CN108333358B - 一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，包括如下步骤：将第一配体、第二配体和磁球混合反应得到第一免疫磁球复合物；采用洗脱液对第一免疫磁球复合物进行洗脱，对得到的第二免疫磁球复合物进行免疫测定获得免疫数据，若不超过第一阈值，则判定为第一筛选洗脱液；采用第一筛选洗脱液对第一免疫磁球复合物进行多次洗脱，对得到的第三免疫磁球复合物进行免疫测定获得免疫数据，若超过第二阈值，则判定为第二筛选洗脱液；采用第二筛选洗脱液对第二配体进行放大检测获得免疫数据，若超过第三阈值，则判定为第三筛选洗脱液。这种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法采用磁球作为固相载体，磁球在洗脱过程中分散性好，假阳性率低，可靠性高。

Description

一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法
技术领域
本发明涉及免疫亲和纯化领域，特别是涉及一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法。
背景技术
免疫亲和层析是利用抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法，即利用抗原或抗体中的一方作为配体，特异性抗体或抗原作为亲和吸附的另一方的分离系统。免疫亲和层析应用相当广泛。许多蛋白质纯化过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过淋洗去除无关的蛋白，然后用洗脱缓冲液处理微珠，特异性结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件合适，纯化的抗原仍能保持其天然状态。免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。
影响免疫亲和纯化的关键的因素有：抗原最初的浓度，抗原与抗体的亲和力以及抗原抗体结合是否容易发生解离。
在免疫亲和纯化技术中，抗原最初的相对浓度是决定最终产物纯度的重要的因素，因为抗原抗体的反应具有相当高的特异性，故而没有任何其他层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，因为使用亲和层析柱亦有某些内在的背景限制，亲和纯化的纯化倍数一般可达1000-10000倍。
抗体对相应抗原的亲和力是免疫亲合纯化关键的因素，抗体的亲和力将决定从含抗原的溶液中提取抗原的总量，高亲和力的抗体(>108mol/L)能在1h以内达到有效地分离；而低亲和力的抗体(106mol/L)即使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。
影响免疫亲和纯化结果的第三个因素是哪种抗原相对容易被洗脱。这完全由抗原-抗体相互作用的结合键的类型和数量来决定，因此这与抗体的亲和力有关。然而亲和力并不决定抗原是否容易洗脱。用于免疫亲和纯化的理想抗体是对抗原具有高亲和力，与抗原的结合可被一种易于操作的简单而且温和的方法如pH值的改变而逆转。在设计免疫亲和纯化的方法时，通常认为最重要的是选择抗体和洗脱条件，在数种不同的洗脱条件下测试若干份有潜在使用价值的抗体，可发现高亲和力与容易洗脱的优化组合。
从免疫亲和层析柱上洗脱抗原很快且较容易，大多数工作是花费在设计和用于摸索各种有效的洗脱条件。可以采用三种方法进行洗脱，以阻断抗原抗体之间的相互作用：①用较强烈的条件处理；②加入模拟结合位点的饱和量小分子化合物；③使用一种能引起构象改变而使抗原释出的试剂。
传统的亲和纯化方法是将抗原或者抗体等配基偶联到凝胶上，相应的配体在液相环境中与凝胶上的配基发生特异性结合，再通过洗脱液特异性/非特异性的将与配基结合的配体洗脱下来，从而得到目标蛋白。亲和层析种洗脱液的是将抗原-抗体复合物有效地解离。对不同的抗原-抗体复合物其解离条件各不相同。可用作洗脱液的物质通常有强酸、强碱、高盐、去垢剂以及蛋白变性剂等几大类，往往以一种或几种物质配制不同pH和离子强度的洗脱液，对抗原-抗体复合物进行解离。其解离过程要确保不会引起被洗脱组分失活，而且对亲和层析柱没有损害。从众多的洗脱液中选出一种最适洗脱液并非易事。如果将每一种洗脱液都通过亲和柱，按实际洗脱效果来判断其洗脱能力，显然很费时费力，而且必然造成层析材料和样品的很大浪费。阎静辉等人采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-EILSA)筛选促卵泡激素(FSH)与其对应抗体的最佳解离条件，其筛选过程中用凝胶sepharose 4B作为抗体的固相载体，在小离心管中进行DAS-EILSA检测来筛选最适洗脱液。然而，采用凝胶作为抗体的固相载体的方法，在进行免疫亲和纯化洗脱液的筛选时，容易由于洗脱的不彻底而导致假阴性，降低了筛选方法的可靠性。
发明内容
基于此，有必要提供一种可靠性较高的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法。
一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，包括如下步骤：
将第一配体和磁球混合反应，接着加入第二配体，反应后得到第一免疫磁球复合物，其中，所述第一配体可与所述第二配体特异性结合；
采用洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行洗脱，沉降后得到第二免疫磁球复合物；
对所述第二免疫磁球复合物进行免疫测定，获得所述第二免疫磁球复合物中的所述第二配体的免疫数据，若所述第二免疫磁球复合物中的所述第二配体的免疫数据小于或等于第一阈值，则判定所述洗脱液为第一筛选洗脱液；
采用所述第一筛选洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行多次洗脱，沉降后得到第三免疫磁球复合物；
对所述第三免疫磁球复合物进行免疫测定，获得所述第三免疫磁球复合物中的所述第一配体的免疫数据，若所述第三免疫磁球复合物中的所述第一配体的免疫数据大于或等于第二阈值，则判定所述第一筛选洗脱液为第二筛选洗脱液；
将所述第一配体与凝胶偶联，接着加入所述第二配体，反应后得到凝胶复合物；
采用所述第二筛选洗脱液对所述凝胶复合物进行洗脱，沉降后收集洗脱后的混合液，接着对所述混合液进行免疫测定，获得所述混合液中的所述第二配体的免疫数据，若所述混合液中的所述第二配体的免疫数据大于或等于第三阈值，则判定所述第二筛选洗脱液为第三筛选洗脱液。
在一个实施例中，所述得到第一免疫磁球复合物的反应过程为：将所述第一配体、所述磁球和交联剂在缓冲液中混合反应，再加入所述第二配体，反应后得到第一免疫磁球复合物。
