CN103364428A - 一种基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针检测食源性致病菌的快速检测方法，属于食品安全致病菌快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品液体样本中致病菌的核磁共振检测方法，利用γ晶型Fe2O3纳米材料制备免疫磁珠针对性的富集目标菌株，利用γ晶型Fe2O3的超顺磁特性对核磁共振衰减信号的弛豫时间的影响，检测出样本中是否含有目标致病菌。不同的具体的对应关系为：超顺磁免疫磁珠，在一定条件下显示出线性关系，即免疫磁珠含量大，样品的T2/T1值越小，在一定范围能够定量检测目标菌。该方法可以用于食品样本中有害致病菌的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种致病菌的快速检测方，尤其涉及一种基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法。
背景技术
基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。其主要的原理步骤：1. 利用γ晶型的Fe2O3磁珠，包被一层高分子化合物，经过改性后采用适当的偶联剂将待检目标菌的单克隆抗体偶联在磁珠表面，形成特异性免疫磁珠。2. 将另一部分目标菌的特异性单克隆抗体采用一定的方法固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭。3. 将制备的特异性免疫磁珠用于抓取富集目标菌，通过外加磁场将磁珠分离出来，此时，结合了目标菌的磁珠和没有结合目标菌的磁珠还是混在一起。4. 将上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的磁珠将与固相载体表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未发生结合的磁珠洗脱。5. 再采用洗脱剂将固定载体上的结合的特异性纳米免疫磁珠洗下来，清洗掉离子、溶剂。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目标菌的磁珠。由于Fe2O3具有顺磁和超顺磁特性，对于共振仪器非常敏感，相对于其他分子而言，微量的Fe2O3能够大幅降低无菌的去离子水的自旋-晶格驰豫参数T1和自旋-自旋弛豫时间T2，而无菌的去离子水在一定的均匀场强下，T1/T2是固定的。将洗脱液置于核磁共振仪中，与无菌的去离子水对照组进行对照。显著发生T1/T2值降低的说明有磁珠存在，从而间接说明食品样品中有致病菌检出。磁珠含量与T1/T2值降低呈正比。通过加标，可以定量检测目标菌。该方法中γ-Fe2O3磁珠既是分离富集的手段，同时γ-Fe2O3具有的顺磁和超顺磁特性，又可作为定量检测的探针。该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛选，检出的阳性样还需用微生物培养进行确证。目前，国内外还没有文献报道这种方法，但是采用免疫磁珠进行致病菌的富集、目标物的富集等的报道还是很多的，但都没有采用核磁共振做进一步的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价，该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。
一种基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针的核磁共振技术快速检测出食品中的有害致病菌的方法，核磁共振仪对顺磁、超顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与γ-Fe2O3纳米超顺磁免疫磁珠含量的相关性指标。不同的致病菌检出下限不同。
该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分离，从核磁共振弛豫信号参数变化的角度，检测出样品中的有害致病菌；采用偶联了特异性单克隆抗体的超顺磁免疫磁珠，可以将样品中的特异性致病菌进行富集；由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对γ-Fe2O3纳米粒子非常敏感，即在去离子水中，存在微量的超顺磁γ-Fe2O3纳米粒子，则水的自旋-晶格弛豫时间（T1）和/自旋-自旋弛豫（T2）就会显著下降。在一定条件下，超顺磁免疫磁珠的顺磁特性使核磁共振的弛豫衰减信号T2/T1产生线性减小。通过定量检测出样品中的免疫磁珠含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与磁珠含量线性相关，相关系数R2为0.98，拟合度较好。最终以超顺磁免疫磁珠与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。
本发明是这样实现的，步骤如下：
1）检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备；
2）将目标菌特异性单克隆抗体固定在固相载体表面；
3）免疫磁珠富集目标菌株，并分离：将第1步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出磁珠若待检样本中有目标菌，则被磁珠所富集，加少量无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬浊液；
4）将富集的磁珠悬浊液加到第２步制作的固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心；用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；
5）之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠就是抓到目标菌的磁珠；
