JPH01219563A - 化学発光の写真法による検出方法 - Google Patents
化学発光の写真法による検出方法Info
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- JPH01219563A JPH01219563A JP4498988A JP4498988A JPH01219563A JP H01219563 A JPH01219563 A JP H01219563A JP 4498988 A JP4498988 A JP 4498988A JP 4498988 A JP4498988 A JP 4498988A JP H01219563 A JPH01219563 A JP H01219563A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
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- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は核酸やタンパク質の化学発光を写真法によって
検出する、新規な微量分析法に関するものである。
検出する、新規な微量分析法に関するものである。
（従来の技術）
分子生物学における遺伝子レベルでの研究は、制限酵素
の発見や各種ベクターの開発、細胞培養技術の発達など
により大きく進展した。中でも核酸の特定のシーケンス
を持つ断片をプローブを用いて検出する技術、たとえば
コロニーハイブリダイゼーション、サザン法、ノーザ／
法などは研究を進める上で欠くべからざる技術である。
の発見や各種ベクターの開発、細胞培養技術の発達など
により大きく進展した。中でも核酸の特定のシーケンス
を持つ断片をプローブを用いて検出する技術、たとえば
コロニーハイブリダイゼーション、サザン法、ノーザ／
法などは研究を進める上で欠くべからざる技術である。
また、モノクローナル抗体を用いた細胞膜表面のレセプ
ターなどのタンパク質やオリゴ糖の選択的検出、たとえ
ばＥＬＩＳＡ法やイムノアッセイなども日常的に行なわ
れている。しかし、これらの微量物質を検出するために
従来用いられている放射性同位元素を利用した技術は、
不安定でかつ取り扱いが厳しく規制されている放射性同
位元素を用いている点で非常に不利である。
ターなどのタンパク質やオリゴ糖の選択的検出、たとえ
ばＥＬＩＳＡ法やイムノアッセイなども日常的に行なわ
れている。しかし、これらの微量物質を検出するために
従来用いられている放射性同位元素を利用した技術は、
不安定でかつ取り扱いが厳しく規制されている放射性同
位元素を用いている点で非常に不利である。
また、Ｘ線フィルムの露光のために一般に１日から数日
を要するため、結果を直ちに知ることができない欠点も
持っている。但し、放射性同位元素を用いる方法は感度
を高くできる利点があるため、螢光標識で代替しても感
度的に充分でない。このほか酵素標識法も知られている
が、検出に−１，未反応が利用する関係で、迅速性に欠
ける欠点がある。
を要するため、結果を直ちに知ることができない欠点も
持っている。但し、放射性同位元素を用いる方法は感度
を高くできる利点があるため、螢光標識で代替しても感
度的に充分でない。このほか酵素標識法も知られている
が、検出に−１，未反応が利用する関係で、迅速性に欠
ける欠点がある。
（発明が解決しようとする問題点）
近年、化学発光を用いた微量分析については発光イムノ
アッセイ（１，Ｗｅｅｋｓ ｅｔａｌ Ｃ１１ｒｂＳｃ
ｉ、 、 ７０，４０３．１９８６ など）が最も
盛んに行なわれておシ、感度的には１２５Ｉ または
３Ｈを用いるラジオイムノアッセイに劣らないという結
果が得られて込る（ Ｊ、 Ｄｅ、 Ｂｏｅｖｅｒ。
アッセイ（１，Ｗｅｅｋｓ ｅｔａｌ Ｃ１１ｒｂＳｃ
ｉ、 、 ７０，４０３．１９８６ など）が最も
盛んに行なわれておシ、感度的には１２５Ｉ または
３Ｈを用いるラジオイムノアッセイに劣らないという結
果が得られて込る（ Ｊ、 Ｄｅ、 Ｂｏｅｖｅｒ。
ｅｔａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｃｈｉｒｒｈ Ａｃｔａ＋
１７０，１１７．１９８５ ）。
１７０，１１７．１９８５ ）。
しかしながら、従来性なわれている化学発光イムノアッ
セイでは化学発光標識による化学発光は光電子増倍管な
どを用いた光子計測法によっている。この方法は極めて
高感度に標識化合物の存在を検出することができる反面
放射性同位元素を用いたオートラジオグラフィーのよう
に二次元平面上に展開した標識化合物の位置に関する情
報は得られない。たとえばサザン法では、ＤＮＡ断片は