在一个实施例中，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺对甲苯甲磺酸(CMC)。
在一个实施例中，所述缓冲液为pH为3～4的醋酸盐缓冲液、pH为2～4的甘氨酸盐酸缓冲液或pH为9～11的碳酸盐缓冲液。
在一个实施例中，所述第一配体为甲状腺过氧化物酶、谷氨酸脱羧酶、促甲状腺激素受体、蛋白酪氨酸磷酸酶、胃泌素17或抗缪勒氏管激素，所述第二配体为甲状腺过氧化物酶抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、促甲状腺激素受体抗体、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体、胃泌素17抗体或抗缪勒氏管激素抗体；
或者，所述第一配体为甲状腺过氧化物酶抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、促甲状腺激素受体抗体、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体、胃泌素17抗体或抗缪勒氏管激素抗体，所述第二配体为甲状腺过氧化物酶、谷氨酸脱羧酶、促甲状腺激素受体、蛋白酪氨酸磷酸酶、胃泌素17或抗缪勒氏管激素。
在一个实施例中，在所述采用洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行洗脱的操作之前，还包括采用淋洗液对所述第一免疫磁球复合物进行淋洗的步骤。
在一个实施例中，所述淋洗液为pH为7～8且浓度为300mM～500mM的NaCl的缓冲液。
在一个实施例中，所述洗脱液选自酸性洗脱液、碱性洗脱液、含有盐类的洗脱液和含有中性去垢剂的洗脱液中的至少一种。
在一个实施例中，所述酸性洗脱液的pH为2～4.5。
在一个实施例中，所述碱性洗脱液的pH为10～12.5。
在一个实施例中，所述含有盐类的洗脱液中含有1mol/L～5mol/L的硫氰酸盐、2mol/L～5mol/L的胍、2mol/L～8mol/L的尿素、3mol/L～5mol/L的MgCl2和5mol/L～10mol/L的LiCl中的至少一种。
在一个实施例中，所述含有中性去垢剂的洗脱液含有质量百分数为25％～50％的乙二醇、质量百分数为5％～20％的二氧六环和质量百分数为5％～10％的Triton X-100中的至少一种。
在一个实施例中，所述采用所述第一筛选洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行多次洗脱的操作中，所述多次为5次～30次。
在一个实施例中，所述磁球为Fe2O3磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，或者，所述磁球为Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体；
所述磁球的粒径为0.1μm～5μm的粒径，并且所述磁球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。
在一个实施例中，所述对所述第二免疫磁球复合物进行免疫测定的操作包括：加入标记有示踪标记物的第三配体进行免疫检测，其中，所述第三配体与所述第二配体特异性结合。
在一个实施例中，所述示踪标记物选自金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的至少一种。
在一个实施例中，所述异鲁米诺衍生物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
在一个实施例中，所述第一阈值为采用阴性洗脱液对第一免疫磁球复合物进行洗脱做对照组测得的免疫数据的5％～20％。
在一个实施例中，所述第二阈值为采用阴性洗脱液对第一免疫磁球复合物进行多次洗脱做对照组测得的免疫数据的80％～100％。
在一个实施例中，所述第三阈值为采用所述第二配体的标准品溶液做对照组测得的免疫数据的80％～100％。
这种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法采用磁球作为固相载体，磁球与第一配体形成第一配体包被的磁球，在洗脱过程中由于第一配体包被的磁球的分散性好，不易发生假阳性，相对于传统的以凝胶为固相载体的筛选方法，可靠性较高。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，包括如下步骤：
S10、将第一配体和磁球混合反应，接着加入第二配体，反应后得到第一免疫磁球复合物。
第一配体可与第二配体特异性结合。
优选的，S10为：将第一配体、磁球和交联剂在缓冲液中混合反应(优选为35℃～40℃下恒温震荡反应1h～5h)，再加入第二配体，反应(优选为35℃～40℃下恒温反应5min～30min)后得到第一免疫磁球复合物。
第一配体为抗原或抗体。第一配体为抗原时，第二配体为抗体；第一配体为抗体时，第二配体为抗原。
第一配体为甲状腺过氧化物酶(TPO)、谷氨酸脱羧酶(GAD65)、促甲状腺激素受体(TSHR)、蛋白酪氨酸磷酸酶(IA2)、胃泌素17(Gastrin-17,G-17)或抗缪勒氏管激素(AMH)时，第二配体为TPO抗体、GAD65抗体、TSHR抗体、IA2抗体、G17抗体或AMH抗体。
第一配体为TPO抗体、GAD65抗体、TSHR抗体、IA2抗体、G17抗体或AMH抗体时，第二配体为甲状腺过氧化物酶(TPO)、谷氨酸脱羧酶(GAD65)、促甲状腺激素受体(TSHR)、蛋白酪氨酸磷酸酶(IA2)、胃泌素17(Gastrin-17,G-17)或抗缪勒氏管激素(AMH)。
第一配体可以直接或间接的包被磁球，间接包被磁球的方式包括但不限于通过FITC与抗FITC抗体体系或通过链霉亲和素与生物素体系进行间接包被。直接包被是指利用第一配体(第一抗胃泌素-17抗体或第二抗胃泌素-17抗体)直接对磁球进行包被；间接包被是指通过中间媒介链接体系，使得第一配体(第一抗胃泌素-17抗体或第二抗胃泌素-17抗体)对磁球进行包被。中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系(优选为羊抗FITC多克隆抗体)以及链霉亲和素与生物素体系。
交联剂可以为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺对甲苯甲磺酸(CMC)。
磁球为Fe2O3磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，或者，磁球为Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体.