6）这部分磁珠，加入无菌的去离子水形成磁珠的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定，以无菌的去离子水为空白，测得的悬浊液的弛豫时间T1/T2相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有磁珠，从而间接证明样本中有目标致病菌，磁珠的量与T1/T2的下降呈正比，可以通过定量磁珠而间接定量出目标菌的量。
所述NMR纳米探针为γ-Fe2O3材料，γ晶形的纳米粒径小于1000纳米。
所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化。
所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间(T1)和自旋-自旋弛豫时间(T2)。
所述弛豫时间特性，T1采用180°-τ-90°脉冲方法测定，T2采用CPMG序列方法测定。
本发明的有益效果：本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依赖于建立的可用于检测超顺磁免疫磁珠的核磁共振检测方法。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。
具体实施方式
实例1
从一种食品样本中测定其是否含有有害致病菌——李斯特菌。
1. 免疫磁珠制备：磁珠与单克隆抗体的偶联。采用商品化羧基化磁珠，或采用微乳液法自行制备γ-Fe2O3纳米微球，通过包被修饰成羧基化磁珠或氨基化磁珠。单克隆抗体采用生物试剂公司购买的商品李斯特菌单克隆抗体，或自行制备单克隆单克隆抗体并分离纯化。以羧基化磁珠为例，偶联步骤：①清洗：分别取5mg羧基化磁珠于5mL离心管中，2mL 磷酸缓冲液（PB）0.02M，pH=6.0洗2次，洗涤后用2mL 水吗啉乙磺酸（MES）0.05M，pH=6.0重悬；②活化：超声使磁珠分散，再分别加入1mg 碳二亚胺（EDC），1mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHSS)（用0.05M，pH=6.0 MES溶解），25℃活化2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；③偶联：磁分离，吸去上清，2mL PB（0.02M，pH=7.4）洗涤一次并转移至新的离心管，3mL 磷酸盐缓冲液（PBS）0.02M，pH=7.4重悬，超声使磁珠分散。再分别将275μg抗体加入到已活化磁珠中，25℃偶联3h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；④封闭：磁分离，取出上清（上清中的蛋白含量用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测，测算偶联量），加入1mg/mL乙醇胺及1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）封闭（0.02M，pH=7.4的PB溶解，并调节pH至中性），25℃封闭2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；⑤保存：0.01M PBS洗涤磁珠2次，磁分离，去上清，用3mL pH7.4 PB（0.02M，0.02% NaN3，0.5%BSA）重悬，存于4℃。制备的免疫磁珠备用。
2. 单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入李斯特菌单克隆单抗，即将 
单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ℃孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22℃，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3. 将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将第一步制得的免疫单克隆抗体磁珠加入后进行充分震荡数分钟。上磁力架分离磁珠，加少量无菌的去离子水得到磁珠的悬浊液。此时，如果待检样本中有目标李斯特菌，则通过免疫磁珠的特异性反应就达到了目标菌富集的目的。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的单克隆抗体固定板上，则磁珠乳液中结合了李斯特菌的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了李斯特菌的磁珠。
4. 用洗脱液（甲醇等）将固定板上的结合了李斯特菌的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并清洗1-2次，将离子洗去。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20,纽迈公司或miniNMR华东师范大学)测定溶液的T1和T2。以无菌的去离子水为空白，溶液测得的T1/T2与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有磁珠存在，从而说明样本中有李斯特菌，磁珠的量与T1/T2的下降值呈正比。下降的越多说明磁珠越多，从而间接说明李斯特菌越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。
具体实施方式
实例2
测定食品样品是否含有有害致病菌大肠杆菌O157：H7。
