CH640061A5 - Procede de detection, analyse, dosage ou localisation d'une substance par des techniques de marquage. - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé pour déceler, analyser, doser ou localiser une substance d'intérêt biologique dans un liquide ou tissu d'un corps et un réactif luminescent pour la mise en œuvre de ce procédé.
Le réactif luminescent qui est une substance marquée (voir plus bas) peut être utilisé dans divers types de recherches biologiques, telles que:
a) dosage immunologique et dosages par fixation de protéines,
b) renouvellement de substances in vivo et in vitro,
c) localisation histologique de substances,
d) traçage de substances subissant une redistribution dans des systèmes biologiques ou techniques de séparation in vitro, tels que centri-fugation, Chromatographie et électrophorèse.
Dans la présente description, on entend par réactif luminescent une combinaison d'une molécule normalement incapable de prendre part à une réaction luminescente avec une autre molécule qui est capable de participer à une réaction luminescente. Une réaction luminescente est une réaction chimique avec production de lumière. On mesure la quantité de réactif luminescent en enregistrant la lumière émise après production des conditions appropriées nécessaires pour que la réaction luminescente ait lieu. La lumière peut être intense ou très faible, mais de durée suffisante pour permettre la détection et la mesure de lumière. Cette luminescence doit être nettement distinguée de la fluorescence et de la phosphorescence.
Une réaction luminescente est normalement une réaction entre au moins deux molécules S et L avec ou sans autres réactifs, cofacteurs, ou un catalyseur D ou sous l'influence d'un initiateur physique. Le composé L est la substance qui produit la lumière, telle que le luminol; S est la substance qui réagit avec L pour provoquer l'excitation des molécules, par exemple oxygène ou peroxyde d'hydrogène; D (le cas échéant) est un cofacteur et/ou un catalyseur ou initiateur, tel qu'une enzyme, une luciférase, ou le ferricyanure de potassium. La réaction entre L et S conduit à la conversion de L en une molécule excitée L± et le retour de cette molécule excitée à un état non excité s'accompagne de l'émission d'un photon. La réaction entre L et S et la désintégration de L± à l'état non excité peuvent avoir lieu spontanément ou nécessiter la présence du cofacteur ou catalyseur D ou d'un initiateur physique, tel que température ou radiation. Un exemple .d'une telle réaction est l'oxydation du luminol par H202. Les catalyseurs et cofacteurs sont souvent des composés inorganiques, comme c'est le cas ici, mais ils peuvent également être extraits de substances biologiques, telles que la Peroxydase qui catalyse la réaction luminescente du luminol.
L'invention consiste en un procédé pour déceler, analyser, doser ou localiser une substance d'intérêt biologique dans un liquide ou tissu d'un corps, caractérisé en ce que l'on combine un réactif de fixation apte à se lier de façon spécifique à ladite substance et choisi parmi un anticorps et une protéine de fixation, avec un marqueur comprenant un chromophore luminescent de façon que le réactif de fixation ainsi marqué soit immunologiquement pur et stable et que son aptitude de réaction ne soit pas sensiblement modifiée par le marqueur, on met ensuite ladite substance en contact avec le réactif de fixation marqué, on amorce une réaction de luminescence et l'on détecte ou mesure la lumière émise afin d'obtenir une information concernant ladite substance.
La réaction de luminescence peut être amorcée chimiquement au moyen d'un réactif chimique ou d'un catalyseur ou par une variation de pH, ou bien physiquement, par exemple par la chaleur ou les radiations. Dans certains modes de mise en œuvre préférés, le réactif luminescent comprend au moins deux composants chimiques, avec ou sans un cofacteur ou catalyseur, et le marqueur comprend un nombre inconplet des composants ou éléments, la réaction de lumi-
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nescence étant amorcée par addition ultérieure du ou des composants ou éléments essentiels manquants.
En tout cas, les composants de marquage de réaction sont de préférence stables et ne modifient pas sensiblement la substance sur laquelle ils sont fixés.
De préférence, la substance d'intérêt biologique est une protéine, un anticorps, un antigène, un haptène, une hormone, un métabolite, un acide nucléique ou un stéroïde. Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention, le réactif luminescent comprend des anticorps marqués avec une substance luminescente. Les anticorps marqués sont de préférence utilisés pour déceler, analyser, doser ou localiser les antigènes correspondants.
La formation et la mesure du réactif luminescent peuvent être décrites par les réactions générales suivantes:
La synthèse du réactif luminescent peut s'écrire:
A + B + autres réactifs et/ou catalyseurs -» AB + autres produits où A est une substance normalement incapable de participer à une réaction de luminescence, B est une substance capable de prendre part à une réaction de luminescence et AB est le réactif luminescent.
A est la substance d'intérêt biologique nécessitant l'analyse ou la détection. Par exemple, A peut être une protéine, un anticorps, un antigène, un haptène, une hormone, un médicament ou une autre substance d'intérêt pharmacologique, un métabolite, un acide nucléique ou, en général, n'importe quelle macromolécule ou molécule non polymère.