磁球的粒径为0.1μm～5μm的粒径。
磁球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团(包括羧基、羟基和氨基中的至少一种)。
通过将纳米级的Fe2O3磁性粒子和有机高分子材料进行复合(或纳米级的Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合)，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。
此外，这种磁球通过表面改性使磁球表面连接活性基团，不仅减少非特异性吸附，且增加体系的稳定性，不产生凝聚，同时显著提高结合率。
缓冲液可以为pH为3～4的醋酸盐缓冲液(优选pH为3.6、浓度为50mM)、pH为2～4的甘氨酸盐酸缓冲液(优选pH为2.7、浓度为100mM)或pH为9～11的碳酸盐缓冲液(优选pH为10.5、浓度为50mM)。
S10中，磁球、第一配体和第二配体的质量比为1mg：2μg～10μg：2μg～10μg。
S10中，缓冲液中交联剂的浓度为2mg/mL～50mg/mL。
S20、采用洗脱液对S10得到的第一免疫磁球复合物进行洗脱，沉降后得到第二免疫磁球复合物。
优选的，在采用洗脱液对第一免疫磁球复合物进行洗脱的操作之前，还包括采用淋洗液对第一免疫磁球复合物进行淋洗的步骤。
淋洗液为含盐的缓冲液。优选的，淋洗液可以为pH为7～8且浓度为300mM～500mM的NaCl的缓冲液。
洗脱液选自酸性缓冲液、碱性缓冲液、含有盐类的缓冲液和含有中性去垢剂的缓冲液中的至少一种。
优选的，酸性洗脱液的pH为2～4.5。具体的，酸性缓冲液选自甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液。
优选的，碱性洗脱液的pH为10～12.5。具体的，碱性洗脱液选自Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠-氢氧化钠缓冲液。
优选的，含有盐类的缓冲液中含有1mol/L～5mol/L的硫氰酸盐、2mol/L～5mol/L的胍、2mol/L～8mol/L的尿素、3mol/L～5mol/L的MgCl2和5mol/L～10mol/L的LiCl中的至少一种。
优选的，含有中性去垢剂的缓冲液含有质量百分数为25％～50％的乙二醇、质量百分数为5％～20％的二氧六环和质量百分数为5％～10％的Triton X-100中的至少一种。中性去垢剂能够降低疏水作用，降低蛋白质的极性，对蛋白质的变性作用影响较少。
对于较为难以洗脱的第一配体和第二配体的组合，往往是由多种化学键连接的，可以采用几种不同性质的洗脱液结合使用。
S30、对S20得到的第二免疫磁球复合物进行免疫测定，获得第二免疫磁球复合物中的第二配体的免疫数据，若第二免疫磁球复合物中的第二配体的免疫数据小于或等于第一阈值，则判定洗脱液为第一筛选洗脱液。
第一筛选洗脱液即为通过第一次筛选后选定的洗脱液。
对第二免疫磁球复合物进行免疫测定的操作包括：加入标记有示踪标记物的第三配体进行免疫检测，其中，第三配体与第二配体特异性结合。
S30中，免疫测定可以利用化学发光检测平台进行检测，例如：半自动或全自动免疫分析仪。
第三配体为与第二配体免疫结合的抗原或抗体。举例来说，第二配体为GAD65时，第三配体为GAD65抗体，第三配体可以与第一配体相同，也可以与第一配体不同。
示踪标记物选自金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的至少一种。
优选的，异鲁米诺衍生物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
示踪标记物可以直接或间接地标记抗原或抗体(例如，第一抗胃泌素-17抗体或第二抗胃泌素-17抗体)。间接标记的方式包括但不限于通过异硫氰酸荧光素(FITC)与抗FITC抗体体系或通过链霉亲和素(SA)与生物素(Biotin)体系30进行间接标记。直接标记是指ABEI直接与抗原或抗体(第一抗胃泌素-17抗体或第二抗胃泌素-17抗体)连接进行标记；间接标记是指通过中间媒介链接体系使得ABEI标记抗原或抗体(第一抗胃泌素-17抗体或第二抗胃泌素-17抗体)。中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系(优选为羊抗FITC多克隆抗体)以及链霉亲和素与生物素体系。
第一阈值为采用阴性洗脱液(PBS缓冲液)对第一免疫磁球复合物进行洗脱做对照组(control check，CK)测得的免疫数据的5％～20％(优选为10％)。
S40、采用S30得到的第一筛选洗脱液对S10得到的第一免疫磁球复合物进行多次洗脱，沉降后得到第三免疫磁球复合物。
多次为5次～30次。
优选的，可以分别对第一免疫磁球复合物进行重复洗脱5次、10次、20次和30次，从而分别得到四组第三免疫磁球复合物。
S50、对S40得到的第三免疫磁球复合物进行免疫测定，获得第三免疫磁球复合物中的第一配体的免疫数据，若第三免疫磁球复合物中的第一配体的免疫数据大于或等于第二阈值，则判定第一筛选洗脱液为第二筛选洗脱液。
第二筛选洗脱液即为通过第二次筛选后选定的洗脱液。
