CN113376378A - 一种d-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种D‑二聚体检测试剂盒、制备方法及用途。本发明的所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一株抗体、标记有示踪标记物的第二株抗体和校准品；所述第一株抗体和所述第二株抗体所识别的D‑二聚体的特异性结合位点不同；所述校准品包括含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。该试剂盒具有良好的灵敏度和特异性，反应时间短，能够快速得到检测结果，阴性符合率高，稳定性高，结合化学发光仪器可以实现快速自动化检测。

Description

一种D-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种D-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途。
背景技术
D-二聚体(D-Dimer，DD)是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物。D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。近十多年来，国内外的研究证实D-二聚体检测已成为临床诊断血栓性疾病的重要指标，主要用于筛查深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、弥漫性血管内凝血(DIC)。另外，只要机体血管内有活化的血栓形成及纤维溶解活动，D-二聚体就会升高，因此，心肌梗死、脑梗死、手术、肿瘤、感染及组织坏死、肾脏疾病、器官移植排斥反应等均可导致D-二聚体升高。特别对老年人及住院患者，因患菌血症等病易引起凝血异常而导致D-二聚体升高。D-二聚体检测不仅对多种疾病的辅助诊断具有重要的临床意义，也具备巨大的市场前景。
目前，D-二聚体的免疫检测方法有多种，其中包括放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)、荧光免疫层析法(FICA)、胶乳增强免疫比浊法(PETIA)及近年来逐渐被广泛使用的化学发光法(CLIA)等。
放射性同位素免疫分析法(RIA)是利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。但是放射性同位素免疫分析法(RIA)有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等问题。
酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。但酶联免疫吸附法(ELISA)操作繁琐时间长、灵敏度低、线性范围窄和自动化程度低。
胶体金免疫层析法(GICA)作为POCT检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。不过胶体金免疫层析法在灵敏度、线性范围、定量准确度等方面还有待改进。
荧光免疫层析法(FICA)相比于传统的免疫层析法区别在于以荧光微球代替胶体金作为抗体载体，既保留了传统胶体金层析试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，提高免疫层析方法检测性能。但荧光免疫层析法存在自动化程度低、检测通量较小的缺点。
胶乳增强免疫比浊法(PETIA)，传统的免疫比浊法基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。胶乳增强免疫比浊法是在传统免疫比浊基础上，将抗体标记在乳胶微球上使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。胶乳增强免疫比浊法(PETIA)则存在检测灵敏度不高，线性范围较窄等缺点。
化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。但目前现有的检测D-二聚体的化学发光法试剂盒，多为利用生物素-亲和素体系，比如专利文献CN108445214A试剂盒主要组成为包被有链亲和素的磁微粒R1、吖啶类衍生物标记的D-二聚体的单克隆抗体R2、生物素标记D-二聚体的单克隆抗体R3三种试剂，其基本原理是样本中的抗原与R2和R3的单克隆抗体形成吖啶酯-抗体-抗原-抗体-生物素复合物，再与R1磁珠上的亲和素反应形成吖啶酯-抗体-抗原-抗体-生物素-亲和素-磁珠复合物，再根据发光值测出抗原浓度值，这种三试剂体系存在着反应时间长，成本较高的缺点。也有专利文献报导采用碱酶体系制备的试剂盒，但是在线性范围、反应时间、测试通量等方面还有待改善。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于，提供一种D-二聚体检测试剂盒，该试剂盒具有良好的灵敏度和特异性，反应时间短，能够快速得到检测结果，阴性符合率高，稳定性高，结合化学发光仪器可以实现快速自动化检测。
本发明的另一目的在于，提供一种前述D-二聚体检测试剂盒的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供一种前述D-二聚体检测试剂盒的用途。
用于解决问题的方案
具体来说，本发明记载了如下技术方案。
