JPH09509480A

JPH09509480A - 光学導波管を使用する超高感度の競合イムノアッセイ

Info

Publication number: JPH09509480A
Application number: JP7515802A
Authority: JP
Inventors: スタンリーエムクライナー; ホンリー
Original assignee: エフシーアイ−ファイバーケムインコーポレイテッド
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1997-09-22
Also published as: TW371714B; EP0731916A1; WO1995015496A1

Abstract

(57)【要約】競合イムノアッセイ光学センサーの感度は、抗体への標識抗原の結合が抗体への未標識抗原の結合に比例するように、標識を選択し、又は抗原への標識の付着を変化することにより増大される。インジケーター物質が適当なサイズの減少された抗体から選択され、又はインジケーター物質が長鎖の高分子量化合物を介して抗原に付着され、又はインジケーター物質が抗原にいずれかに付着された長鎖の高分子量化合物とともに抗原に直接付着される。未結合の抗原を除去するための抗体／結合された標識抗原の前処理、及び基質の光学分離が又感度を増大する。標識が抗原に付着し得ない場合、それは抗体に付着される。標識が選択され、又は付着されて抗原に対する感度を増大する。

Description

【発明の詳細な説明】光学導波管を使用する超高感度の競合イムノアッセイ発明の背景本発明は一般に光学センサー、化学センサー、及び生化学センサーに関するものであり、更に特別には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いる競合イムノアッセイを使用するセンサーに関する。競合イムノアッセイ光学センサーにおいて、抗体がセンサー中に固定され、そして標識抗原が抗体に結合される。標識は典型的には蛍光体である。標的（未標識(untagged)）抗原が抗体に競合的に結合し、標識抗原を置換し、センサーの光学的性質、例えば、標識抗原の蛍光の変化を生じ、これは標的抗原の濃度に関係する。Buc-klesに1983年３月23日に付与された米国特許第4,321,057 号は標識抗原と未標識抗原の間の競合イムノアッセイに基く光学繊維センサーを記載している。イムノアッセイは関係する標的化合物に対するそれらの申し分のない特異性のために医療おにいて良く受け入れられた分析方法になっていた。モノクローナル抗体が使用される場合、その反応は特別な抗原（関係する化合物）に対し特異的である。一方、ポリクローナル抗体が使用される場合、その反応は正確な化学化合物ではなく特別な化学構造に対し特異的である。本発明は主として競合結合フルオロイムノアッセイに関する新規なアプローチに関する。しかしながら、提供された技術の多くは又一般にイムノアッセイに適用できる。例えば、この適用は蛍光標識に集中するが、その技術は同様に放射性標識に使用し易い。競合抗体−抗原反応の使用は主として(1)感度の欠如、即ち、高いバックグラウンドノイズ、基質における不十分な抗体負荷及び標識抗原と未標識抗原に結合された抗体間の効力がない交換、並びに(2)小分子を測定できないことのために制限されていた。測定し得る分子につき、最小検出限界(MDL)は高いppb（10億分の一）〜低いpp m（100 万分の一）の範囲であり、一方、定量化の限界(LOQ)は3.3 以上のファクターである。これらの限界は(1)環境モニタリング、特に、飲料水中、そして作業場所又は家庭中の汚染物質の測定、(2)化学プロセスにおける汚染の測定、( 3)アルコール、薬剤又はその他の物質の乱用に関する人員の試験、(4)毒性物質及び感染性疾患への暴露並びにこれらの存在の測定、並びに(5)癌、心不全、関節炎、胃腸疾患、異常な血液パネル、及び泌尿器科学上の問題の如き疾患の診断及び評価の如き重要な領域におけるそれらの使用を排除する。抗原の広範囲にわたるリストに関する高感度の競合イムノアッセイの創作が本発明の主たる焦点である。これは多数の抗原をそれらの分子サイズにかかわらず低いppb〜pptr（１兆分の一）の範囲で測定し、定量する能力を与える。こうして、小分子の分析が又本発明の一部である。小分子の高感度の測定及び分析につき本発明に従って開発された化学系の結果として、既存の従来技術のイムノアッセイが熟練した人員により行われる必要があり、また人的誤りを受けるという欠点が解消される。