ゲルプレート上で電気泳動法によって分子量の大きさに
従って［Ｒ分離したのちニトロセルロースフィルターに
転写し、目的とするＤＮＡ断片の塩基配列と相補的な放
射性同位元素標識ＤＮＡ ７’ロープを用いてニトロセ
ルロース上ＩＩＰＤＮＡ断片と）・イブリダイズし、最
終的にオートラジオグラフィーによりＸ線フィルムで検
出する。従って標識化合物の存在有無とともにゲルプレ
ート上での位置に関する情報も得られ、目的ＤＮＡ断片
の検出同定が可能となるＯ （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、以上の理由から標識物質として放射性同
位元素の代わりに化学発光物質を用いれば、標識化合物
が平面の展開媒体上のどの位置に存在するかを高感度フ
ィルムを用いて写真法で検出できるのではないかという
ことに思いつき、化学発光標識化合物の写真法による検
出法に関する研究を行なった結果、本発明を完成させた
。すなわち、本発明は微量の核酸あるいはタンパク質の
検出に発光標識化合物を用い、写真フィルム上に二次元
情報としてその発光を写しとる方法である。
セイでは化学発光標識による化学発光は光電子増倍管な
どを用いた光子計測法によっている。この方法は極めて
高感度に標識化合物の存在を検出することができる反面
放射性同位元素を用いたオートラジオグラフィーのよう
に二次元平面上に展開した標識化合物の位置に関する情
報は得られない。たとえばサザン法では、ＤＮＡ断片は
ゲルプレート上で電気泳動法によって分子量の大きさに
従って［Ｒ分離したのちニトロセルロースフィルターに
転写し、目的とするＤＮＡ断片の塩基配列と相補的な放
射性同位元素標識ＤＮＡ ７’ロープを用いてニトロセ
ルロース上ＩＩＰＤＮＡ断片と）・イブリダイズし、最
終的にオートラジオグラフィーによりＸ線フィルムで検
出する。従って標識化合物の存在有無とともにゲルプレ
ート上での位置に関する情報も得られ、目的ＤＮＡ断片
の検出同定が可能となるＯ （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、以上の理由から標識物質として放射性同
位元素の代わりに化学発光物質を用いれば、標識化合物
が平面の展開媒体上のどの位置に存在するかを高感度フ
ィルムを用いて写真法で検出できるのではないかという
ことに思いつき、化学発光標識化合物の写真法による検
出法に関する研究を行なった結果、本発明を完成させた
。すなわち、本発明は微量の核酸あるいはタンパク質の
検出に発光標識化合物を用い、写真フィルム上に二次元
情報としてその発光を写しとる方法である。
（作 用）
化学発光の系としては、例えば次のような手段が用いら
れる。
れる。
１）Ｏ−７工ナントロリン誘導体と過酸化水素を、鋼（
ｍ）あるいはオスミウム（■）触媒存在下反応させ発光
させる。
ｍ）あるいはオスミウム（■）触媒存在下反応させ発光
させる。
２） ルミノ−ル誘導体と過酸化水素を鉄（ｍ）触媒存
在下反応させ発光させる。
在下反応させ発光させる。
３） アクリジニウム誘導体と過酸化水素を反応させ発
光させる。
光させる。
このうち１）、２）では微量の金属イオンの触媒作用に
よって反応が進行するので、目的化合物は基質の７エナ
ントロリンやルミノール誘導体で標識してもよく、また
触媒作用を持つ金属イオンをキレート化合物として目的
化合物に標識してもよい。また、３）は無触媒反応であ
るからアクリジニウム誘導体で標識しなければならない
。標識の方法は、化学発光物質あるいは触媒にアミン基
、カルボキシル基などの官能基を導入した化合物を用い
、その官能基を介して核酸あるいはタンパク質と反応さ
せることにより行なわれる。
よって反応が進行するので、目的化合物は基質の７エナ
ントロリンやルミノール誘導体で標識してもよく、また
触媒作用を持つ金属イオンをキレート化合物として目的
化合物に標識してもよい。また、３）は無触媒反応であ
るからアクリジニウム誘導体で標識しなければならない
。標識の方法は、化学発光物質あるいは触媒にアミン基
、カルボキシル基などの官能基を導入した化合物を用い
、その官能基を介して核酸あるいはタンパク質と反応さ
せることにより行なわれる。
また、写真フィルムに写しとる方法としてはポラロイド
Ｔｙｐｅ ６１２ ７ イ＃ム（ＡＳＡｚｏ、ｏｏｏ）
のような高感度インスタントフィルムあるいは高感度Ｘ
線フィルムを化学発光物質あるいは触媒で標識した化合
物を含むゲルプレートあるいはニトロセルロースフィル
ターなどと薄いプラスチックまたはガラス板を介して接
触させ、ゲルプレートあるいはフィルター上に過酸化水
素及び触媒あるいは化学発光物質を含む溶液を塗布し発
