FI76380B

FI76380B - Lysande eller luminometrisk bestaemning.

Info

Publication number: FI76380B
Application number: FI840548A
Authority: FI
Inventors: Larry Jan Kricka; Gary Harold Gregory Hen Thorpe; Thomas Patterson Whitehead
Original assignee: Nat Res Dev
Priority date: 1983-02-11
Filing date: 1984-02-10
Publication date: 1988-06-30
Also published as: FI840548A0; DE3463395D1; AU575552B2; US4598044A; FI76380C; EP0116454B1; FI840548A; EP0116454A2; CA1217121A; NZ207095A; EP0116454A3; AU2427184A

Description

1 76380

Luminoiva tai luminometrinen määritys Tämä keksintö koskee parannettua luminoivaa tai luminometristä määritystä, erityisesti immuunimääritystä ja taudinmääritys-sarjaa, joka on suunniteltu määrityksen helpottamiseksi.

Immuunimääritys on yleisimmin käytettyjä analyyttisiä tekniikoita kliinisessä laboratoriossa. Nykyään useimmissa immuuni-määrityksissä käytetään merkkiaineen radioaktiivista isotooppia, erityisesti jodi-125:tä. Radioaktiivisilla isotoopeilla on kuitenkin lukuisia suuria haittoja. Ensiksi merkkausmene-telmään liittyy erittäin radioaktiivisten ja näin ollen potentiaalisesti vaarallisten aineiden käyttö. Toiseksi radioaktii-visesti merkityn aineen varastointi-ikä on usein suhteellisen lyhyt, ei vain siksi, että radioaktiivinen isotooppi on luonteeltaan jatkuvasti hajoava, vaan myös koska radioaktiivises-ti merkityt proteiinit ovat usein epästabiileja. Kolmanneksi on usein vaikeaa merkitä proteiineja riittävästi herkästi ja nopeasti havaittavan reagenssin aikaansaamiseksi. Neljänneksi radioaktiivisesti merkittyjen aineiden hävittäminen on vaivalloista.

Nämä haitat ovat kiihdyttäneet elinkelpoisten vaihtoehtojen etsimistä radiomerkkaukselle. Ollakseen sopiva merkkiaineena aineen on täytettävä ainakin seuraavat kolme vaatimusta: a. sen pitäisi olla havaittava sekä nopeasti että hyvin pieninä määrinä, kun se on kiinnitetty ligandiin, kuten antigeeniin tai vasta-aineeseen; b. pitäisi olla mahdollista kiinnittää se vaikuttamatta sen määritykseen, ligandiin kuten antigeeniin tai vasta-aineeseen, ja c. kun se on kiinnitetty, se ei saisi merkittävästi muuttaa 1igandin omina i suuk s ia.

Eräitä lupaavimpia vaihtoehtoisia merkkiaineita ovat joko aineet, jotka voivat itse ottaa osaa reaktioon, joka johtaa 2 76380 luminoivan valon säteilyyn, tai aineita, jotka sopivasti käsiteltyinä tuottavat yhdisteitä, jotka kykenevät osallistumaan luminoivaan reaktioon. Luminoiva reaktio (kemiallinen reaktio, joka johtaa luminoivan valon säteilyyn) on yleensä kestoltaan riittävä tehdäkseen mahdolliseksi säteilleen valon toteamisen ja mittaamisen ja salliakseen täten merkityn materiaalin paljouden määrittämisen. Toisaalta luminesenssin mittaus on nopea prosessi ja voidaan saattaa päätökseen muutamassa sekunnissa useiden minuuttien sijasta, jonka radioaktiivisuuden mittaaminen vaatii. Yleiskatsauksen asiasta on esittänyt T.P. Whitehead et ai., Clinical Chemistry 25, 1531-1546 (1979).

Luminesenssia on käytetty kolmessa luminoivan tai luminimetri-sen immuunimäärityksen pääsysteemissä: a. organoluminoivat tai organoluminometriset immuunimääri-tykset, joissa on käytetty kemiluminoivia tai bioluminoivia yhdisteitä, jotka osallistuvat suoraan luminoiviin reaktioihin (ts. jotka konvertoidaan viritettyyn tilaan ja palaavat sitten virittymättömään tilaan emittoiden fotonin) ligandien, kuten proteiinien, hormonien, hapteenien, steroidien, nukleiinihappojen, aineenvaihtoaineiden, antigeenien ja/tai vasta-aineiden merkitsemiseen. Esimerkkejä sopivista yhdisteistä ovat luminoli ja isoluminoli; b. luminoivan katalyytin tai kofaktorin immuunimäärityk-set, joissa luminoivien reaktioiden katalyyttejä tai kofak-toreita on käytetty merkkiaineina. Esimerkki sopivasta katalyytistä on peroksidaasientsyymi; ja c. entsyymivälitteiset immuunimääritykset, joissa luminoivia reaktioita on käytetty niiden tuotteiden määrittämiseen, joita muodostuu entsyymimerkkiaineiden vaikuttaessa sopiviin alusta-aineisiin. Eräs esimerkki tämän tyyppisestä immuunimää-rityksestä on vasta-ainevälitteisen glukoosioksidaasin määritys antamalla entsyymi/vasta-ainereagenssin reagoida glukoosin kanssa vetyperoksidin muodostamiseksi ja mittaamalla sitten muodostuneen vetyperoksidin määrä lisäämällä luminolia hallituissa olosuhteissa luminoivan reaktion initioimiseksi.

Yllä esitettyjen immuunimääritysten herkkyyden määrää osittain 3 76380 merkkiaineen tai merkkiaineen tuotteen toteamisen alaraja. Kun kyseessä on luminoiva tai luminometrinen immuunimääritys, systeemin herkkyys riippuu osittain luminoivassa reaktiossa emittoidusta valosta merkityn materiaalin yksikköä kohti. Tämän keksinnön eräänä pyrkimyksenä on saada aikaan luminoiva tai luminometrinen immuunimääritys, jolla on parantunut herkkyys, joka on saavutettu määrittämällä merkitty materiaali tai merkkiaineen tuote tällä parannetulla luminoivalla reaktiolla.

Vaikka tämä parannettu luminoiva reaktio on erityisen hyödyllinen immuunimäärityksen merkkiaineiden tai niiden tuotteiden määrityksessä, sitä ei ole millään muotoa rajoitettu tähän käyttöön. Niinpä tämän keksinnön lisäpyrkimyksenä on saada aikaan luminoiva tai luminometrinen määritys (immuunimääritys tai muu), jolla on parannettu herkkyys, joka on saavutettu liittämällä tämä parannettu luminoiva reaktio määritysmenet-telyyn.

Esimerkkejä määrityksistä, jotka eivät ole immuunimäärityksiä, mutta joihin voi liittyä kyseessä oleva luminoiva reaktio, ovat: a. elastaasimääritys, joka perustuu peroksidaasin vapautumiseen liukenemattoman peroksidaasielastiinin valmistuksessa, b. glukoosimääritys, joka perustuu yhdessä liikkumattomaksi tehtyyn glukoosioksidaasiin ja peroksidaasin, ja c. peroksidaasientsyymin, 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin tai hapettimen, kuten vetyperoksidin määritys, kun nämä materiaalit eivät ole merkkiaineita eivätkä merkkiaineiden tuotteita .

Aikaisemmassa FI-patentissamme 70728 on esitetty parannettu luminoiva tai luminometrinen määritysmenetelmä, jossa peroksidaasientsyymin, hapettimen ja kemiluminoivan dihydroftaa-liatsiinidionin annetaan reagoida, ja menetelmälle on tunnusomaista, että reaktio suoritetaan määrätyn 6-hydroksibenso-tiatsoli-yhdisteen läsnäollessa herkkyyden parantajana.

