JPS6080765A - 免疫分析方法 - Google Patents

免疫分析方法

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Publication number
JPS6080765A
JPS6080765A JP19034083A JP19034083A JPS6080765A JP S6080765 A JPS6080765 A JP S6080765A JP 19034083 A JP19034083 A JP 19034083A JP 19034083 A JP19034083 A JP 19034083A JP S6080765 A JPS6080765 A JP S6080765A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antigen
antibody
light emission
microcapsule
complement
Prior art date
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Pending
Application number
JP19034083A
Other languages
English (en)
Inventor
Takeshi Sakamaki
坂巻 武司
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toshiba Corp
Original Assignee
Toshiba Corp
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Filing date
Publication date
Application filed by Toshiba Corp filed Critical Toshiba Corp
Priority to JP19034083A priority Critical patent/JPS6080765A/ja
Publication of JPS6080765A publication Critical patent/JPS6080765A/ja
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 この発明は、試料中の特定の抗原や抗体を定量分析する
だめの免疫分析方法に関する。
〔発明の技術的背景とその問題点〕
アイソトープで標識した抗体(または抗原)と生体より
採取した試料中の抗原(または抗体)との抗原抗体反応
を利用して試料中の特定の抗原(または抗体)を定量分
析するラジオイムノアッセイ法や、酵素で標識した抗体
(または抗原)と生体より採取した試料中の抗原(また
は抗体)との抗原抗体反応により抗原抗体結合物な得、
その抗原抗体結合物に標識した酵素による酵素反応を利
用して試料中の特定の抗原(または抗体)を定量分析す
るエンザイムイムノアツセイ法等がある。
しかしながら、前記ラジオイムノアッセイ法は、放射性
?l質を利用するので設備が大かかりになるという欠点
があり、また、ラジオイムノアッセイ法およびエンザイ
ムイムノアツセイ法のいずれにおいても、十分な検出感
度に達するまでには数時間から数十時間を要して分析に
長時間な喪するという欠点がある。
〔発明σ少目的〕
この発明は前記事情に鑑みてなされたものであ体を簡単
な装置で感度良く高精度に分析することのできる簡便な
免疫分析方法を提供することを目的とするものである。
〔発明の概要〕
前記目的を達成するためのこの発明の概要は、抗体(ま
たは抗原)な表面に結合すると共にその内部に、発光関
与物質を封入するマイクロカプセルを有する第1の試薬
と、抗原(または抗体)を有する試料とを混合すること
により抗原抗体反応を生ぜしめて得られる抗原抗体複合
体に補体を作用させて、マイクロカプセルな破壊J−る
ことにより遊離する発光関与物質を含む糸に発光反応を
生じさせる第2の試薬を添加し、発光反応により生じる
発光な測定することにより試料を分析することを特徴と
するものである。
〔発明の実施例〕
この発明の方法は、次のような原理に基づくものである
マイクロカプセル表面に、被測定物質である抗体(また
は抗原)と特異的に反応する抗原(または抗体)を結合
すると共に、マイクロカプセル内に発光関与物質を封入
してなるマイクロカプセルと、抗原と抗体とが結合する
ことにより生ずる抗原抗体複合体に作用してマイクロカ
プセル膜を破壊する補体と、前記発光関与物質と反応し
て発光現象を引き起す物質とを用意する。そして、 A
U記マイクロカプセルと被測定物質である抗体(または
抗原)と補体とを混合1−ることにより、マイクロカプ
セル膜上で抗原抗体反応を起して抗原抗体複合体を形成
し、次いでこの抗原抗体複合体に補体を作用させること
によりマイクロカプセル膜を溶解あるいは破壊して、マ
イクロカプセル内に封入していた発光関与物質を系内に
流出させる。抗原あるいは抗体の分子数に比して多量(
例えは104倍)の流出した発光関与物質を有する系に
、前記発光関与物質と反応して発光現象を引き起す物質
を添加することにより、発光現象を惹起し、測光するこ