光させ感光させる。あるいはまた、暗室内でプレート上
の標識化合物を上記の方法で発光させ、これを高感度フ
ィルムを装填したカメラで撮影しても同様な結果が得ら
れる。
Ｔｙｐｅ ６１２ ７ イ＃ム（ＡＳＡｚｏ、ｏｏｏ）
のような高感度インスタントフィルムあるいは高感度Ｘ
線フィルムを化学発光物質あるいは触媒で標識した化合
物を含むゲルプレートあるいはニトロセルロースフィル
ターなどと薄いプラスチックまたはガラス板を介して接
触させ、ゲルプレートあるいはフィルター上に過酸化水
素及び触媒あるいは化学発光物質を含む溶液を塗布し発
光させ感光させる。あるいはまた、暗室内でプレート上
の標識化合物を上記の方法で発光させ、これを高感度フ
ィルムを装填したカメラで撮影しても同様な結果が得ら
れる。
これらの標識化合物で目的化合物を修飾し二次元的に検
出する具体的・方法としては、まずルミノール誘導体と
して６−Ｎ−（４−７ミノプチル）−エチル−２，３−
ジヒドロ−１゜４−フタルヒドラジジジオン（以下、Ａ
ＢＥ゛ 工と略す。）をグルタルアルデヒドを介して特
定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの核酸塩基の７
ミノ基と反応させることによシ核酸をルミノール標識し
プローブとすることができる。これを常法（Ｔ、 Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ。
出する具体的・方法としては、まずルミノール誘導体と
して６−Ｎ−（４−７ミノプチル）−エチル−２，３−
ジヒドロ−１゜４−フタルヒドラジジジオン（以下、Ａ
ＢＥ゛ 工と略す。）をグルタルアルデヒドを介して特
定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの核酸塩基の７
ミノ基と反応させることによシ核酸をルミノール標識し
プローブとすることができる。これを常法（Ｔ、 Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔａｌ。
”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ’Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２）などに
従い作成した、ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を転写したニ
トロセルロースフィルターのプローブと相補配列を持つ
断片とハイブリダイズさせ、ポラロイドのインスタント
フィルムと薄いプラスチック板を介して密着させる０次
に暗室でインスタントフィルムカセットのシャッターカ
ハーヲ開キ、ニトロセルロースフィルターに過酸化水素
ト鉄（ｍ）−テトラフェニルポルフィリン錯体の混合水
溶液を加え、化学発光を生じさせる。約十数分間露光さ
せたのちフィルムをホルダーから抜きと９現像すると、
プローブと相補配列を有する断片を白いバンドとして検
出できる。このような化学発光標識と写真法を用いるこ
とにより取り扱いがやっかいで、結果を得るのに時間を
要する放射性同位元素標識によらずに、微量な物質の二
次元的検出が安全に且つ短時間に行なうことができるよ
うになるＯ 上記化学発光の系の検出限界を知るために化学発光の検
出感度を簡単な系で測定した。
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ’Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２）などに
従い作成した、ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を転写したニ
トロセルロースフィルターのプローブと相補配列を持つ
断片とハイブリダイズさせ、ポラロイドのインスタント
フィルムと薄いプラスチック板を介して密着させる０次
に暗室でインスタントフィルムカセットのシャッターカ
ハーヲ開キ、ニトロセルロースフィルターに過酸化水素
ト鉄（ｍ）−テトラフェニルポルフィリン錯体の混合水
溶液を加え、化学発光を生じさせる。約十数分間露光さ
せたのちフィルムをホルダーから抜きと９現像すると、
プローブと相補配列を有する断片を白いバンドとして検
出できる。このような化学発光標識と写真法を用いるこ
とにより取り扱いがやっかいで、結果を得るのに時間を
要する放射性同位元素標識によらずに、微量な物質の二
次元的検出が安全に且つ短時間に行なうことができるよ
うになるＯ 上記化学発光の系の検出限界を知るために化学発光の検
出感度を簡単な系で測定した。
０−フェナントロリンを利用する系ではＣＥＤＡＢ （
