JPH09184842A

JPH09184842A - 生理活性物質を固定化した導電性磁気ビーズ

Info

Publication number: JPH09184842A
Application number: JP34294095A
Authority: JP
Inventors: Yuji Miyahara; 裕二宮原; Tomoharu Kajiyama; 智晴梶山; Ryuji Tao; 龍治田尾; Kenji Yasuda; 健二保田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1995-12-28
Publication date: 1997-07-15
Anticipated expiration: 2015-12-28
Also published as: JP3545524B2

Abstract

(57)【要約】【課題】磁気ビーズに固定化された発光試薬を最大限
に利用し、高感度な電気化学発光分析を行う。【解決手段】導電性を有する磁気ビーズ１の表面に直
接又は電子がトンネル現象により透過できる程度に薄い
絶縁膜を介して生理活性物質４を固定化し、生理活性物
質にトリス（ビピリジル）ルテニウムのような発光試薬
を結合させる。【効果】導電性磁気ビーズを試料中に含ませ、永久磁
石により作用極上に捕捉して電流を流すと、磁気ビーズ
表面に固定化された全ての発光試薬は磁気ビーズとの間
で電子の授受を行い、酸化又は還元され、その過程で発
光する。したがって、磁気ビーズの表面全体から発光す
るため、発光強度が飛躍的に増大する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体中の化学成分
を分析する装置、特に医療用の高感度化学分析装置で使
用される磁気ビーズに関する。

【０００２】

【従来の技術】電気化学発光を利用し、血清中の蛋白質
を測定する装置がクリニカルケミストリー、第３７／９
巻、１９９１年、第１５３４頁〜第１５３９頁（Clinic
al Chemistry, 37/9(1991), pp1534-1539)に記載されて
いる。この装置では、磁気ビーズの表面で蛋白質を選択
的に反応させ、発光試薬で標識した蛋白質を磁気ビーズ
の表面に導入し、金の作用電極（作用極）表面に捕捉し
て発光試薬を電気化学発光させている。

【０００３】この装置で用いられている磁気ビーズは、
ノルウェーのＤｙｎａｌ社から販売されているＤＹＮＡ
ＢＥＡＤＳ（商品名）に代表されるように、電気絶縁材
料であるポリスチレンに酸化鉄のような可磁化物質を分
散させたものである。したがってポリスチレンが主成分
であるので、上記磁気ビーズは全体として絶縁体であ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では、磁
気ビーズ上に蛋白質を固定化し、発光試薬であるトリス
（ビピリジル）ルテニウムを結合した抗体と反応させ、
最終的に磁気ビーズ上にトリス（ビピリジル）ルテニウ
ムを導入している。上記磁気ビーズは金の作用極上に磁
石で捕捉され、作用極と対極の間に電流を流し、トリス
（ビピリジル）ルテニウムと作用極を電気化学反応させ
る。トリス（ビピリジル）ルテニウムは作用極との間で
電子の授受を行い、酸化又は還元される。この酸化、還
元反応の過程でトリス（ビピリジル）ルテニウムが発光
する。

【０００５】上記従来の構成では磁気ビーズ表面の全面
に結合したトリス（ビピリジル）ルテニウムのうち、作
用極に接触するトリス（ビピリジル）ルテニウムのみが
電気化学反応に関与して発光する。したがって、磁気ビ
ーズ表面の一部のみしか発光しないため、トリス（ビピ
リジル）ルテニウムの利用効率が悪く、感度が低いとい
う問題があった。本発明は、磁気ビーズに固定化され
た、ほぼ全てのトリス（ビピリジル）ルテニウムを最大
限に利用し、高感度に電気化学発光を放出する磁気ビー
ズを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的は、導電性を有
する磁気粒子の表面に直接、又は電子がトンネル現象に
より透過できる程度に薄い絶縁膜を介して、生理活性物
質を固定化し、生理活性物質にトリス（ビピリジル）ル
テニウム又はその誘導体のような発光試薬を結合させる
ことにより達成される。

