JP2005172694A

JP2005172694A - タンパク質の検出方法

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Publication number: JP2005172694A
Application number: JP2003415269A
Authority: JP
Inventors: Yukio Sudo; 幸夫須藤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2005-06-30
Also published as: EP1542018A2; US20050196815A1; EP1542018A3; US7067270B2

Abstract

【課題】非放射性標識を使用し、ビオチン／（ストレプト）アビジンの相互作用よりも妨害されにくく、かつＤＩＧを用いた検出系よりも高い検出感度を達成することができる蛋白質の検出方法を提供すること。
【解決手段】（Ａ）標的物質と下記式（１）で表される６員環を有する化合物で標識された蛋白質とを接触させて結合反応を行う工程；及び、
（Ｂ）上記６員環を有する化合物に対する抗体を用いて標的物質と結合した該６員環を有する化合物で標識された蛋白質を検出する工程；
を含む、標的物質の検出方法。
【化１】

（式中、Ｒ¹及びＲ²は同一でも異なっていてもよく、各々独立に水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、点線は６員環を形成するのに必要な原子団を示す。）
【選択図】なし

Description

本発明は、微量標的物質の検出方法に関する。

従来から公知の蛋白質検出方法としては、膜などの固定用担体に固定した蛋白質に特異的に結合し、かつラジオアイソトープで放射性標識した抗体を反応させ、未反応の標識抗体を洗浄により除去した後、残留した放射性標識を検出することによって蛋白質を検出する方法がある。

放射性標識した抗体を用いる検出方法は感度が高く有効な方法ではあるが、放射性化合物を扱うための特別な施設が必要であり、取り扱いが煩雑であり、放射性物質の廃棄の問題といった諸問題を伴う。また、放射性物質は半減期を有するため、放射性標識した抗体は製造後の一定期間しか使用することができない。さらに、検出すべきＤＮＡ量が少量である場合、検出のためにオートラジオグラフイーの露光時間を長時間（数日間〜数週間）とする必要があった。このような問題を克服するために非放射性の検出方法が開発されてきた。

例えば、ビオチン分子を導入した抗体を用いて、標的物質と結合した抗体のビオチン分子を、（ストレプト）アビジン−標識酵素複合体を用いて検出する方法が知られている。ビオチン／（ストレプト）アビジンを介したこの検出系は蛋白質を比較的高感度で検出することができる。しかしながら、ビタミンであるビオチンは生物学的試料中に内生している場合が多いため、検出の際の相互作用が妨害され易いという欠点がある。

また、特許文献１には、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いた検出系が記載されている。この検出系では、抗体に結合する標識としてジゴキシゲニンを用い、標識の検出に当たっては、アルカリフォスファターゼを結合させた抗ジゴキシゲニン抗体をジゴキシゲニンに結合させた後、アルカリフォスファターゼの触媒反応による基質の発色により検出している。

しかしながら、上記のＤＩＧを用いた検出系では、標的物質に対する抗体をＤＩＧにより標識することになる。しかし、ＤＩＧ誘導体は水溶性に乏しく、抗体を効率よく標識することが困難であるという欠点を有している。

特開平１−２１５３００号公報

本発明は、上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、非放射性標識を使用し、ビオチン／（ストレプト）アビジンの相互作用よりも妨害されにくく、かつＤＩＧを用いた検出系よりも高い検出感度を達成することができる蛋白質の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本明細書に定義する式（１）で表される６員環を有する化合物で標識された蛋白質と標的物質とを結合させた後に、上記６員環を有する化合物に対する抗体を用いて６員環を有する化合物により標識された蛋白質を検出することにより、高感度に効率よく標的物質を検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、（Ａ）標的物質と下記式（１）で表される６員環を有する化合物で標識された蛋白質とを接触させて結合反応を行う工程；及び、
（Ｂ）上記６員環を有する化合物に対する抗体を用いて標的物質と結合した該６員環を有する化合物で標識された蛋白質を検出する工程；
を含む、標的物質の検出方法が提供される。