B est l'agent marqueur et est essentiellement stable en termes de luminescence et de toutes autres réactions possibles qui pourraient affecter le procédé. B peut consister en L et/ou S et/ou D, et peut comprendre en général un ou plusieurs composants stables quelconques d'un réactif luminescent multicomposant. Ordinairement, la réaction de synthèse de AB supprime un ou plusieurs des composants ou ingrédients essentiels, de sorte que la réaction luminescente peut être amorcée par addition du ou des composants manquants.
Dans certains cas, la substance A seule doit être analysée, mesurée ou décelée. Le marqueur stable B est alors normalement ajouté à A à un stade antérieur du procédé, et le ou les composants restants du réactif luminescent sont ajoutés au moment où l'on veut enregistrer la lumière émise.
Dans d'autres cas, la substance A doit réagir avec une autre substance C, et soit A soit C peut être intéressante et nécessiter l'analyse ou la détection. La réaction à analyser peut s'écrire:
nAB 4- C —* C(AB)n où C est une substance, non normalement luminescente, qui réagit avec A et n est le nombre de molécules de AB qui se combinent avec C.
L'analyse implique la mesure de C(AB)n ou la perte de nAB par rapport au stock initial de molécules AB.
Dans la détermination finale du réactif luminescent, la réaction peut s'écrire:
AB + composant manquant (L, S ou D) ou initiateur physique -► produit + lumière
La quantité de lumière émise (luminescence) peut être en relation directe avec la concentration de AB ajoutée au mélange de réaction.
Couramment, la substance la plus populaire pour le marquage des protéines est un isotope radioactif, tel que 12SI. Avec cette méthode, on détermine la quantité de réaction de AB avec C,
comme indiqué ci-dessus, par mesure de la radioactivité. Les réactifs radioactifs ont trois inconvénients principaux. En premier lieu, la méthode de marquage implique l'utilisation de réactifs fortement radioactifs et pouvant par conséquent être dangereux. En second lieu, la durée de conservation de la substance marquée radioactive est souvent relativement courte, non seulement parce que, du fait de sa nature, l'isotope radioactif se désintègre continuellement, mais également les protéines marquées radioactives sont souvent instables. En troisième lieu, il est souvent difficile de marquer suffisamment les protéines pour obtenir un réactif décelable par une méthode sensible et rapide. La mesure de luminescence est à la fois fortement sensible et très rapide, la durée de mesure étant de l'ordre de 1 s au lieu des quelques minutes normalement nécessaires pour la mesure de la radioactivité. La fixation soit par liaison covalente, soit par liaison non covalente d'une substance capable de prendre part à une réaction de luminescence sur des substances normalement incapables de participer à une réaction de luminescence donne un réactif qui peut être mesuré rapidement en très petites quantités.
Une substance à utiliser comme marqueur dans la préparation d'un réactif luminescent doit de préférence satisfaire à quatre conditions:
a) elle doit être capable de prendre part à une réaction de luminescence,
b) il doit être possible de la fixer sur la substance normalement non luminescente, pour former un réactif relativement stable,
c) elle doit encore être capable de participer à une réaction de luminescence après fixation pour former le réactif, et d) elle ne doit pas modifier sensiblement les propriétés de la molécule sur laquelle elle est fixée.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un réactif luminescent comprenant des anticorps ou des protéines de fixation d'origine naturelle marqués avec un chromophore luminescent et étant pur au point de vue immunologique. En général, au moins 60%, de préférence au moins 80% des antigènes dans le réactif luminescent sont biologiquement actifs, c'est-à-dire qu'ils sont capables de se fixer sur les antigènes correspondants.
On peut préparer les anticorps marqués à partir d'un milieu contenant les anticorps, tel que le sérum, par mise en contact du milieu avec les antigènes correspondants, de préférence en phase solide, pour provoquer une association anticorps/antigène, avec addition du marqueur luminescent avant ou après l'association, et dissociation ultérieure des anticorps marqués d'avec les antigènes. Les antigènes ne fixent que les anticorps qui leur sont spécifiques et la dissociation ultérieure produit des anticorps marqués luminescents ayant une activité biologique élevée. La dissociation peut être produite par réglage du pH du système ou par une réaction de réduction. Cette préparation produit efficacement des anticorps marqués purifiés à cause de la sélectivité de la réaction antigène/anticorps. Les antigènes sont de préférence fixés sur un immunoadsorbant en phase solide, et le marqueur luminescent peut être ajouté au milieu contenant l'anticorps soit avant, soit après la mise en contact du milieu avec les antigènes. Le résultat est le même en ce que les composants restants du milieu, qui ne fixent pas les antigènes, peuvent être éliminés par lavage, laissant un complexe antigène/anticorps marqué dont on peut séparer par dissociation les anticorps marqués. Ce type de purification est connu sous le nom de purification immunologique et, lorsque l'antigène est lui-même une immunoglobuline, on peut l'utiliser pour produire des anti-immunoglobulines marquées qui peuvent être utilisées comme réactifs universels dans les déterminations immunologiques.