【０００７】生理活性物質の固定は、直接に、又はスト
レプトアビジン、ビオチン、グルタルアルデヒド、アル
ブミン、アミノ基を有するシランカップリング剤等の有
機化合物、又はこれらの有機化合物を複数個組み合わせ
た複合体を介する結合によって行われる。磁気粒子は
鉄、コバルト、ニッケル、ガドリウム、テルビウム、ジ
スプロシウム、酸化鉄、二酸化クロム、チタニウム、ヴ
ァナジウム、スカンジナビウム、ニオビウム、ジルコニ
ウム、イットリウムの群から選択された１つの材料、又
は前記群の中から選択された複数の材料を組み合わせた
合金からなる。

【０００８】生理活性物質は、抗体、酵素などの蛋白
質、デオキシリボ核酸又は抗原、あるいはそれに発光試
薬を結合させた複合体とすることができる。試料中に含
まれる、磁気ビーズに結合したトリス（ビピリジル）ル
テニウム等の発光試薬は、磁石により作用極上に捕捉さ
れる。磁気ビーズは導電性を有し作用極から電子の授受
が可能であるので、作用極と対極の間に電流を流すと、
磁気ビーズ中に電流が流れ、磁気ビーズ表面に固定化さ
れたすべての発光試薬は磁気ビーズとの間で電子の授受
を行い、酸化又は還元され、その過程で発光する。した
がって、磁気ビーズの表面全体から発光するため、従来
技術に比べて発光強度が飛躍的に増大し、高感度測定を
行うことが可能となる。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。一般に金属を空気中に放置すると、その表
面の金属原子に酸素が結び付き、表面酸化膜が形成され
る。この表面酸化膜は非常に薄く、これを完全に除去す
ることは困難である。第１の金属の表面酸化膜と第２の
金属を接触させ、第１及び第２の金属間に電圧を印加し
て上記酸化膜に電界を誘起させると、電子はトンネル効
果により酸化膜を透過することができる。トンネル効果
を起こすためには酸化膜の膜厚は１００ｎｍ以下、好ま
しくは１０ｎｍ以下であることが必要であるが、上記酸
化膜はこの要件を満たす。

【００１０】本発明の第１の実施の形態として、この酸
化膜を利用した磁気ビーズについて説明する。金属を材
料とする微粒子は空気中では前述のようにその表面が酸
化されている。この金属微粒子を水溶液中に浸し、表面
酸化膜を水和化して表面に水和化物を形成させた。この
水和化物と例えばガンマ−アミノプロピルトリエトキシ
シランのようなシランカップリング剤とを下式〔化１〕
で表されるように反応させ、金属表面にアミノ基を導入
した。

【００１１】

【化１】

【００１２】ここで、Ｍは対象としている金属を表し、
Ｍ−ＯＨはその水和化物を表す。またａ−ａ’で示した
線は金属の表面であることを表し、Ｍ側が金属、ＯＨ側
が水溶液である。金属微粒子材料としては、強磁性又は
常磁性を示し、かつ導電性を示す材料を使用することが
でき、例えば、鉄、コバルト、ニッケル、ガドリウム、
テルビウム、ジスプロシウム、酸化鉄、二酸化クロム、
チタニウム、ヴァナジウム、スカンジナビウム、ニオビ
ウム、ジルコニウム、イットリウム、又は上記材料を複
数個組み合わせた合金を用いることができる。

【００１３】この生成物をアルデヒド基などの官能基を
有する化合物、例えば二官能性化合物であるグルタルア
ルデヒドと反応させ、下式〔化２〕に示すようにシッフ
基により結合させて金属表面にアルデヒド基を導入し
た。

【００１４】

【化２】

【００１５】〔化２〕に示したように、アミノ基はアル
デヒド基と容易に反応して結合する。したがって、アミ
ノ基を有する化合物を上記アルデヒド基末端とシッフ結
合させ、金属表面に導入することができる。一般に蛋白
質は複数個のアミノ酸が結合したものであり、少なくと
も１個のアミノ基を有する。したがって、蛋白質のアミ
ノ基を金属表面のアルデヒド基と下記〔化３〕に示すよ
うに反応させてシッフ基により結合させ、蛋白質を金属
表面に導入した。

