JPS6017359A - 免疫分析方法 - Google Patents

免疫分析方法

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JPS6017359A
JPS6017359A JP12461583A JP12461583A JPS6017359A JP S6017359 A JPS6017359 A JP S6017359A JP 12461583 A JP12461583 A JP 12461583A JP 12461583 A JP12461583 A JP 12461583A JP S6017359 A JPS6017359 A JP S6017359A
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antibody
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玉山 康子
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峯金 富治
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 この発明は、試料中の特定の抗原、抗体または補体価を
定量分析するための免疫分析方法に関する。
〔発明の技術的背景とその問題点〕
従来の免疫分析方法として、たとえば、ラジオアイソト
ープで標識した抗体(または抗原)と生体よシ採取した
試料中の抗原(または抗体)との抗原抗体反応を利用し
て試料中の特定の抗原(または抗体)を定量分析するラ
ジオイムノアッセイ法や、酵素で標識した抗体(または
抗原)と生体よジ採取した試料中の抗原(または抗体)
との抗原抗体反応により抗原抗体結合物を得、その抗原
抗体結合物に標識した酵素による酵素反応を利用して試
料中の特定の抗原(または抗体)を定量分析するエンザ
イムイムノアツセイ法等がロイ。
しかしながら、前記ラジオイムノアッセイ法は、放射性
物質を利用するので設備が犬がかりになるという欠点が
あり、また、ラジオイムノアッセイ法およびエンザイム
イムノアツセイ法のいずれにおいても、十分な検出感度
に達するまでには数時間から数十時間を要して分析に長
時間を要すると込う欠点がある。一方、血清中の補体価
の測定法としては、Meyerらが開発した50%溶血
法(CH2O)がある。これは、至適濃度の溶血素(抗
羊赤血球抗体)で感作された羊赤血球と被検血清とを緩
衝液中で67℃、60分間反応させると、感作羊赤血球
は補体の作用を受け溶血するので、溶血の程度を調べる
事によシ、被検血清中の補体価をめる方法である。しか
しながらこの方法は補体による膜障番反応を氷冷と云う
手段でしか停止出来ず、更に溶血の程度を見る為には反
応液を遠心分離して上澄を得、その541nmにおける
吸光度を測定していた。従って拳法は手間もか\す、し
かも必ずしも定量性に富むとは言い難い而があつた。
前記欠点を解消して短時間のうちに試料中の抗原(また
は抗体)を定量分析する方法を、この出願人は、先に、
昭和57年特許願第195117号に係る明細書に開示
したが、前記明細書に開示する方法は、遠心分離器を使
用しなければならず、装置が大計夛になるとの新たな問
題点を生じた。
〔発明の目的〕
この発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、極め
て短い分析時間で試料中の抗原、抗体および補体価を感
度良く分析することのできる免疫分析用試薬を用いた簡
便な免疫分析方法を提供することを目的とするものであ
る。
〔発明の概要〕
前記目的を達成するためのこの発明の概−安は、抗体ま
たは抗原を表面に結合すると共に、その内部に、螢光物
質または非螢光物質を封入するマイクロカプセルと、補
体と、前記マイクロカプセルに封入する物質が非螢光物
質のときには前記非螢光物質と反応して発光可能な反応
生成物を与えると共にマイクロカプセル外に存在する単
一あるいは複数の共存物質とを有する試薬、および抗原
または抗体を含有する試料を混合することにより、抗原
抗体反応を惹起し、補体活性作用により破壊されたマイ
クロカプセルより流出する前記螢光物質の螢光、または
、前記マイクロカプセルよシ流出する非螢光物質と前記
共存物質との反応により生成する反応生成物の螢光を、
分光分析することにより試料中の抗原、抗体または補体
価を定量することを特徴とするものである。
〔発明の実施例〕
この発明の方法においては、抗体または抗原を表面に結
合すると共にその内部に特定の物質を封入するカイクロ
カプセルと補体と、前記特定の物質がそれ自身螢光物質
でないときには、前記特定の物質と反応して生成する反
応生成物が螢光、化学発光等の発光を起こすような共存