对第三免疫磁球复合物进行免疫测定的操作为：采用夹心法、竞争法或间接法对第三免疫磁球复合物中的第一配体进行免疫测定。
第二阈值为采用阴性洗脱液(PBS缓冲液)对第一免疫磁球复合物进行多次洗脱做对照组(control check，CK)测得的免疫数据的80％～100％(优选为90％)。
S60、将第一配体与凝胶偶联(优选为35℃～40℃下恒温震荡反应15min～5h)，接着加入第二配体，反应(优选为35℃～40℃下恒温震荡反应15min～5h)后得到凝胶复合物。
凝胶可以为NHS-sepharose活化凝胶。
S70、采用S50得到的第二筛选洗脱液对S60得到的凝胶复合物进行洗脱，沉降后收集洗脱后的混合液，接着对混合液进行免疫测定，获得混合液中的第二配体的免疫数据，若混合液中的第二配体的免疫数据大于或等于第三阈值，则判定第二筛选洗脱液为第三筛选洗脱液。
对混合液进行免疫测定的操作为：采用夹心法、竞争法或间接法对混合液中的第二配体进行免疫测定。
第三阈值为采用第三阈值为采用第二配体的标准品溶液(浓度与混合液中的第二配体的浓度相同)做对照组(control check，CK)测得的免疫数据的80％～100％。
优选的，在对凝胶复合物进行洗脱之前，还包括先用含盐的中性缓冲液对凝胶复合物进行清洗以去除非特异性结合的杂蛋白的操作。
这种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法采用磁球作为固相载体，磁球与第一配体形成第一配体包被的磁球，在洗脱过程中由于第一配体包被的磁球的分散性好，不易发生假阳性，相对于传统的以凝胶为固相载体的筛选方法，可靠性较高。
这种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法采用磁球作为固相载体，相对于采用凝胶为固相载体的筛选方法，大大节省了抗原和抗体的用量，并且可以结合化学发光检测平台检测抗原或抗体的活性，有效的缩短了筛选的时间。
此外，这种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法还进一步的验证了洗脱液对第一配体和第二配体是否有损伤，筛选得到的洗脱液可以直接应用于免疫亲和纯化，无需后续操作。
以下为具体实施例。
实施例中涉及的药品如下：IA2(来源：菲鹏生物)、GAD65(来源：上海领潮生物科技有限公司)、TPO(来源：Diarect,INC)、HBsAg(来源：菲鹏生物)、GAD65抗体(来源：SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.)、TPO抗体(来源：SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.)、IA2抗体(来源：华葵金配)、HBsAg抗体(来源：菲鹏生物)、HD磁球(来源：新产业生物医学工程股份有限公司生产)、ABEI(来源：新产业生物医学工程股份有限公司生产)以及NHS-sepharose凝胶(来源：GE公司)。
实施例中针对抗原或抗体的活性检测，均采用双抗夹心法，利用新产业生物医学工程股份有限公司生产的全自动免疫分析仪完成测试。
实施例1
1、取1mL HD磁球(磁球浓度20mg/mL)加入1mL的pH3.6的醋酸缓冲液悬浮磁球，再加入CMC(浓度为10mg/mL)，按1mg:4μg加入TPO抗体(20mg磁球需要抗体80μg。)，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应2小时；
2、接有TPO抗体的磁球10μL与真核细胞表达的含有TPO抗原的发酵液20μL 37℃预反应10分钟，之后用磁球洗液100μL清洗3次；
3、用含有150mM NaCl的磁球洗液100μL对磁球连接抗原抗体的免疫复合物进行淋洗，将一些非特异性结合的杂蛋白淋洗冲去；
4、选择不同的洗脱缓冲液各100μL与磁球连接抗原抗体的免疫复合物37℃反应10分钟，将抗原抗体进行解离。
实施例1中选择的洗脱液包括：
A.6M盐酸胍；
B.8M尿素；
C.3M NaCNS；
D.100mM柠檬酸钠，1M尿素，25％PEG 200，pH 4.5；
E.100mM柠檬酸钠，1M尿素，1M NaCNS，pH 4.5；
F.100mM柠檬酸钠，1M尿素，3M MgCl2，pH 4.5；
G.100mM柠檬酸钠，1M尿素，7％Triton X-100，pH 4.5；
H.0.5M NaAC，2M GuCl，pH 5.5；
I.100mM柠檬酸钠，pH 3.5；
J.100mM柠檬酸钠，含1M NaCNS，7％Triton X-100，pH 4.5；
K.0.15M NaAC，含0.5M NaCl，25％PEG 200，1M GuCl，pH 5.0；
L.100mM Gly-HCl，pH 2.7；
CK1.20mM PBS，pH 7.4。
5、反应结束后将磁球沉降下来并收集，加入100μL磁球洗液清洗3次。之后加入相应的标记ABEI的另一株相对于TPO的配对抗体10μL，37℃温浴反应10分钟。最后利用新产业生物医学工程股份有限公司生产的直接化学发光平台进行检测，如果磁球上的TPO抗原完全被解离，则磁球上的抗体与标记ABEI的配对抗体不反应，光信号很低。反之如果检测光信号很高，说明磁球上仍然结合有TPO抗原，相对应的洗脱缓冲液没有能够有效的将TPO抗体与抗原解离。经过筛选A、B、G、K、L这5种洗脱液能够有效的将TPO抗原与抗体进行解离，具体实验数据见表1。
