JP2014524567A - 金属/金属酸化物表面に対する分子結合のための新しい方法 - Google Patents
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Abstract
Description
米国特許仮出願第61/515,348号(2011年8月5日出願)に対し優先権が主張され、この開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、タンパク質などの分子を、金属/金属酸化物表面に結合させるための改善された手順に関する。より具体的には、本発明は、磁性でありかつ稠密であるニッケル粒子にタンパク質を結合させるための方法に関する。これらの粒子は、タンパク質精製(親和性及びイオン交換)、核酸の分離、及び化学物質の富化又は検出を含む、分離手順に使用される。
ニッケル粒子(1g)(総容積0.4〜0.5mL)をPBS 3mLずつで3回、5分間洗った。平衡させた粒子を、4℃で一晩、2mLの0.1% BSA又はタンパク質A(1mg/mL)と共にインキュベーションした。タンパク質Aコーティングについては、一晩のインキュベーション後にタンパク質A溶液を除去し、次に室温で2時間、0.1% BSA 2mLを用いてブロックした。タンパク質コーティングされたニッケル粒子を次に、PBS 3mLずつで3回、5分間洗い、使用まで4℃で保存した。
BSA又はタンパク質Aで一晩インキュベーションした後、タンパク質/ニッケル混合物に、1%グルタルアルデヒドを、タンパク質とグルタルアルデヒドとの間のモル比が1:60となるように加えた。この混合物を250RPMで2時間、37℃で振盪した。これに1/10容の1Mトリス塩酸(pH 8.0)を加えることにより反応を停止させ、この粒子をPBS 3mLで3回洗った。
タンパク質Aコーティングされたニッケル粒子(1g)を、0.1%マウスIgG又は1mg IgG/mLマウス血清と共に、室温で、5分間、10分間、20分間、30分間、40分間及び50分間、インキュベーションした。インキュベーション後、ニッケル粒子を磁気的に溶液から除去した。ニッケル粒子を消磁し、1X PBSずつで3回、5分間洗った。500μLの酸性緩衝液(クエン酸100mM、pH 2.2)又はアルカリ性緩衝液(トリエタノールアミン100mM、pH 12.8)を加え、更に室温で5分間20rpmで回転させることによって、タンパク質A結合IgGを溶出させた。溶出後、粒子を磁気的に溶液から除去し、上澄み液に1Mトリス塩酸(pH 8.0)を75μL加えることによって中和した。溶出したIgGの濃度は、ブラッドフォード法及びBCA法によって取得した。タンパク質は、SDS−PAGEの後、銀又はクマシーブルーG−250染色によって可視化した。
メカニズムは不明であるが、タンパク質はニッケル粒子に吸着し、ニッケル表面に共有結合的に付着することなく、比較的安定な複合体を形成する。ニッケルからのタンパク質の溶脱はクロマトグラフィー利用には制限があるため、我々は、様々なインキュベーション条件下で粒子から放出されたタンパク質の量を試験した。溶脱の評価には、モデルタンパク質としてBSAを使用した(図1)。BSA結合ニッケル粒子を、それぞれ、酸性緩衝液(レーン2、100mMクエン酸、pH 2.2)及びアルカリ性緩衝液(レーン3、100mMトリエチルアミン、pH 12.8)でインキュベーションした。上澄み液を回収し、溶出したBSAをSDS−PAGE及び銀染色で同定した。ニッケル粒子に結合したBSAが計算され、溶出緩衝液に溶脱したBSAが測定された。これらの測定により、酸性緩衝液に溶出したニッケル結合BSAは2%未満、アルカリ性緩衝液に溶出したのは約2〜5%であることが示された。
タンパク質Aは、BSAと同様、ニッケル粒子表面で非共有結合複合体を形成する。ニッケル結合タンパク質A粒子は、溶脱が最小限であれば、抗体の磁気精製に有用であり得るため、我々は様々な条件下でタンパク質Aの溶脱を試験した。タンパク質Aニッケル粒子を、1mg/mLのマウスIgGと共に20分間インキュベーションした。タンパク質A−IgG複合体を含む粒子を、溶液から磁気的に除去した。図2のデータは、タンパク質A結合ニッケル粒子が精製IgGを捕捉可能であることを示している。しかしながら、IgG溶出中に(レーン2及び4)、顕著な量のタンパク質Aが粒子から溶脱した。更に、タンパク質Aは、酸性条件とアルカリ性条件の両方において(レーン3及び5)、BSAよりも容易に、ニッケル表面から溶出した。
タンパク質AとBSAの両方とも、標的タンパク質の溶出中にニッケル粒子から溶脱することが見出されたため、ニッケルに対するこれらのタンパク質のより安定した複合体が必要となった。ニッケル表面には明らかな官能基はないため、現在当該技術分野で行われている(currently the art)ポリマーコーティングされた磁性粒子によってなされ得るような、タンパク質Aをニッケル粒子に共有結合させるのは実践的ではない。我々は、ニッケル結合タンパク質を架橋させることにより、タンパク質結合を安定化させ、溶脱を防止又は少なくとも最小限に抑えることが可能になるかどうかを試験した(図3)。ニッケル結合タンパク質/ポリマーを架橋させることによって、タンパク質/ポリマーにより提示される化学官能基に更なる化学修飾を行うための、安定なマトリックスを提供することが示された場合は、タンパク質精製、及びリガンド/化学物質検出において、ニッケル粒子の適用が劇的に拡大することになろう。