カチオン界面活性剤） １．ＯＸｌｏ−２Ｍ。
カチオン界面活性剤） １．ＯＸｌｏ−２Ｍ。
水酸化ナトリウム３．５Ｘ１０ ”Ｍ、銅（ＩＩ） ４
３Ｘ１０ ’Ｍ及び過酸化水素３．０％で溶液の全量が
３５＃ｔ の場合、０−７エナントロリン２．５Ｘ１０
’Ｍの濃度まで写真法により発光が検出できた。
３Ｘ１０ ’Ｍ及び過酸化水素３．０％で溶液の全量が
３５＃ｔ の場合、０−７エナントロリン２．５Ｘ１０
’Ｍの濃度まで写真法により発光が検出できた。
また鋼（ｎ）の代わシにオスミウム（ｓｍ）６．７ｘ１
０ ’Ｍを用いても同様の検出感度があった。これは０
−７エナントロリンとして１．０Ｘ１０ ｍｏｌの量
になる。次にルミノール類を利用する系では、鉄（ｍ）
−ａ、ムｒＳ’−テトラキス（４−カルボキシフェニル
）ポルフィリン（以下ＴＣＰＰと略す） ５．０Ｘ１０
−８Ｍ 及び過酸化水素０．０３チで溶液の全量が３０
μｔ の場合、ルミノール１．０Ｘ１０−’Ｍ で検
出できた。これはルミノールとして３．０Ｘ１０−”ｍ
ｏｌの量に対応し、たとえばｐＢＲ３２２ベクター１０
μｇ の特定のシーケンスを検出できることになる。ま
た鉄（ＩＩＩ） −Ｔ ＣＰ Ｐで標識する方法で行な
うとするとルミノール１．０刈０’Ｍ、過酸化水素０．
０３チで溶液の全量が３０ ｓｌ の場合、鉄（■）
−Ｔ ＣＰ Ｐ ６．７ｘｌＯ”Ｍの濃度まで検出でき
、これは触媒の鉄（ＩＩＩ） −Ｔ ＣＰ Ｐ トＬテ
２．ＯＸ１０−１８ｍｏｌの量に匹適する。プラークハ
イブリダイゼーションでは、一つのプラークに平均１×
１０７個の７７−ジが存在しており、約１．７Ｘ１０
ｍｏｌの量になるので、この系で充分検出できること
がわかる。アクリジニウムを利用する系での検出限界は
約８．０Ｘ１０ ｍｏｌであり、更に感度が高く超微
量の核酸やタンパク質などの検出が行なえる。
０ ’Ｍを用いても同様の検出感度があった。これは０
−７エナントロリンとして１．０Ｘ１０ ｍｏｌの量
になる。次にルミノール類を利用する系では、鉄（ｍ）
−ａ、ムｒＳ’−テトラキス（４−カルボキシフェニル
）ポルフィリン（以下ＴＣＰＰと略す） ５．０Ｘ１０
−８Ｍ 及び過酸化水素０．０３チで溶液の全量が３０
μｔ の場合、ルミノール１．０Ｘ１０−’Ｍ で検
出できた。これはルミノールとして３．０Ｘ１０−”ｍ
ｏｌの量に対応し、たとえばｐＢＲ３２２ベクター１０
μｇ の特定のシーケンスを検出できることになる。ま
た鉄（ＩＩＩ） −Ｔ ＣＰ Ｐで標識する方法で行な
うとするとルミノール１．０刈０’Ｍ、過酸化水素０．
０３チで溶液の全量が３０ ｓｌ の場合、鉄（■）
−Ｔ ＣＰ Ｐ ６．７ｘｌＯ”Ｍの濃度まで検出でき
、これは触媒の鉄（ＩＩＩ） −Ｔ ＣＰ Ｐ トＬテ
２．ＯＸ１０−１８ｍｏｌの量に匹適する。プラークハ
イブリダイゼーションでは、一つのプラークに平均１×
１０７個の７７−ジが存在しており、約１．７Ｘ１０
ｍｏｌの量になるので、この系で充分検出できること
がわかる。アクリジニウムを利用する系での検出限界は
約８．０Ｘ１０ ｍｏｌであり、更に感度が高く超微
量の核酸やタンパク質などの検出が行なえる。
以上、本発明の概要について述べたが、本発明における
化学発光反応は上記の三種に限定されるものではなく、
標識可能な基質、触媒系にすべて応用することができる
。また写真法に用いられるフィルムはポラロイドＴｙｐ
ｅ６１２フィルムや高感度Ｘ線フィルムに限定されるも
のではなく、本発明の目的に応用可能な感度を持つフィ
ルム、印画紙などの感光体も含むものである。
化学発光反応は上記の三種に限定されるものではなく、
標識可能な基質、触媒系にすべて応用することができる
。また写真法に用いられるフィルムはポラロイドＴｙｐ
ｅ６１２フィルムや高感度Ｘ線フィルムに限定されるも
のではなく、本発明の目的に応用可能な感度を持つフィ
ルム、印画紙などの感光体も含むものである。
（実 施 例）
以下に実施例をあげ、本発明の内容を更に詳細に説明す
る０ 実施例１ ルミノール銹導体で標識したＤＮＡ第１ノゴマーをプロ
ーブとし、相補的なシーケンスを有するＤＮＡ断片を写
真法により検出する方法。
る０ 実施例１ ルミノール銹導体で標識したＤＮＡ第１ノゴマーをプロ
ーブとし、相補的なシーケンスを有するＤＮＡ断片を写
真法により検出する方法。
１） ＤＮＡオリゴマー及びプローブの作成デオキシ
オリゴヌクレオチド５ ’Ｔ、５Ａ３ ’（オリゴｄＴ
）及び”ＴＡｌ、３’ （オリゴｄＡ）をＤＮＡ合成装
置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅｒｎａ社製
３ｇ０Ａ）により合成した。オリゴｄＴとＡＢＥ Ｉを
グルタルアルデヒドを用いて３′端のアデニンのアミノ