【1】一种D-二聚体检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一株抗体、标记有示踪标记物的第二株抗体和校准品；所述第一株抗体和所述第二株抗体所识别的D-二聚体的特异性结合位点不同；所述校准品包括含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。
【2】根据【1】所述的D-二聚体检测试剂盒，其中，所述示踪标记物为吖啶酯。
【3】根据【1】或【2】所述的D-二聚体检测试剂盒，其中，所述第一株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列，所述第二株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3所示的序列，优选地，所述第一株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列。
【4】根据【1】-【3】任一项的D-二聚体检测试剂盒，其中，所述磁性微球和第一株抗体的质量比为100:1～2。
【5】根据【1】-【4】任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其中，所述试剂盒不包含咪唑成分。
【6】根据【1】-【5】任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括质控品、磁珠清洗液和化学发光底物液。
【7】根据【1】-【6】任一项所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：
磁性微球包被步骤：将所述第一株抗体包被于所述磁性微球上；
示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二株抗体上；
配制校准品步骤。
【8】根据【7】所述的制备方法，其中，在所述磁性微球包被步骤中第一株抗体和磁性微球的偶联时间为1～2小时，进一步优选1～1.5小时，最优选1.5小时。
【9】根据【7】或【8】所述的制备方法，其中，在所述示踪标记物标记步骤中使用的抗体偶联缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，其pH值为7.5～8.5。
【10】根据【1】-【6】任一项所述的D-二聚体检测试剂盒在制备用于诊断血栓性疾病如深静脉血栓、肺栓塞或弥漫性血管内凝血的试剂中的应用。
发明的效果
本发明采用两株抗体分别标记示踪标记物和包被磁珠，当样本中含有D-二聚体，则样本中的D-二聚体可以与磁珠上包被的第一株抗体和吖啶酯上标记的第二株抗体形成三明治夹心结构，这种双试剂反应体系，样本中的抗原直接与这两种试剂反应形成吖啶酯-抗体-抗原-抗体-磁珠复合物，相比三试剂反应体系如CN108445214A节约了成本以及反应时间，从而增加测试通量。本发明的试剂盒具有良好的灵敏度和特异性，反应时间短，能够快速得到检测结果，阴性符合率高，能有效地排除深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)，结合化学发光仪器可以实现自动化检测。本发明通过对各组分的配方优化，提高了本发明的试剂盒各组分的稳定性。同时，本发明通过对原料和参数的选择，大大缩短了各组分制备时间，提高了试剂盒的生产效率并降低了生产成本。
在另一个实施方式中，本发明使用吖啶酯作为示踪标记物，线性范围比碱酶体系宽(线性范围能达到0.08-40mg/L)、反应时间短、测试通量也比较高，本发明所能达到的临床样本相关性R值可达0.9953，斜率达到0.95，阴性符合率96％，阳性符合率100％；变异系数CV小于5％。
在另一个实施方式中，本发明的待测样本可以是直接获得血浆和全血，也可以是通过抽取人体血样进行分离得到的样本。使用本试剂盒检测时使用更为简便，减少人为误差。
附图说明
图1示出了本发明检测方法反应原理图；
图2示出了本发明的线性相关图；
图3示出了本发明的样本符合率图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
需要说明的是：
本说明书中，术语“磁性微球”与“磁珠”具有相同的含义，是指具有细小粒径的超顺磁微球，一般具有超强的顺磁性。其表面可包被上特异性抗体、受体等，用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施方式”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式或方案中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
在描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该(所述，the)”和类似的语言将被解释为覆盖单数和复数，除非本文另外指示或与上下文明显矛盾。
本说明书中，使用“数值A～数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
<第一方面>
本发明提供了一种D-二聚体(DD)检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一株抗体、标记有示踪标记物的第二株抗体和校准品；所述第一株抗体和所述第二株抗体所识别的D-二聚体的特异性结合位点不同；所述校准品包括含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。本发明提供的试剂盒检测效果好且稳定性高。