（式中、Ｒ¹及びＲ²は同一でも異なっていてもよく、各々独立に水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、点線は６員環を形成するのに必要な原子団を示す。）

本発明の第一の態様では、６員環を有する化合物に対する抗体として標識抗体を使用して、標的物質と結合している６員環を有する化合物により標識された蛋白質を検出することにより、該標的物質を検出する。
本発明の第二の態様では、６員環を有する化合物に対する抗体と、当該抗体に特異的に結合することができる標識抗体とを用いて、標的物質と結合している６員環を有する化合物により標識された蛋白質を検出することにより、該標的物質を検出する。

好ましくは、標的物質は固相担体に固定化されている。
好ましくは、式（１）で表される６員環を有する化合物がテオフィリン誘導体またはフェノバルビタール誘導体である。
好ましくは、式（１）で表される６員環を有する化合物が下記式で示される化合物である。

好ましくは、６員環を有する化合物に対する抗体がモノクローナル抗体である。
好ましくは、標識抗体の標識として、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識又は生物発光標識を使用する。
好ましくは、標識抗体の標識酵素としてアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセテートキナーゼ、ルシフェラーゼ、アミラーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素、セルラーゼ又はキサンチンオキシダーゼを使用する。
好ましくは、検出方法は、発光法、蛍光法、遅延蛍光法、比色法または電気化学法である。
好ましくは、６員環を有する化合物で標識された蛋白質は、標的物質に対する抗体、レセプター、DNA結合蛋白質またはそれらの断片である。

本発明により、非放射性標識を使用し、ビオチン／（ストレプト）アビジンの相互作用よりも妨害されにくく、かつＤＩＧを用いた検出系よりも高い検出感度を達成することができる蛋白質の検出方法を提供することが可能になった。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明においては、先ず、標的物質と下記式（１）で表される６員環を有する化合物（本明細書中において、ハプテンとも称する場合がある）で標識された蛋白質とを接触させて結合反応を行う。

Ｒ¹及びＲ²が示す炭素数１〜６のアルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられ、これらは直鎖でも分岐鎖でもよい。
式（１）において点線で示される６員環を形成するのに必要な原子団としては、主鎖が炭素原子またはヘテロ環を形成する異種原子（例えば、窒素原子、酸素原子または硫黄原子など）から構成される原子団である。即ち、当該原子団の主鎖は、炭素原子または異種原子（例えば、窒素原子、酸素原子または硫黄原子など）から選択される２原子から成る連結基であり、これらの炭素原子または異種原子には、水素原子または置換基が、適切な原子価を維持するように結合している。また、当該原子団の中には二重結合が存在してもよい。

式（１）において点線で示される６員環を形成するのに必要な原子団の具体例としては、−ＣＲ¹¹Ｒ¹²−ＣＲ¹³Ｒ¹⁴−、−ＣＲ¹¹＝ＣＲ¹³−、−ＣＲ¹¹Ｒ¹²−ＮＲ¹³−、−ＣＲ¹¹＝Ｎ−、−ＮＲ¹¹−ＮＲ¹³−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＣＲ¹¹Ｒ¹²−Ｏ−、−ＣＲ¹¹Ｒ¹²−Ｓ−、−ＮＲ¹¹−Ｏ−、または−ＮＲ¹¹−Ｓ−などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

Ｒ¹¹、Ｒ¹²、Ｒ¹³及びＲ¹⁴は各々独立に水素原子または置換基を示す。置換基の種類は特に限定されず、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、炭素数１から１０のアルキル基、炭素数１から１０のアルケニル基、炭素数１から１０のアルキニル基、炭素数６から２０のアリール基、炭素数１から１０のアルコキシ基など任意の置換基を挙げることができる。また、Ｒ¹¹及びＲ¹²、またはＲ¹³及びＲ¹⁴はそれぞれ一緒になってケトン基（＝Ｏ）を形成してもよい。