基と結合させ、反応物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム 流速
１ ｓｔ／分、１０％アセトニトリル／９０％ＩＱｍＭ
ホウ酸−トリエチルアミン緩衝液→５０チアセトニ
ト リ ル −５０％ １ ０ ｍＭ ホ ウ
酸 −ト リ エチルアミン緩衝液 ２０分のグラージ
ェント）によシ、オリゴｄＴのＡＢＥＩによる標識化合
物（プローブ）を単離精製した。
オリゴヌクレオチド５ ’Ｔ、５Ａ３ ’（オリゴｄＴ
）及び”ＴＡｌ、３’ （オリゴｄＡ）をＤＮＡ合成装
置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅｒｎａ社製
３ｇ０Ａ）により合成した。オリゴｄＴとＡＢＥ Ｉを
グルタルアルデヒドを用いて３′端のアデニンのアミノ
基と結合させ、反応物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム 流速
１ ｓｔ／分、１０％アセトニトリル／９０％ＩＱｍＭ
ホウ酸−トリエチルアミン緩衝液→５０チアセトニ
ト リ ル −５０％ １ ０ ｍＭ ホ ウ
酸 −ト リ エチルアミン緩衝液 ２０分のグラージ
ェント）によシ、オリゴｄＴのＡＢＥＩによる標識化合
物（プローブ）を単離精製した。
２） ニトロセルロースフィルター上でのドツトプロッ
ティング ＯＤ ２．。＝０．１ の濃度に調製したオリゴｄＡ、
オリゴｄＴを２ ｃｍＸ ５ ｃｍ のニトロセルロ
ースフィルター上に−すれ（’ｔＬ５．Ｌ１０ｓＬＳ
２０ｓ１． づつスポットした。ドツトの大きさは直
径的２ ｍｍ とした０常法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔａｌ、 ＠Ｍｏ１ｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’ Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １
９８２など）に従い、焼き付ケ、ヒートシールバッグに
入れ４２℃でグレハイプリダイゼーションについでハイ
ブリダイゼーションを行なった。この際、０Ｄ２６゜＝
１．０に調製したプローブ１００ ｐｌ を２ ｍｌ
のノ・イブリダイゼーシ芦ン緩衝液に混合して用い
た。４２℃で一夜インキユペートしたのち、洗浄風乾し
て減圧下焼き付けした０ ３） 写真法による化学発光の検出 ポラロイドＴｙｐｅ６１２インスタントフィルムカセッ
トの上に、フィルムのサイズと一致する薄いプラスチッ
クでできた長方形の容器を置き、カセットに固定した。
ティング ＯＤ ２．。＝０．１ の濃度に調製したオリゴｄＡ、
オリゴｄＴを２ ｃｍＸ ５ ｃｍ のニトロセルロ
ースフィルター上に−すれ（’ｔＬ５．Ｌ１０ｓＬＳ
２０ｓ１． づつスポットした。ドツトの大きさは直
径的２ ｍｍ とした０常法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔａｌ、 ＠Ｍｏ１ｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’ Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １
９８２など）に従い、焼き付ケ、ヒートシールバッグに
入れ４２℃でグレハイプリダイゼーションについでハイ
ブリダイゼーションを行なった。この際、０Ｄ２６゜＝
１．０に調製したプローブ１００ ｐｌ を２ ｍｌ
のノ・イブリダイゼーシ芦ン緩衝液に混合して用い
た。４２℃で一夜インキユペートしたのち、洗浄風乾し
て減圧下焼き付けした０ ３） 写真法による化学発光の検出 ポラロイドＴｙｐｅ６１２インスタントフィルムカセッ
トの上に、フィルムのサイズと一致する薄いプラスチッ
クでできた長方形の容器を置き、カセットに固定した。
３．０ＸＩＱ ”Ｍホウ酸−６，０Ｘ１０−”Ｍ水酸化
カリウム緩衝液に浸したニトロセルロースフィルターを
その容器に入れ密着させた。暗室においてシャッターカ
バーを開き、過酸化水素、鉄（ｍ）−ＴＣＰＰ水溶液（
ｏ、ｏ３％過酸化水素、５．ＯＸｌｏ−８Ｍ鉄（ｍ）
−Ｔ ＣＰ Ｐ ／ ３．ＱＸｌｏ−２Ｍ ホウ酸−６
，０Ｘ１０−”Ｍ水酸化カリウム緩衝液）２０ｍｔ
を容器に入れ、１０分間放置した〇フィルムをカセット
から扱きとシ現像して発光を確認した結果、ドツトのう
ちオリゴｄＡのＩ Ｑ ｍｌ、 ２０ ｓｔ に明ら
かな白いスポットが見られたが、オリゴｄＴはｈずれも
スポットを与えなかった。従ってルミノール標識オリゴ
ｄＴは相補配列を持つオリゴｄＡに選択的にハイブリダ
イズし、この系での検出感度は６１）ＸＩＯ”ｍｏｌと
なる。