本发明采用双抗体夹心法，该法主要是使用两株不同的特异性单克隆抗体，其中一株被标记于示踪标记物，另一株包被于磁性微球上，当样本中存在D-二聚体抗原时，标记于示踪标记物的抗体与包被于磁性微球上的抗体以及抗原形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，复合物中的示踪发光物质或者酶可以被进一步催化发光，通过特定仪器读出信号值，样本中抗原的浓度和信号值成正比，通过反应曲线测出样本中D-二聚体的含量。该法主要是使用两株不同的特异性抗体，其中被标记于示踪标记物的抗体的结合位点与包被于磁性微球上的抗体结合位点不同。选择这些结合位点不仅有利于示踪物的标记或磁性微球的包被，也不会阻碍抗体与抗原结合形成夹心复合物，因此，提高了反应的特异性和灵敏度。在本发明的一些具体实施方式中，本发明中的第一株抗体和第二株抗体均为抗DD的单克隆抗体。在一个技术方案中，为了提高检测样品的信号值和检测样本的符合率，优选地，本发明所述第一株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列，所述第二株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3所示的序列。进一步优选地，本发明所述第一株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列。
作为优选，本发明所述示踪标记物为吖啶酯，相对其他种类的示踪标记物如碱性磷酸酶，吖啶酯应用于化学发光检测背景发光低、信噪比高、光释放快速集中、发光效率高、发光强度大，易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少，标记物稳定(在2-8℃下可保存数月之久)，另外吖啶酯在水中溶解性好，稳定且不易水解。在本发明的一个实施方式中，采用一株抗体标记吖啶酯，相对于两株抗体标记吖啶酯，成本降低，工艺更为简单，本发明所能达到的临床样本相关性R值可达0.9953，斜率达到0.95，阴性符合率96％，阳性符合率100％；变异系数CV小于5％，线性范围能达到0.08-40mg/L。
本发明对于适用于本发明的磁性微球的种类不作特定限定，可以是本领域常用的磁珠。作为本发明实施方式之一，本发明所使用的磁珠为纳米级Fe2O3和Fe3O4的磁性微粒与高分子材料进行复合后形成的具有顺磁性和极大蛋白吸附量的微米级固相微球，该磁性微球可以在外加磁场的作用下迅速磁化，在磁场消失后剩磁为零。在本发明中对与其复合所用的高分子材料的种类没有特定限定。
作为本发明实施方案之一，本发明所使用的磁珠平均粒径为1-5μm，上述磁珠可以通过表面改性而添加多个活性基团，本发明中的活性基团的种类包括但不限于-OH和-COOH。
在本发明的一些具体实施方式中，为了提高检测样品信号，所述磁性微球和第一株抗体的质量比为100:1～2，为了操作的稳定性和便捷性，进一步优选的，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1.3～1.8，在本发明的一个具体实施方式中，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1.5。
示踪标记物与抗体的摩尔比和工艺、反应体系以及信号值有关系，在本发明的优选实施方式中，所述示踪标记物和第二株抗体的摩尔比为不小于15:1，如果过低则会影响检测信号。在本发明的一个具体实施方式中，采用吖啶酯与抗体比摩尔比为15：1，可以减少抗体使用，节约成本。
在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒使用时将第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.03～0.08mg/mL，将示踪标记物标记第二株抗体稀释到0.5～2μg/mL，优选1μg/mL。
本发明中，所述的试剂盒还包括校准品，所述校准品包括含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(即PBS缓冲液)。该校准品在37℃或4℃条件下均能稳定保存，具有良好的热稳定性。本发明人发现使用PBS缓冲液相对与其他种类的缓冲液(如HEPES或Tris-HCl)而言，所获得的校准品稳定性高。进一步地，牛血清白蛋白占PBS缓冲液的质量百分数为1.5～3.5wt％，有助于进一步提高稳定性。在本发明的另一些实施方案中，本发明使用含2.5％的牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液来稀释D-二聚体抗原获得校准品。
进一步地，本发明的校准品包括低点校准品和高点校准品，高点校准品是指将D-二聚体抗原使用含牛血清白蛋白的PBS溶液稀释至10～20mg/L得到的校准品，低点校准品是指将D-二聚体抗原使用含牛血清白蛋白的PBS溶液稀释至0.1～0.5mg/L得到的校准品。在本发明的一个具体实施方式中，校准品的制备包括：取D-二聚体抗原，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液稀释至15mg/L和0.3mg/L的高低点校准品溶液。
在本发明中，所述试剂盒还包括质控品。在本发明的一个具体实施方式中，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液稀释至10mg/L和0.5mg/L的高低点质控品溶液。
在本发明中，所述试剂盒还包括：清洗液、化学发光激发液。