特に、現在の従来技術のアッセイの多くが薬品の混合、例えば、酵素及び色素の添加を必要とし、それ故、その結果は技術者と同程度の正確さであるにすぎない。化学において人の関与がない免疫系の使用が本発明の付加的な一部である。光学導波管化学センサー(OWCS)、光学導波管生化学センサー(OWBS)、光学繊維化学センサー(FOCS)、光学繊維生化学センサー(FOBS)、光学チップ化学センサー (OCCS)、及び光学チップ生化学センサー(OCBS)は全て化学系及び生化学系中の特定の種、又は化合物の化学基の存在及び濃度に関する実時間のデータを得る情報獲得戦略におけるトランスデューサである。光学導波管は平らなチャネルド(cha nneled)導波管及び未チャネルド導波管を含むだけでなく、それらの上に導波管を備えたチップを含む。幾っかの導波管センサーの形態が図1A-Dに示される。図 1Aはセンサー化学物質が付着された典型的な導波管系を示し、図1Bは単一導波管上の一つより多い検知化学物質を示し、一方、図1Cは検知化学物質で完全に覆われているミニチア化導波管である。内部基準を有するために、導波管は半分被覆されており、未被覆部分が基準シグナルを得るのに使用される（図1D）。これが作用するために、導波管の未被覆部分は照射源と面する必要があり、そして基準シグナルが被覆部分のそれの前に測定される必要がある。ミニチア化導波管はほぼ２・２・0.1 cm以下であってもよく、又はチップ上に形成されてもよい。光学化学センサー及び光学生化学センサーは、それらの表面に付着された前もって選択された化学的性質及び／又は物理的性質のインジケーターを備えた装置であり、その結果、感度の良い、特異的な、実時間の分析が行い得る。これらは蛍光測定、吸光度測定、ラマン測定、偏光測定、屈折率測定、反射率測定、又は放射線化学測定に基き得る。種特異性又は群特異性化学物質は有機物質、無機物質、金属、酵素、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、生化学物質及びポリマー又はこれらの組み合わせから選択し得る。検知試薬（この場合には、標識抗原又は標識抗体）との分析物の相互物質が上記分光パラメーターの一つの変化を生じる。抗体−抗原反応を使用する感度の良い測定のために、蛍光及び偏光が、標的分子の分子サイズに応じて、好ましい測定される性質である。読み取り装置が光束を電圧に電気的に変換する。電圧の読みの変調は分析物濃度と直接相関関係がある。図2A、Bは競合イムノアッセイにおける基本的な反応を示す。この図中、Ｙは抗体を表し、^*▽（又は▽^*）は標識抗原であり、かつ▽は未標識抗原、即ち、関係する標的化合物である。▽と^*▽の交換速度が大きい程、その反応は感度が良い。理想的には、^*▽の殆どが測定すべき化合物の実際の（又は積算された）濃度で失われるであろう。これは正常な状況下の場合ではない。しかしながら、本発明はこれを起こらせる方法を提供する。図3Aは、抗体（Ｙ）がガラス基質に付着され、標識抗原（^*▽）で飽和される方法を示す。図4Aは膜基質に関する同じ配置を示す。発明の要約それ故、本発明の目的は競合イムノアッセイの感度を増大することである又、本発明の目的は競合イムノアッセイに基く改良された光学センサーを提供することである。本発明の別の目的は低いppb レベルそして更にはpptrレベルまでの感度を有する競合イムノアッセイの方法及びその装置を提供することである。本発明はセンサー中に固定された抗体に結合された標識抗原を有する競合イムノアッセイの方法及びその装置であり、この場合、抗体への標識抗原の結合は、未標識標的抗原が標識抗原を更に容易に置換するように変化され、又は歪められる。標識抗原の結合は、好適な大きい標識を選択することにより、又は長い鎖を小さい標識に付加することにより標識を更に大きくすることにより、又は標識抗原を大きくし、かつ長い鎖を標識抗原のどこかに付着することにより調節される。光学分離が又提供される。抗体−標識抗原が特別な洗浄技術により前処理される。センサーは単一抗原及び多種抗原を検出するように形成でき、そしてチップの上に置くことができる。抗原が標識し得ない場合、抗体が標識し得る。図面の簡単な説明図1A-Dは単一検知化学物質及び多種検知化学物質を有する導波管センサー形態を示す。図2A、B は競合イムノアッセイの基本的な反応を示す。図3A-Cはガラス基質に付着された抗体に結合された標識抗原を示す。