6、取10μL连接TPO抗体的磁球分别与20μL真核细胞表达的含有TPO抗原的发酵液37℃反应10分钟，形成抗原抗体免疫复合物，再用上述筛选得到的A、B、G、K、L这5种洗脱液以及对照组CK1洗脱液进行抗原抗体的解离，重复此步骤，分别取重复5次，10次，20次，30次的磁球，经过洗脱液多次洗脱的磁球与20μL真核细胞表达的含有TPO抗原的发酵液37℃反应10分钟，形成抗原抗体免疫复合物后加入相应的标记ABEI的另一株相对于TPO的配对抗体10μL，37℃温浴反应10分钟。利用新产业生物医学工程股份有限公司生产的直接化学发光平台检测连接到磁球上的抗体经过洗脱液反复洗脱后抗体的活性。如果经过洗脱液洗脱30次，双抗体夹心法仍然能够检测到很高的光强，说明在洗脱时该洗脱液对连接在磁球上的抗体活性没有损伤，适用于亲和纯化洗脱。如果经过5次洗脱，双抗体夹心法检测到光信号值就很低了，则说明在洗脱时该洗脱液对连接在磁球上的抗体活性损伤严重，不适于亲和纯化洗脱。经过筛选洗脱液G、K这2种洗脱液适用于纯化洗脱，具体实验数据见表2。
7、TPO抗体20mg偶联到4mL NHS-sepharose活化凝胶上，真核细胞表达的TPO抗原发酵液500mL上样到凝胶柱上，让TPO抗原与凝胶柱上的TPO抗体结合，形成特异性结合的免疫复合物。柱子经过20mM PB,含0.5M NaCl,pH 7.4淋洗，将一些非特异性结合的杂蛋白淋洗冲去。最后分别用筛选得到的G,K这2种洗脱液进行洗脱，收集特异性结合的TPO抗原。将收集的TPO抗原和对照组CK2抗原(直接购买的TPO抗原)分别包被磁球，取10μL包被TPO抗原的磁球，加入标记ABEI的TPO抗体，37℃温浴反应10分钟。利用新产业生物医学工程股份有限公司生产的直接化学发光平台检测连接到磁球上的TPO抗原的活性。检测到光信号值高说明TPO抗原活性高，光值低说明TPO抗原活性低。最终检测显示经过洗脱液G洗脱得到的TPO抗原活性很高，说明该洗脱液G不但能够有效的将TPO抗体与抗原进行解离，而且洗脱条件温和，经过多次洗脱对TPO抗体的活性基本无损伤，洗脱得到的TPO抗原活性也能够保证。经过一系列的筛选后最后得到合适的TPO抗原免疫亲和纯化最优洗脱方案，具体实验数据见表3。
实施例2
将实施例1中的TPO替换为GAD65抗原，TPO抗体替换为GAD65抗体将洗脱液的组分替换为：
A.0.1M Na2CO3-NaHCO3，pH 9.5；
B.0.1M Na2CO3-NaHCO3，pH 10.5；
C.0.1M Na2CO3-NaHCO3，pH 12.5；
D.100mM Gly-HCl，pH 3.5；
E.100mMGly-HCl，pH 2.7；
F.0.15M NaAC，0.5M NaCl，25％PEG 200，1M GuCl，pH 5.0；
G.100mM柠檬酸钠，1M尿素，7％Triton X-100，pH 4.5；
H.50mM KPO4，10mM diethylamine，0.2mM PLP，1mM AET，20mM glutamic acid，pH11；
I.50mM甘氨酸-NaOH，10mmol/L DTT，1％正辛基葡萄糖苷，1mmol/L谷氨酸，1mmol/L Pyridoxal 5-phosphate PLP，pH 9.5；
J.50Mm甘氨酸-NaOH，1mM谷氨酸，pH 10.5；
CK.20mM PBS，pH 7.4。
与实施例1相比，其筛选方法的区别在于针对GAD65抗原的性质更换不同的洗脱条件，其筛选实验数据见表4、表5和表6。
实施例3
将实施例1中的TPO抗原替换为IA2抗原，TPO抗体替换为IA2抗体。将洗脱液的组分替换为：
A.3M KSCN；
B.3M KI；
C.8M Uera；
D.0.05M二乙胺，pH 11；
E.0.lM Gly-HCl，pH 3.5；
F.0.1M磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 2.8；
G.0.15M NaCl-NaOH，pH 11；
H.0.15M NaAC，0.5M NaCl，5M MgCl2，pH 5.0；
I.0.15M NaAC，0.5M NaCl，10％PEG200，pH 5.0；
J.0.15M NaAC，0.5M NaCl，含5％Triton，pH 5.5；
CK.20mM PBS，pH 7.4。
与实施例1相比，其筛选方法的区别在于更换不同的洗脱条件，具体实验数据见表7、表8和表9。
实施例4
将实施例1中的TPO抗原替换为HBsAg抗原，TPO抗体替换为HBsAg抗体，将洗脱液的组分替换为：与实施例1相比，
A.0.1mol/L Gly-HCl，pH 2.7；
B.0.1mol/L Gly-HC1，pH 3.5；
C.20mM Tris-HCl，含150mM NaCl，4M尿素，pH 8.0；
D.20mM Tris-HCl，含150mM NaCl，5M NaI，pH 8.0；
E.20mM Tris-HCl，含150mM NaCl，1M KSCN，pH 8.0；
F.100mM柠檬酸钠，1M尿素，25％PEG 200，pH 4.5；