本发明中的清洗液为磷酸盐吐温缓冲液(PBST)，在本发明的一些具体实施方式中，PBST的pH为7.0～9.0，浓度为0.01～0.03mol/L，进一步地，其包括0.1～0.5wt％的吐温20(Tween-20)。可选地，所述清洗液中还包括防腐剂，本发明所适用的防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin-300(主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮)和抗生素中的一种或多种。
本发明使用的化学发光激发液包括激发液A和激发液B两种，需配合使用，在本发明的一些具体实施方式中，先向反应杯中加入一定量激发液A后，再加入等量的激发液B。激发液A是将H2O2和HNO3进行混合，其中H2O2质量分数为0.01-5.0％，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L；激发液B是将聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和NaOH进行混合，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。
<第二方面>
本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：
磁性微球包被步骤：将所述第一株抗体包被于所述磁性微球上；
示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二株抗体上；
配制校准品步骤。
在本发明的一个实施方式中，所述磁性微球包被步骤中第一株抗体和磁性微球的偶联时间为1～2小时，进一步优选1～1.5小时，最优选1.5小时。偶联时间短可能与本发明选择特定的抗体有关。
作为本发明的实施方案之一，所述磁性微球包被步骤中第一株抗体和磁性微球在2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中进行偶联，MES相比于其他缓冲液而言，检测信号和样本符合率更好。
作为本发明的实施方案之一，所述磁性微球包被步骤中还使用封闭液，进一步优选地，为了获得更高的检测信号和样本符合率，所述封闭液为含酪蛋白(Casein)的磷酸盐缓冲液(PBS)。封闭试剂的浓度范围优选0.01～0.05M，封闭试剂的用量为100～300μL。
作为本发明的实施方案之一，在封闭后的磁珠混悬液中，加入少量发光恢复液用以保存磁珠混悬液，所述发光恢复液的制备方法包括取一定量的牛血清白蛋白用Tris-HCl缓冲液溶解，然后加入吐温80以及新生牛血清。
在本发明的一个具体实施方式，所述磁性微球包被步骤包括：
(1)量取磁性微球，并混匀于0.1M的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)缓冲液中，用磁铁吸附5～10min后，弃去上清，重复上述清洗步骤3～5次，加入0.1M MES，涡旋混匀；
(2)加入DD单克隆抗体，使磁珠与抗体的质量比为100:1～2，涡旋混匀，37℃孵育1～2小时；
(3)加入10mg/mL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐)，涡旋混匀，37℃孵育1.5h；
(4)取100～300μL含1％Casein(酪蛋白)的PBS溶液(0.02M)进行封闭，封闭2h；
(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1mL发光恢复液(5g的牛血清白蛋白+400mL的0.025M的Tris-HCl缓冲液溶解+0.1-2‰的Tween-80+100ml新生牛血清)，磁铁吸附5～10min，去上清后，重复上述清洗步骤3～5次。
(6)将上述制备好的磁珠置于1mL的发光恢复液中，2～8℃保存即得包被DD单抗的磁性微球悬浮液。
作为本发明的实施方案之一，示踪标记物标记步骤中使用的抗体偶联缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，HEPES相比于其他缓冲液如碳酸盐缓冲液(CB)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)而言，检测信号和样本符合率更好。在本发明的一个具体实施方式中，采用0.05M的HEPES缓冲液，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液的pH为7.5～8.5，pH的变化对信号值影响不大。
作为本发明的实施方案之一，示踪标记物标记第二株抗体的标记时间(即室温避光反应的时间)为1.5～2.5小时，在本发明的一个具体实施方式中，所述第二株抗体标记示踪标记物的标记时间为2小时。在本发明的一个具体实施方式，所述示踪标记物标记步骤包括：
(1)将DD单克隆抗体置于离心管内，加入0.05M HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH 8.0)，再加入溶于DMF的5mg/mL的吖啶酯溶液，使吖啶酯与DD单克隆抗体的摩尔比不小于15:1，混匀后，室温避光反应(即标记时间)2h，加入100μL 100mg/mL的赖氨酸溶液，反应30min，终止反应。
(2)将标记物置于透析袋中，用不少于2L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的吖啶酯。