Tämän keksinnön laajimman näkökohdan mukaisesti aikaansaadaan tämän vuoksi parannettu luminoiva tai luminometrinen määritys, 76380 4 jossa luminoiva reaktio tapahtuu peroksidaasientsyymin, ha-pettiraen ja kemiluminoivan 2, 3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin välillä, jolloin reaktio suoritetaan fenoliyhdisteen läsnäollessa, jolla on kaava

OH

A (1)

— B R

jossa (i) A ja B ovat vety; ja R on halogeeni; fenyyli; —Y—-^ —V, Y:n ollessa -CH_^-, -o- tai -N=N- ja V:n ollessa vety tai Y;n ollessa -O-, -S- tai -S-S- ja V:n ollessa hydr-oksyyli; -N=N-r ^ , W;n ollessa vety tai karboksi; —; -CH=CH-Z, Z:n ollessa karboksi tai 2,4-dinit- rofenyyli; -CH CH COOC H tai C -C -alkyyli; 2 2 2 5 1 6 (ii) A on vety; B on halogeeni tai C -alkyyli; ja R on 1-6 halogeeni; (iii) A on halogeeni; B on vety; ja R on halogeeni tai fenyyli; tai (iv) A on vety tai halogeeni; R ja B yhdessä ovat nafta-leeniytimen täydentävä ketju, jolla suunnassa R:stä B;hen on kaava 5 6 7 8

—CH=C-CH=CH—, X:n ollessa vety tai halogeeni, jolloin kaavan X

(1) mukainen yhdiste on fr-naftoli, jolla on kaava;

OH

ta·*· halogeeni

C T

siili®

V

H tai halogeeni ja halogeeni kaikissa tapauksissa (i)-(iv) yllä tarkoittaa klooria, bromia tai jodia.

5 76380 Määritys on edullisesti immuunimääritys.

Tämä keksintö perustuu hämmästyttävään havaintoon, että tiettyjen helposti saatavien fenolien tai naftolien lisääminen tunnettuun 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni/hapetusaine/pe-roksidaasisysteemiin parantaa merkittävästi muodostuneen lu-minoivan reaktion herkkyyttä.

Tässä keksinnössä sanonta "parantunut" tarkoittaa, että tämän luminoivan reaktion kokonaisvaloemissio ja/tai tämän luminoi-van reaktion signaali/taustasuhde on suurempi kuin mikä saavutetaan 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni/hapetusaine/per- oksidaasisysteemillä ilman herkkyyttä parantavaa ainetta.

Vain ne määritykset, joihin liittyy luminoiva reaktio, joka on näin "parantunut", sattuvat tämän keksinnön suojapiiriin.

6 76380 Tämän systeemin erityisetuna on, että näiden fenolien tai naf-tolien lisäyksen aikaansaama parannus on spesifinen peroksi-daasientsyymiä käyttäville reaktioille.

Tämän keksinnön mukainen kemiluminoiva 2,3-dihydro-l,4-ftalat-siinidioni (DPD) voi olla mikä tahansa DPD, joka konvertoituu viritettyyn tilaan kemiluminoivassa reaktiossa ja palautuu sitten virittymättömään tilaan emittoiden valoa.

2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionilla on edullisesti yleinen kaava (2)

O

2 NH

I (2)

*3VVH

R4 ° jossa R·^ on amino- tai substituoitu aminoryhmä ja jokainen ryhmä R2, R3 ja R^ on H, valinnaisesti substituoitu C-^-Cg-alkyyli-, valinnaisesti substituoitu C^-Cg-alkenyyli-, hydroksyyli-, C^-Cg-alkoksyyli-, karboksyyli-, amino- tai substituoitu aminoryhmä tai R2 on amino- tai substituoitu aminoryhmä ja kukin ryhmistä R1# R3 ja R4 on H, valinnaisesti substituoitu C^-Cg-alkyyli-, valinnaisesti substituoitu C^-Cg-alkenyyli-, hydroksyyli-, C-^-Cg-alkoksyyli-, karboksyy li-, amino- tai substituoitu aminoryhmä tai R·^ ja R2 on ajateltu yhdessä ja ovat bentsoryhmän amino- tai substituoitu aminojohdannainen ja kumpikin ryhmästä R^ ja R^ on H, valinnaisesti substituoitu C-^-Cg-alkyyli-, valinnaisesti substituoitu Cj^-Cg-alkenyyli-, hydroksyyli-, C^-Cg-alkoksyyli-, karboksyyli-, amino- tai substituoitu aminoryhmä. Erityisen edullisia ftalatsiinidioneja käytettäväksi tässä keksinnössä ovat luminoli ja isoluminoli.

7 76380 Tässä keksinnössä substituoituun aminoryhmään liittyy amido-ryhmä.

Muoto, jonka kemiluminoiva DPD saa tämän keksinnön luminoi-vassa määritysmenetelmässä, riippuu tarkasteltavan määrityksen tyypistä. Sellaisten määritysten kuin organoluminoivien tai organo-luminometristen immuunimääritysten kyseessä ollen, joissa ftalatsiinidionia käytetään merkkiaineena, kemiluminoiva DPD on 2,3-dihydro-l,4-ftalatsonidionin substituoitu aminojoh-dannainen, jossa aminoryhmä on liittynyt ligandiin, kuten proteiiniin, hormoniin, hapteeniin, steroidiin, nukleiinihappoon, aineenvaihdunta-aineeseen, antigeeniin tai vasta-aineeseen. Aminoryhmä voi olla liittynyt suoraan ligandiin tai sillan muodostavan haaran kautta. Sopivat sillan muodostavat haarat ovat tähän alaan perehtyneille hyvin tunnettuja, mitä osoittaa niiden selostaminen brittiläisessä hakemus julkaisussa 2 008 247A ja US-patentissä 4 104 029. Edullisia sillan muodostavia haaroja ovat ne, jotka on johdettu hemisukkinaatti-, hemiglutaraatti-, hemimaleaatti-, karboksimetyyli-, glukuro-nidi-, merkaptoasetaatti- ja karboksimetyylijohdannaisista. Aminoryhmä voidaan liittää ligandiin millä tahansa sopivalla hyvin tunnetulla menettelyllä, joista jälleen tiettyjä selostetaan brittiläisessä hakemus julkaisussa 2 008 247A ja US-patentissa 4 104 029. Edullisia liittämismenettelyjä on seka-anhydridien, karbodi-imidien ja/tai aktiivisten estereiden käyttö.

Vaikka kemiluminoivia DPD-aineita, jotka sopivat käytettäväksi niissä määrityksissä, joissa käytetään ftalatsiinidionia merkkiaineena, voivat olla mitkä tahansa 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin substituoidut aminojohdannaiset, joiden aminoryhmä on liittynyt ligandiin, edullisia aineita ovat 5-amino- 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni (luminoli) ja 6-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidioni (isoluminoli), kummassakin tapauksessa aminoryhmän ollessa liittynyt ligandiin, erityisesti vasta-aineeseen.

Kun kyseessä ovat muut määritykset kuin ne, joissa käytetään ftalatsiinidioneja merkkiaineina, kemiluminoiva DPD on 8 76380 2.3- dihydro-1,4-ftalatsiinidioni, erityisesti yllä lueteltua edullista tyyppiä, joka ei ole liittynyt ligandiin. Tässä tapauksessa kemiluminoiva DPD voi olla vapaana liuoksessa tai tehty liikkumattomaksi matriisiin. Erityisen edullisia materiaaleja ovat luminoli ja isoluminoli.