Un anticorps marqué est par nature une immunoglobuline. Dans la plupart des cas, ceux-ci peuvent être dirigés contre les antigènes, tels que protéines, hormones, haptènes ou autres molécules. Dans des cas spéciaux, les immunoglobulines peuvent elles-mêmes être utilisées comme antigènes, par exemple l'IgG de lapin (immunoglobuline) qui se comporte comme un antigène lorsqu'on l'injecte au mouton. L'anticorps produit fixe l'IgG de lapin qui comprend des anticorps spécifiques produits chez les lapins. Ainsi, par exemple, on peut doser l'a-fœtoprotéine (AFP) par la fixation de l'anticorps de lapin marqué sur l'AFP. On peut également doser l'AFP en la faisant d'abord réagir avec l'anticorps de lapin anti-AFP (non marqué) et en décelant ensuite le complexe par l'absorption de l'anticorps de mouton anti-IgG de lapin marqué. Ce mode opératoire indirect a l'avantage que de nombreux systèmes de détermination immunologique utilisent les anticorps de lapins. Au lieu de marquer ceux-ci individuellement, on peut utiliser l'anticorps de mouton anti-IgG de lapin marqué comme réactif universel. D'autres réactifs universels appréciés sont les anticorps contre l'JgG de cobaye, l'IgG de mouton, l'IgG de chèvre et l'IgG d'âne, puisque les antisérums contre certaines molécules peuvent être produits chez n'importe la-
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quelle de ces espèces. Les réactifs universels les plus couramment utilisés seraient cependant l'anticorps de mouton anti-IgG de lapin et l'anticorps de mouton anti-IgG de cobaye. La préparation d'anticorps marqués purifiés est extrêmement stable, en particulier si on la conserve à un pH d'environ 7 à 8 et à une température inférieure à 5 0°C, de préférence à environ — 20° C, et elle a une durée de conservation de plusieurs mois. Cela est un grand avantage sur les radio-isotopes qui ont une durée de vie limitée en raison de leur désintégration continuelle. Un autre avantage est que les radio-isotopes peuvent dégrader les protéines, tandis que ce n'est pas le cas des io marqueurs luminescents. Des anticorps marqués peuvent être obtenus pour les hormones et protéines suivantes: insuline, hormone de croissance, parathyroïde, hormone folliculostimulante, hormone lutéinisante, hormone thyréostimulante, adrénocorticotrophine (ACTH), glucagon, prolactine, calcitonine, ferritine, a-fœtoprotéine, 15 immunoglobuline G humaine (IgG), IgG de lapin, IgG de mouton, IgG de cobaye, IgG d'âne, immunoglobulines E et M humaines, antigènes de surface de cellule. On peut également produire des anticorps marqués contre les haptènes qui se fixent sur les médicaments ou sur les nucléotides cycliques. Les anticorps marqués dérivés de 20 ces hormones, protéines et haptènes, sont particulièrement utiles pour la mise en œuvre de déterminations immunologiques rapides. Ces déterminations sont convenablement mises en œuvre par l'utilisation de la détermination dite immunoradiométrique ou à deux sites.
Selon un mode d'exécution, l'invention permet donc une déter- 25 mination dans laquelle on met en contact un milieu contenant la substance intéressante, telle que des antigènes, avec des anticorps, de sorte que les anticorps fixent sélectivement la substance, le produit de la réaction de fixation est ensuite mis en contact avec des anticorps marqués luminescents et on amorce une réaction de lumines- 30 cence, la quantité de la substance intéressante présente étant indiquée par la quantité de luminescence.
De préférence, la substance intéressante est fixée aux anticorps sur une phase solide qui peut être de la poudre de cellulose ou la paroi d'un récipient de réaction, tel qu'un tube en verre ou en 35 matière plastique. D'autres substances dans le milieu ne sont pas fixées par les anticorps et peuvent donc être éliminées par lavage.
Cette technique de détermination à deux sites est spécialement efficace lorsqu'on utilise le luminol ou un de ses dérivés comme marqueur luminescent, combiné avec l'anticorps de mouton anti-IgG de 40 lapin. Les résultats obtenus avec cet anticorps marqué/luminol ne sont pas modifiés après stockage pendant 9 mois à — 20° C.
Les marqueurs luminescents que l'on peut utiliser selon l'invention sont extrêmement variés.
Ces marqueurs luminescents peuvent être divisés en deux classes : 45
1. les marqueurs chimioluminescents,
2. les marqueurs bioluminescents.
Les marqueurs chimioluminescents comprennent des molécules inorganiques ou organiques qui peuvent réagir avec d'autres molécules pour produire de la lumière. Ces substances peuvent être ex- 50 traites de sources biologiques mais, dans ce cas, elles n'interviennent pas normalement dans l'émission de lumière dans leur environnement naturel. La réaction de luminescence impliquant le marqueur chimioluminescent est amorcée par addition du ou des réactifs appropriés. 55
L'initiateur ou amorceur peut être un agent oxydant, de préférence en milieu alcalin, ou un catalyseur. Un marqueur chimioluminescent préféré est un composé de formules générales :
N-H
I
N-H
ou dans lesquelles chacun des restes Rj, R2 et R3 est un atome d'hydrogène ou un reste alkyle ou alcényle en Q-Qo facultativement substitué, amino, amino substitué, carboxy ou hydroxy, chacun des restes R4 et R5 répond à la même définition que R!, R2 ou R3, ou bien est une liaison diazo, une liaison hêmidicarboxylate, une liaison amide, un halogénure d'acide organique ou un groupe isothiocya-nate, avec la condition que l'un au moins des restes Rt à Rs soit un groupe amino ou amino substitué. De préférence, le composé est le luminol (les restes R! à R3 sont chacun l'hydrogène).