カリウム緩衝液に浸したニトロセルロースフィルターを
その容器に入れ密着させた。暗室においてシャッターカ
バーを開き、過酸化水素、鉄（ｍ）−ＴＣＰＰ水溶液（
ｏ、ｏ３％過酸化水素、５．ＯＸｌｏ−８Ｍ鉄（ｍ）
−Ｔ ＣＰ Ｐ ／ ３．ＱＸｌｏ−２Ｍ ホウ酸−６
，０Ｘ１０−”Ｍ水酸化カリウム緩衝液）２０ｍｔ
を容器に入れ、１０分間放置した〇フィルムをカセット
から扱きとシ現像して発光を確認した結果、ドツトのう
ちオリゴｄＡのＩ Ｑ ｍｌ、 ２０ ｓｔ に明ら
かな白いスポットが見られたが、オリゴｄＴはｈずれも
スポットを与えなかった。従ってルミノール標識オリゴ
ｄＴは相補配列を持つオリゴｄＡに選択的にハイブリダ
イズし、この系での検出感度は６１）ＸＩＯ”ｍｏｌと
なる。
実施例２
鉄（ｍ） −Ｔ ＣＰ Ｐ触媒で標識したＤＮＡオリゴ
マーをプローブとし、相補的なシーケンスを有するＤＮ
Ａ断片を写真法により検出する方法。
マーをプローブとし、相補的なシーケンスを有するＤＮ
Ａ断片を写真法により検出する方法。
１） プローブの作成
鉄（町−ＴＣＰＰを実施例１で合成し
たオリゴｄＴとＤＣＣ（ジシクロへキシルカルボジイミ
ド）を用いて結合させた鉄（ＩＩＩ） −Ｔ ＣＰ Ｐ
標識オリゴｄＴは実施例１と同様な操作によｆｉＨＰＬ
ｃで単離精製した。
ド）を用いて結合させた鉄（ＩＩＩ） −Ｔ ＣＰ Ｐ
標識オリゴｄＴは実施例１と同様な操作によｆｉＨＰＬ
ｃで単離精製した。
２） ニトロセルロースフィルターへのササンプロッテ
ィング ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位にオリゴｄＡを常法に従
って組み込んだプラスミドを作成し、Ｅｃｏｌｉ ８０
３で増やした。このプラスミド２ 、＋＋ｇ をＰｓ
ｔＩ とＢａｍＨＩで切断し、０．８％アガロースゲ
ルに０．１ｍｇ。
ィング ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位にオリゴｄＡを常法に従
って組み込んだプラスミドを作成し、Ｅｃｏｌｉ ８０
３で増やした。このプラスミド２ 、＋＋ｇ をＰｓ
ｔＩ とＢａｍＨＩで切断し、０．８％アガロースゲ
ルに０．１ｍｇ。
０．５１ｍｇ 及び１．０μｇ づつ載せ電気泳動し
た。同時にλファージＤＮＡ′ｔ−Ｈｉｎｄ■で切断し
たものをマーカーとして用いた。電気泳動後、アガロー
スゲルヲ水醸化ナトリウム−ＮａＣ１に浸け、−本鎖Ｄ
ＮＡ、！：したのちニトロセルロースフィルターに転写
した。フィルターを風乾し焼き付けしたあとヒートシー
ルバッグに入れ、４２℃でプレハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションを行すった。この際、Ｏ，
Ｄ＝２６゜＝１．Ｏに調製したプローブ１００ ｐｌ
を３ ｍｌ のハイブリダイゼーション緩衝液に混
合して用いた。
た。同時にλファージＤＮＡ′ｔ−Ｈｉｎｄ■で切断し
たものをマーカーとして用いた。電気泳動後、アガロー
スゲルヲ水醸化ナトリウム−ＮａＣ１に浸け、−本鎖Ｄ
ＮＡ、！：したのちニトロセルロースフィルターに転写
した。フィルターを風乾し焼き付けしたあとヒートシー
ルバッグに入れ、４２℃でプレハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションを行すった。この際、Ｏ，
Ｄ＝２６゜＝１．Ｏに調製したプローブ１００ ｐｌ
を３ ｍｌ のハイブリダイゼーション緩衝液に混
合して用いた。
４２℃で一夜インキユベートしたのち洗浄し風乾後、減
圧下焼き付けした。
圧下焼き付けした。
３） 写真法による化学発光の検出
過酸化水素、イソルミノール水溶液
（０，０３％過酸化水素、１．０Ｘ１０ ’Ｍインルミ
ノール／ ３．０Ｘ１０ ”ホウ酸−６，０Ｘ１０ ”
Ｍ水酸化カリウム緩衝液）を用い、実施例１と同様の操
作により発光を検出した。
ノール／ ３．０Ｘ１０ ”ホウ酸−６，０Ｘ１０ ”
Ｍ水酸化カリウム緩衝液）を用い、実施例１と同様の操
作により発光を検出した。
その結果、Ｏｌａｇ 、 ０．５μｇ 、 １．０μｇ
のいずれも１２００塩基のオリゴｄＡを含むバンドのみ
が検出された。従って、この系では３．４Ｘ１０ ”ｍ
ｏｌ 以下の量でも検出が可能であることがわかった
０サザン抹により特定の塩基を検出するには、０．１〜
１．０μｇ のＤＮＡ量が一般的であるので、放射性同
位元素標識に代わシ発光標識でも充分に代替可能である
。
のいずれも１２００塩基のオリゴｄＡを含むバンドのみ
が検出された。従って、この系では３．４Ｘ１０ ”ｍ
ｏｌ 以下の量でも検出が可能であることがわかった
０サザン抹により特定の塩基を検出するには、０．１〜
１．０μｇ のＤＮＡ量が一般的であるので、放射性同