図3D-Fは付加的な光学分離層を含む図3A-Cの系である。図4A-Fは膜基質に関する図3A-Fと同様の配置である。図５、６は一対のフルオレセインをベースとする蛍光標識の化学式である。図７は、コカインを含まず、また160 ppb のコカインを含む図６の標識を使用するセンサーの蛍光スペクトルを示す。図８は図６の標識、光学分離、及び特別な洗浄を使用し、コカインを含まず、また4 ppb のコカインを含むセンサーの蛍光スペクトルを示す。図９は図８とは別の蛍光スペクトルを示し、80 ppbのコカインの前に飽和に達することを示す。図10は時間の関数として4 ppb のコカインの反復性を示す。図11は図11よりも大きい量の抗体−標識抗原の負荷効果を示す。図12はppb 以下の濃度のコカインの検出を示す。図13は種々の濃度の抗マウスIgG の蛍光スペクトルである。図14は標識抗体を示す。図15は標識抗体を用いるイムノアッセイの反応を示す。図16はコカインの加水分解反応である。好ましい実施態様の詳細な説明競合イムノアッセイにおける基本的な反応が図2A、B に示される。抗体12が固定された基質10が、標識16を付着した抗原14を含む標識抗原14’を含む溶液と接触される。標識抗原14’は抗体12に結合し、センサー15を生じる。センサー15が抗原14を含む試料と接触される時、抗原14は抗体12の結合部位に対し標識抗原14 ’と競合する。抗原14は標識抗原14’を置換してセンサー15とは異なる光学特性を有するセンサー15’を生じる。センサー15の感度は、抗原14が標識抗原14’を競合して置換する容易さにより決定されるであろう。本発明は、抗原14が標識抗原14’を更に容易に置換するように標識抗原14’の結合を変化させる。基質10は光学繊維もしくはその他の導波管構造、又は光シグナルが入力されたり出力されたりしてセンサー15中の変化を測定し得る支持体であってもよい。抗体と抗原の相互作用は“鍵と鍵穴”フィットであり、即ち、唯一の抗原がモノクローナル抗体と反応し、また一つの化学構造のみがポリクローナル抗体と反応するので、標識抗原が充分に歪められ、その結果、その抗体と結合するその能力が阻害されるが、無効にはされないようなアプローチを提案することが必要であり。一方、^*▽と抗体の結合は充分に強いことが必要であり、その結果、それは更に良好なフィットをつくる抗原、即ち、関係する特定の分析物である▽による以外は除去し得ない。 ^*▽を歪め、即ち、▽に対する結合を減少するのに適したサイズの^*▽をつくるのには三つのアプローチがある。(1)標識抗原が充分なサイズを有するように大きいものが選ばれ（図3A、4A）、(2)長鎖の高分子量の化合物が図3B及び4Bに示されるように抗体と標識の間に置かれ、また(3)単純な標識化合物が使用され、かつ長鎖の高分子量の化合物が抗原のいずれかに付着し得る（図3C及び4C）。いずれの場合にも、抗原が抗体により認識されない点まで抗原の形状を変化しない “歪形成化合物(distorting compound)”を使用することが重要である。図3A、4Aに示されるように、標識16を付着した抗原から形成された標識抗原14 ’は基質に固定される抗体12に結合する。図3Aにおいて、抗体12はシラン24及びグルタルアルデヒド26によりガラス基質22に付着される。図4Aにおいて、抗体12は膜基質10に直接付着される。同じ方法が図3B-C、4B-Cにおいて抗体12を基質に固定するのに使用される。標識抗原は標識の存在下で未標識抗原とは異なるので、適当なサイズの標識の適切な選択（一つが利用できる場合）が必要とされるような抗体への結合が減少した標識抗原を産生し得る。しかしながら、適当な標識が利用できない場合、本発明は標識抗原を変化して未標識抗原と較べて相対的な結合強さを変化することにより利用可能な標識を用いて実施し得る。図3B、4Bに示されるように、標識抗原14a は標識16を長鎖の高分子量化合物18を介して抗原14に付着することにより形成される。又、図3C、4C に示されるように、標識抗原14b は標識16を抗原14に直接付着するが、更に長鎖の高分子量化合物20を抗原14のいずれかに付着することにより形成される。簡素化及び再現性の観点から、抗原を又歪形成標識化合物の使用、即ち、適当に大きい標識の使用が最良のアプローチである。これは、唯一の合成操作が抗原に対して行われるべきであることを意味する。