【００１６】

【化３】

【００１７】ここで、アミノ基（ＮＨ₂−）が結合した
楕円形のシンボルは蛋白質を表す。蛋白質とアルデヒド
基を反応させるときにアルブミンを混入させると、蛋白
質、アルブミン、及びグルタルアルデヒドが相互に架橋
し、蛋白質を効率良く固定化することができる。一方、
ストレプトアビジン及びビオチンを用いても金属表面に
生理活性物質を固定化することができる。ストレプトア
ビジンとビオチンは親和性が強く、容易に安定な複合体
を形成する。まず、金属微粒子表面にストレプトアビジ
ンを吸着させておく。蛋白質又はデオキシリボ核酸の一
端にビオチンを結合させると、ストレプトアビジンとビ
オチンが複合体を形成して、金属微粒子表面に蛋白質又
はデオキシリボ核酸を導入することができる。

【００１８】なお、酵素等の蛋白質は金属表面に付着し
やすい性質がある。この性質を利用して、生理活性物質
を有機化合物を介さず金属微粒子の表面に物理的に直接
固定することもできる。以上のようにして表面に生理活
性物質を固定化した金属微粒子の模式図を図１（ａ）に
示す。金属微粒子１の表面に有機化合物のスぺーサー２
を介して生理活性物質３が固定化されている。上記生理
活性物質は、抗体、酵素、抗原、ホルモンリセプター、
デオキシリボ核酸など特定の物質と特異的に複合体を形
成するものである。例えば、金属微粒子表面に抗体が固
定化されている場合、上記金属微粒子を抗原を含む溶液
中に浸すと、図１（ｂ）に示すように金属表面で免疫反
応が起こり、抗体−抗原の複合体が形成される。図中、
４は抗原を表す。

【００１９】金属表面に酵素、ホルモンリセプター、デ
オキシリボ核酸が固定化されている場合は、それぞれ基
質、ホルモン、デオキシリボ核酸断片を含む溶液中で反
応させることはもちろんである。図１（ｂ）に示した、
抗原４が固定化された金属微粒子１を、さらに発光試薬
５でラベルした抗体３と反応させ、免疫反応を行わせる
と図１（ｃ）に示すように金属微粒子表面に発光試薬５
を導入することができる。発光試薬にはトリス（ビピリ
ジル）ルテニウム又はその誘導体を用いることができ
る。以上のように複数段階の反応を経て、最終的に発光
試薬５を固定化した金属微粒子１を用いて生理活性物質
の検出を行うことができる。

【００２０】測定者は上に述べたすべての反応を最初か
ら行う必要はなく、例えば、あらかじめ図１（ａ）に示
した金属微粒子を作製して保管しておき、被測定物、例
えば抗原４を測定するときに上記金属微粒子１を取り出
して反応させればよい。図２に、本発明の金属微粒子
（磁気ビーズ）を用いた測定の概念を示す。本発明の金
属微粒子１には、上述した方法で有機化合物を介して発
光試薬が固定化されている。金属微粒子１は、溶液中で
一様に懸濁、分散させる必要があるため、その直径は
０．５μｍから１００μｍの範囲が望ましい。一方、金
属微粒子の表面に固定化する有機化合物の大きさはせい
ぜい１０ｎｍ程度であるので、金属微粒子の直径に比べ
て著しく小さい。また、有機化合物のスぺーサーはフレ
キシブルであるため、図２に示したように任意の形状を
とることができ、その先端に結合した発光試薬は金属微
粒子表面に容易に接触することができる。