本発明の別の態様は、BSA又は他のタンパク質が結合したニッケル粒子を、今日の磁気分離技術では不可能な温度まで加熱することができ、これによって、(特に上述のようにネッティング後に)安定した、タンパク質、核酸、又は化学物質の直接的な共有結合付着に使用できる、変性ポリペプチド及び化学官能基(NH2、COOH、SH等)を得ることができる。官能基化されたニッケル粒子は、あらゆる種類のクロマトグラフィー分離に利用することができる。
タンパク質A結合ニッケル粒子は、非常に急速な混合及び捕捉反応速度を有する。ゆえに、他の磁性ビーズよりも迅速に、未希釈のマウス血清から抗体を分離するのに使用することもできる。マウス血清を、図6に示す時間、架橋したタンパク質A結合ニッケル粒子と共にインキュベーションした。わずか5分で、タンパク質A結合ニッケル粒子は血清から抗体を効率的に分離した。50分までのインキュベーション時間で、追加で捕捉された抗体はごくわずかであった。インキュベーションが短かったため、抗体の純度及び収率は損なわれなかった。加えて、粒子抗体複合体を血清から磁気的除去するのは、1分未満で完了した。このプロセスは、例えばアガロースビーズなどの、他のタンパク質A系修飾クロマトグラフィー基質よりも、顕著に迅速である。この反応速度増加は、非多孔質ニッケル表面によるものであるか、又は、粘稠な溶液中で稠密な粒子を急速に混合したことによるものであり得る。
本開示の結合手順は、望ましい分子でカーボンナノチューブをコーティングするのに使用される。様々な寸法及び形状のカーボンナノチューブは、適切な緩衝液中の吸収によって、望ましい分子と非共有結合する。このカーボンナノチューブを次に、遠心分離及び緩衝液での再懸濁によって洗う。架橋剤、グルタルアルデヒド、又は別の適切な架橋剤を、吸収によりカーボン(crabon)ナノチューブに結合している分子が存在する溶液に加える。反応は室温で、様々な時間実施する。当該技術分野に従い、グリシンを加えることによって反応を止める。関心対象の分子、例えばタンパク質(抗体及びリガンド)、核酸(DNA、RNA、又は化学修飾したDNA若しくはRNA誘導体)、又は化学物質(薬剤若しくは化学プローブ)を備えた、ナノチューブコーティングされたタンパク質の官能基の修飾について調べる。
ニッケル粒子は、250℃で3〜72時間加熱し、金属酸化物層を形成する。この粒子を室温(RT)まで冷ます。50mMトリス緩衝液(pH 8.0)中0.1%〜2%の範囲の様々なBSA溶液を、32〜64mg/mLのニッケル粒子と混合し、室温で一晩転倒混和する。粒子をトリス緩衝液で3回すすぎ、56℃以上に加熱して、安定な共有結合BSA−ニッケル粒子を形成するのに最適な温度を判定する。安定性を判定するために測定されるパラメーターは、酸性及び塩基性溶出であり、BSAが酸又は塩基によって溶出しない温度を調べる。このBSA−ニッケル粒子を、当該技術分野で既知の標準手順により、BSAの反応性側鎖に、関心対象の分子(すなわち抗体が挙げられるがこれに限定されない)を共有結合させるのに使用する。
(1) 分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
a.金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
b.安定化タンパク質を含む架橋試薬を加えることと、を含む、方法。
(2) 前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記金属粒子がニッケルである、実施態様1に記載の方法。
(4) 前記安定化タンパク質が、前記吸収分子と同じである、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記安定化タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、実施態様1に記載の方法。
(7) 前記分子が、カチオンクロマトグラフィーに使用するための塩基性タンパク質である、実施態様1に記載の方法。
(8) 前記塩基性タンパク質が、ヒストンタンパク質又はプロタミンである、実施態様7に記載の方法。
(9) 前記分子が、アニオンクロマトグラフィーに使用するための酸性タンパク質である、実施態様1に記載の方法。
(10) 前記酸性タンパク質が、トリプシン阻害物質又はペプシンAである、実施態様9に記載の方法。
a.タンパク質に結合した金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