当該原子団としては、式（１）で表される化合物がテオフィリン誘導体またはフェノバルビタール誘導体になる原子団が好ましい。
式（１）で表される化合物がテオフィリン誘導体となるためには、当該原子団は、−Ｃ（ＮＨＲ²¹）＝Ｃ（Ｎ＝Ｒ²²）−（式中、Ｒ²¹及びＲ²²は一緒になって５員環を形成する）で表される。
また、式（１）で表される化合物がフェノバルビタール誘導体となるためには、当該原子団は、−Ｃ（＝Ｏ）―Ｃ（ＣＨ₂ＣＨ₃）（Ｃ₆Ｈ₅）−で表される。

式（１）で表される６員環を有する化合物は直接（標的物質と結合しうる）蛋白質に連結してもよいが、好ましくはリンカーを介して連結される。他方、式（１）で表される６員環を有する化合物におけるリンカー結合部位としては、式（１）において点線で示される６員環を形成するのに必要な原子団を用いるのが好ましい。

リンカーは、ハプテン−抗体反応の際にいわゆる立体障害を避けるためにある程度以上の長さを必要とし、例えば原子４個以上の長さを有することが好ましい。
リンカーが結合した式（１）で表される６員環を有する化合物の具体例としては、以下の構造式で示されるテオフィリン−ＬＣまたはテオフィリン−８−ブタン酸などが挙げられる。

本発明における、６員環を有する化合物で標識される蛋白質とは、標的物質に特異的に結合しうる全ての種類の蛋白質及びペプチドのことをいう。最も好ましい例としては、標的物質に対する抗体またはその断片またはそのフラグメントをあげることができる。また、標的物質がリガンドである場合、該リガンドに特異的に結合するレセプター及びその断片であってもよい。また、標的物質が核酸である場合、該核酸に特異的に結合する蛋白質やペプチド（アプタマー）であってもよい。

本発明における、６員環を有する化合物を、標的物質に結合しうる蛋白質、ペプチド化合物に標識する場合、例えば、NH₂基や、COOH基、SH基などを介して結合させてもよい。このような、標識方法については、酵素免疫測定法（医学書院 1987年刊）に記載されている方法等を利用することもできる。

本発明では、標的物質と、本明細書に定義した式（１）で表される６員環を有する化合物で標識された蛋白質とを接触させて結合反応を行う。標的物質は、好ましくは、固相担体に固定化された蛋白質である。

本発明の方法において、標的物質が固定されている形態において、標的物質を固定するための固体担体としては、公知の各種固定用担体が用いられる。一般的には、ハプテン−抗体反応のため溶液に浸しやすい形状で、バックグラウンドの原因となる抗体や蛋白質との非特異的結合性の低い材質のものが用いられ、具体例としては、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、プラスチック、プレキシガラス、ニトロセルロース、石英またはナイロンで被覆したプラスチックやプレキシガラス、等が挙げられる。

本発明では、上記の通り、固体担体表面上に標的物質を固定することが好ましい。固定は常法に従って行うことができる。例えば、標的物質を含む溶液をナイロン膜などの固体担体上に点着後、風乾すればよい。その後、BSA溶液などを用いてブロッキングを行うことが好ましい。

次に、式（１）で表される６員環を有する化合物で標識された蛋白質を含む溶液で固体担体を処理することにより、標的物質と該蛋白質とを接触させて結合反応を行う。結合反応は常法により行うことができる。例えば、結合反応が抗原・抗体反応である場合には、抗原を結合させた固体担体を、例えば０．５％ＢＳＡを含む抗体溶液中で振盪することにより結合反応を行うことができる。上記した結合反応後に、上記６員環を有する化合物に対する抗体を用いて、標的物質と結合した蛋白質を検出する。