例えば、コカイン、モルヒネ又はヘロインが抗原である場合、単純な標識、フルオレセインイソチアシアネート(F ITC)（図５）が使用される時にそれらが1 ppm 未満で測定し得ない。フルオレセインチオカルバミルエチレンジアミン（図６）が使用される場合、160 ppb のコカインが検出し得る（図７）。この化合物はFITCよりも高い分子量を有し、そして又歪んだ鎖を有することに注目されたい。こうして、その標識はインジケーター（フルオレセイン）及び歪形成化合物の両方を与える。この標識が選択された。何となれば、それは抗原を歪めて^*▽と▽の交換を最適にしたからである。FIT Cのみが利用できた場合、それは長鎖化合物を介して抗原に付着でき、又はそれはその抗原に直接付着でき、そして別の化合物がその抗原のいずれかに付着できた。抗原を歪める標識の選択は実験データに基いてなされる。夫々の標識は、それが付着される抗原に基いて選択される必要がある。標的抗原が標識し得ない場合、即ち、標的化合物が標識を付着できる活性基を有しない場合、以下に更に説明されるように、抗体を標識することが必要である。標識は活性インジケーター物質、例えば、蛍光体をベースとし、これはその高い量子効率のためにレーザー色素であることが好ましい。抗原の標識に適した例示化合物として、フルオレセインチオカルバミルエチレンジアミンローダミンＢイソチアシアネートエオシン−５−イソチアシアネートマラカイトグリーンイソチアシアネートローダミンＸイソチアシアネートリサミン（商標）ローダミンＢスルホニルクロリド６−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン６−（フルオレセイン−５−（及び−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステルテキサスレッド（商標）スルホニルクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。その他の標識が“蛍光プローブ及び研究用薬品のハンドブック”、第５編、1992-1994、Richard P．Haugland、モレキュラープローブス社に見られ、これが参考として本明細書に含まれる。標識が選択され、又は抗原標識された付加的な化合物に付着され、又は付加的な化合物がその抗原に付着されて、抗体への標識抗原の最低結合エネルギーを理想的に生じ、その結果、未標識抗原が存在しない限り、標識抗原がはずされないが、標識抗原は未標識抗原により容易に置換される。理想的な最低結合エネルギーが得られなくてもよいが、標識抗原の結合エネルギーのかなりの低下が未標識抗原に対する感度を大幅に増大するであろう。本発明の原理に従うことにより、好適な標識抗原がルーチン実験により産生し得る。測定のシグナル対ノイズの比を低下するバックグラウンドノイズは三つの源： (1)基質の未使用の部位、(2)基質からの反射及び散乱する光、及び(3)抗体又は抗原のゆるやかな標識から生じ得る。感度に対する最も容易な最初の工程は、標識化合物が抗原又は抗体に付着された時にのみ存在することを確実にすることである。通常の標識方法において、これは問題ではない。何となれば、^*▽と▽の間の結合強さを低下するように努力しなくてもよく、しかも従来の洗浄技術が充分であるからである。抗体と^*▽の間の結合が計画的に弱くされる時、更に温和な洗浄技術、即ち、中性の緩衝液及び３回蒸留した水を使用することが必要である。使用された洗浄液中に蛍光の指示が絶対になくなるまで、洗浄が反復して行われる。ゆるやかな標識を除くためのこの洗浄処理が本発明の付加的な一部を形成する。干渉化合物が付着し得る基質に未使用の活性部位がないことを確実にするのに二つのアプローチが使用される。(1)基質が延長された時間の期間（数時間〜数日）にわたって標識抗原を含む抗体と反応させられる。これは、最大数の抗体が基質に付着されることを確実にする。(2)残っている部位がウシ血清アルブミン( BSA)の如き不活性ブロッキング化合物に結合される。幾何学的障害及び立体障害が活性部位の全てを抗体に結合させないので、これが必要とされる。基質からの反射及び光散乱は、通常分光技術を使用して、即ち、狭いスリット又は狭いバンドフィルターを使用して蛍光放出シグナルからの励起光（反射され、又散乱されたもの）を選別して取り扱われる。しかしながら、最高の感度を得るためには、光回収を増進するように広いスリット又は広いバンドフィルターを使用してできるだけ多くの光を回収することが必要である。スペクトル選別が使用し得ないので、この問題を取り扱うために二つの方法がガラスにつき考案された。