【００２１】金属微粒子１は強磁性又は常磁性を示すの
で、金属電極６の裏側に永久磁石を配置して金属電極６
の表面に捕捉した。金属電極６は溶液中に設置されてお
り、上記溶液中には第２の金属電極が設けられている。
金属電極６と第２の金属電極の間に適切な電圧を印加す
ると、２つの電極間に電流が流れる。金属微粒子１は強
磁性又は常磁性を示し、かつ導電性を有するので、図２
に示すように、金属電極６を流れてきた電子は、金属微
粒子１の中を流れることができる。

【００２２】金属微粒子１の表面には発光試薬が接触し
ているので、金属微粒子１の表面で発光試薬が電子と反
応し、酸化又は還元される。発光を持続させるために、
試料溶液中にトリプロピルアミンのような還元試薬を混
合させておくと、上記発光試薬が酸化、還元される過程
で約６２０ｎｍの波長の光を発光する。この発光は金属
微粒子表面に吸着した発光試薬密度、すなわち金属微粒
子表面に固定化した抗原濃度に依存するので、発光強度
を測定することにより、抗原濃度を求めることができ
る。

【００２３】本発明の第２の実施の形態を図３に示す。
図１及び図２に示した第１の実施の形態の金属微粒子１
の表面を絶縁材料の膜８で被覆し、上記絶縁膜の表面
に、第１の実施の形態で示した方法と同様に有機化合物
を介して発光試薬を固定化した。絶縁膜８の厚さは、電
子がトンネル現象により透過できる程度に薄くする必要
があり、１００ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下とす
る。

【００２４】絶縁膜材料としては、第１の実施の形態に
示した自然酸化膜の他に、ポリスチレンなどの高分子材
料を用いることができる。ポリスチレンなどの高分子材
料を適切な有機溶媒に溶解し、この溶液中に金属微粒子
を浸し、引き上げたのち有機溶媒を蒸発させると高分子
の薄膜が金属表面に均一に形成される。高分子材料の方
が無機材料に比べて官能基の設計が容易なため、生理活
性物質、発光試薬などの固定化が容易である。

【００２５】図４に、本発明の磁気ビーズを用いて生理
活性物質の濃度を測定する分析装置を示す。（ａ）図は
斜視図、（ｂ）図は各部を分解した図、（ｃ）図は
（ａ）図のｌ−ｌ’の線で切ったときの断面図を示す。
分析装置は、標準液、血清などが流れるフローセル部９
と発光を検出する光検出器１０から構成されている。フ
ローセル部９は、下部支持基板１１、スペーサー１２及
び上部支持基板１３を液密に積層した構造である。標準
液、血清などの液体試料は、上部支持基板１３に形成さ
れた一方のチューブ１４によりフローセル中に導入さ
れ、他方のチューブ１５により排出される。スペーサー
１２には中央部が幅広く、周辺部が狭くなるように菱形
状の溝１６が形成されている。周辺部の狭い部分がそれ
ぞれチューブ１４及び１５の開口部に位置合わせされ、
菱形状の溝１６が液体試料が流れる流路となる。

【００２６】下部支持基板１１の表面には第１の金属電
極１７が設けられており、この第１の金属電極１７の一
部が液体試料と接触し、作用極として機能する。作用極
１７を流れる電流信号は、リード線１８を介して外部測
定回路に接続される。一方、上部支持基板１３には第２
の金属電極１９が形成されており、この第２の金属電極
１９の一部が液体試料と接触し、対極として機能する。
対極１９の信号はリード線２０を介して外部測定回路に
接続される。

【００２７】抗体が固定化された本発明の導電性磁気ビ
ーズを、他の場所に設置してある恒温槽中で、試料中の
目的抗原続いてトリス（ビピリジル）ルテニウムなどの
発光試薬を固定化した抗体と反応させ、導電性磁気ビー
ズ表面に発光試薬を導入する。上記混合溶液をチューブ
１４によりフローセル中に導入し、永久磁石２１により
第１の金属電極１７上に捕捉する。作用極１７と対極１
９の間に所定の電圧を印加して電流を流すと、トリス
（ビピリジル）ルテニウムと作用極が電気化学反応を起
こし、トリス（ビピリジル）ルテニウムが発光する。上
部支持基板１３にガラス、アクリレート、ポリ塩化ビニ
ル、ポリカーボネイトなどの透明材料を用いると、トリ
ス（ビピリジル）ルテニウムから出射した光は上部支持
基板１３を透過して光検出器１０に到達する。本発明の
導電性磁気ビーズは、その表面全体から発光するので高
感度測定に適している。