1.免疫磁珠制备：磁珠与单克隆抗体的偶联。采用商品化羧基化磁珠，或采用微乳液法自行制备γ-Fe2O3纳米微球，通过包被修饰成羧基化磁珠或氨基化磁珠。单克隆抗体采用商品的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体，或自行制备单克隆单克隆抗体并分离纯化。偶联步骤：①清洗：分别取5mg羧基化磁珠于5mL离心管中，2mL PB（0.02M，pH=6.0）洗2次，洗涤后用2mL MES（0.05M，pH=6.0）重悬；②活化：超声使磁珠分散，再分别加入1mg EDC，1mg NHSS（用0.05M，pH=6.0 MES溶解），25℃活化2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；③偶联：磁分离，吸去上清，2mL PB（0.02M，pH=7.4）洗涤一次并转移至新的离心管，3mL PB（0.02M，pH=7.4）重悬，超声使磁珠分散。再分别将275μg单克隆抗体加入到已活化磁珠中，25℃偶联3h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；④封闭：磁分离，取出上清（上清中的蛋白含量待检），加入1mg/mL乙醇胺及1mg/mL BSA封闭（0.02M，pH=7.4的PB溶解，并调节pH至中性），25℃封闭2h，旋转仪15r/min保持悬浮状态；⑤保存：0.01M PBS洗涤磁珠2次，磁分离，去上清，用3mL pH7.4 PB（0.02M，0.02% NaN3，0.5%BSA）重悬，存于4℃。制备的免疫磁珠备用。
2.单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入O157：H7单克隆抗体，即将
单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ℃孵育45 min，形成如下结构。加入牛血清蛋白将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3.将食品样本进行预处理，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样本。将第一步制得的免疫单克隆抗体磁珠加入后进行充分震荡数分钟。上磁力架分离磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此时，如果待检样本中有目标大肠杆菌O157：H7，则通过免疫磁珠的特异性反应就达到了目标菌富集的目的。将此富集的磁珠悬浊液加到第2步所制备的单克隆抗体固定板上，则磁珠悬浊液中结合了大肠杆菌O157：H7的磁珠会进一步与固定板上的单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将未结合大肠杆菌O157：H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有结合了大肠杆菌O157：H7的磁珠。
4.用洗脱液（甲醇等）将固定板上的结合了大肠杆菌O157：H7的磁珠洗脱下来。上磁力架，分离磁珠并用无菌的去离子水清洗1-2次，将离子、溶剂洗去。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20,纽迈公司或miniNMR华东师范大学)测定溶液的T1和T2，以去离子水为空白，溶液测得的T1/T2与空白比较，有显著差异，说明溶液中有磁珠存在，从而说明样本中有大肠杆菌O157：H7，磁珠的量与T1/T2的下降值呈正比。下降的越多说明磁珠越多，从而间接说明大肠杆菌O157：H7越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。
Claims (5)
1.一种基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法， 其特征步骤如下：
1）检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备；
2）将目标菌特异性单克隆抗体在固相载体上的固定；
3）免疫磁珠富集目标菌株，并分离：将第1步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出磁珠，若待检样本中有目标菌，则被磁珠所富集，加少量无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬浊液；
4）将富集的磁珠悬浊液加到固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；
5）之后，用洗脱剂将固定板上的双抗夹心的磁珠洗下来，用外加磁场分离磁珠的方法用无菌的去离子水清洗掉离子和溶剂，如果还存在磁珠就是抓到目标菌的磁珠；
6）这部分磁珠，加入无菌的去离子水形成磁珠的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定，在固定场强下，无菌的去离子水的T1/T2是一个恒定值，以无菌的去离子水为空白，测得的悬浊液的弛豫时间T1/T2相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有磁珠，从而间接证明样本中有目标致病菌，磁珠的量与T1/T2的下降呈正比，可以通过加标定量磁珠而间接定量出目标菌的量。
2.根据权利要求1所述的基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法，其特征是所述NMR纳米探针为γ-Fe2O3材料，γ晶形的纳米粒径小于1000纳米。
3.根据权利要求1所述的基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法，其特征是所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化。
4.根据权利要求1所述的基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法，其特征是所述NMR弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间(T1)和自旋-自旋弛豫时间(T2)。
5.根据权利要求1所述的基于γ-Fe2O3的NMR纳米探针食源性致病菌的快速检测方法，其特征是所述弛豫时间特性，T1采用180°-τ-90°脉冲方法测定，T2采用CPMG序列方法测定。
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