(1)ガラスが不透明又は艶消しされて励起光からの散乱及び反射の両方を減少でき、又(2)不活性な非反射性化合物、例えば、木炭がブロッキング剤に添加されて基質を“フラットブラック(flat black)”かつ非反射性にし得る（図3D-F ）。木炭の添加又はその他の光学分離は抗体の固定化（結合された標識抗原による）の後に続くことが重要であり、さもないと活性部位がブロックされ、又は抗体が基質に付着されないか、もしくは最小の抗体が基質に付着されるであろう。膜基質の場合、木炭の使用又はその他の光学分離のみが可能である。何となれば、前処理が膜を破壊するからである（図4D-F）。両方の型の基質につき、非反射性化合物は固定化後の化学反応におけるいずれかの適合工程で添加し得る。図3D -F、4D-Fは図3A-C、4A-Cの構造への光学分離層28又は10の添加を示す。光学分離層は種々の材料のものであってもよい。光学分離は不活性かつ抗原透過性のポリマー中の黒色、白色、赤色又は反射性の材料の分散であってもよい。着色材料の例として、カーボンブラック、硫酸バリウム、二酸化チタン、赤色もしくは黒色の酸化第一鉄、金粒子、又は微光色素が挙げられる。BSA に加えて、着色材料が分散される抗原透過性ポリマーとして、シリコーン、ポリスチレン又はエチルセルロースが挙げられる。図3D-F、4D-Fに図示されるように（現尺ではない）、抗体は光学分離層をはるかに越えて延びる。しかしながら、基質の上に形成される光学分離層は典型的には抗体を覆うが、抗原の通過を可能にする。又、光学分離層は抗体結合部位の下で非反射性表面を形成してもよい。図８は上記感度改良方法が適用される時になし得る改良を示す。この図において、4 ppb のコカインがpptr（兆分の一）の感度が得られることを示すシグナル対ノイズ比で示される。図７と図８の比較は、改良された標識のみを使用した図７において、160 ppb のコカインが約0.2 単位の強さの変化を生じたが、一方、洗浄及び光学分離を又使用した図８において、4 ppb が約1.0 単位の強さの変化を生じることを示す。図９は4 ppb 及び80 ppbの両方を示す。ここで、センサーが感度が良く、しかも交換速度が充分であり、その結果、80 ppbの前に飽和に達し、即ち、充分に標識された部位が残されておらず、しかも０、４及び80 ppbの間に線形の関係がないことがわかる。図10は時間の関数として4 ppb における反復性を示す。図11は、基質の“負荷因子”に応じて時間依存性があり得ることを示す。しかしながら、重要なことは、１秒当たりのカウント数(CPS)の変化が10 分の暴露時間で両方のセンサーにつき同じであることである。10分で、両方のセンサーは4 ppb に関して約２単位の強さの変化を生じた。図10と図11の差異は、図11中の基質が図10中の基質よりも多くの抗体で“負荷”されることである。更に長い時間にわたって、更に多くの標識抗原が図11において置換され、一方、図 10において、標識抗原の合計数が迅速に除去される。図12は種々のコカイン濃度におけるスペクトルを示し、これらは非常に低い(pptr)濃度が検出し得ることを示す。図13は抗体としてマウスIgG を使用し、かつ抗原として標識抗マウスIgG を使用するこの技術の定量的な局面を示す。測定し得る抗原の数を増大するために取り組む必要がある二つの特別な場合がある。(1)標識を付着するための活性官能基があるが、標識はそれが抗体と適合しない程度に抗原を歪める小分子、及び(2)標識を付着するための官能基がないあらゆるサイズの分子。これらの場合には、標識が抗体に入れられる必要がある（図14）。好適な標識30が、必要により、長鎖の高分子量化合物31を介して抗体 12に付着される。標識抗体を使用するイムノアッセイの反応が図15に示される。標識16を付着した抗体12が抗原14を含む試料と接触され、これが標識抗体に結合して、センサー17を生じる。センサー17の光学特性は標識抗体に結合する抗原の量の関数である。標識16は、センサー17が抗原14に対して増大された感度を有するような様式で選択され、又は抗体12に付着される。好ましい標識は蛍光化合物であるが、放射性薬品の如きその他の標識が又作用するであろう。抗原の不在下で、抗体に付着された蛍光体は自由に移動し、それ故、その蛍光が高度に脱分極されるであろう。抗原が標識抗体と結合する場合、蛍光体の移動は制限されるようになり、更に分極された発光をもたらす。