5106950A (en) Polypeptide-labeled analyte analog for carrying out an immunoassay
JPS5924386B2 (ja) ポリヨ−ドチロニンの免疫学的分析法
US4489157A (en) Chloramphenicol derivatives
JPS61186855A (ja) チロキシンを形成するグロブリンの結合能力を測定する方法