物質とを有する試薬と、抗原または抗体を含有する試料
とを混合することにより、抗原抗体反応を惹起し、補体
活性作用により破壊されたマイクロカプセルより前記特
定の物質を流出させ、前記特定の物質が螢光物質である
ときには、発する螢光を分光分析し、前記特定の物質が
螢光物質でないときには、前記特定の物質と共存物質と
の反応により生成する物質が発する螢光、化学発光等の
光を分光分析することによシ、試料中の抗原または抗体
あるいは補体価を定量することを、その原理とする。
この発明に係る方法における試薬は、補体活性によシ溶
解作用を受けるマイクロカプセル膜に抗原または抗体を
結合するマイクロカプセルを含有する液である。
抗体(または抗原)を結合することのできるマイクロカ
プセルとしては、動物たとえば羊の赤血球、およびリポ
ゾームを用いることができる。なお、他の動物の赤血球
あるいは赤血球以外の動物細胞であって永、細胞膜に抗
体(または抗原)を結合することができれば、この発明
におけるマイクロカプセルとして使用することができる
マイクロカプセル膜に結合する抗体(または抗原)は、
試料中の抗原(または抗体)と特異な抗原抗体反応を惹
起するものが適宜に選ばれる。たとえば、゛試料中の抗
原がα−7二トプロテインであるときは、抗α−フェト
プロティン抗体が挙げられる。又補体価測定を目的とす
る時には、マイクロカプセル膜に結合させる抗体は、当
該マイクロカプセルに対する抗体を用いる。
マイクロカプセル内に封入する物質としては、螢光物質
たとえばフルオレセインイソチアシアネ−) (FIT
C)、カルボキシルフルオレセイン等が挙げられる。前
記FITCは492 nmに励起ピークがあり、発光ピ
ークが518nmに有る。したがって、この発明の方法
によシ分光分析するときには、492nmの光を照射す
ることにより[’ITCを励起し、発光する518nr
nの光の強度を測定することとなる。カルボキシルフル
オレセンは、濃度が高いと自己消光(Se 1 f−q
uenching)を起して非常に弱い螢光しか発光し
ないので、螢光強度を大きくするために反応系全体で1
0−7M以下の濃度となるように、マイクロカプセル内
の濃度を調製しておくのが好ましい。
また、マイクロカプセル内に封入する物質としては、試
料中にマイクロカプセルと共存する共存物質と反応して
螢光物質を生成させるものであってもよく、封入物質と
共存物質との組み合せとして、ウンベリフェリル−β−
D−ガラクトシド(umbel l 1feryl−β
−D”galactoside)とβ−ガラクトシダー
ゼ(β−galactosidase )、8−アニリ
ノ−1−ナフタレンスルホン酸と蛋白質等が挙げられる
。ウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドはβ−ガラ
クトシダーゼにょシ加水分解されて螢光を発する。8−
アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸は蛋白質の疎水部
分と反応して螢光を発する。
また、封入物質と共存物質とは、反応して化学発光物質
を生成するものであってもよく、その組み合せとして、
ヘモグロビンとルミノール等が挙げられる。ヘモグロビ
ンは酸素の存在下にルミノールと反応して生成するアミ
ノフタル酸が発光する。前記組み合せ以外にも、反応に
より化学発光物質を生成する公知の化合物、物質の組み
合せを適宜に採用することができる。
試薬中の補体は、動物の血液中に含まれているものを使
用することができ、たとえばモルモットの血清を補体含
有液としてそのまま使用することができる。
この発明における試料は生体より採取したところの抗体
または抗原を有するものであり、たとえ体 ば患者よシ採取した血液、尿、リンパ液弧ご崖液、膵液
等が挙げられる。
この発明においては、前記試薬と前記試料とを混合する
ことによシ、第1図(a)および(b)に示すように、
前記試薬中のマイクロカプセルにおける抗体6または抗
原と前記試料中の抗原4または抗体とで抗原抗体反応を
進行させ、この抗原抗体反応により前記試薬中の補体5
を活性化することにょシ補体5の膜溶解作用を発現し、
これによってマイクロカプセル膜1を破壊し、マイクロ
カプセル内より反応液中にマイクロカプセル内の物質2
を放出させる。これら一連の過程は、通常の反応容器内
又は光学測定用セル内で行なうことができる。
前記物質2が螢光物質であるときには、第1図(a)に
示すように、マイクロカプセル1より流出した物質2が
発する螢光を分光分析することとなる。
なお、マイクロカプセル1内に螢光物質を封入している
のにその螢光を分光分析することができないのは、マイ
クロカプセル1により螢光が散乱ないし吸収されてしま