Mitä tahansa yleisen kaavan I fenolia tai naftolia, joka parantaa luminoivaa reaktiota kemiluminoivan DPD:n, hapetusai-neen ja perok^idaasin välillä, voidaan käyttää kyseisessä määrityksessä. Kuitenkin seuraavien herkkyyttä parantavien aineiden on havaittu antavan erityisen korkeat herkkyyden parantumis tasot erityisesti, kun kemiluminoiva DPD on luminoli tai isoluminoli. Herkkyyttä parantavat aineet ovat 4-kloori-fenoli, 4-bromifenoli, 4-jodifenoli, 4-bromi-2-kloorifenoli, 2.4- dikloorifenoli, 3,4-dikloorifenoli, 4-metyylifenoli, 4-tert.-butyy1ifenoli, etyyli-3-(4-hydroksifenyyli)propio-naatti, 4-bentsyylifenoli, 4-(2',4'-dinitrostyryyli)fenoli, 4-hydroksikanelihappo, 4-fenyylifenoli, 2-kloori-4-fenyyli-fenoli, 4-(4'-hydroksifenyyli)bentsofenoni, 4-(fenyyliatso) fenoli, 4-{2'-karboksifenyyliatso)fenoli, 4-fenoksifenoli, 4 —(4 *-hydroksifenoksi)fenoli, 4-hydroksifenyylisulfidi, 4-hydroksifenyylidisulfidi, naft-2-oli, 1-brominaft-2-oli, 6-brominaft-2-oli ja 1,6-dibrominaft-2-oli. Näistä herkkyyden parantajista 4-jodifenoli, 4-fenyylifenoli ja 2-kloori-4-fenyylifenoli ovat erityisen tehokkaita, 4-jodifenolin ollessa kaikkein tehokkain.

Mitä tahansa peroksidaasientsyymiä (International Union of Biochemistry on määritellyt luovuttajaksi, vetyperoksidiksi; oksidoreduktaasiksi (EC n:o 1 .1 1 .1 . 7)) ,joka katalysoi 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidionin, erityisesti luminolin luminoivaa reaktiota, voidaan käyttää tämän keksinnön luminoivassa määritysmenetelmässä. Esimerkkejä ovat kasviperoksidaasit. Edullisesti entsyymi on kuitenkin piparjuuriperoksidaasi (EC n:o 1.11.1.7).

9 76380

Muoto, jonka peroksidaasientsyymi ottaa tämän keksinnön lumi-noivassa määritysmenetelmässä, riippuu tarkasteltavana olevasta määri-tystyypistä. Sellaisten määritysten, erityisesti immuunimää-ristysten kyseessä ollen, joissa peroksidaasia käytetään merkkiaineena, se liittyy ligandiin, kuten proteiiniin, hormoniin, hepteeniin, steroidiin, nukleiinihappoon, metaboliittiin, antigeeniin tai vasta-aineeseen. Yleensä peroksidaasi liittyy ligandiin sillan muodostavan haaran kautta. Sopivia sillan muodostavia haaroja ja liittämismenettelyjä ovat ne, joita kuvattiin yllä kemiluminoiville DPD-aineille.

Kun kyseessä ovat muut määritykset kuin ne, joissa käytetään peroksidaasia merkkiaineena, entsyymi on vapaassa muodossaan, joko liuoksessa tai liikkumattomana matriisissa eikä liitettynä ligandiin.

Mitä tahansa hapetusainetta, joka reagoi 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioniin, erityisesti luminolin tai isoluminolin kanssa aiheuttaen DPD:n virittymisen niin, että se emittoi valoa luminoivassa reaktiossa, voidaan käyttää kyseisessä lu-minoivassa reaktiossa. Erityisen edullisia hapetusaineita ovat perboraatti-ioni ja vetyperoksidi.

Määrityksissä, erityisesti immuunimäärityksissä, joissa käytetään 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionia tai peroksidaasi-entsyyraiä merkkiaineena ligandille, tunnettu määrä hapetusainetta lisätään reaktioseokseen, yleensä sopivasta lähteestä. Tietyissä muissa määrityksissä hapetusaineen, yleensä vetyperoksidin määrä on kuitenkin tuntematon. Tässä toisessa määritystyypissä merkkiaine on aine, usein entsyymi, kuten glukoosioksidaasi, joka osallistuu alusta-aineen konvertointiin hapetusaineeksi. Niinpä tässä tapauksessa kyseistä lumi-noivaa reaktiota käytetään merkityn ligandin määrän määrittämiseen mittaamalla hapetusaineen pitoisuus luminoivassa reak-tioseoksessa.

Valon emittoitumista tämän keksinnön luminoivasta määritysmenetelmästä vaikka se riippuukin pääasiassa peroksidaasin, hapettimen, 10 76380 herkkyyttä parantavan aineen ja kemiluminoivan DPD:n valinnasta, määräävät myös sekundääriset tekijät, kuten lämpötila, pH, reagenssin pitoisuus, sekoitusnopeus ja valon mittausmenetelmä. Kyseisen systeemin herkkyyden maksimoimiseksi nämä sekundääriset tekijät tulee säätää maksimi valoemission saamiseksi toistettavalla ja helposti mitattavalla tavalla signaalin ja taustan välisen suhteen ollessa mahdollisimman suuri.

Valitut olosuhteet ovat yleensä kompromissi, johon liittyy peroksidaasin entsyymi- tai katalyyttinen aktiivisuus, reaktion kinetiikka, käytetty laitteisto, signaalin suhde taustaan ja vaadittu herkkyys.

Nyt on havaittu, että optimitulosten saavuttamiseksi kyseinen luminoiva reaktio tulee suorittaa kohtuullisissa lämpötilan, joka vaihtelee välillä 10-50°C, ja pH:n olosuhteissa, joka vaihtelee välillä 6-10, useimmiten välillä 7-9. Sopivia pusku-rointiaineita tämän keksinnön menetelmään ovat fosfaatti, tris(hydroksimetyyli)aminometaani, 2-amino-2-metyyli-l,3-pro-paanidioli, asetaatti, karbonaatti ja boraatti.

Yleensä luminoivassa reaktioseoksessa olevien reagenssien pitoisuudet lukuunottamatta määriteltävää materiaalia, pidetään vakiona. Muuttuja voi olla esimerkiksi merkityn ligan-din, merkkiaineen tuotteen, hapetusaineen tai sitomattoman peroksidaasin pitoisuus.

Seuraavat reagenssipitoisuudet ovat erityisen sopivia käytettäväksi kyseessä olevassa luminoivassa reaktiossa: peroksidaasi 0,1 ^,ug - 5000 mg/litra hapetusaine 10 ^umoolia- 300 mmoolia/litra kemiluminoiva DPD 0,5 ^umoolia- 200 mmoolia/litra herkkyyttä parantava aine 1 ^umooli - 100 mmoolia/litra

Suoritettaessa kyseinen luminoiva reaktio tietyt näistä neljästä olennaisesta reagenssista (mutta jättäen ainakin yhden pois) asetetaan näyteputkeen. Luminoiva reaktio laukaistaan 76380 11 sitten lisäämällä putkeen puuttuvat olennaiset reagenssit. Emittoidun valon paljous voidaan määrittää standardi mittausvälineellä, kuten monistusvaloputkella, josta tuleva signaali syötetään piirturiin, oskilloskooppiin tai asteikkomittariin ja esitetään tai rekisteröidään siinä. Valo voidaan myös joissakin tapauksissa todeta paljaalla silmällä tai rekisteröidä valokuvauslevylle. Edullisesti kuitenkin valon paljous määritellään luminometrillä, joka on brittiläisessä hakemus-julkaisussa n:o 2 025 609A esitettyä tyyppiä.

Tämän keksinnön luminoivaa määritysmenetelmää voidaan käyttää kolmessa immuunimäärityksen päätyypissä, jokaisen ominaispiirteen ollessa ligandiin kiinnittyneen merkkiaineen tyyppi. Merkkiaineet ovat: a. 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin amino- tai substituoitu aminojohdannainen, jossa aminoryhmä on liittynyt ligandiin, b. peroksidaasientsyymi ja c. muu aine kuin kohdissa a ja b luetellut ja yleisesti entsyymi, kuten glukoosioksidaasi, joka osallistuu substraatin konvertointiin materiaaliksi, joka voidaan määrittää kyseessä olevalla luminoivalla reaktiolla (yleisesti vetyperoksidi tai peroksidaasi).