G.100mM柠檬酸钠，1M尿素，1％SDS，pH 4.5；
H.100mM柠檬酸钠，0.2M KC1，25％PEG 200，pH 4.5；
I.100mM柠檬酸钠，0.5M NaC1，1M盐酸胍，pH 4.5；
CK.20mM PBS，pH 7.4。
其筛选方法的区别在于更换不同的洗脱条件，实验数据见表10,11,12。
对比例1：
1、取2mL NHS-sepharosen凝胶，200mL 1mM HCl冲洗凝胶，之后用pH 8.3 100mMNaCO2-Na2HCO3buffer冲洗凝胶。按1mL:10mg加入TPO抗体(2mL凝胶需要TPO抗体20mg)，室温反应2小时；
2、连接有TPO抗体的凝胶2mL与真核细胞表达的含有TPO抗原的发酵液200mL 37℃预反应10分钟，之后用pH 7.4 20mM PB 100mL清洗3次；
3、用pH 7.4 20mM PBS含150mM NaCl 100mL对凝胶连接抗原抗体的免疫复合物进行淋洗，将一些非特异性结合的杂蛋白淋洗冲去；
4、选择不同的洗脱缓冲液各200μL分别与100μL凝胶连接抗原抗体的免疫复合物室温震荡反应2分钟，将抗原抗体进行解离。本方案选择的洗脱缓冲液如下：
A.6M盐酸胍；
B.8M尿素；
C.3M NaCNS；
D.100mM柠檬酸钠，1M尿素，25％PEG 200，pH 4.5；
E.100mM柠檬酸钠，1M尿素，1M NaCNS，pH 4.5；
F.100mM柠檬酸钠，1M尿素，3M MgCl2，pH 4.5；
G.100mM柠檬酸钠，1M尿素，7％Triton X-100，pH 4.5；
H.0.5M NaAC，2M GuCl，pH 5.5；
I.100mM柠檬酸钠，pH 3.5；
J.100mM柠檬酸钠，1M NaCNS，7％Triton X-100，pH 4.5；
K.0.15M NaAC，0.5M NaCl，25％PEG 200，1M GuCl，pH 5.0；
L.100mM Gly-HCl，pH 2.7。
5、反应结束后800rpm离心将凝胶沉降下来并收集，同时分别收集经过不同洗脱液洗脱得到的上清。用截留分子量10KD的超滤离心管进行缓冲液置换，最终将缓冲液置换为pH 7.4 20mM PB。
6、上述不同洗脱液洗脱获得的TPO样品和对照组CK2抗原(直接购买的TPO抗原)分别测定浓度后包被磁球，取10μL包被TPO抗原的磁球，加入标记ABEI的TPO抗体，37℃温浴反应10分钟。利用本公司直接化学发光平台检测连接到磁球上的TPO抗原的活性。检测到光信号值高说明TPO抗原被洗脱液解离并且解离过程中对TPO抗原活性影响低，TPO抗原保持较高的活性；光值低的原因：1)TPO抗原被洗脱液解离过程中对TPO抗原活性有损伤，导致TPO抗原活性降低甚至丧失。2)选用的洗脱条件不合适，没有有效的将TPO抗原与凝胶上偶联的抗体解离。经过筛选洗脱液A、G、L这3种洗脱液能够有效的将TPO抗原与抗体进行解离，并且TPO抗原保持较高的活性，具体实验数据见表格13。
对比例2：
1、取1mL HD磁球(磁球浓度20mg/mL)加入1mL的pH3.6的醋酸缓冲液悬浮磁球，再加入EDC(浓度为10mg/mL)，按1mg:4μg加入TPO抗体(20mg磁球需要抗体80μg。)，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应2小时；
2、连接有TPO抗体的磁球10μL与真核细胞表达的含有TPO抗原的发酵液20μL 37℃预反应10分钟，之后用磁球洗液100μL清洗3次；
3、用含有150mM NaCl的磁球洗液100μL对磁球连接抗原抗体的免疫复合物进行淋洗，将一些非特异性结合的杂蛋白淋洗冲去；
4、选择不同的洗脱缓冲液各100μL与磁球连接抗原抗体的免疫复合物37℃反应10分钟，将抗原抗体进行解离。本方案选择的洗脱缓冲液如下：
A.6M盐酸胍；
B.8M尿素；
C.3M NaCNS；
D.100mM柠檬酸钠，含1M尿素，25％PEG 200，pH 4.5；
E.100mM柠檬酸钠，含1M尿素，1M NaCNS，pH 4.5；
F.100mM柠檬酸钠，含1M尿素，3M MgCl2，pH 4.5；
G.100mM柠檬酸钠，含1M尿素，7％Triton X-100，pH 4.5；
H.0.5M NaAC，2M GuCl，pH 5.5；
I.100mM柠檬酸钠，pH 3.5；
J.100mM柠檬酸钠，1M NaCNS，7％Triton X-100，pH 4.5；
K.0.15M NaAC，0.5M NaCl，25％PEG 200，1M GuCl，pH 5.0；
L.100mM Gly-HCl，pH 2.7；
CK1.20mM PBS，pH 7.4。
5、反应结束后将磁球沉降下来并收集，加入100μL磁球洗液清洗3次。之后加入相应的标记ABEI的另一株相对于TPO的配对抗体10μL，37℃温浴反应10分钟。最后利用本公司直接化学发光平台进行检测，如果磁球上的TPO抗原完全被解离，则磁球上的抗体与标记ABEI的配对抗体不反应，光信号很低。反之如果检测光信号很高，说明磁球上仍然结合有TPO抗原，相对应的洗脱缓冲液没有能够有效的将TPO抗体与抗原解离。经过筛选A,B,G,K,L这5种洗脱液能够有效的将TPO抗原与抗体进行解离。其实验数据见表格1.