それ故、偏光測定が適合標識抗体が利用できる抗原を定量するのに使用し得る。蛍光標識の選択が依然として感度に関して重要である。それは最大の偏光の変化を与えるように選択されるべきであり、これは抗体及び標的分子に応じて夫々の場合に異なり得る。標識を付着するための長鎖化合物の使用は、抗原の不在下の蛍光体の更に大きな運動、及び抗原結合が起こる時に偏光の変化を測定する際の更に大きな感度を可能にする。こうして、分子の形状、サイズ及び電荷分布、等並びに標識の付着の方法が調節されて抗原に対する標識抗体の更に大きな感度及び測定された光学的効果の更に大きな変化を生じ得る。又、別の測定技術、例えば、蛍光が使用し得る。必要とされる測定は蛍光寿命の変調を伴う。これは、既に記載された抗原濃度対光の強さのルーチン関係とは異なるアプローチである。寿命変調は探究される標的分子の存在に非常に特異的である。蛍光寿命は蛍光体を抗体に結合する様式により調節される。標識抗体方法の例示の例はコカインを検出するための別法である。コカインは先に示されたようにして好適な標識及びコカインに特異性の抗体を使用して大きな感度で直接検出し得るが、間接アプローチが又使用し得る。コカイン及びその塩酸塩は周囲条件で非常に低い揮発性を有する。こうして、別のアプローチは更に検出し易いはるかに大きな揮発性を有するコカイン誘導体に焦点を当てることである。コカインが輸送、貯蔵又は運搬される時、環境条件が劣化を生じる。温度、湿度、圧力及びその他の環境変化がコカイン誘導体の生成をもたらす。これらの誘導体の一つ（これは常に見られる）は、図16に示されるように、コカインの加水分解中に生成されるエステル交換生成物である安息香酸メチルである。安息香酸メチルはコカインの良好な化学マーカーを構成する。何となれば、それは室温で液体であり、それ故、かなり高い蒸気圧を有するからである。しかしながら、安息香酸メチルは蛍光体による標識に使用し得る官能基を含まない小分子である。それ故、抗体が蛍光体で標識される。安息香酸メチルを定量するための偏光測定がコカインの存在を明らかにするであろう。又、導入されたアプローチは単一基質に関する多数のセンサーの使用に適用し得る。これは、その他の増進パラメーターの全てを適用するとともに標識を単に変化することにより行われる（図1B）。最初の工程は関係する抗原（標的分子）の夫々に特異性である抗体を使用することである。次の段階は夫々の抗原又は抗体につき異なる標識を選択することである。蛍光標識が使用される場合、(1)それらは付着が起こり得る活性基を有する必要があり、かつ(2)それらは非常に高い量子効率を有する必要がある。これらの蛍光体が同じ波長で励起し、そして良く分離された異なる波長で放出する場合、簡素化が系全体に加えられる。フルオレセイン及びローダミンが良好な選択の一対である。何となれば、それらがこれらの基準を満たすからである。例えば、モルヒネ及びコカインに関する多数のセンサーが、これらの夫々に特異性の抗体を使用し、抗原を異なって標識して、即ち、一方をフルオレセインで標識し、他方をローダミン化合物で標識してつくられる。この概念は付加的な標識を選択することにより単一の基質に関する幾つかのセンサーに拡張し得る。これを行う最良の方法は、抗体があるのと同じ程多くの部分に基質をマスクし、これらを個々に固定することである。正確に知られている濃度混合物中の抗体混合物の使用は、これらがこれらの比で基質に付着されること又はこれらの関係がセンサー間で同じであることを確実にしない。夫々の標識はそれ自体の特定の放出波長を有し、これは夫々のこれらの系又は同調可能な検出系につき固定のスペクトルチャンネルがある必要がないことを意味する。図1Aに示されるように、導波管32は発生源38とフィルター36を備えた検出器40 の間に配置される。検知領域34は固定化抗体からつくられ、結合された標識抗原が導波管32の上に形成される。抗原は本発明に従って標識される。図1Bは、付加的な検知領域42、44が導波管32に加えられる多重センサー形態を示す。夫々の検知領域42、44は結合標識抗原と会合した異なる固定化抗体からつくられる。標識は、応答が区別し得るように異なる。図1Cにおいて、検知領域34は導波管全体を覆い、これはミニチア化構造、例えば、チップであってもよい。図1Cの形態は、導波管32の半分のみを検知領域34で被覆することにより図1Dに示されるように内部基準を与えるように改良し得る。実施例本発明に従ってセンサーをつくる方法の例が以下に示される。