Yllä esitetyissä immuunimäärityksissä määriteltävän aineen tai vasta-aineen merkkaaminen tällaiseen aineeseen on mahdollista. Riippuen käytetyn merkkiaineen tyypistä määritys voi olla joko heterogeeninen tai homogeeninen. Edellisessä tapauksessa monimutkaisia nesteitä, kuten seerumia voidaan analysoida; jälkimmäisessä tapauksessa kuitenkin alustava uutto- tai puhdistusvaihe voi olla tarpeen.

Tyypillisiä heterogeenisiä tai homogeenisia luminoivia tai luminometrisiä immuunimäärityksiä hahmotellaan alla: 1. Heterogeeninen luminoiva tai luminometrinen immuunimääritvs Tässä immuunimääritystyypissä määritettävän aineen annetaan reagoida sen vasta-aineen kanssa. Vapaa vasta-aine erotetaan 1 2 76380 sitten sidotusta vasta-aineesta. Reaktion paljous määritetään merkkaamalla joko vasta-aine, määritettävä aine tai muu molekyyli, joka kykenee reagoimaan vapaiden tai sidottujen yhdisteiden kanssa erotuksen jälkeen.

2. Kilpaileva heterogeeninen luminoiva immuunimääritys Tässä tapauksessa tuntematon määrä määritettävää ainetta sekoitetaan tunnettuun määrään sanottua ainetta, joka on liitetty merkkiaineeseen, ja tunnettuun, mutta rajoitettuun määrään sen vasta-ainetta. Seurauksena on kilpaileva reaktio vasta-aineelle tarkoitetun merkatun ja merkkaamattoman aineen välillä. Vasta-aineen ja merkkaamattoman aineen väliset ja vasta-aineen ja merkatun aineen väliset kompleksit erotetaan vapaasta merkatusta ja merkkaamattomasta aineesta.

Vasta-aineeseen sitoutuneen merkatun aineen määrä on verrannollinen merkkaamattoman aineen määrään määritettävässä liuoksessa. Nämä määrät voidaan määrittää joko mittaamalla vasta-aineeseen sitoutuneen merkkiaineen määrä tai mittaamalla jäljelle jääneen vapaan merkatun aineen määrä. Esimerkkejä tästä määritystyypistä, jossa peroksidaasi on merkkiaine ja vasta-aine on sidottu kiinteään faasiin, nimittäin lasikoeputken seinämiin, esitetään brittiläisessä hakemus julkaisussa 2 044 927A.

3. "Kaksikohtainen" heterogeeninen luminometrinen immuuni-määritys Tässä immuunimääritystyypissä määritettävä aine sidotaan ensin sen merkkaamattomaan vasta-aineeseen, joka vuorostaan sidotaan kiinteän faasin tukiaineeseen, kuten muoviin. Kompleksia (vasta-aineen ja ko. aineen välillä) käsitellään sitten merkatulla vasta-aineella. Merkatun vasta-aineen analyysi saadusta kiinteästä kompleksista voidaan sitten suorittaa erottamalla kiinteä kompleksi liuoksesta ja määrittämällä sitten joko erotetussa kiinteässä kompleksissa olevan merkkiaineen määrä tai liuokseen liuenneessa merkatussa jäännösvasta-aineessa olevan merkkiaineen määrä.

Tämän tyyppisen immuunimäärityksen vaihtoehtoisissa toteutus- 13 76380 muodoissa määritettävä aine voidaan joko sitoa peräkkäin merkattuun vasta-aineeseen ja merkkaamattomaan, kiinteään tuettuun vasta-aineeseen tai sitoa sekä merkattuun että merkkaamattomaan vasta-aineeseen yhdessä sidosvaiheessa.

4. Homogeeninen luminoiva tai luminometrinen immuunimääritys Tämä on sovellettavissa immuunimäärityksiin, joissa merkkiaine on 2/3-dihydro-l/4-ftalatsiinidionin amino- tai substi-tuoitu aminojohdannainen. Se riippuu siitä, että valo, joka emittoituu kiinnostavasta vapaasta merkatusta aineesta (tai sen vasta-aineesta), on voimakkuudeltaan ja aallonpituudeltaan erilainen kuin valo, joka emittoituu kiinnostavasta sidotusta merkatusta aineesta (tai sen vasta-aineesta).

Eräässä esimerkissä havaittiin, että sen valon voimakkuus, joka emittoitui (progesteroni-isoluminolijohdannais-)konjugaa-tin, verikatalyytin ja vetyperoksidin reaktiosta, oli pienempi kuin samassa reaktiossa, joka suoritettiin anti-progesteronin IgG läsnäollessa.

Näin ollen määrityksessä inkuboitiin ensin tuntematonta pro-gesteroninäytettä tunnetun määrän kanssa anti-progesteronia IgG. Kun tasapaino oli saavutettu, lisättiin tunnettu määrä progesteroni-isoluminolijohdannaiskonjugaattia ja sen jälkeen tunnettu määrä verta ja vetyperoksidia. Emittoitunut valo mitattiin ja tuntemattomassa näytteessä oleva progesteronin määrä määritettiin sen avulla standardikäyrästä. (Mitä enemmän progesteronia on läsnä tuntemattomassa näytteessä, sitä vähemmän vapaata IgG:tä on jäljellä tasapainossa ja sitä pienempi on valosaanto luminoivasta reaktiosta).

Tällä tavoin progesteronin määritys voidaan saavuttaa ilman, että vaaditaan erotusvaihetta.

Kaikissa yllä esitetyissä immuunimääritykeissä paljouden määritys-, toteamis- tai paikantamisvaiheissa voidaan käyttää tämän keksinnön mukaista luminoivaa reaktiota.

14 76380

Yllä esitetyissä immuunimäärityksissä käytetyt vasta-aineet voidaan ostaa kaupallisesti tai valmistaa tunnetulla immunologisella tekniikalla. Vasta-aineet voivat olla vasta-aineiden monimutkaisen seoksen muodossa tai ne voivat olla yhtenä tai useampana monoklonaalisena vasta-aineena. Yleensä vaaditaan vain pieni tilavuusmäärä vasta-ainetta ja sitä pidetään pH-, ionivahvuus- ja lämpötilaolosuhteissa, jotka ovat asianmukaisia sen aktiivisuudelle.

Seuraavan epätäydellisen luettelon aineiden vasta-aineita voidaan hyödyllisesti käyttää immuunimäärityksissä, joissa käytetään kyseessä olevaa luminoivaa reaktiota: proteiinit, kuten insuliini, alfafetoproteiini ja ferritiini, hormonit, kuten kasvuhormoni, paratyroidihormoni, follikkelia stimuloiva hormoni, keltarauhashormoni, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, adrenokortikotrooppinen hormoni, glukagoni, prolaktiini ja kalsitoniini, hapteenit/steroidit, kuten estrioli, progesteroni ja kortisoli, lääkkeet, kuten digoksiini, antigeenit kuten solun pinta-antigeenit ja alkiokautinen syöpäanti-geeni ja vasta-aineet, kuten sikotautiviruksen vasta-aine, ihmisen immunoglobuliini G (IgG), kaniinin IgG, lampaan IgG, marsun IgG, aasin IgG ja ihmisen immunoglobuliinit E ja M.

Tämän keksinnön luminoivaa määritysmenetelmää voidaan myös käyttää muissa määrityksissä kuin yllä kuvatuissa immuunimäärityksissä.