6、TPO抗体25mg偶联到5mL NHS-sepharose活化凝胶上，将凝胶平分成5份，真核细胞表达的TPO抗原发酵液各200mL，分别上样到1mL凝胶柱上，让TPO抗原与凝胶柱上的TPO抗体结合，形成特异性结合的免疫复合物。柱子经过20mM PB,含0.5M NaCl,pH 7.4淋洗，将一些非特异性结合的杂蛋白淋洗冲去。分别用筛选得到的A,B,G,K,L这5种洗脱液进行洗脱，收集特异性结合的TPO抗原，测定蛋白浓度，计算纯化得到的TPO抗原的产量。将TPO抗原包被磁球，取10μL包被TPO抗原的磁球，加入标记ABEI的TPO抗体，37℃温浴反应10分钟。利用本公司直接化学发光平台检测连接到磁球上的TPO抗原的活性。检测到光信号值高说明TPO抗原活性高，光值低说明TPO抗原活性低。重复该实验5，10，20次，分别检测每次纯化得到的TPO产量及抗原活性，具体实验数据见表14。检测结果显示凝胶在经过洗脱液A,B,K,L多次洗脱液后，得到的TPO抗原产量逐渐下降。说明洗脱液在洗脱的抗原的过程中对凝胶上偶联的抗体或许有损伤，导致纯化得到的TPO抗原的产量逐渐减少，因此筛选得到的洗脱条件不能直接用于免疫亲和纯化，需要进一步验证洗脱条件是否会对凝胶上的抗体活性有损伤。
实验数据以及数据分析。
表1、实施例1中TPO洗脱液的第一次筛选
Figure BDA0001214173720000171
Figure BDA0001214173720000181
由表1可知，A、B、G、K、L这5种洗脱液能够有效的将TPO抗原与抗体进行解离。
表2、实施例1中TPO洗脱液的第二次筛选
5次 10次 20次 30次
A 102142 95414 98745 101031
B 2978841 2311587 1628115 92147
G 3214457 3317872 3258745 3288745
K 3354751 3321769 3301478 3214782
L 2674142 2215697 112581 99852
CK1 3394121 3387792 3024786 3258741
由表2可知，经过筛选洗脱液G、K这2种洗脱液适用于TPO纯化洗脱。
表3、实施例1中TPO洗脱液的第三次筛选
G 5121429
K 798543
CK2 5211419
由表3可知，经过一系列的筛选后最后得到洗脱液G为TPO抗原免疫亲和纯化最优洗脱方案。
表4、实施例2中GAD65洗脱液的第一次筛选
Figure BDA0001214173720000182
Figure BDA0001214173720000191
由表4可知，B、C、D、E、H、I、J这7种洗脱液能够有效的将GAD65抗原与抗体进行解离。
表5、实施例2中GAD65洗脱液的第二次筛选
5次 10次 20次 30次
B 987412 992145 964107 901453
C 745212 420489 221045 88204
D 661211 78412 77623 70214
E 101450 77452 76214 72141
H 1021457 1016478 987451 961234
I 1032145 1015478 1005831 1012365
J 1011234 987421 965432 902587
CK1 1154412 1098741 1087441 1100254
由表5可知，经过筛选洗脱液H、I、J这3种洗脱液适用于GAD65纯化洗脱。
表6、实施例2中GAD65洗脱液的第三次筛选
Figure BDA0001214173720000192
Figure BDA0001214173720000201
由表6可知，经过一系列的筛选后最后得到洗脱液I为GAD65抗原免疫亲和纯化最优洗脱方案。
表7、实施例3中IA2洗脱液的第一次筛选
A 82314
B 914780
C 92102
D 88541
E 90314
F 85476
G 84510
H 632144
I 91354
J 90179
CK1 925477
由表7可知，A、C、D、E、F、G、I、J这8种洗脱液能够有效的将IA2抗原与抗体进行解离。
表8、实施例3中IA2洗脱液的第二次筛选
Figure BDA0001214173720000202
Figure BDA0001214173720000211
由表8可知，经过筛选洗脱液I、J这2种洗脱液适用于IA2纯化洗脱。
表9、实施例3中IA2洗脱液的第三次筛选
I 1269982
J 1243684
CK2 1302841
由表9可知，经过一系列的筛选后最后得到洗脱液I、J均为IA2抗原免疫亲和纯化最优洗脱方案。
表10、实施例4中HBsAg洗脱液的第一次筛选
A 22373
B 19847
C 20176
D 245644
E 1981350
F 252367
G 18963
H 1035411
I 19954
CK1 2022109
由表10可知，A、B、C、G、I这5种洗脱液能够有效的将HBsAg抗原与抗体进行解离。
表11、实施例4中HBsAg洗脱液的第二次筛选
Figure BDA0001214173720000212
Figure BDA0001214173720000221
由表11可知，经过筛选洗脱液C、I这2种洗脱液适用于HBsAg纯化洗脱。
表12、实施例4中HBsAg洗脱液的第三次筛选
C 3321546
I 2541183
CK2 3511039
由表12可知，经过一系列的筛选后最后得到洗脱液C可作为HBsAg抗原免疫亲和纯化最优洗脱方案。
表13、对比例1中TPO洗脱液的筛选
A 4912544
B 302544
C 902365
D 1022546
E 802144
F 602145
G 5532147
H 665412
I 502879
J 802651
K 402213
L 5011236
CK2 5323544
由表13可知，A、G、L这3种洗脱液能够有效的将TPO抗原与抗体进行解离，TPO抗原保持较高的活性。但是无法检测洗脱液是否会对偶联在凝胶上的抗体或许产生影响，不能直接用于亲和纯化，从而影响免疫亲和纯化方法的确立。
表14、对比例2中多次洗脱凝胶获得的TPO产量及活性
Figure BDA0001214173720000231
由表14可知，凝胶在经过洗脱液A、B、K、L多次洗脱液后，得到的TPO抗原产量逐渐下降。说明洗脱液在洗脱的抗原的过程中对凝胶上偶联的抗体或许有损伤，导致纯化得到的TPO抗原的产量逐渐减少，因此筛选得到的洗脱液不能直接用于免疫亲和纯化。
结合上述实验数据，可以看出：
1、实施例1～4中的筛选方法，能够筛选出直接用于免疫亲和纯化的最优洗脱液，
2、对比实施例1和对比例1，实施例1中基于磁球作为载体包被抗原抗体，结合化学发光平台进行筛选，筛选过程使用的抗原抗体量非常少，1mL磁球上连接抗体所需的抗体量为100～200μg，而1mL凝胶连接抗体所需的抗体量为5～10mg，并且1mL磁球足够完成一次筛选试验，在原料用量方面能够节约大量成本，并且采用凝胶作为载体进行洗脱条件筛选时，由于无法直接检测凝胶上偶联抗体的活性，只能通过间接法进行检测，检测方法繁琐而复杂，实施例1中基于磁球作为载体的方法，结合化学发光平台能够直接检测磁球上偶联抗体的活性，能够有效缩短洗脱条件的筛选时间。
3、对比实施例1和对比例2可知，实施例1的筛选方案经过第一次筛选确定能够有效将抗原抗体复合物进行解离的洗脱液，经过第二次筛选的过程能够确定第一次筛选得到的洗脱液是否会对偶联在磁球上的抗体产生影响，经过第三次筛选能最终确定亲和纯化方法的建立，三个步骤缺一不可，否则会影响亲和纯化方法的建立。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (17)