とによって発光関与物質を定量し、これによって被測定
物質を分析する。
この発明の方法における第1の試薬は、補体活性により
溶解作用を受けるマイクロカプセル膜に抗原または抗体
を結合するマイクロカプセルを含有する。
抗体(または抗原)を結合することのできるマイクロカ
プセルとしては、動物たとえば羊の赤血球、およびリポ
ゾームを用いることができる。なお、他の動物の赤血球
あるいは赤血球以外の動物細胞であっても、細胞膜に抗
体(または抗原)を結合することができれば、この発明
におけるマイクロカプセルとして使用することができる
マイクロカプセル膜に結合する抗体(または抗原)は、
試料中の抗原(または抗体)と特異な抗原抗体反応を惹
起するものが適宜に選ばれる。たとえば、試料中の抗原
がα−フェトプロティンであるときは、抗α−フェトプ
ロティン抗体が挙げられる。又補体価測定な目的とする
時には、マイクロカプセル膜に結合させる抗体は、当該
マイクロカプセルに対1″る抗体を用いる。
マイクロカプセル膜への抗体または抗原の結合は、公知
の方法により行なうことができる。たとえば、先ず、動
物たとえばウサギ、ヤギ、マウス、ラット等にα−フェ
トプロティンを常法に従って注射すると、これら動物は
感作されて動物体内で抗α−フェトプロティン抗体が産
生される。注射後適当な期間の経過後、その動物より所
定量の血液を採取し、得られた血液の上澄み液を分離す
ることにより、抗α−フェトプロティン抗体を有する抗
血清を得る。なお、抗原抗体反応の特異性を向上させる
ために、前記抗血清をさらに精製してもよい。一方、他
の動物たとえばヒツジから所定量の血液を採取してこれ
を鞘製し1等張液たとえは0.15Mの製置の塩を含有
するバッファ液(pH7)と混合することにより赤血球
なサスペンドした等張液を得る。次いで、ヒツジの赤血
球をサスペンドした等張液と前記の抗α−フェトプロテ
ィン抗体を有する抗血清とな混合すると、ヒツジの赤血
球の細胞膜上に抗α−フェトプロティン抗体が吸着され
、抗α−フェトプロティン抗体を細胞膜に結合する赤血
球を有する等張液が得られる。
この場合、赤血球膜が抗体を吸着しにくい時は、グルタ
ルアルデヒドや無水コノ・り酸の様な2価性試薬、ウッ
ドワード試薬の様なペプチド試薬等と共に処理する事に
より、膜表面に抗原(または抗体)を結合させる事がで
きる。
この発明の方法においては第1の試薬内のマイクロカプ
セル内より流出する発光関与物質と、第2の試薬中の物
質との反応により生ずる化学発光または生物発光を利用
する。化学発光または生物発光を生じる反応としては、
たとえば THOMASP、 Wl−1,ITEHEA
I) etal[Analytical Lu −m+
nescence;ITSPotentialinCl
i−nical Laboratry−C1inica
l Chemistry。
Vol、 25. A9. P、 1531.1979
.に掲げられた種々の発光反応が挙げられる。代表的な
反応例として以下を挙げることができる。
・−・・・・・・ (す したがって、マイクロカプセル内に封入する発光関与物
質は、マイクロカプセルを阻害せず、マイクロカプセル
内に安定に存在することができ。
化学発光あるいは生物発光を生じさせる反応に与る物質
であればよく、たとえばルミノール、イソルミノール等
のルミノール誘導体、シュウ酸ジエステル、ニコチンア
ミドジヌクレオチド(NADH)、グルコース−6−リ
ン酸、アデノシン−3−リン酸等が挙げられる。なかで
も、ルミノールは、その検出限界が10〜10 Mに達
し、リニアティが10〜10 Mであるので広いダイナ
ミックレンジな有するから、好ましい発光関与物質の一
つである。また、マイクロカプセル内の等仮数の寿命を
考慮すると、発光関与物質はある程度分子量が大きいの
が望ましい。何故ならは分子量の大きい発光関与物質は
、時間の経過と共に除々にマイクロカプセルの外に排出
され難い。ルミノールに比して化学発光量が若干少なく
、検出限界の数値がやや大きいけれど、マイクロカプセ
ル外に容易に排出されないイソルミノール誘導体として
、次の構造式を有するものが挙げられる。
1 ただし、R1はCI(3C■12基であり、I(+2は
T4(サイロキシン) −CON)L−(Ca12)、
i基である。
マイクロカプセル内への発光関与物質の刺入は。
公知の方法により行なうことかできる。たとえば。
0.1mA’の赤血球標本(約1×109個含有)ト、
0.9m1lの発光関与物質含有のr−PH8(137
mM−KCa、2.7 mM−Nard、 8.1 n
tM−Na2HPO4,1,5mM−KH2P O,t
、d @ M −M、g C132、pH7,2)との
混合物をセロファン透析チューブに入れ、6倍希釈のr
−PH8に対して溶血が完了するまで透析を継続する。
次に再び、等張のr −P B S に対して同じ時間
透析をすると、ヘモグロビンのかわりに発光関与物質を
含んだ外液が赤血球内に封入される。赤血球内に封入す
る発光関与物質の濃度は。
透析チューブ内での濃度に比例する、 試薬中の補体は、動物の血液中に含まれているものを使
用することができ、たとえばモルモットの血清を補体含
有液としてそのまま使用することができる。補体は、第