Näitä ovat: 1. Elastaasin määritys, joka perustuu peroksidaasin vapautumiseen liukenemattomasta peroksidaasielastiinivalmisteesta Tässä määrityksessä elastiini-peroksidaasikonjugaattia inkuboi-daan vaihtelevien määrien kanssa elastaasientsyymiä. Ennalta määrätyn ajan kuluttua reagoimaton konjugaatti poistetaan sentrifugoimalla ja yläpuolisesta nesteestä määritetään sitoutumaton peroksidaasi.

Yläpuolisessa nesteessä olevan sitoutumattoman peroksidaasin määrä on verrannollinen elastaasin aktiivisuuteen testatussa näytteessä.

15 7 6 3 8 0 2. Proteinaasin määritys, joka perustuu isoluminolin vapautumiseen synteettisestä peptidialustasta Tässä määrityksessä liikkumattomaksi tehtyä synteettistä pepti-dialustaa, Affigel 10-Ala-Ala-Ala-Phe-isoluminolia käsitellään vaihtelevilla määrillä proteinaasia. Ennalta määrätyn ajan kuluttua reagoimaton alusta-aine poistetaan sentrifugoimalla ja yläpuolisesta nesteestä määritetään isoluminoli. Yläpuolisessa nesteessä olevan isoluminolin määrä on verrannollinen proteinaasiaktiivisuuteen testatussa näytteessä.

3. Glukoosin määritys, joka perustuu yhdessä liikkumattomaksi tehtyyn glukoosioksidaasiin ja peroksidaasiin Tässä määrityksessä glukoosioksidaasi ja peroksidaasi tehdään yhdessä liikkumattomiksi tukiaineelle, esim. Sepharose^ tai muoviputkille. Tähän lisätään luminolin ja herkkyyttä parantavan aineen liuos. Lopuksi lisätään glukoosin liuos ja valo-emissio rekisteröidään. Valoemissio on suoraan verrannollinen glukoosin määrään liuoksessa.

Kyseessä olevan määrityksen pääkäyttö on kliinisissä laboratorioissa tai lääkärien vastaanotoilla. Tällaisissa laboratorioissa ja/tai vastaanotoilla on tavallista, että määrätyssä määritysmenettelyssä käytetyt materiaalit saadaan määritysvälinesarjän muodossa.

Näin ollen tämä keksintö kohdistuu myös määritysvälinesarjaan käytettäväksi tämän keksinnön parannetussa luminoivassa tai luminometrisessa määrityksessä, joka sarja sisältää: a. peroksidaasientsyymiä, b. yleisen kaavan I herkkyyttä parantavaa ainetta, jossa kaavassa R, A ja B ovat samat kuin yllä määriteltiin, c. kemiluminoivaa 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionia.

Testivälinesarja voi sisältää myös hapetusainetta, mutta monissa tapauksissa tämä materiaali voidaan joko hankkia erikseen tai se voi olla määritettävä aine.

16 76380

Edullisesti peroksidaasientsyymi, hapetusaine, herkkyyttä parantava aine ja kemiluminoiva DPD on kukin yksi luetelluista aineista, jotka ovat hyödyllisiä käytettäväksi kyseisessä määrityksessä. Kyseessä olevan määritysvälinesarjän erityisen edullisessa toteutusmuodossa ainakin toinen peroksidaasient-syymistä ja kemiluminoivasta DPDistä liitetään määritettävän aineen vasta-aineeseen.

Valinnaisesti määritysvälinesarja voi sisältää myös yhtä tai useampaa standardiliuosta, jotka kukin sisältävät tunnetun määrän määritettävää ainetta ja/tai yhtä tai useampaa edullista puskuriliuosta. Määritysvälinesarja voi sopivasti sisältää myös reaktioastian, joka sopii käytettäväksi sen laitteiston yhteydessä, jota käytetään määrityksen suorituksen kuluessa emittoituneen valon määrittämiseen. Määritysväline-sarjaan voi kuulua myös sekoituslaite, jota käytetään varmistamaan reagenssien riittävä sekoittuminen.

Tämän keksinnön määritystä ja määritysvälinesarjaa kuvataan nyt ainoastaan esimerkin avulla.

Materiaalit ja menetelmät Reagenssit

Piparjuuriperoksidaasi (HRP: puhtausluku (suhde optinen tiheys 430 nm:ssä/250 nm:ssä; RZ) suunnilleen 1,0) saatiin yhtiöltä Hughes and Hughes Ltd., Romford, Essex ja puhdistettiin geelisuodatuksella käyttäen 2,6 x 40 cm:n Ultragel ACA 34-kolonnia (LKB Instruments Ltd., South Croydon, Surrey). Kolonnia eluoitiin käyttäen 0,015 moolia/l:n fosfaattipuskuria, pH 7,2, joka sisälsi 0,15 moolia/l NaCl; saadun puhdistetun peroksidaasin RZ-arvo oli n. 3,0.

Alfa-fetoproteiini (AFP), kaniinin anti-ihmisen AFP (koodi 100-008) ja kaniinin anti-ihmisen AFP/HRP-konjugaatti saatiin yhtiöltä Dako Products, Mercia Brocades Ltd., Brocades House, Pyrford Road, West Byfleet, Weybridge, Surrey.

Tyroksiini(T4), kaniinin anti-T4-päällysteiset putket ja 76380 T4/HRP-konjugaatti saatiin yhtiöltä Boehringer Corporation, Lewes, Sussex, UK.

Rubella-viruksella (ihmisen) päällystetyt palloset ja anti-ihmisen IgG (vuohi)/HRP-konjugaatti saatiin yhtiöltä Abbott Laboratories Ltd., Diagnostic Division, Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire.

Anti-IgE:llä (vuohi) päällystetyt putket ja anti-IgE (kaniini)-peroksidaasikonjugaatti saatiin yhtiöltä Behringwerke AG, Marburg.

Luminoli (5-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni) ja iso-luminoli (6-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni) saatiin yhtiöltä Sigma Chemical Co., Fancy Road, Poole, Dorset, UK. Luminolin mononatriumsuola valmistettiin edellä kuvatulla tavalla (Ham et ai., Anal. Lett., 1979, 12, 535).

7-dimetyyliaminonaftaleeni-1,2-dikarboksyylihappohydratsidi (kaava 2, R^ ja R2 on ajateltu yhdessä ja ovat dimetyyli-aminosubstituoitu bentsoryhmä, R^ = R^ = H) saatiin yhtiöltä Boehringer Mannheim.

N-(6-aminoheksyyli)-N-etyyli-isoluminoli saatiin yhtiöltä LKB, Suomi.

Kaikki fenolit ja naftolit saatiin yhtiöltä Aldrich Chemical Co., paitsi 2-kloorifenoli ja 2,4,6-trikloorifenoli (saatiin yhtiöltä Fluka AG, Chemische Fabrik, CH 9470, Buchs, Sveitsi), 2-naftoli (saatiin yhtiöltä BDH Chemicals Ltd., Atherstone, Warwickshire) ja 4-hydroksifenyylisulfidi (saatiin yhtiöltä Fluorochem Ltd., Glossom, Derbyshire).

Elastiini, elastaasi ja glukoosioksidaasi saatiin yhtiöltä Sigma Chemical Co., Dorset).

Analyysilaitteisto

Kemiluminoivat reaktiot suoritettiin 10 x 10 mm:n 4 ml:n 18 763 80 tilavuisilla muovisilla kertakäyttökyveteillä (W. Sarstedt Ltd., Leichester LE3 1UQ, UK). Emittoidun valon paljous määritettiin luminometrilla, jota edellä kuvattiin (Carter et ai., UK-hakemusjulkaisu 2025609A) , jossa on muunnos, joka sallii useiden kyvettien asettamisen peräkkäin tarkasti ja toistettavasti valomonistinputken valokatodin eteen.