うことによる。前記物質2が螢光物質でないときには、
第1図(b)に示すように、前記物質2と試薬中に共存
する共存物質6とが反応し、生成する螢光物質7が発す
る螢光、または生成する励起物質7の化学発光を分光分
析することとなる。
分光分析装置は、たとえば第2図および第6図に示すも
のが挙げられる。第2図に示す分光分析装置は、反応容
器または光学測定用セル10よシの光を電流に女換する
光電変換素子1またとえばフォトダイオードと、前記光
電変換素子12より出力される電流を増幅する直流増幅
器16と、直流増幅器16よシ出力した電流値に基づき
抗原あるいは抗体の量を算出してこれを表示ないし出−
力する表示記録計14とを有して構成される。また、光
学測定用セル10よシの光が微弱でおるときには第6図
に示す分光分析装置を使用するのが好ましく、第6図に
示す分光分析装置は、光電子増倍管12Aと、光電子増
倍管12Aより出力される光電流パルスを増幅するメ5
Aス増幅器13Aと、パルス増幅器13Aより出力され
る光電流パルスから雑音電流パルスを除去する波高弁別
回路15と、タイマー17と、タイマー17で設定され
た所定時間の間、波高弁別回路15よシ出力されるパル
スをカウントするパルスカウンタ16と、パルスカウン
タ16よシ出力されるカウント値により抗原または抗体
の量を算出し、これを表示、記録する表示記録計14と
を有して構成される。
以上、この発明の方法について詳述したが、この発明は
前記説明に限定されるものではなく、この発明の要旨を
変更しない範囲内で適宜に変形して実施することができ
るのはいうまでもない。
〔発明の効果〕
この発明によると、試料中の含有量の少ない抗体または
抗原につき、抗原抗体反応により破壊されてマイフルロ
カプセル内よジ放出されるところの、前記抗体または抗
原よシも過剰液であるマイクロカプセル内の物質あるい
はその物質と共存物質との反応による生成物を有する反
応液中の発光の分光分析によって、従来法におけるよジ
もはるかに迅速に抗原、抗体の定量分析をすることがで
きる。
この発明によると、前記反応液を分光測光することによ
ジ定量分析しているので、遠心分離等の手数をかけるこ
となく簡便に分析処理を行なうことができ、しかも、精
度の高い分析を行なうことができる゛。
また、この発明における免疫分析方法は、ガン発見のた
めのα−FP(α−フェトプロティン)の定量分析、肝
炎発見のためのHBs分析、テンカン治療のために使用
される抗テンカン剤を抗原とする抗テンカン剤の生体内
濃度の定量分析等更VCは補体価測定などにつききわめ
て有効かつ巾広い項目に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図(a) (b)はこの発明の方法の原理を示す説
明図、第2図および第3図はこの発明の方法における分
光分析を行なうのに使用する分光分析装置を示すブロッ
ク図である。 1・・・マイクロカプセル、2・・・物質、6・・・抗
体、 4・・・抗原、 5・・・補体、 6・・・共存
物質、7・・・反応生成物。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)抗体または抗原を表面に結合すると共に、その内
    部に、螢光物質または非螢光物質を封入するマイクロカ
    プセルと、補体と、前記マイクロカプセルに封入する物
    質が非螢光物質のときには前記非螢光物質と反応して発
    光可能な反応生成物を与えると共にマイクロカプセル外
    に存在する単一あるいは複数の共存物質とを有する試薬
    、および抗原または抗体を含有する試料を混合すること
    により、抗原抗体反応を惹起し、補体活性作用によす破
    壊されたマイクロカプセルよp流出する前記螢光物質の
    螢光、または、前記マイクロカプセルより流出する非螢
    光物質と前記共存物質との反応により生成する反応生成
    物の螢光を、分光分析することにより試料中の抗原、抗
    体または補体価を定量することを特徴とする免疫分析方
    法。
  2. (2) 前記反応生成物が、励起された物質であって、
    励起状態からの遷移により光を発(−1あるいは、他の
    共存物質にエネルギー移動を行りつてその他の共存物質
    を発光させることを特徴とする特許請求の範囲第1項に
    記載の免疫分析方法。
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JPS62163966A (ja) * 1986-01-16 1987-07-20 Toshiba Corp 補体価測定用試薬
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