(3)收集透析过后的标记物，加入5％BSA溶液使BSA终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存得到标记吖啶酯的DD单抗溶液。
本发明的制备方法还包括配制校准品和质控品的步骤，其包括取D-二聚体抗原A，使用含牛血清白蛋白的PBS溶液稀释得到高、低点校准品和质控品溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，制校准品和质控品的步骤包括取D-二聚体抗原，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液稀释至15mg/L和0.3mg/L的高低点校准品溶液，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液稀释至10mg/L和0.5mg/L的高低点质控品溶液。
作为本发明的实施方案之一，本发明试剂盒的制备方法还包括配制化学发光激发液和清洗液。称取规定量的各组分按照常规方法配制即可。
<第三方面>
本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的D-二聚体检测试剂盒在制备用于诊断血栓性疾病如深静脉血栓、肺栓塞或弥漫性血管内凝血的试剂中的应用。
D-二聚体是诊断血栓性疾病标志物，具有较高的灵敏度和特异度。本发明D-二聚体检测试剂盒与适配的全自动化学发光分析仪(曜旋风系列)配套使用能快速有效检测待测样本中D-二聚体水平，有助于临床判断患者是否存在血栓性疾病，尤其适合诊断深静脉血栓、肺栓塞或弥漫性血管内凝血等。
本发明的待测样本为直接获得血浆和全血，也可以是通过抽取人体血样进行分离得到的样本。本发明配合适配的全自动化学发光分析仪(曜旋风全血机系列)可以实现在不添加咪唑条件下进行全血直接检测。
具体检测过程包括：将试剂盒中第一株抗体包被磁性微球和示踪标记物标记第二株抗体分别进行稀释，在本发明的一些具体实施方式中，第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.03～0.08mg/mL制成试剂1，示踪标记物标记第二株抗体稀释到0.5～2μg/mL制成试剂2；在反应杯中依次加入稀释后的试剂以及待测样本或/和校准品，整个加样过程约0.5分钟；将反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；之后将反应杯置于磁性条件下，使用磁性微球清洗液清洗三次，整个过程需要2分钟；向反应杯中加入化学发光激发液并检测光子值；根据反应杯中检测的光强度，仪器自动计算待测样本中D-二聚体的浓度，检验计算过程需要1分钟。由此可见，使用本发明提供的试剂盒在10分钟即可得到检测结果。
检测原理是基于化学发光免疫法，参见图1，第一株DD单抗包被磁珠形成磁珠-抗体复合物(即包被于磁性微球的第一株抗体)，第二株DD单抗和吖啶酯反应形成吖啶酯-抗体复合物(即标记有吖啶酯的第二株抗体)，以上两种复合物以及待测抗原在反应杯充分混匀后可获得磁珠-抗体-抗原-吖啶酯复合物。之后经过清洗、加入化学发光激发液，检测光信号强度，从而获得样本中的D-二聚体浓度。
使用本发明提供的试剂盒能够以高的灵敏度检测样本的D-二聚体浓度，本发明的空白限可达0.033mg/L。本发明的天内精密度可达到3.5～4.5％，线性相关性R＞0.990，与西门子公司的D-二聚体试剂盒有较好的相关性，对深静脉血栓(DVT)及肺栓塞(PE)的阴性排查有重要意义。
实施例
实施例一
本实施例提供了一种D-二聚体检测试剂盒的制备方法和样本中D-二聚体检测方法。
制备1：第一株抗体包被磁性微球
(1)量取10mg磁性微球(平均粒径1.5μm，采购于Bangs Laboratories公司，固含量2.54％)，并混匀于1mL 0.1M的MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)缓冲液中，用磁铁吸附5～10min后，弃去上清，重复上述清洗步骤3～5次，加入1mL 0.1M MES，涡旋混匀；
(2)加入150μg DD单克隆抗体(第一株抗体所识别的DD氨基酸位点的序列为如SEQID NO:1所示的序列)，使磁珠与抗体的质量比为100:1.5，涡旋混匀，37℃孵育1.5h；
(3)加入10μL 10mg/mL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐)，涡旋混匀，37℃孵育1.5h；
(4)取200μL含1％Casein(酪蛋白)的PBS溶液(0.02M)进行封闭，封闭2h；
(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1mL发光恢复液(5g的牛血清白蛋白+400ml的0.025M的Tris-HCl缓冲液溶解+0.1-2‰的Tween-80+100ml新生牛血清)，磁铁吸附5～10min，去上清后，重复上述清洗步骤3～5次。
(6)将上述制备好的磁珠置于1mL的发光恢复液中，2～8℃保存。
制备2：标记吖啶酯的DD单抗溶液的制备
(1)将1mg DD单克隆抗体(第二株抗体所识别的DD氨基酸位点的序列为如SEQ IDNO:4所示的序列)置于0.5mL的离心管内，加入100μL0.05M HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH 8.0)，再加入100μL的溶于DMF的5mg/mL的吖啶酯溶液，使吖啶酯与DD单克隆抗体的摩尔比为15:1，混匀后，室温(避光)反应2h，加入100μL 100mg/ml的赖氨酸溶液，反应30min，终止反应。