Tulokset esitettiin nopealla potentiometrisella diagramma-piirturilla (Type PM 8202; Philips, Eindhoven, Hollanti; täyden skaalan näyttöaika alle 0,25 s).

Esimerkki 1

Peroksidaasin luminoiva määritys käyttäen luminolia ja 4-jodifenolia

Natriumluminolia (50 mg) ja vetyperoksidia (62 ^ul, 30 % paino/tilavuus) lisättiin 200 ml:aan tris-puskuria (0,1-molaarinen, pH 8,5). Liuos valmistettiin useita tunteja ennen käyttöä luminoivan reaktion initioimiseksi. 10 ^ul 4-jodife-nolia dimetyylisulfoksidissa (4,54 mmoolia/1) asetettiin kyvetin yhteen nurkkaan ja 10 ^ul kaniinin anti-AFP-HRP-kon-jugaattia (1:1000-laimennus) asetettiin toiseen nurkkaan.

Reaktio initioitiin ruiskuttamalla luminoli/H202-reagenssi (0,9 ml). Valon ulostulo mitattiin ja esitetään taulukossa 1. Signaali/taustasuhteen parannus mitattiin myös ja esitetään taulukossa 2 .

Esimerkit 2-3

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että lisätty 4-jodifenoliliuoksen määrä nostettiin 20 ^uljaan ja 90 ^uljaan. Valon ulostulo mitattiin ja esitetään taulukossa 1. Signaali/ taustasuhteen parannus mitattiin myös ja esitetään taulukossa 2.

Esimerkit 4-8

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että 4-jodifenoli korvattiin seuraavilla herkkyyttä parantavilla aineilla: 19 7 6380 4-bromifenoli 4-kloorifenoli 4-bromi-2-kloorifenoli 2.4- dikloorifenoli 3.4- dikloorifenoli

Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2.

Esimerkit 9-13

Esimerkkien 4-8 menettely toistettiin paitsi, että lisätyn herkkyyttä parantavan aineen liuoksen määrä nostettiin 90 ^ul:aan. Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2.

Esimerkit 14-16

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että 4-jodifenoli korvattiin seuraavilla herkkyyttä parantavilla aineilla: 4-hydroksikanelihappo 2-naftoli 6-brominaft-2-oli

Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2.

Esimerkit 17-19

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että 10 ^,ul 4-jodi-fenolia korvattiin 5 ^ul:lla seuraavia herkkyyttä parantavia aineita: 4-fenyylifenoli 1,6-dibrominaft-2-oli 1-brominaft-2-oli

Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2.

Esimerkit 20-24

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että 10 ^ul 4-jodi-fenolia korvattiin 5 ^ulilla seuraavia herkkyyttä parantavia aineita: 20 7 6 3 8 0 bis-4-bydroksifenyylisulfidi bis-4-hydroksifenyylidisulfidi 4 — (2',41-dinitrostyryyli)fenoli 4-(4'-hydroksifenyyli)bentsofenoni 4 — (4'-hydroksifenoksi)fenoli

Signaali/taustasuhteen parannus mitattiin ja esitetään taulukossa 3.

Esimerkit 25-28

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että 10 ^ul 4-jodi-fenolia korvattiin 20 ^,ul:lla seuraavia herkkyyttä parantavia aineita: 4- (fenyyliatso)fenoli 4-(2'-karboksifenyyliatso)fenoli 4-bentsyylifenoli

Etyyli-3-(4-hydroksifenyyli)propionaatti

Signaali/taustasuhteen parannus mitattiin ja esitetään taulukossa 3 .

Vertailuesimerkki

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että mitään herkkyyttä parantavaa ainetta ei lisätty luminoivaan reaktioseok-seen. Tulokset esitetään taulukoissa 1, 2 ja 3.

Taulukko 1

Valoemission parantaminen eri fenoleilla ja naftoleilla

Esi- Lisätty Valoemissio merkki Parannusaine tilavuus( /Ui) (mV 700 V PM)

Vertailu - _ 11 0 2-kloori-4-fenyylifenoli 5 713/ 1 4-jodifenoli 10 903 2 4-jodifenoli 20 1958 3 4-jodifenoli 90 3056 4 4-bromifenoli 10 261 5 4-kloorifenoli 10 190 6 4-bromi-2-kloorifenoli 10 80 7 2,4-dikloorifenoli 10 29 8 3,4-dikloorifenoli 10 20 2i 76380

Taulukko 1 (jatkoa)

Valoemission parantaminen eri fenoleilla ja naftoleilla

Esi- Lisätty Valoemissio merkki Parannusaine tilavuus ( ,ul) (mV 700 V PM) 9 4-bromifenoli 90 1379 10 4-kloorifenoli 90 1190 11 4-bromi-2-kloorifenoli 90 555 12 2,4-dikloorifenoli 90 165 13 3,4-dikloorifenoli 90 82 14 4-hydroksikanelihappo 10 2317 15 2-naftoli 10 50 16 6-bromina£t-2-oli 10 42 17 4-fenyylifenoli 5 5830 18 1,6-dibrominaft-2-oli 5 2401 19 1-brominaft-2-oli 5 651 NB: valoemissio mitataan ulostulona (mV) 700 V:n valo-monistimen jännitteellä.

Taulukko 2

Esi- Signaali/taustasuhteen merkki parannus_

Vertailu 1 0 3674 1 1 70 2 510 3 1697 4 40 5 25 7 7 8 4 9 476 10 357 12 258 -13 44 14 2935 15 1698 16 1268 22 7 63 8 0

Taulukko 2 (jatkoa)

Esi- Signaali/taustasuhteen merkki parannus_ 17 3482 18 2055 19 3931

Taulukko 3

Esi- Lisätty Signaali/tausta- merkki Parannusaine tilavuus(^ul) suhteen parannus

Vertailu - 1 2 0 bis-4-hydroksifenyylisulfidi 5 73 21 bis-4-hydrdksifenyylidisulfidi 5 1724 22 4-(2',4'-dinitrostyryyli)- fenoli 5 73 23 4-(4'-hydroksifenyyli)- bentsofenoni 5 118 24 4-(4'-hydroksifenoksi)- fenoli 5 521 25 4-(fenyyliatso)fenoli 20 659 26 4-(2'-karboksifenyyliatso) fenoli 20 171 27 4-bentsyylifenoli 20 109 28 Etyyli-3-(4-hydroksi- fenyyli)propionaatti 20 86 23 76380

Esimerkit 29-32

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että 4-jodifenoli korvattiin eri vaihtoehtoisilla fenoleilla ja naftoleilla (10 ^ul, 1 mg/ml liuosta DMSO:ssa). Valon ulostuloa verrattiin luminoivan reaktion valon ulostuloon ilman parannusainetta.

Jos valon ulostulo oli suurempi fenolin tai naftolin läsnäollessa kuin ilman sitä, luminoivan reaktion sanottiin parantuneen. Tulokset esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4

Eri fenolien ja naftolien vaikutus valon ulostuloon Esimerkki Fenoli/naftoli Parannus 29 4-kloori-3-metyylifenoli Kyllä 30 4-metyylifenoli Kyllä 31 4-tert.-butyylifenoli Kyllä 32 4-fenoksifenoli Kyllä

Esimerkki 33

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että N-(6-amino-heksyyli)-N-etyyli-isoluminoli korvasi luminolin.

Esimerkki 34

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että luminoli korvattiin isoluminolilla.

Esimerkki 35

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että luminoli korvattiin 7-dimetyyliaminonaftaleeni-1,2-dikarboksyylihappo-hydratsidilla (9-dimetyyliamino-2,3-dihydrobentso/ f7-ftalat-siini-1,4-dioni) ja ftalatsiinidioni/I^C^ laimennettiin suhteessa 1:10 ennen käyttöä.

Esimerkki 36

Esimerkin 1 menettely toistettiin paitsi, että vetyperoksidi korvattiin natriumperboraatilla.