De préférence, chacun des restes R4 et R5 est un groupe amino substitué par un reste hémisuccinate, aminoéthyle ou chloroacétyle.
Un avantage important des composés de formule (I) est qu'ils peuvent facilement former des ponts avec les anticorps, par exemple par des liaisons peptidiques. La formation de la liaison peptidique peut s'effectuer par combinaison avec un anhydride mixte, un carbo-diimide, un subérimidate ou un hémisuccinate. D'autres marqueurs chimioluminescents préférés sont:
i) la lophine et ses dérivés, c'est-à-dire les composés de formule générale:
R„
(II)
dans laquelle chacun des restes Rô, R, et R8 est un radical phênyle facultativement substitué,
ii) la lucigénine et ses dérivés, c'est-à-dire les composés de formule générale:
N
(III)
dans laquelle chacun des restes Rg, Ri 0, Ri 1 et Rj 2 est le même que Rt, R2, R3, R4 ou R5 tel que défini dans la formule (I),
iii) les composés de formule générale:
(IV)
14
dans laquelle chacun des restes R13 et Ri4 est le même que Ri, R2 R3, R4 et R5, tel que défini dans la formule (I),
iv) les transazodicarboxylates de formule générale:
RIS02C
/
N = N
/
co2r16
(V)
dans laquelle chacun des restes R15 et Ri6 est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur,
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6
v) les esters d'acide oxalique de formule générale:
coor17 I
coorj 8
dans laquelle chacun des restes X5, X6 et X7 a la même signification que Rlt R2, R3, R4 et Rs dans la formule (I), ou bien représente:
(vi)
dans laquelle chacun des restes R17 et Rls est un groupe alkyle inférieur,
vi) le pyrogallol.
Les initiateurs préférés sont le peroxyde d'hydrogène, le carbonate de potassium, le ferricyanure de potassium ou l'oxygène en pré- io sence de diméthylsulfoxyde. Les catalyseurs d'origine biologique,
tels que les enzymes, peuvent être utilisés comme initiateurs. Un catalyseur préféré est la Peroxydase.
Des exemples de réactions impliquant le luminol qui ont lieu avec émission de lumière sont les suivants: 15
Il | + H,0o + K^FeCCN)^ + OH"-»2O
m
2 + n2 + hO
2. luminol + H202 + KMn04 -» luminol oxydé + hv
3. luminol + H202 + Peroxydase -<• luminol oxydé + hv
La réaction de luminescence peut également être amorcée par une variation du pH ou des conditions physiques, telles que tempé- : rature, polarité du solvant et radiations, telles que rayons X, rayons y et particules émises par les isotopes radioactifs.
Les marqueurs bioluminescents sont des composants qui prennent part à une réaction de bioluminescence, laquelle est définie comme une réaction avec production de lumière dans laquelle l'un au moins des composants a été extrait d'une source biologique et qui, dans son environnement naturel, intervient dans la production de lumière. On entend par là les réactions impliquant un composé de synthèse de structures identiques ou semblables à celles qui sont synthétisées pour imiter le composé naturel.
Les marqueurs bioluminescents préférés sont:
i) la luciférine de la luciole et ses dérivés de formule générale:
X,
H
X, " N
(VII)
R.
OR
1
En général, n'importe quels dérivés stables de luciférine ou de cœlentérate sont appropriés.
Un grand nombre de réactions de bioluminescence nécessitent de l'oxygène comme partie de la réaction, par exemple la réaction suivante:
luciférine + autres cofacteurs + 02 -►
(L) (D) (S)
oxyluciférine + autres produits 4- hv
La réaction est catalysée par une enzyme connue sous le nom de luciférase. D'autres agents oxydants, tels que ceux utilisés pour les marqueurs de chimioluminescence, peuvent être utilisés dans la réaction.
Les réactions de luminescence isolées dans certains organismes lumineux, cependant, ne sont pas conformes à ce schéma. Dans certains cas de l'invention, ces réactions sont amorcées par addition des cofacteurs appropriés. On peut citer par exemple l'addition d'ions calcium aux photoprotéines isolées de certains cœlentérates:
o 2+ Ca ou autres cations
X,
55
NH
dans laquelle chacun des restes Xj, X2, X3 et X4 a la même signification que R!,R2,R3, R4 et R5 dans la formule (I), et ii) les chromophores de cœlentérates de formule générale:
0.. X.
(VIII)
X,
dans laquelle chacun des restes X5, X6 et X7 est tel que défini dans la formule (VII).