位元素標識に代わシ発光標識でも充分に代替可能である
。
実施例３
アクリジニウム誘導体で標識したモノクローナル抗体を
プローブとし目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ
を検出する方法１） プローブ作成 ラットの崖細胞株Ｌ２のグロテオグリ カンのカルボキシル基側をエピトープとして認識するモ
ノクローナル抗体を４−（２−サクシンイミジルオキシ
カルポニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニ
ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホン酸塩と反
応させプローブとした。
プローブとし目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ
を検出する方法１） プローブ作成 ラットの崖細胞株Ｌ２のグロテオグリ カンのカルボキシル基側をエピトープとして認識するモ
ノクローナル抗体を４−（２−サクシンイミジルオキシ
カルポニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニ
ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホン酸塩と反
応させプローブとした。
２） プラークハイブリダイゼーションによるＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングラットＲＢＬＩ細胞株の、
λｇｔ１１によシ作成したＤＮＡライブラリーを用い、
常法に従ってＥｃｏｌｉＹ １０９０に感染させ、２０
枚のプレートを用ｂプラークを作成シタのチ、ニトロセ
ルロースフィルターに転写した。この際、プラークの数
は１．０Ｘ１０／プレートに調製した。そのフィルター
をインブロビルーβ、Ｄ−ガラクトースを含む寒天培地
に載せ一夜培養した。そのフィルターをｐＨ７，４のＰ
ＢＳ緩衝液Ｉｏｎ／、 にアクリジニウム標識モノク
ロナール抗体を混合した溶液に１時間浸したのち、洗浄
し風乾した。
イブラリーのスクリーニングラットＲＢＬＩ細胞株の、
λｇｔ１１によシ作成したＤＮＡライブラリーを用い、
常法に従ってＥｃｏｌｉＹ １０９０に感染させ、２０
枚のプレートを用ｂプラークを作成シタのチ、ニトロセ
ルロースフィルターに転写した。この際、プラークの数
は１．０Ｘ１０／プレートに調製した。そのフィルター
をインブロビルーβ、Ｄ−ガラクトースを含む寒天培地
に載せ一夜培養した。そのフィルターをｐＨ７，４のＰ
ＢＳ緩衝液Ｉｏｎ／、 にアクリジニウム標識モノク
ロナール抗体を混合した溶液に１時間浸したのち、洗浄
し風乾した。
３） 写真法による化学発光の検出
過酸化水溶液（０，０３％過酸化水素、０、ＩＮ水酸化
す） ＩＪウム）を用い、実施例１と同様の操作により
化学発光を検出した。その結果、２０枚のフィルターか
ら２個のスポットが検出された。このスポットはＬ２プ
ロテオグリカンコアタンフ１
す） ＩＪウム）を用い、実施例１と同様の操作により
化学発光を検出した。その結果、２０枚のフィルターか
ら２個のスポットが検出された。このスポットはＬ２プ
ロテオグリカンコアタンフ１
Claims (1)
- 化学発光物質あるいは触媒で核酸あるいはタンパク質を
標識し、それらの物質から生じる化学発光を二次元情報
として写真フィルムで検出する方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4498988A JPH01219563A (ja) | 1988-02-27 | 1988-02-27 | 化学発光の写真法による検出方法 |
| EP19890103401 EP0331077A3 (en) | 1988-02-27 | 1989-02-27 | Method of detecting chemiluminescence by photography |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4498988A JPH01219563A (ja) | 1988-02-27 | 1988-02-27 | 化学発光の写真法による検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01219563A true JPH01219563A (ja) | 1989-09-01 |
Family