【００２８】図５に、図４のフローセル部９を搭載した
測定システムの例を示す。抗体が固定化された本発明の
導電性磁気ビーズを他の場所に設置してある恒温槽中
で、試料中の目的抗原続いてトリス（ビピリジル）ルテ
ニウムなどの発光試薬を固定化した抗体と反応させ、導
電性磁気ビーズ表面に発光試薬を導入する。上記混合溶
液を試料２２とし、試料、試薬２３又は洗浄液２４をサ
ンプリングプローブ２５及びポンプ２６により電気化学
発光セル９に導入し、使用済み後は廃液ボトル２７に廃
棄する。

【００２９】電気化学発光セル９の下流には参照電極２
８が設置されており、電気化学発光セル中の作用極及び
対極とともにポテンシオスタット２９に信号線３０で接
続され、３電極法のポーラログラム測定システムを構成
する。試料がフローセル中の第１の金属電極を通過する
際、永久磁石２１を下部支持基板１１の近傍に設置し、
試料中の導電性磁気ビーズを第１の金属電極表面に捕捉
する。この状態でトリプロピルアミンなどの還元試薬２
３をフローセル中に導入し、第１及び第２の金属電極間
に所定の電圧を印加すると、導電性磁気ビーズ表面に固
定化されたトリス（ビピリジル）ルテニウムが約６２０
ｎｍの光を発光する。

【００３０】この発光を透明な上部支持基板１３を介し
て光検出器１０で検出する。光検出器からの信号は、信
号線３１により増幅器又はホトンカウンター３２に接続
され、ポテンシオスタット２９とともにコンピュータ３
３に接続され、濃度計算などの演算処理が行なわれる。
ポテンシオスタット２９による電流の印加、光検出器１
０による信号のサンプリングは、相互に連携しあいなが
ら一定の秩序にしたがってコンピュータ３３により制御
される。この測定システムにより、複数の試料を連続し
て、迅速にかつ高感度に測定することができる。

【００３１】本発明の効果を図９に示す。本発明の導電
性磁気ビーズを用い、表面に甲状腺刺激ホルモン抗体を
固定化し、甲状腺刺激ホルモン及び甲状腺刺激ホルモン
抗体を介してトリス（ビピリジル）ルテニウムを導入し
た。図５の測定システムにおいて、光検出器に光電子増
倍管、第１及び第２の金属電極に白金を用い、上記電極
間に１．４Ｖの電圧を印加したときの光電子増倍管の出
力の時間変化を示したものである。図中（ａ）は本発明
の導電性磁気ビーズを用いたときの発光特性、（ｂ）は
従来の絶縁性磁気ビーズを用いたときの発光特性であ
る。本発明の導電性磁気ビーズを用いると、ビーズ全面
から発光させることができるので、感度を飛躍的に増大
させることができることが分かる。

【００３２】

【発明の効果】本発明によると、磁気ビーズ表面に固定
化されたすべての発光試薬は磁気ビーズとの間で電子の
授受を行い、酸化又は還元され、その過程で発光する。
したがって、磁気ビーズの表面全体から発光するため、
従来技術に比べて発光強度が飛躍的に増大し、高感度測
定を行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】導電性磁気ビーズの概略図。