(2)将标记物置于透析袋中，用不少于2L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的吖啶酯。
(3)收集透析过后的标记物，加入5％BSA溶液使BSA终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存。
制备3：校准品、质控品的制备
取D-二聚体抗原，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液稀释至15mg/L和0.3mg/L的高低点校准品溶液，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M PBS溶液稀释至10mg/L和0.5mg/L的高低点质控品溶液。
制备4：化学发光底物液的配制
化学发光预底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.1％，HNO3浓度为0.1mol/L。
化学发光预底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为2.0％，NaOH的浓度为0.25mol/L。
制备5：清洗液的配制
本发明所述清洗液为pH值7.4、浓度为0.02mol/L的PBST溶液，其中含质量分数为0.5％的Tween-20。
使用制备1中得到的第一株抗体包被磁性微球，制备2得到的第二株抗体标记吖啶酯，制备3的高低点校准品、质控品，制备4的化学发光底物液和制备5的清洗液制备DD检测试剂盒。
使用该试剂盒与全自动化学发光分析仪(曜旋风系列)，检测样本中的DD浓度。
具体的，按照如下步骤使用全自动化学发光分析仪器测量待测样本中的DD浓度：
1.将制备1中制备的第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.05mg/mL(试剂1)，将制备2制备的吖啶酯标记第二株抗体稀释到1μg/mL(试剂2)；
2.反应杯中依次加入50μL的试剂1和50μL的试剂2；
3.将20μL的待测样本或/和校准品加入反应杯中，整个加样过程需要0.5分钟；
4.反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；
5.置于磁性条件下，使用磁性微球清洗液清洗三次，整个过程需要2分钟；
6.向反应杯中加入100μL的化学发光激发液A后，再加入100μL的化学发光激发液B，并立即检测光子值；
7.根据反应杯中检测的光强度，仪器自动计算待测样本中DD的浓度，整个检验，计算过程需要1分钟。
实施例二
DD检测试剂盒中使用的抗体的配组筛选
本实施例制备1和制备2过程中DD单克隆抗体有四种：抗体1识别氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，抗体2识别氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:2所示的序列，抗体3识别氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:3所示的序列，抗体4识别氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列。
按照实施例一中的磁珠包被和吖啶酯标记方法分别对4种抗体进行包被和标记，得到4种包被DD单抗的磁珠悬浮液和4种标记吖啶酯的DD单抗溶液；再按照实施例一中的测试方法，用4种包被DD单抗的磁珠悬浮液和4种标记吖啶酯的DD单抗溶液制成4种试剂1(试剂1①表示用抗体1包被磁珠，其余类推)和4种试剂2(试剂2①表示标记有吖啶酯的抗体1，其余类推)，试剂1和试剂2相互搭配测试系列浓度值梯度的临床血浆样本，结果如下表1所示。除第一列外的数值显示的是光强度。
表1试剂盒抗体配组筛选测试样本信号值以及相关性
Figure BDA0002391479470000161
根据表1的结果可以看出，①号抗体试剂1与④号抗体试剂2搭配测临床样本的信号值最高而且线性相关性也最好，优选地本发明抗体选择①号抗体进行磁珠包被以及④号抗体进行吖啶酯标记来制备试剂盒。也可以选择②号抗体进行磁珠包被以及③号抗体进行吖啶酯标记来制备试剂盒，通过工艺优化以提高信号值。
实施例三
本实施例提供了第一株抗体包被磁性微球的制备过程中第一株DD单克隆抗体和磁性微球偶联时间的筛选过程。
实施例3采用与实施例1基本相同的制备1过程。与实施例1的制备1过程相比，实施例3主要改变制备1中步骤(2)的孵育时间。实施例3在制备1的步骤(2)中分别采用30min或1h或1.5h作为孵育时间。将实施例3中制备所得的三种第一株抗体包被磁性微球，分别和实施例1制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯组合，测试系列浓度的校准品，结果如表2所示：
表2第一株DD单克隆抗体和磁性微球偶联时间的筛选结果
Figure BDA0002391479470000171
结果显示，偶联时间从0.5h增加到1h信号值明显增加，偶联时间从1h增加到1.5h信号值基本没变化，说明偶联时间到1h时可能已经达到了平衡。因而，在本发明试剂盒的第一株抗体包被磁性微球的制备过程中，可选择1h和1.5h，但为了保留一定的误差控制空间，优选的偶联时间为1.5h。
实施例四
本实施例提供了示踪标记物标记步骤中缓冲液pH的筛选过程。