ガラス又は石英のスライド又は導波管を１％の硝酸(HNO₃)で洗浄し、次いでアセトン中の３−アミノプロピル−トリエトキシシラン(APTS)の20％の溶液中でシラン化する。次いでそれをアセトン及び水で洗浄する。次いでスライド／導波管を約５時間にわたってグルタルアルデヒドの50％の水溶液中に入れる。その後、それを9.6 のpHで炭酸塩緩衝液中で洗浄する。その緩衝液は0.05M の炭酸ナトリウムである。次いでスライド又は導波管を15時間にわたってコカイン抗体の溶液（pH9.6 の緩衝液中1g/L）に入れる。次いでそれをpH7.4 の緩衝液（0.05Mのリン酸ナトリウム）で洗浄する。その順序におけるこの時点で、ウシ血清アルブミン（BSA、炭酸塩緩衝液中１％、pH9.6）を“ブロッキング剤”として通常添加する。しかしながら、この工程は、その系の純度が満足なレベルで調節し得る場合には省略されてもよい。次いでスライド又は導波管を約１時間にわたって標識抗原（薬剤）（リン酸塩緩衝液、pH7.4 中300nM）に入れる。更に大きな感度のために、活性炭粉末の如きオプティカルアイソレーターがこの工程で使用し得る。次いで、安定な蛍光基準線が得られ、遊離標識が存在しないことを示すまで、スライド又は導波管をpH7.4 の緩衝液で洗浄する。標識を選択するために或る基準を使用する。本発明において、蛍光色素を標識として使用した。しかしながら、その他の例にいて、ヨウ素、ビオチン、酵素等が使用し得る。標識を選択する際に、下記の考慮事項を考慮すべきである。 1.良好な光シグナルを生じる物質を選択すべきである。 2.高い蛍光量子効率を有する物質を選択すべきである。 3.長い寿命を有する物質、即ち、容易に漂白しない物質を使用すべきである。 4.適当な波長で励起し、放出する物質を選択すべきである。換言すれば、良好なLED 及び検出器が利用できる場合。 5.抗原を付着するのに良好な結合基を有する物質が好ましい。 6.抗原に適合するのに適当な化学構造を有するだけでなく、標識に最適の抗体 −抗原結合部位及び立体障害からの最小の干渉を有する物質を使用すべきである。本件出願に記載された競合アッセイはできるだけ一般的であるように設計される。それが抗体に適合する抗原及び標識を付着するための部位であるか否かはあらゆる反応に作用するであろう。感度の利点は、抗原及び標識のサイズ、形状及びその他の特徴が検知系との標的分子の相互作用を妨害しないあらゆる状況で利用できるべきである。請求の範囲のみにより限定されることが意図される本発明の範囲から逸脱しないで、詳しく記載された実施態様の変化及び改良が行い得る。

Claims

【特許請求の範囲】１．未標識抗原が抗体に結合された標識抗原を置換する競合イムノアッセイの感度を増大する方法であって、その抗体への標識抗原の結合を抗体への未標識抗原の結合に対して減少して未標識抗原との交換速度を増大することを特徴とする競合イムノアッセイの感度を増大する方法。２．適当なサイズの標識抗原を生成することによりその結合を減少する請求の範囲第１項に記載の方法。３．適当なサイズの標識を抗原に付着することにより標識抗原を生成する請求の範囲第２項に記載の方法。４．標識を長鎖の高分子量化合物を介して抗原に付着することにより標識抗原を生成する請求の範囲第２項に記載の方法。５．長鎖の高分子量化合物を標識に加えて抗原分子に付着することにより標識抗原を生成する請求の範囲第２項に記載の方法。６．抗体を基質に固定し、インジケーター標識を抗原に付着して標識抗原を産生し、標識抗原を固定化抗体に結合し、固定化抗体及び結合された標識抗原を未標識抗原を含む試料と接触させ、その結果、未標識抗原が標識抗原を置換し、抗体に結合された標識抗原の量の変化により生じた光学変化を測定し、標識抗原を生成して抗体への標識抗原の結合を抗体への未標識抗原の結合に対して減少することを特徴とする競合イムノアッセイのための方法。７．充分なサイズの標識を選択することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。８．インジケーター標識をフルオレセインチオカルバミルエチレンジアミン、ローダミンＢイソチオシアネート、エオシン−５−イソチオシアネート、マラカイトグリーンイソチオシアネート、ローダミンＸイソチオシアネート、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、６−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−（フルオレセイン−５−（及び −６）−カルボキサミド）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル、テキサスレッドスルホニルクロリドから選択することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。