本発明において用いる上記６員環を有する化合物に対する抗体（即ち、抗ハプテン抗体）は、抗原としてハプテンである上記６員環を有する化合物を用いて生じさせた抗体であり、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。抗原としてハプテンを用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製する方法はよく知られており、既知の方法に従って得ることができる。ポリクローナル抗体を産生する動物としては、例えばウサギ、モルモット、マウス等が用いられる。また、遺伝子工学的に作成された抗体またはそのフラグメントを利用できることも勿論である。

本発明の第一の態様によれば、上記の抗体は、それを検出するための標識と連結しておく。この標識としては、酵素、例えば発色反応、発光反応又は蛍光反応を生じさせるための酵素が挙げられる。例えば発色反応を生じさせる酵素の例としてアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシターゼ等が用いられ、発光反応を生じさせる酵素として、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられ、また蛍光反応の酵素としてはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、エステラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の検出のためには、酵素の種類に対応して比色基質、発光基質、蛍光基質等が使用される。検出のための酵素、基質、検出反応等は常法に従って行うことができる。

本発明の第二の態様によれば、抗ハプテン抗体（一次抗体）を直接標識せず、抗ハプテン抗体に対する標識抗体（二次抗体）を用いて抗ハプテン抗体を検出することができる。例えば抗ハプテン抗体（一次抗体）としてある種の動物の抗体を用いる場合には、その種の抗体に対して特異的に結合する他の種の抗体（二次抗体）を用いることができる。例えば、抗ハプテン抗体としてマウスの抗体を一次抗体として用いる場合、マウスの抗体に対して特異的なウサギの抗体を二次抗体として用いることができる。

この態様において二次抗体を検出するために二次抗体に結合させる標識及びその検出方法は、第一の態様において抗ハプテン抗体を検出する場合と同様である。上記一次抗体及び／又は二次抗体に、生来の抗体をそのまま用いてもよく、又は結合性を保持している抗体の断片、例えばＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ）等を用いてもよい。これらの断片化は常法に従って行うことができる。

上記した抗ハプテン抗体を用いて、標的物質と結合した６員環を有する化合物で標識された蛋白質を検出する方法は常法により行なうことができる。
本発明の第一の態様によれば、６員環を有する化合物（ハプテン）で標識された蛋白質のもつハプテンと、標識された抗ハプテン抗体と結合させる。この反応は常用の条件下で、例えばトリス緩衝液（pH７．５）、リン酸緩衝液等の中で２０〜３７℃にて１５〜６０分間行うことができる。次に、洗浄液、例えばトリス緩衝液（pH７．５）等により固体担体を洗浄して未結合の標識抗体を除去した後、抗ハプテン抗体の標識が酵素であれば、該酵素に対する発色基質と反応せしめることにより発色を行う。

この場合の反応媒体としては、例えばトリス緩衝液（pH７．５）等が使用される。発色は、標識酵素及びその基質により異るが、例えば２０〜３７℃にて適宜な時間放置して行う。

本発明の第二の態様によれば、抗ハプテン抗体は標識されておらず、抗ハプテン抗体に対する標識された抗体を用いて検出を行う。抗ハプテン抗体（一次抗体）と標識抗体（二次抗体）との反応は例えばトリス緩衝液（pH７．５）等の媒体中で２０〜３７℃にて１５〜６０分間行うことができる。

次に、洗浄液、例えばトリス緩衝液（pH７．５）等により固体担体を洗浄して未結合の標識抗体（二次抗体）を除去した後、二次抗体の標識が酵素である場合には、発色基質と反応せしめることにより発色を行う。この場合の発色は第一の態様の場合と同様にして行えばよい。