b.前記金属粒子を安定化させるのに十分な量の架橋試薬を加えることと、を含む、方法。
(12) 前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、実施態様11に記載の方法。
(13) 前記金属粒子がニッケルである、実施態様11に記載の方法。
(14) 結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、実施態様11に記載の方法。
(15) タンパク質を、粒子の金属/金属酸化物表面に共有結合させる方法であって、
a.前記粒子の金属/金属酸化物表面にタンパク質を吸着させて、非共有結合性のタンパク質/粒子複合体(non-covalent protein/particle complex)を形成することと、
b.結合していないタンパク質を除去することと、
c.前記複合体を十分な温度に加熱して、前記吸着したタンパク質と前記粒子表面の酸化物との間に共有結合を形成することと、を含む、方法。
(17) 前記金属粒子がニッケルである、実施態様15に記載の方法。
(18) 前記共有結合したタンパク質が、標準共有結合手順により、第2の分子に更に結合される、実施態様15に記載の方法。
(19) 前記第2の分子が、タンパク質、核酸及び化学物質からなる群から選択される、実施態様18に記載の方法。
(20) 前記タンパク質が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、実施態様15に記載の方法。
Claims (20)
- 分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
a.金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
b.安定化タンパク質を含む架橋試薬を加えることと、を含む、方法。 - 前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記金属粒子がニッケルである、請求項1に記載の方法。
- 前記安定化タンパク質が、前記吸収分子と同じである、請求項1に記載の方法。
- 前記安定化タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項1に記載の方法。
- 結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分子が、カチオンクロマトグラフィーに使用するための塩基性タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記塩基性タンパク質が、ヒストンタンパク質又はプロタミンである、請求項7に記載の方法。
- 前記分子が、アニオンクロマトグラフィーに使用するための酸性タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記酸性タンパク質が、トリプシン阻害物質又はペプシンAである、請求項9に記載の方法。
- 分子を金属粒子に対して架橋させるための方法であって、
a.タンパク質に結合した金属粒子の表面に分子を吸収させて、非共有結合性複合体を形成することと、
b.前記金属粒子を安定化させるのに十分な量の架橋試薬を加えることと、を含む、方法。 - 前記分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、及び化学物質からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記金属粒子がニッケルである、請求項11に記載の方法。
- 結合していない分子を除去するために前記複合体を洗うことを更に含む、請求項11に記載の方法。
- タンパク質を、粒子の金属/金属酸化物表面に共有結合させる方法であって、
a.前記粒子の金属/金属酸化物表面にタンパク質を吸着させて、非共有結合性のタンパク質/粒子複合体を形成することと、
b.結合していないタンパク質を除去することと、
c.前記複合体を十分な温度に加熱して、前記吸着したタンパク質と前記粒子表面の酸化物との間に共有結合を形成することと、を含む、方法。 - 前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項15に記載の方法。
- 前記金属粒子がニッケルである、請求項15に記載の方法。
- 前記共有結合したタンパク質が、標準共有結合手順により、第2の分子に更に結合される、請求項15に記載の方法。
- 前記第2の分子が、タンパク質、核酸及び化学物質からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記タンパク質が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項15に記載の方法。
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