1の試薬中に共存させてもよく、また、第1の試薬とは
別体にしておいてもよい。
この発明の方法における第2の試薬は、発光関与物質と
反応して、化学発光あるいは生物発光な生せしめる物質
であり、たとえば過酸化水素、フラゼンモノヌクレオチ
ドとデカナールとオキシドリダクターゼとルシフェラー
ゼとの混合物、ルシフェリンとホタルルシフェラーゼと
の混合物、等が挙げられる。
この発明における試料は生体より採取したところの抗体
または抗原を有するものであり、たとえば患者より採取
した血液、尿、リンパ液体、体液、膵液等が挙げられる
次に、この発明による分析の手j胆な説明する。
先ず、抗体をマイクロカプセル膜上に結合すると共に、
内部に発光関与物質を刺入したマイクロカプセルをサス
ペンドした緩衝液である第1の試薬を調製する。マイク
ロカプセルとしてたとえばヒツジの赤皿球を選び、また
1発光関与物質としてルミノールを選ぶことができる。
次に、補体を含有する動物血清を用意する(以下、補体
液と称する。)。 さらに、発光関与物質と反応し1発
元現象な生せしめる物質な有する第2の試薬、たとえば
、発光関与物質がルミノールであるとぎ、過酸化水素の
アルカリ土類金属触媒たとえば2価の鉄イオンを加えて
なる第2の試薬を調製する。
以上の試薬を準備した後、先ず、第1の試薬と。
被測定対象である抗原を含有する試料たとえば人血清と
を十分に混合する。数分から数十分の経過後、補体欣を
加え、さらに攪拌をする。その後数分経過してから、第
2の試薬を加えると、溶液が発光するので、分光測光装
置で特定の波長たとえばルミノール系であるなら4’2
50mの光量を、ピーク値あるいは積分値で測定する。
あらかじめ。
既知の抗原量で同様の操作を行ない、抗原量と光量との
検量線を作成しておくと、測定した光量から未知の抗原
量を定量することができる。
以上、この発明の方法について説明したが、この発明は
前記説明に限定されるものではなく、この発明の要旨の
範囲内で種々変形して実施することができるのはいうま
でもない。
この発明の方法は、第1の試薬中のマイクロカプセル内
の物質と第2の試薬中の物質とを反応させて発光反応を
生せしめるものである。したがって、触媒の存在下に進
行する発光反応を利用するときには、マイクロカプセル
内にtことえはペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等の
触媒を封入しておき、第2の試薬中には反応物たとえば
ルミノールと過酸化水素とを含めておいてもよい。
〔発明の効果〕
この発明によると、試料中の微結成分の抗体または抗原
につき、抗原抗体反応により破壊されてマイクロカプセ
ル内より放出されるところの、前記抗体または抗原より
も多量であるマイクロカプセル内の物質発光関与物質に
もとづく化学発光あるいは生物発光を測光することによ
って、従来法におけるよりもはるかに迅速に抗原、抗体
の定量分析をすることができる。
この発明によると、前記反応液を分光測光することによ
り定量分析しているので、遠心分離等の手数なかけるこ
とな(簡便に分析処理を行なうことができ、しかも、精
度の高い分析な行なうことができる。
また、この発明における免疫分析方法は、ガン発見のた
めのα−FP(α−フェトプロティン)の定量分析、肝
炎発見のためのHB、分析、テンカン治療のために使用
される抗テンカン剤を抗原とする抗テンカン剤の生体内
濃度の定量分析等につききわめて有効かつ巾広い項目に
適用することができる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 抗体(または抗原)を表面に結合すると共にその内部に
    、発光関与物質を封入するマイクロカプセルを有する第
    1の試薬と、抗原(または抗体)な有する試料とtxi
    t4合することにより抗原抗体反応を生せしめて得られ
    る抗原抗体複合体に補体な作用させて、マイクロカプセ
    ルを破壊することにより遊離する発光関与物質を含む糸
    に発光反応を生じさせる第2の試薬を添加し、発光反応
    により生じる発光を測定することにより試料を分析する
    ことな特徴とする免疫分析力法。
JP19034083A 1983-10-11 1983-10-11 免疫分析方法 Pending JPS6080765A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0144084A2 (en) * 1983-11-30 1985-06-12 Kabushiki Kaisha Toshiba Reagent for immunoassay and analytical method using the same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0144084A2 (en) * 1983-11-30 1985-06-12 Kabushiki Kaisha Toshiba Reagent for immunoassay and analytical method using the same

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