本発明では、標的物質、またはプローブ抗体の検出は、発光法、蛍光法、遅延蛍光法、比色法または電気化学法で行なうことができる。
発光法及び蛍光法は、標識として化学発光物質、蛍光物質、または発光反応または蛍光反応を触媒する酵素を使用することにより行うことができる。
遅延蛍光法では、非常に蛍光寿命の長い蛍光色素（例えば、ランタニドキレート化合物）を使用する。これにより、励起光、短寿命蛍光物質に起因するバックグラウンドの上昇を抑えることができ、高感度の検出系が設計できる可能性がある。
比色法では、酵素反応により生成された生成物の吸光度の変化を測定する。代表的な例として、酵素ペルオキシダーゼ・基質ＡＢＴＳ（2,2 Azinobis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt）系を挙げることができる。
また、フェロセン誘導体を用いることにより、電気化学的手法での検出が可能になる。

本発明の方法の適用の具体例を以下に挙げるが、これらに限定されるものではない。
（1）プロテインチップ、
（２）固定された全細胞，固定された組織塗布標本、染色反応；
（３）ウエスタンブロット分析；
（４）血液分析
（５）環境汚染物質の分析
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

合成例１：Theophylline-LC誘導体（１）の合成
1mgのTheophylline-8-butanoic acid(Sigma 社)を0.1M MES 緩衝液2ml に溶解し、WSC塩酸塩3.6mg 及び NHS 2.5mg を加え室温で15分間撹拌した。これに、εAmino Caproic ACID (Sigma 社) 2.0mgを200μlの0.1M MES に溶解して添加し、室温で2時間反応させた。1M Tris緩衝液(pH7.5)100μlを加え反応を停止させた後、8gのODSシリカ(YMC-ODS-AQ 120A)を充填したカラムに吸着させ、30%メタノール水溶液で溶離した。溶離液を濃縮後さらに中圧分取クロマトグラフィー(YAMAZEN Ultrapack ODS-S-4OB)により精製した。

合成例２：Theophylline-BSAの合成・抗体の作成
2mgのTheophylline-8-butanoic acid(Sigma 社)を0.1M MES 緩衝液4ml に溶解し、WSC塩酸塩7mg 及び NHS 5mg を加え室温で15分間撹拌した。これに、BSA(Sigma 社) 10mgを2mlの0.1M MESに溶解して添加し、室温で2時間反応させた。1M Tris緩衝液(pH7.5)500μlを加え反応を停止させた後、0.1M Tris緩衝液(pH7.5)に対して透析を行った。
このTheophylline-BSAを免疫原として、通常の方法(A Laboratory Manual:Antibodies GoldSpringHaborLaboratory1988年刊) によりマウスモノクローナル抗体を作成した。

合成例３：Theophylline-抗ヒトIgG抗体の合成・抗体の作成
合成例１で作製したTheophylline-LC誘導体(0.2mg)をPBS 0.4ml に溶解し、WSC塩酸塩0.7mg 及び NHS 0.5mg を加え室温で15分間撹拌した。これに、抗ヒトIgG抗体 1mgを0.2mlのPBSに溶解して添加し、室温で2時間反応させた。1M Tris緩衝液(pH7.5)500μlを加え反応を停止させた後、0.1M Tris緩衝液(pH7.5)に対して透析を行った。

合成例４：抗Theophylline抗体ALPコンジュゲートの作成
合成例２により作成した抗Theophylline Monoclonal抗体をProteinAカラムより精製後、パパイン処理によりF(ab’)２を作成した。また、ALP(AlkalinePhosphatase (Sigma社))を、Sulfosuccimidyl4-［N-maleimidomethl］-cyclohexane-1-carboxylate(Pierce社)と反応させることにより、ALPにmaleimido基を導入し、これとFab’のSH基とを反応させることにより、抗Theophylline抗体ALP コンジュゲートを作成した。詳しい合成条件は、酵素免疫測定法第３版（医学書院１９７８年刊）記載の方法を用いた。