On peut utiliser comme marqueurs pour former un réactif luminescent n'importe lequel des composants intervenant dans une réac-65 tion de luminescence. Ainsi, un marqueur de chimioluminescence peut être un composé organique, tel que le luminol, un ion ou une molécule inorganique, ou un catalyseur tel qu'une Peroxydase. De manière semblable, un marqueur de bioluminescence peut être n'im
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porte quelle luciférine ou la luciférase, il peut avoir une structure analogue à celle de la luciférine, ou bien il peut être l'un des cofacteurs suivants:
1. luciole ATP
2. bactéries NADH
FMNH
R • CHO, où R est un groupe aliphatique
3. champignons NADH
NADPH
Dans la mise en œuvre de l'invention, on détermine normalement la quantité du réactif luminescent AB en plaçant un échantillon dans un tube, en supprimant un ou plusieurs des composants, ou bien l'initiateur nécessaire pour la réaction de luminescence. On amorce ensuite la réaction, physiquement ou chimiquement, par addition du ou des composants restants ou du catalyseur. La lumière émise peut être localisée ou mesurée par un dispositif classique, tel qu'un tube photomultiplicateur dont le signal est introduit et affiché ou enregistré dans un appareil d'enregistrement, un oscilloscope ou un scalaire. Dans certains cas, on peut aussi observer la lumière à l'œil nu ou l'enregistrer sur une plaque photographique ou au moyen d'un intensificateur d'image, en particulier lorsque l'on a besoin d'une information de position, par exemple la position de l'intensité lumineuse maximale à des fins histologiques, ou la couleur, ou l'intensité par rapport à un étalon.
L'invention propose l'application de réactifs luminescents à diverses techniques comportant en particulier les quatre problèmes analytiques principaux suivants:
1. Détermination immunologique et de fixation de protéines
Cette technique analytique est d'usage courant et comporte normalement la réaction de la molécule à analyser A avec la protéine de fixation C, qui, dans le cas d'une détermination immunologique, est un anticorps.
La caractéristique essentielle de cette méthode d'analyse est qu'il est nécessaire de séparer la substance A fixée sur l'anticorps de la substance A libre ou de séparer l'anticorps fixé de l'anticorps libre. La réaction est évaluée par marquage soit de l'anticorps, soit d'une autre molécule qui peut réagir avec les fractions libres ou liées après séparation. Le marqueur est soit chimioluminescent, soit bioluminescent comme défini ci-dessus. A titre d'exemple de ce type de détermination, on citera la détermination à deux sites décrite ci-dessus.
2. Renouvellement
Il existe de nombreuses situations dans lesquelles il est nécessaire de suivre quantitativement le renouvellement d'une molécule in vitro ou in vivo. La molécule peut être d'origine biologique ou elle peut être un composé pharmacologique. Pour mesurer le renouvellement de ces substances, on ajoute une faible quantité normalisée de la substance marquée avec le marqueur chimio- ou bioluminescent (comme défini ci-dessus) au milieu contenant la substance non marquée. On peut alors mesurer le renouvellement de la substance en mesurant la perte de la substance marquée.
3. Localisation histologique de substances
Pour localiser une substance à l'intérieur ou à l'extérieur d'une cellule en utilisant un réactif luminescent, le réactif approprié (par exemple un anticorps marqué) est ajouté à une préparation tissulaire et, après lavage, on l'examine au microscope. On localise ensuite le réactif luminescent à l'œil nu ou au moyen d'un intensificateur d'image; l'image peut ensuite être photographiée.
4. Traçage de substances subissant une redistribution
Dans un certain nombre de systèmes biologiques et de techniques de séparation in vitro, telles que centrifugation, Chromatographie et électrophorèse, il est nécessaire de suivre une substance subissant une redistribution. A cet effet, on ajoute à la préparation initiale une faible quantité étalonnée de la substance marquée avec un marqueur chimio- ou bioluminescent. On peut ensuite contrôler la distribution de la substance étudiée en suivant la distribution du réactif luminescent.
L'invention a également un intérêt considérable dans la mise en œuvre de déterminations homogènes, en particulier pour de petites molécules. Ces déterminations ont l'avantage d'une analyse rapide et ne nécessitent pas une étape de séparation.
Dans une technique classique de détermination immunologique, on fait réagir un antigène avec une quantité limitée d'un réactif de fixation (c'est-à-dire un anticorps). La proportion d'antigène fixée varie en raison inverse de la concentration ajoutée. On contrôle la réaction par incorporation d'une trace d'antigène marqué. Une caractéristique essentielle de la technique est l'aptitude à séparer l'antigène fixé de l'antigène non fixé.
Une détermination homogène est destinée à modifier une propriété de l'antigène marqué par réaction avec l'anticorps. Ainsi, on contrôle la réaction sans qu'il soit nécessaire de séparer les fractions fixée et non fixée. On ne peut utiliser de cette manière des marqueurs radio-isotopiques. Dans une détermination homogène, la lumière émise par un antigène (ou anticorps) marqué luminescent provoque l'émission de lumière d'une longueur d'onde différente par l'anticorps (ou antigène) marqué avec une molécule fluorescente. Ainsi donc, l'utilisation d'un filtre approprié dans l'appareil de détection entraînerait la mesure de la lumière dérivée de la fluorescence produite par l'interaction antigène/anticorps. Le système est homogène parce qu'il n'est pas nécessaire de séparer l'antigène n'ayant pas réagi puisqu'il émet une lumière de plus courte longueur d'onde et, par conséquent, non enregistrée.