1.一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
将第一配体和磁球混合反应，接着加入第二配体，反应后得到第一免疫磁球复合物，其中，所述第一配体可与所述第二配体特异性结合；所述磁球为Fe2O3磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，或者，所述磁球为Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体；并且所述磁球通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团；
采用洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行洗脱，沉降后得到第二免疫磁球复合物；
对所述第二免疫磁球复合物进行免疫测定，获得所述第二免疫磁球复合物中的所述第二配体的免疫数据，若所述第二免疫磁球复合物中的所述第二配体的免疫数据小于或等于第一阈值，则判定所述洗脱液为第一筛选洗脱液；
采用所述第一筛选洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行多次洗脱，沉降后得到第三免疫磁球复合物；
对所述第三免疫磁球复合物进行免疫测定，获得所述第三免疫磁球复合物中的所述第一配体的免疫数据，若所述第三免疫磁球复合物中的所述第一配体的免疫数据大于或等于第二阈值，则判定所述第一筛选洗脱液为第二筛选洗脱液；
将所述第一配体与凝胶偶联，接着加入所述第二配体，反应后得到凝胶复合物；
采用所述第二筛选洗脱液对所述凝胶复合物进行洗脱，沉降后收集洗脱后的混合液，接着对所述混合液进行免疫测定，获得所述混合液中的所述第二配体的免疫数据，若所述混合液中的所述第二配体的免疫数据大于或等于第三阈值，则判定所述第二筛选洗脱液为第三筛选洗脱液；
所述第一阈值为采用阴性洗脱液对第一免疫磁球复合物进行洗脱做对照组测得的免疫数据的5％～20％；
所述第二阈值为采用阴性洗脱液对第一免疫磁球复合物进行多次洗脱做对照组测得的免疫数据的80％～100％；
所述第三阈值为采用所述第二配体的标准品溶液做对照组测得的免疫数据的80％～100％。
2.根据权利要求1所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述得到第一免疫磁球复合物的反应过程为：将所述第一配体、所述磁球和交联剂在缓冲液中混合反应，再加入所述第二配体，反应后得到第一免疫磁球复合物。
3.根据权利要求2所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述交联剂为、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺对甲苯甲磺酸。
4.根据权利要求2所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述缓冲液为pH为3～4的醋酸盐缓冲液、pH为2～4的甘氨酸盐酸缓冲液或pH为9～11的碳酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述第一配体为甲状腺过氧化物酶、谷氨酸脱羧酶、促甲状腺激素受体、蛋白酪氨酸磷酸酶、胃泌素17或抗缪勒氏管激素，所述第二配体为甲状腺过氧化物酶抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、促甲状腺激素受体抗体、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体、胃泌素17抗体或抗缪勒氏管激素抗体；
或者，所述第一配体为甲状腺过氧化物酶抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、促甲状腺激素受体抗体、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体、胃泌素17抗体或抗缪勒氏管激素抗体，所述第二配体为甲状腺过氧化物酶、谷氨酸脱羧酶、促甲状腺激素受体、蛋白酪氨酸磷酸酶、胃泌素17或抗缪勒氏管激素。
6.根据权利要求1所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，在所述采用洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行洗脱的操作之前，还包括采用淋洗液对所述第一免疫磁球复合物进行淋洗的步骤。
7.根据权利要求6所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述淋洗液为pH为7～8且浓度为300mM～500mM的NaCl的缓冲液。
8.根据权利要求1所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述洗脱液选自酸性洗脱液、碱性洗脱液、含有盐类的洗脱液和含有中性去垢剂的洗脱液中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述酸性洗脱液的pH为2～4.5。
10.根据权利要求8所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述碱性洗脱液的pH为10～12.5。
11.根据权利要求8所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述含有盐类的洗脱液中含有1mol/L～5mol/L的硫氰酸盐、2mol/L～5mol/L的胍、2mol/L～8mol/L的尿素、3mol/L～5mol/L的MgCl2和5mol/L～10mol/L的LiCl中的至少一种。
12.根据权利要求8所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述含有中性去垢剂的洗脱液含有质量百分数为25％～50％的乙二醇、质量百分数为5％～20％的二氧六环和质量百分数为5％～10％的Triton X-100中的至少一种。
13.根据权利要求1所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述采用所述第一筛选洗脱液对所述第一免疫磁球复合物进行多次洗脱的操作中，所述多次为5次～30次。
14.根据权利要求1所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述磁球的粒径为0.1μm～5μm。
15.根据权利要求1所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述对所述第二免疫磁球复合物进行免疫测定的操作包括：加入标记有示踪标记物的第三配体进行免疫检测，其中，所述第三配体与所述第二配体特异性结合。
16.根据权利要求15所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述示踪标记物选自金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶中的至少一种。
17.根据权利要求16所述的免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法，其特征在于，所述异鲁米诺衍生物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
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