合成例５：Digoxigenin-抗ヒトIgG抗体の合成・抗体の作成
抗ヒトIgG抗体PBS溶液１ml（１ｍｇ/ｍｌ）にDigoxigenin-NHS（ロシュダイアグノスティック社製）のDMSO溶液（１ｍｇ/２０μｌ）２０μｌを添加し、室温で2時間反応させた。その後、1M Tris緩衝液(pH7.5)500μlを加え反応を停止させた後、0.1M Tris緩衝液(pH7.5)に対して透析を行った。

実施例１：ドットブロッティング
ヒトIgG PBS溶液１μｌをナイロン膜に点着後、風乾したのち、３％BSA溶液にて３時間ブロッキングを行った。

次に合成例３記載のTheophylline-抗ヒトIgG抗体の0．5％のBSA入り5mlに37℃で30分振盪後、0．3％のTween20入りPBSにより10分×3回洗浄した。
その後、合成例４に記載の抗Theophylline抗体ALPコンジュゲートの0．5％のBSA入り緩衝液A 5mlに37℃で30分振盪後、0．3％のTween20入りTris-HCl(pH7.5)（1mM MgCl₂, 0.1mM ZnCl₂）緩衝液Aにより10分×3回洗浄した。このメンブレンをラップフィルムに乗せ、CDPStar 検出キット(Rosche Diagnostics社)添付のCDP-Star検出試薬を十分量滴下し、3分後にラップでくるみ、LAS1000（富士フイルム製）で発光を検出・記録した。

比較例１：
実施例１で使用したTheophylline−抗ヒトIgG抗体の代わりに合成例５のDigoxigenin−抗ヒトIgG抗体を使用し、実施例１で使用した抗Theophylline抗体ALPコンジュゲートの代わりに抗Digoxigenin抗体ALPコンジュゲート（ロシュダイアグノスティック社製）を使用した以外は、実施例１と同様の実験を行い、これを比較例とした。

（結果）
実施例１と比較例１についての発光強度の測定結果を以下の表２に記載する。表２の結果から分かるように、本発明の方法を用いた場合の方が、従来のジゴキシゲニン標識法を用いた場合よりも、良好なシグナルが得られ、メンブラン上の蛋白質を効率よく検出できることが明らかである。

Claims

（Ａ）標的物質と下記式（１）で表される６員環を有する化合物で標識された蛋白質とを接触させて結合反応を行う工程；及び、
（Ｂ）上記６員環を有する化合物に対する抗体を用いて標的物質と結合した該６員環を有する化合物で標識された蛋白質を検出する工程；
を含む、標的物質の検出方法。

（式中、Ｒ¹及びＲ²は同一でも異なっていてもよく、各々独立に水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、点線は６員環を形成するのに必要な原子団を示す。）
６員環を有する化合物に対する抗体として標識抗体を使用して、標的物質と結合した６員環を有する化合物で標識された蛋白質を検出する、請求項１に記載の方法。
６員環を有する化合物に対する抗体と、当該抗体に特異的に結合することができる標識抗体とを用いて、標的物質と結合した６員環を有する化合物で標識された蛋白質を検出する、請求項１に記載の方法。
標的物質が固相担体に固定化されている、請求項１から３の何れかに記載の方法。
式（１）で表される６員環を有する化合物がテオフィリン誘導体またはフェノバルビタール誘導体である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
式（１）で表される６員環を有する化合物が下記式で示される化合物である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
６員環を有する化合物に対する抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から６の何れかに記載の方法。
標識抗体の標識として、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識又は生物発光標識を使用する、請求項１から７の何れかに記載の方法。
標識抗体の標識酵素としてアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセテートキナーゼ、ルシフェラーゼ、アミラーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素、セルラーゼ又はキサンチンオキシダーゼを使用する、請求項１から８の何れかに記載の方法。
検出方法が、発光法、蛍光法、遅延蛍光法、比色法または電気化学法である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
６員環を有する化合物で標識された蛋白質が、標的物質に対する抗体、レセプター、DNA結合蛋白質またはそれらの断片である請求項１から１０の何れかに記載の方法。