Le procédé de l'invention peut être appliqué à une détermination homogène: on fait réagir une substance marquée luminescente avec un anticorps ou un antigène marqué avec un marqueur fluorescent et on amorce une réaction de luminescence, l'énergie de la réaction de luminescence excitant le marqueur fluorescent fixé sur l'anticorps ou l'antigène en produisant un déplacement de longueur d'onde de l'émission de lumière ou une variation du rendement quantique.
De préférence, l'anticorps ou l'antigène est marqué avec la fluo-rescéine. La réaction de luminescence est convenablement amorcée par addition de peroxydase.
De préférence, la substance intéressante est un haptène et elle est choisie parmi les substances suivantes: nucléotides cycliques (AMP cyclique, GMP cyclique et CMP cyclique), 25-hydroxycholécaci-férol, 1,25-dihydroxycholécalciférol, thyroxine, triiodothyronine, progestérone, œstradiol, œstriol, testostérone, aldostérone, cortisol, acide glycocholique, acide taurocholique, barbiturates, salicylates, phénitoïne, morphine, héroïne, méthotrexate et digoxine.
Le marqueur chimioluminescent préféré pour les haptènes, en particulier la thyroxine, est un ester oxalique.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemples:
1. Excitation d'un luminoljanticorps de mouton anti-IgG de lapin
On prépare un réactif luminescent par copulation du sel de dia-zonium de luminol sur l'anticorps de mouton anti-IgG de lapin. La réaction de luminescence est amorcée par excitation du réactif par l'oxygène en présence d'alcali, la lumière étant émise dans une gamme de longueurs d'onde de 400-500 nm et décelée au moyen d'un compteur de photons.
L'émission de lumière par le réactif après excitation est extrêmement rapide, il suffit de moins de 2 s pour doser avec précision le luminol présent.
Des exemples plus détaillés de l'invention sont donnés ci-après.
2. Détermination immunologique de l'hormone parathyroïde au moyen d'anticorps marqués au luminol a. Mode opératoire général
On connaît un procédé pour mesurer la concentration d'hormone parathyroïde dans le sérum humain (Woodhead et coll., «Brit.
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Med. Bull.», 30, pp. 44-49, 1974), utilisant des anticorps marqués avec I2SI.
b. Préparation d'anticorps marqués au luminol
La réaction chimique, principale décrite est une diazotation entre le luminol et les anticorps contre l'hormone parathyroïde humaine. On met en suspension 2 mg de luminol dans 1 ml de HCl N à 0°C, on ajoute 10 mg de NaN02 et on mélange doucement la solution pendant environ 3 min. On ajuste ensuite le pH à 8,0-9,0 par NaOH. On ajoute ensuite 2 ml d'une solution d'anticorps contre l'hormone parathyroïde humaine fixés à l'hormone parathyroïde humaine sur aminocellulose (immuno-adsorbant) dans le tampon au borate de sodium 0,2M à pH 8,2. Après incubation de ce mélange pendant environ 16 h à 4° C, on lave l'immuno-adsorbant quatre fois avec le tampon au borate. On lave ensuite l'immuno-adsorbant trois fois avec du chlorure de sodium à 0,9% (poids/volume). Les anticorps marqués au luminol sont élués avec le tampon à pH 2.
c. Détermination de l'hormone parathyroïde (PTH)
Celle-ci s'effectue par une méthode semblable à une détermination immunoradiométrique, sauf que les anticorps sont marqués au luminol au lieu de I25I. On prépare des étalons de PTH (0,08-50 ng/ml) dans le NIGP (20,6 g de barbitone de sodium, 10 g de NaCl, 1 g d'azide de sodium, 2 g de sérumalbumine humaine, 40 mg de y-globuline de cobaye non immun, complété à 21, ajusté à pH 8,0 par HCl 1,0N). On place 100 |il de chaque étalon dans un tube en polyéthylène Beckman (EET 23), à raison de quatre tubes pour chaque étalon, et on ajoute 50 (il de tampon NIGP. On ajoute 10 |xl de réactif luminescent (anticorps PTH marqué au luminol). Après avoir mélangé, on fait incuber les tubes pendant 3 d à 4°C. On ajoute 50 jxl de PTH ImAD (PTH lié par covalence sur la cellulose). Après 20 min, on centrifuge les tubes pendant 1 min et on détermine le réactif luminescent dans 90 ni du liquide surnageant en dosant le luminol.
d. Détermination du réactif luminescent
On ajoute 90 (il du liquide surnageant ci-dessus à 900 |il de NaOH N/10, on ajoute 10 (j.1 de H202 et on place le tube devant un tube photomultiplicateur. On trace la courbe du comptage total enregistré dans les dix premières secondes après l'addition de 1 ml de K3Fe(CN)6 10 3M en fonction de la concentration de PTH. Les valeurs dans les échantillons peuvent être lues sur cette courbe d'étalonnage.