【図２】金属微粒子を用いた測定の概念図。

【図３】絶縁膜を有する磁気ビーズの概略図。

【図４】測定セルの概略図。

【図５】測定システムの構成図。

【図６】磁気ビーズの発光特性を示す図。

【符号の説明】

１…金属微粒子、２…スぺーサー、３…生理活性物質、
４…抗原、５…発光試薬、６…金属電極、８…絶縁膜、
９…フローセル部、１０…光検出器、１１…下部支持基
板、１２…スペーサー、１３…上部支持基板、１４…チ
ューブ、１５…チューブ、１６…溝、１７…作用極、１
８…リード線、１９…対極、２０…リード線、２１…磁
石、２２…試料、２３…試薬、２４…洗浄液、２５…サ
ンプリングプローブ、２６…ポンプ、２７…廃液ボト
ル、２８…参照電極、２９…ポテンシオスタット、３０
…信号線、３１…信号線、３２…ホトンカウンタ、３３
…コンピュータ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/553 (72)発明者保田健二茨城県ひたちなか市大字市毛882番地株式会社日立製作所計測器事業部内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】強磁性又は常磁性を示し、かつ導電性を
有する粒体の表面に、生理活性物質を直接に、又は有機
化合物を介して結合させたことを特徴とする生理活性物
質を固定化した導電性磁気ビーズ。
【請求項２】強磁性又は常磁性を示し、かつ導電性を
有する粒体の表面に、薄い絶縁膜を設け、前記絶縁膜上
に生理活性物質を直接に、又は有機化合物を介して結合
させたことを特徴とする生理活性物質を固定化した導電
性磁気ビーズ。
【請求項３】前記絶縁膜は酸化膜又は高分子膜であ
り、厚さが１００ｎｍ以下であってトンネル効果により
電子が透過可能であることを特徴とする請求項２記載の
生理活性物質を固定化した導電性磁気ビーズ。
【請求項４】前記粒体は鉄、コバルト、ニッケル、ガ
ドリウム、テルビウム、ジスプロシウム、酸化鉄、二酸
化クロム、チタニウム、ヴァナジウム、スカンジナビウ
ム、ニオビウム、ジルコニウム、イットリウムの群から
選択された１つの材料、又は前記群の中から選択された
複数の材料を組み合わせた合金からなることを特徴とす
る請求項１、２又は３記載の生理活性物質を固定化した
導電性磁気ビーズ。
【請求項５】前記生理活性物質は、抗体、酵素などの
蛋白質、デオキシリボ核酸又は抗原であることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか１項記載の生理活性物質を
固定化した導電性磁気ビーズ。
【請求項６】前記生理活性物質は、抗体、酵素などの
蛋白質、デオキシリボ核酸又は抗原に、発光試薬を結合
させた複合体であることを特徴とする請求項１〜４のい
ずれか１項記載の生理活性物質を固定化した導電性磁気
ビーズ。
【請求項７】前記発光試薬は、トリス（ビピリジル）
ルテニウム又はその誘導体であることを特徴とする請求
項６記載の生理活性物質を固定化した導電性磁気ビー
ズ。
【請求項８】前記有機化合物は、ストレプトアビジ
ン、ビオチン、グルタルアルデヒド、アルブミン、アミ
ノ基を有するシランカップリング剤、又はこれらの有機
化合物を複数個組み合わせた複合体であることを特徴と
する請求項１〜７のいずれか１項記載の生理活性物質を
固定化した導電性磁気ビーズ。
【請求項９】強磁性又は常磁性を示し、かつ導電性を
有する粒体の表面に、生理活性物質を直接に、又は酸化
物又は有機化合物を介して結合させた構造を有し、金属
電極と接触させて前記金属電極と前記粒体及び前記粒体
と前記生理活性物質の発光試薬との間で電子が移動可能
であり、発光試薬を酸化又は還元することができること
を特徴とする生理活性物質を固定化した導電性磁気ビー
ズ。
【請求項１０】請求項６〜９のいずれか１項に記載の
生理活性物質を固定化した導電性磁気ビーズを作用極表
面に捕捉し、前記作用極と対極との間に電圧を印加し
て、前記発光試薬の電気化学発光強度を測定することを
特徴とする前記生理活性物質の濃度測定方法。