实施例4采用与实施例1基本相同的制备2过程。与实施例1的制备2过程相比，本实施例主要改变制备2的步骤(1)的缓冲液种类。本实施例在制备2的步骤(1)中分别采用0.05M HEPES缓冲液(pH 7.5)，0.05M HEPES缓冲液(pH 8.0)，0.05M HEPES缓冲液(pH8.5)。将本实施例中制备所得的三种标记吖啶酯的DD单抗溶液，分别和实施例1的制备1所得的DD单抗的磁性微球悬浮液组合，测试系列浓度的校准品，结果如下表所示：
表3吖啶酯标记缓冲液pH的筛选结果
Figure BDA0002391479470000181
由表3的结果显示，随着0.05M HEPES pH从7.5变化到8.5过程中，信号值变化不明显，在本发明试剂盒的标记吖啶酯的DD单抗溶液制备过程中缓冲液pH，可选择7.5、8.0和8.5，但为了保留一定的误差控制空间，优选的标记缓冲液pH为8.0。
实施例五
本实施例提供了校准品稀释液制备过程中稀释液缓冲液的筛选过程。
本实施例采用常规缓冲液0.05M PBS(pH 7.1)，0.05M HEPES(pH 8.0)，0.05MTris-HCl(pH 9.0)作为稀释液，分别将DD抗原稀释释为六个不同浓度的抗原稀释液，进行37℃破坏七天对比试验。将本实施例中制备所得的抗原稀释液分别和实施例1的制备1所得的DD单抗的磁性微球悬浮液，制备2所得的标记吖啶酯的DD单抗溶液组合，分别测试37℃加速7天实验，结果如表4所示。
由表4的结果显示，可以看出0.05M PBS(pH 7.1)的校准品稀释液的37℃加速稳定性最好，因此在本发明的试剂盒的校准品稀释液缓冲液优选0.05M PBS(pH 7.1)。
表4校准品稀释液制备过程中稀释液缓冲液的筛选结果
Figure BDA0002391479470000191
实施例六
本实施例提供了校准品稀释液制备过程中蛋白稳定剂的筛选过程。
本实施例采用0.05M PBS(pH 7.1)，分别向缓冲体系中加入2.5％的BSA，酪蛋白水解物，以及复合酶稳定剂AES，按相同的比例，分别稀释为六个不同浓度的抗原稀释液，进行37℃破坏七天对比试验。将本实施例中制备所得的抗原稀释液分别和制备1所得的DD单抗的磁性微球悬浮液，制备2所得的标记吖啶酯的DD单抗溶液组合，分别测试37℃加速7天实验，结果如下表所示：
表5校准品稀释液制备过程中蛋白稳定剂的筛选结果
Figure BDA0002391479470000192
由表5的结果显示，使用牛血清白蛋白BSA作为蛋白稳定剂，稳定性整体优于其他两组，破坏七天，发光值下降幅度小，因此本试剂盒优选的使用牛血清白蛋白作为抗原稀释液的蛋白稳定剂。
实施例七
本发明实施例1获得的试剂盒的性能测试。
(1)空白限的检测
重复检测空白样本(样本稀释液)20次，再根据检测结果，利用公式计算空白限，结果见表6-表7。
表6初始校准曲线的检测结果
RLU 浓度mg/L
S0 173 0
S1 3233 0.3
S2 10972 1
S3 47578.5 5
S4 106921.5 10
S5 394765.5 40
根据零浓度校准品(S0)和相邻的校准品(S1)之间的浓度-化学发光(RLU)值的结果进行两点回归拟合得出一次方程，再将20孔空白样本(S0)检测获得的Mean+2SD所对应的RLU值代入上述方程，所获得的浓度值，即为分析灵敏度，本发明的空白限可达到0.033mg/L，低于前述专利文献1(通过对该文献数据重新计算其灵敏度为0.044mg/L)。
表7空白限的检测结果
Figure BDA0002391479470000201
(2)天内精密度的检测
重复检测高、低质控品各10次，再根据检测结果，计算CV，结果见表8，浓度单位为mg/L。
表8天内精密度的检测结果
Figure BDA0002391479470000202
Figure BDA0002391479470000211
本发明的天内精密度可达到3.5％和4.3％。
(3)线性相关性的检测
检测线性样本(每个样本测试三次)，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数，结果见表9及图2，浓度单位为mg/L。
本发明的线性相关性R>0.990，线性范围能达到0.08-40mg/L。检测线性样本(每个样本测试三次)，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数。其中，理论浓度为校准品根据理论稀释比例计算的浓度，而实测值为利用本发明测试的实际。图2表明线性相关性良好。
表9线性相关性的检测结果
Figure BDA0002391479470000212
(4)方法学比对
从医院收集当天的有西门子系统测值的D-二聚体检测血浆样本，使用本发明的试剂盒检测上述样本，以医院值为横坐标，本发明试剂盒检测值作为纵坐标建立线性相关图，检测结果见图3。使用本发明的试剂盒检测103例西门子测值样本，发现相关性较好，整体相关性R值可达0.9953，阴性符合率96％，阳性符合率100％。可见，本发明的试剂盒与国内外公认的西门子D-二聚体试剂盒有较好的相关性，对深静脉血栓(DVT)及肺栓塞(PE)的阴性排查有重要意义。
表10方法学比对的结果
Figure BDA0002391479470000221
(5)参考值
本发明的参考值是建立在120份来源于正常人的血浆样本的基础上的，检测数据见表11。
表11正常人检测结果
Figure BDA0002391479470000231
(6)稳定性研究
将试剂盒组分中的试剂1、试剂2以及校准品放入35-37℃烘箱中7天，测试7天加速稳定性与4℃试剂的相对偏差，结果如表12所示。
表12加速稳定性结果