９．インジケーター標識を長鎖の高分子量化合物を介して抗原に付着する請求の範囲第６項に記載の方法。 10．長鎖の高分子量化合物をインジケーター標識に加えて抗原に付着することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。 11．試料との接触の前に固定化抗体及び結合された標識抗原を前処理して未結合の標識抗原を除去することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。 12．光学分離層を固定化抗体を含む基質の上に形成することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。 13．標識抗原を基質に固定された実質的に全ての抗体に結合することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。 14．不活性ブロッキング化合物を標識抗原が結合されていない抗体に結合することを更に含む請求の範囲第13項に記載の方法。 15．抗原をコカイン、モルヒネ又はヘロインから選択することを更に含む請求の範囲第６項に記載の方法。 16．抗体を基質に固定し、インジケーター標識を抗体に付着して標識抗体を産生し、標識抗体を抗原を含む試料と接触させ、その結果、抗原が標識抗体に結合し、標識抗体に結合する抗原の量により生じた光学変化を測定し、標識抗体を生成して抗原に対する感度を増大することを特徴とするイムノアッセイ方法。 17．標識抗体を充分なサイズ、形状等の標識で生成し、標識を抗原に対する感度を増大する様式で付着する請求の範囲第16項に記載の方法。 18．導波管；導波管に固定された抗体；抗体に結合された標識抗原（その標識抗原は抗原及び活性インジケーター物質を含み、標識抗原が充分なサイズを有して結合エネルギーを低下して所望のレベルの感度を未標識抗原に与える）；標識抗原を含む抗体が未標識抗原を含む試料と接触する時に抗体に結合された標識抗原の量の変化により生じた光学変化を検出するための導波管と組合わされた手段を含むことを特徴とする競合イムノアッセイセンサー。 19．活性インジケーター物質を抗原に付着する歪形成化合物を更に含む請求の範囲第８項に記載のセンサー。 20．活性インジケーター物質とは別の位置で抗原に付着された歪形成化合物を更に含む請求の範囲第９項に記載のセンサー。 21．活性インジケーター物質が充分なサイズを有して充分なサイズの標識抗原を生成する請求の範囲第18項に記載のセンサー。 22．活性インジケーター物質がフルオレセインチオカルバミルエチレンジアミン、ローダミンＢイソチオシアネート、エオシン−５−イソチオシアネート、マラカイトグリーンイソチオシアネート、ローダミンＸイソチオシアネート、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、６−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、５ −（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−（フルオレセイン−５−（及び−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル、テキサスレッドスルホニルクロリドから選択される請求の範囲第21項に記載のセンサー。 23．活性インジケーター物質を長鎖の高分子量化合物を介して抗原に付着して充分なサイズの標識抗原を生成する請求の範囲第18項に記載のセンサー。 24．活性インジケーター物質の他に抗原に付着された長鎖の高分子量化合物を有する請求の範囲第18項に記載のセンサー。 25．導波管の上に形成された光学分離層を更に含む請求の範囲第18項に記載のセンサー。 26．異なる抗原に夫々特異性の複数の異なる抗体を更に含み、かつ導波管に固定された、夫々異なる抗原に付着された異なる活性インジケーター物質を有する請求の範囲第18項に記載のセンサー。 27．導波管が光学チップである請求の範囲第18項に記載のセンサー。