ID=12706856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4498988A Pending JPH01219563A (ja) | 1988-02-27 | 1988-02-27 | 化学発光の写真法による検出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0331077A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01219563A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109765221A (zh) * | 2019-02-12 | 2019-05-17 | 广州微光科技有限公司 | 一种快速鉴别风味样品的方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04232864A (ja) * | 1990-07-12 | 1992-08-21 | Bio Rad Lab Inc | リン光体スクリーンを用いての生化学的アッセイにおける検出及びイメージング |
| CA2056142A1 (en) * | 1990-11-27 | 1992-05-28 | Hirotomo Masuya | Pyridopyridazine compounds and their use |
| CA2130947C (en) * | 1993-11-12 | 2001-02-06 | Robert E. Emmons | Dry elements, test devices, test kits and methods for chemiluminescent detection of analytes using peroxidase-labeled reagents |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE7811630L (sv) * | 1977-11-17 | 1979-05-18 | Welsh Nat School Med | Metod for uppteckt eller mengdbestemning av substanser med anvendning av merkningsteknik |
| MX153322A (es) * | 1979-05-23 | 1986-09-12 | Miles Lab | Dispositivo analitico quimioluminiscente mejorado para detectar un componente en una muestra de liquidos corporales |
| US4396579A (en) * | 1981-08-06 | 1983-08-02 | Miles Laboratories, Inc. | Luminescence detection device |
| WO1984002090A1 (en) * | 1982-11-20 | 1984-06-07 | Thomas Paterson Whitehead | Dispensing device and recording apparatus |
| EP0204510B1 (en) * | 1985-05-31 | 1991-07-10 | Amoco Corporation | Amplification of hybridization signals by employing complementary dna strands |
| GB2207245A (en) * | 1987-07-15 | 1989-01-25 | Unilever Plc | Specific binding chemiluminescent assay |
-
1988
- 1988-02-27 JP JP4498988A patent/JPH01219563A/ja active Pending
-
1989
- 1989-02-27 EP EP19890103401 patent/EP0331077A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109765221A (zh) * | 2019-02-12 | 2019-05-17 | 广州微光科技有限公司 | 一种快速鉴别风味样品的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0331077A3 (en) | 1991-07-31 |
| EP0331077A2 (en) | 1989-09-06 |
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