Figure BDA0002391479470000232
根据表12所示结果，本发明试剂盒所有组分在35-37℃中加速7天后的信号值与4℃放置的试剂相对偏差在±15％以内，试剂盒的稳定性表现很好。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海奥普生物医药股份有限公司
<120> 一种D-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Pro Trp Met Leu Ser Lys Gln Pro Arg Ala Lys Ala Glu Glu Phe
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ile Arg His Asp Gly Gly Asp Phe Ser Ser Glu Ser Ala
20 25 30
Pro Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Lys Phe Ala Lys Ala Val Gln His
35 40 45
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Phe Ser Met Leu Ser Gly Asp Phe Pro Arg Ala Glu Phe Phe Gly
1 5 10 15
Lys Phe Ala Lys Ile Arg His Gln Ser Ser Glu Ser Ala Pro Gly Leu
20 25 30
Asp Gly Lys Lys Ala Glu Ala Val Gln His
35 40
<210> 3
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Gln Arg Glu Leu Tyr His Arg Ser Thr Ser Leu Asn Ser Val Asp
1 5 10 15
Ile Phe Leu Asn Gln Pro Gln Gln Pro Thr Gln Ile Phe Val Ser Lys
20 25 30
Ala Val Ala Pro
35
<210> 4
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Asn Lys Ala Val Gln Tyr His Arg Ser Thr Ser Val Ser Arg Glu
1 5 10 15
Leu Val Asp Ile Phe Leu Asn Gln Gln Ile Phe Val Pro Gln Gln Pro
20 25 30
Thr Ser Ala Pro
35

Claims (10)

1.一种D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一株抗体、标记有示踪标记物的第二株抗体和校准品；所述第一株抗体和所述第二株抗体所识别的D-二聚体的特异性结合位点不同；所述校准品包括含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述示踪标记物为吖啶酯。
3.根据权利要求1或2的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述第一株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列，所述第二株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3所示的序列，优选地，所述第一株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述第二株抗体所识别的D-二聚体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述磁性微球和第一株抗体的质量比为100:1～2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒不包含咪唑成分。
6.根据权利要求1-5任一项所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控品、磁珠清洗液和化学发光底物液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
磁性微球包被步骤：将所述第一株抗体包被于所述磁性微球上；
示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二株抗体上；
配制校准品步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在所述磁性微球包被步骤中第一株抗体和磁性微球的偶联时间为1～2小时，进一步优选1～1.5小时，最优选1.5小时。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，在所述示踪标记物标记步骤中使用的抗体偶联缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，其pH值为7.5～8.5。
10.根据权利要求1-6任一项所述的D-二聚体检测试剂盒在制备用于诊断血栓性疾病如深静脉血栓、肺栓塞或弥漫性血管内凝血的试剂中的应用。
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