24 7 6 3 8 0

Esimerkki 37 - Alfafetoproteiinin (AFP) määritys a. Polystyreenipallosten päällystäminen anti-AFP;llä (1) 500 ml:n laajasuiseen lasipulloon lisättiin 125 ml glysii-ni/NaOH-puskuria (0,1 moolia/1, pH 8,8) ja 0,25 g BSA:a. Liuosta sekoitettiin sitten 2 tuntia telasekoittajalla 20°C:ssa. Tämän ajan kuluttua pullo (ja sen korkki) huuhdeltiin glysii-nipuskurilla (3 x 50 ml) kaiken sitoutumattoman albumiinin poistamiseksi ja lopuksi sen annettiin valua kuivaksi.

(2) 1000 polystyreenipallosta pestiin Lipsol-nesteellä (kauppanimi,1 %, 500 ml) 30 minuuttia. Kun pallosia oli pesty tislatulla vedellä, ne asetettiin Buchner-kolviin yhdessä 200 ml:n kanssa glysiinipuskuria ja kaasu poistettiin niistä.

(3) Glysiinipuskuri (400 ml) siirrettiin esipäällystettyyn lasipulloon ja kaniinin anti-ihmisen AFP:a (1,5 ml) lisättiin. Liuosta sekoitettiin hyvin ja sen jälkeen kaasuttomat palloset lisättiin. Koko seosta sekoitettiin telasekoittimella 6 tuntia 20°C:ssa.

(4) 6 tunnin kuluttua glysiinipuskuri-vasta-aineliuos dekan-toitiin ja palloset pestiin kahdesti 400 ml:lla PBS:a (0,0015 ml/1 fosfaattia, 0,15 moolia/1 NaCl, pH 7,2). Kun toinen PBS-pesu oli dekantoitu, BSA:n liuos (0,5 %) PBS:sä (400 ml) lisättiin. Jälleen koko seosta sekoitettiin telasekoittimella 20°C:ssa.30 minuutin kuluttua PBS-albumiini-liuos poistettiin ja asetaattipuskuria (0,1 moolia/1, pH 4,2, 400 ml), joka sisälsi Tween 20-pesuainetta (kauppanimi, 0,01 %) lisättiin. Sekoitusta suoritettiin 10 minuutin ajan ja sen jälkeen asetaattipuskuri korvattiin PBS-puskurilla, joka sisälsi 0,05 % Tween-pesuainetta (2 x 400 ml). Lopuksi PBS dekantoitiin ja pallosia kuivattiin suodatinpaperilla 20° C:ssa 30 min. Pallosia säilytettiin kierrekorkkisissa pulloissa 4°C:ssa.

b. (1) Riittävästä määrästä vasta-aineella päällystettyjä pallosia (vaihe a. yllä) PBSrssä poistettiin kaasua 15-30 minuutin ajan.

25 7 6 3 8 0 (2) 50 ^ul näytettä, joka sisälsi AFP:a, lisättiin kyvet-tiin yhdessä 0,95 ml:n kanssa PBS/BSA/Tween-pesuainetta (fosfaattia 0,015 moolia/1; NaCl 0,15 moolia/1; BSA 0,2 %;

Tween 20 0,05 %; pH 7,2). Liuos lämmitettiin 37°C:een ja haudottiin sitten pallosten kanssa 1 tunnin ajan.

(3) Sen jälkeen liuos dekantoitiin ja palloset pestiin PBS/Tween-liuoksella (200 ml 15 s, sitten 200 ml 5 min).

(4) Pallosia inkuboitiin sitten 0,9 ml:n kanssa l:1000-lai-mennusta kaniinin anti-ihmis - AFP/HRP-konjugaattia 1 tunnin ajan. (Konjugaatti laimennettiin PBS/BSA/Tween-liuoksella ja lämmitettiin 37°C:een ennen lisäystä pallosiin).

c. (1) Liuos dekantoitiin jälleen kerran ja palloset pestiin ionivaihdetulla tislatulla vedellä 2 minuuttia. Veden dekan-toinnin jälkeen palloset siirrettiin varovasti kyvetteihin (yksi kyvettiä kohti).

(2) Jokaisen kyvetin kulmaan asetettiin myös 10 ^,ul 4-jodi-fenolia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,1 moolia/1, pH 8,0). Luminoiva reaktio initioitiin ruiskuttamalla 0,9 ml luminoli/ H2°2~^;‘'uosta (natriumlumin°lia (50 mg) , H202 (62 ^ul; 30 % paino/tilavuus), Tris (0,1 moolia/1, pH 8,0, 200 ml)). Valo-emissio mitattiin 30 s kuluttua ja verrattiin aikaisemmin valmistettuun standardikäyrään AFP-pitoisuuden määrittämiseksi.

Esimerkki 38 - T4:n määritys T4 määritettiin käyttäen kilpailevaa entsyymisidoksista immuu-nisorboivaa määritystä. Näytteen seosta, joka sisälsi merk-kaamatonta T4:a ja T4/HRP-konjugaattia, haudottiin putkilla, jotka oli päällystetty rajoitetulla määrällä anti-T4:a (kaniini) .

Kun tasapaino oli saavutettu, sitoutumaton materiaali pestiin putkista ja 10 ^ul 4-jodifenolia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,1 moolia/1, pH 8,0) asetettiin jokaiseen putkeen. Luminoiva 26 76380 reaktio initioitiin ruiskuttamalla 0,9 ml luminoli/P^C^-liuosta (natriumluminolia (50 mg), H2<D2 30 % paino/ tilavuus), Tris (0,1 moolia/1, pH 8,0, 200 ml)). Valoemissio 30 s kuluttua mitattiin ja sitä verrattiin aikaisemmin valmistettuun standardikäyrään T4-pitoisuuden määrittämiseksi.

Esimerkki 39 - Vihurirokon anti-igG:n määritys Testinäytettä, joka sisälsi vihurirokon anti-IgG:ä, inkuboi-tiin vihurirokkoviruksella (ihmisen) päällystettyjen pallosten kanssa Tris-puskurissa. Kun pallosista oli pesty pois reagoimattomat komponentit, niitä inkuboitiin anti-ihmis-IgG (vuohi)/HRP-konjugaatin kanssa jälleen Tris-puskurissa.

Liuos dekantoitiin ja palloset pestiin ionivaihdetulla tislatulla vedellä. Kun pestyt palloset oli poistettu vedestä, ne siirrettiin kyvetteihin (yksi kyvettiä kohti).

Jokaisen kyvetin kulmaan asetettiin myös 10 ^ul 4-jodifenolia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,1 moolia/1, pH 8,0). Luminoiva reaktio initioitiin ruiskuttamalla 0,1 ml luminoli/H2C>2-liuosta (natriumluminolia (50 mg), H202 (62 ^,ul; 30 % paino/ tilavuus), Tris (0,1 moolia/1, pH 8,0, 200 ml)). Valoemissio 30 s kuluttua mitattiin ja sitä verrattiin aikaisemmin valmistettuun standardikäyrään vihurirokon anti-IgG:n pitoisuuden määrittämiseksi.

Esimerkki 40 - igE:n määritys Näyte, joka sisälsi ihmisen IgE:ä, lisättiin anti-IgE:llä (vuohi) päällystettyihin putkiin ja inkuboitiin 2 tuntia 20°C:ssa. Tämän ajan kuluttua putket pestiin reagoimattomien komponenttien poistamiseksi ja tunnettu määrä anti-IgE (kaniini) -peroksidaasikonjugaattia lisättiin putkiin ja inkuboitiin vielä 2 tuntia 20°C:ssa. Ylimääräiset entsyymikonjugoidut vasta-aineet pestiin sitten pois ja sitoutuneen entsyymin aktiivisuus määritettiin seuraavasti:

Jokaisen putken kulmaan asetettiin 10 ^,ul 4-jodifenolia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,1 moolia/1, pH 8,0). Luminoiva 27 7 6 3 8 0 reaktio initioitiin ruiskuttamalla 0,9 ml luminoli/i^C^:a (luminolia (50 mg), Η202 (62 yUl, 30 % paino/tilavuus), Tris-puskuria (0,1 moolia/1, pH 8,0, 200 ml)). Valoemissio 30 s kuluttua mitattiin ja sitä verrattiin aikaisemmin valmistettuun standardikäyrään IgE-pitoisuuden määrittämiseksi.