3. Renouvellement de l'albumine dans un homogénéisât de foie
On prépare de la sérumalbumine de bœuf (BSA) marquée au luminol comme décrit à l'exemple 2 pour les anticorps contre PTH. On prépare un homogénéisât de foie de rat (2:1 en poids/volume) dans KCl 150- 10~3M, MgCl2 2- 10_3M, mercaptoéthanol 1 - 10~3M, mercaptoéthanol 1 • 10~3M et tris 20 • 10~3M à pH 7,4. On place des échantillons de 1 ml dans des tubes en matière plastique Luckam LP3, on ajoute des échantillons de 10 ni de BSA marqué au luminol + 10 jj.1 de BSA non marqué (0,01-100 mg/ml) et on fait incuber les tubes à 37" C jusqu'à 60 min. Après un intervalle défini, on précipite l'albumine par addition d'un égal volume de (NH4)2S04 saturé. On centrifuge ensuite les tubes, on lave les pellets et on les redissout dans 0,5 ml de NaOH N/50. On prélève des échantillons de 100 [il pour la détermination du réactif luminescent comme décrit à l'exemple 2 pour les anticorps marqués au luminol. La diminution de l'activité de luminescence dans ces pellets est une mesure de la vitesse de destruction de l'albumine.
4. Localisation histochimique d'antigènes sur des érythrocytes
On marque des anticorps antiérythrocytes humains par le luminol comme décrit à l'exemple 2 pour les anticorps anti-PTH. On ajoute 10 ni de ce réactif luminescent à 1 ml de NaCl à 0,9% (poids/ volume) contenant 108 érythrocytes humains. Après incubation pendant 30 min à 37° C, on centrifuge les cellules et on les étale sur une plaque de microscope et on observe au microscope optique muni d'un dispositif intensificateur d'image. On ajoute KMn04 1 • 10~3M pour stimuler la luminescence du luminol. Les cellules auxquelles sont fixés les anticorps (et par conséquent les antigènes sur la surface de leurs cellules) émettent une lumière qui est visualisée par l'intensificateur d'image et ensuite photographiée. Les cellules contenant les antigènes peuvent ensuite être localisées par comparaison de la photographie de l'image intensifiée avec une photographie prise en contraste de phase.
5. Distribution d'antigènes de membranes de cellules pendant le fractionnement des adipocytes de rat
On marque des anticorps antiadipocytes de rat par le luminol comme décrit à l'exemple 2 pour les anticorps anti-PTH. On ajoute des échantillons de 10 |d du réactif luminescent à 1 ml d'une solution contenantNA+ 144-10-3M,K+ 5,9-10~3M, Mg2+ 1,2-10-3M, Ca2+ 2,6-10~3M, Cl- 128,9- 10-3M, S042- 1,2-10~3M, re 1,2 • 10~3M, hco3- 25 • 10-3M, 4% de BSA 2/v, à pH 7,4 avec 106-107 adipocytes de rat. Après une incubation de 30 min à 37° C, on centrifuge la suspension et on lave les cellules trois fois. On homogénéise ensuite les cellules dans 5 ml de KCl 10_3M, MgCl210-3 M, mercaptoéthanol 1 • 10~3M, tris 20 • 10~3M, à pH 7,4. On met en œuvre une technique classique de centrifugation différentielle en recueillant les pellets à 500 g, 10 000 g et 100 000 g et le liquide surnageant à 100 000 g. On détermine ensuite le luminol dans des échantillons de 100 |il de chaque fraction comme décrit à l'exemple 2. Une comparaison de la quantité de luminol dans chaque fraction avec celle obtenue avec les cellules entières permet une estimation quantitative de la quantité d'antigènes de membranes de cellules dans chaque fraction.
6. Détermination à deux sites de l'a-fœtoprotéine avec des anticorps marqués au luminol
On prépare une fraction d'immunoglobuline d'un antisérum anti-a-fœtoprotêine par précipitation par le sulfate de sodium. On lie par covalence le précipité contenant les anticorps anti-AFP en utilisant le glutaraldéhyde à un silane dérivé d'un verre de borosilicate sous la forme de tubes à réaction. On fait incuber les échantillons contenant l'AFP pendant 3 h dans les tubes, tandis que l'AFP se fixe aux anticorps. On ajoute ensuite les anticorps anti-AFP marqués au luminol préparés comme décrit pour la détermination de PTH.
Après une période d'incubation pendant une nuit, on vide les tubes et on les lave deux fois à la saumure tamponnée à pH 7,4 par le phosphate 0,05M contenant 0,1% de sérumalbumine de bœuf. On place les tubes dans le compteur à photons et on amorce la réaction de photoluminescence comme dans la détermination de PTH. La quantité de lumière émise est fonction de la quantité de luminol présent et, par conséquent, de la concentration d'AFP dans les ' échantillons.
7. Détermination homogène de l'AMP cyclique
On marque un anticorps anti-AMP (ou GMP) cyclique par le luminol comme décrit dans les exemples 2 et 3. On marque le succinyl-AMP (ou GMP) cyclique par la fluorescêine. On fait réagir l'anticorps marqué avec l'AMP (ou GMP) cyclique marqué dans un tube à réaction à pH 7,4. On ajoute 10 mU de peroxydase et du peroxyde d'hydrogène 1 • 10_3M et on mesure l'émission de lumière à 540 nm. L'émission à cette longueur d'onde ne peut provenir que du composant marqué à la fluorescêine qui est fixé à l'anticorps. L'anticorps non fixé émet à une longueur d'onde différente (460 nm).