Esimerkki 41 - Elastaasin määritys

Piparjuuriperoksidaasia konjugoitiin jauhettuun elastiiniin menetelmällä, jonka ovat esittäneet G.C. Saunders et ai.,

Anal. Biochem. 1982, 126, 122. 1 ml elastiiniperoksidaasin suspensiota pestiin ja tasapainotettiin 2 ml:ssa 0,01 moolia/ 1:n Tris-puskuria (pH 9), joka sisälsi CaCl2:a (2 mmoolia/1), 0,5 h 37°C:ssa. Konjugaatti sentrifugoitiin ja yläpuolinen neste heitettiin pois. Eri määrät elastaasia (0-100 ng/ml) Tris-CaCl2~puskurissa lisättiin ja inkuboitiin 37°C:ssa elas-tiini-HRP:n kanssa. 60 minuutin kuluttua reagoimaton elas-tiini-HRP poistettiin sentrifugoimalla ja yläpuolisen nesteen jae poistettiin ja sentrifugoitiin. 200 ^,ul yläpuolista nestettä poistettiin ja asetettiin kyvettiin ja valoemissio initioitiin lisäämällä 0,9 ml luminoli/H2C>2/4-jodifenoliliuos-ta (natriumluminolia (50 mg), Η202 (62 ^ul; 30 % paino/tilavuus) , 4-jodifenolia (2 ml, 1 mg/ml DMSO:ssa) 200 ml:ssa Tris-puskuria (0,1 moolia/1, pH 8,0)).

Valoemissio 30 s kuluttua mitattiin.

Esimerkki 42

Glukoosin määritys, joka perustuu yhdessä liikkumattomaksi tehtyyn glukoosioksidaasiin ja peroksidaasiin Glukoosioksidaasi (5 mg; Sigma) ja piparjuuriperoksidaasi (5 mg; Sigma) tehtiin yhdessä liikkumatttomaksi syaanibromi-dilla aktivoidulle Sepharose-hartsille (Pharmacia, UK) menettelyllä, jonka ovat esittäneet Ford ja DeLuca, Anal. Biochem, 1981, 110, 43. Liikkumattomaksi tehdyt entsyymit suspendoi-tiin fosfaattipuskuriin (0,1 moolia/1, pH 7,0). Liikkumattomaksi tehtyjen entsyymien suspensio (100 mg/1, 50 ^ul) lisättiin 1 mlsaan luminolin vesiliuosta (25 mg/100 ml) ja 50 ^ul:aan 28 7 6 3 8 0 4-jodifenolia (1 mg/ml DMSO:ssa), jotka sisältyivät kyvet-tiin. 10 ^ul:n vesipitoinen näyte glukoosia sisältävää liuosta lisättiin sitten, kyvetin sisältöä sekoitettiin ja valoemis-sio rekisteröitiin. Huippuvaloemissio oli lineaarinen välillä 50-500 nmoolia glukoosia. Vaihtoehtoisesti glukoosioksidaasi ja peroksidaasi voidaan tehdä liikkumattomaksi muovitukien pinnalle (esim. Leon et ai., Clin. Chem., 1977, 23, 1556).

Claims

29 7 6 3 8 0

1. Parannettu luminoiva tai luminometrinen määritysmene telmä, jossa kerniluminoiva reaktio tapahtuu peroksidaasient-syymin, hapettimen ja kemiluminoivan aineen 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin välillä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan fenoliyhdisteen läsnäollessa, jolla on kaava: OH ArA R jossa (i) A ja B ovat vety; ja R on halogeeni; fenyyli; -Y-Q -V, Y:n ollessa -CH^- tai -O- ja V:n ollessa vety tai Y:n ollessa -O-, -S- tai -S-S- ja V:n ollessa hydroksyyli; -N=N-^ ^ , W: n ollessa vety tai karboksi; -CO-^~^ ; W -CH=CH-Z, Z:n ollessa karboksi tai 2,4-dinitrofenyyli; -CH CH COOC H tai C -C -alkyyli; 2 2 2 5 1 6 (ii) A on vety; B on halogeeni tai C -alkyyli; ja R on l—o halogeeni; (iii) A on halogeeni; B on vety; ja R on halogeeni tai fenyyli; tai (iv) A on vety tai halogeeni; R ja B ovat yhdessä nafta-leeniytimen täydentävä ketju, jolla suunnassa R:stä B:hen on kaava 5 6 7 8 . . -CH=C-CH=CH-, X:n ollessa vety tai halogeeni, jolloin kaavan i X (1) mukainen yhdiste on β-naftoli, jolla on kaava: OH

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemiluminoiva aine 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiini-dioni on luminoli, isoluminoli, N-(6-aminoheksyyli)-N-etyyli-isoluminoli tai 7-dimetyyliaminonaftaleeni-l,2-dikarboksyyli-happohydratsidi.

2. H tai halogeeni :(X li il8 511 1 7 6J H tai halogeeni 30 7 6 3 8 0 ja halogeeni kaikissa tapauksissa (i)-(iv) yllä tarkoittaa klooria, bromia tai jodia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peroksidaasientsyymi on piparjuuripe-roksidaasi.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hapetin on vetyperoksidi tai perboraatti-ioni.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peroksidaasientsyymi on läsnä ligandiin sidotussa muodossa ja läsnäolevan peroksidaasient-syymin määrä määritetään havaitsemalla tai mittaamalla kemi-luminesenssi.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fenoliyhdiste on 4-jodifenoli, 4-fenyylifenoli tai 2-kloori-4-fenyylifenoli.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni on luminoli tai isoluminoli, peroksidaasientsyymi on piparjuuriperoksidaasi ja se on läsnä ligandiin sidotussa muodossa ja läsnäolevan piparjuuriperoksidaasin määrä määritetään havaitsemalla tai mittaamalla kemiluminesenssi, hapetin on vetyperoksidi ja fenoliyhdiste on 4-jodifenoli. 76380

8. Määritysvälinesarja käytettäväksi luminoivassa tai luminometrisessä määritysmenetelmässä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat komponentit erillisissä säiliöissä: kemiluminoiva aine 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni, peroksidaasientsyymi, ja vaatimuksessa 1 määritetty fenolinen yhdiste.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen määritysvälinesarja, tunnettu siitä, että kemiluminoiva aine 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni on luminoli, isoluminoli. N-(6-aminoheksyy-li)-N-etyyli-isoluminoli tai 7-dimetyyliaminonaftaleeni-l,2-dikarboksyylihappohydratsidi.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen määritysvälinesar ja, tunnettu siitä, että peroksidaasientsyymi on pipar-juuriperoksidaasi.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukainen määritysvä-linesarja, tunnettu siitä, että peroksidaasientsyymi on läsnä ligandiin sidotussa muodossa.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 8-11 mukainen määritysvä-linesarja, tunnettu siitä, että fenoliyhdiste on 4-jodife-noli, 4-fenyylifenoli tai 2-kloori-4-fenyylifenoli.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen määritysvälinesarja, tunnettu siitä, että 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni on luminoli tai isoluminoli, peroksidaasientsyymi on piparjuuri-peroksidaasi ja se on läsnä ligandiin sidotussa muodossa ja fenoliyhdiste on 4-jodifenoli. 76380