La lumière émise par le luminol est absorbée par la fluorescêine plus efficacement lorsque deux molécules sont étroitement voisines, c'est-à-dire à < 100 Â. Ainsi, le déplacement de longueur d'onde se produit lorsque l'AMP cyclique marqué et l'anticorps sont liés ensemble. On peut effectuer la même réaction lorsque l'AMP cyclique est marqué au luminol et l'anticorps est marqué à la fluorescêine.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention.
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Claims (13)
1. Procédé pour déceler, analyser, doser ou localiser une substance d'intérêt biologique dans un liquide ou tissu d'un corps, caractérisé en ce que l'on combine un réactif de fixation apte à se lier de façon spécifique à ladite substance et choisi parmi un anticorps et une protéine de fixation, avec un marqueur comprenant un chromo-phore luminescent de façon que le réactif de fixation ainsi marqué soit immunologiquement pur et stable et que son aptitude de réaction ne soit pas sensiblement modifiée par le marqueur, on met ensuite ladite substance en contact avec le réactif de fixation marqué, on amorce une réaction de luminescence et on détecte ou mesure la lumière émise afin d'obtenir une information concernant ladite substance.
2 1
(la)
(II)
R_
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction de luminescence est amorcée chimiquement au moyen d'un réactif chimique ou d'un catalyseur.
2
REVENDICATIONS
3
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coor17 I
COORjs ,
(VI)
S' Ns
(VII)
H
C02X4
14. Réactif luminescent selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que 60% au moins des anticorps sont capables de se fixer aux antigènes correspondants.
et
(VIII) 15
dans lesquelles chacun des symboles Ri, R2 et R3 représente un atome d'hydrogène ou un reste alkyle ou alcényle en Ci-C10 facultativement substitué, amino, amino substitué, carboxy ou hydroxy, chacun des symboles R4 et Rs a la même signification que R,, R2 ou R3, ou bien représente une liaison diazo, une liaison hémidicarboxylate, une 25 liaison amide, un halogénure d'acide organique ou un groupe isothio-cyanate, avec la condition que l'un au moins des symboles Rj à Rs représente un groupe amino ou amino substitué, chacun des symboles Re, R7 et R8 représente un radical phényle facultativement substitué; chacun des symboles R9, Ri 0, Ri ! et Ri 2 a la même signfiication que 30 R], R2, R3, R4 ou R5, chacun des symboles R13 et R14 a la même signification que Rj, R2, R3, R4 et Rs, chacun des symboles R15 et Rie, représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur, chacun des symboles R! 7 et Rj 8 représente un groupe alkyle inférieur, chacun des symboles Xj, X2, X3 et X4 a la même signfiication que Ri, 35 R2, R3, R4 et R5, et chacun des symboles Xs, X6 et X7 a la même signification que R!, R2, R3, R4 et Rs, ou bien représente un groupement de formules:
i ou bien le marqueur est le pyrogallol.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réaction de luminescence est amorcée par un agent oxydant, facultativement en conditions alcalines, un catalyseur ou une variation de pH.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le réactif de fixation marqué comprend au moins deux composants chimiques, avec ou sans cofacteur ou catalyseur, et le marqueur comprend un nombre incomplet des composants ou éléments, la réaction de luminescence étant amorcée par addition ultérieure du ou des composants ou éléments manquants essentiels.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction de luminescence est amorcée physiquement.
s
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu contenant la substance d'intérêt biologique, telle que des antigènes, avec des anticorps, de sorte que les anticorps se fixent sélectivement à la substance, on met ensuite le produit de réaction en contact avec les anticorps marqués, io et on amorce la réaction de luminescence, la quantité de substance d'intérêt biologique présente étant indiquée par la quantité de luminescence.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la substance intéressante est liée aux anticorps sur une phase solide. 15
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite phase solide est une poudre de cellulose ou la paroi d'un récipient de réaction.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, constituant un mode opératoire pour la mesure du renouvellement de substances
20 d'intérêt biologique in vitro, caractérisé en ce que la substance à étudier est marquée avec le ou les composants du réactif.
10
l12
(III)
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on localise une substance d'intérêt biologique dans un tissu.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caracté-25 risé en ce que le ou les composants du réactif de luminescence sont des marqueurs chimioluminescents ou bioluminescents répondant à l'une des formules générales suivantes:
12. Réactif luminescent pour la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications précédentes pour déceler ou doser les antigè- 60 nés spécifiques dans des tissus ou liquides biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend des anticorps ou des protéines de fixation d'origine naturelle, marqués avec un chromophore luminescent et étant pur au point de vue immunologique.
13. Réactif luminescent selon la revendication 12, caractérisé en ce 65 que les anticorps sont l'anticorps de mouton anti-IgG de lapin, l'anticorps de mouton anti-IgG de cobaye, l'IgG de mouton, l'IgG de chèvre, l'IgG d'âne ou l'IgG de cobaye.
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