CN115236341A - 一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法。该检测方法包括以下步骤：将待测样品与发光标记物‑生物标志物多抗及链霉亲和素磁珠‑生物素‑单抗混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，通过检测光强度值，计算得到待测样品中的生物标志物的浓度。本发明将免疫磁珠富集法及化学发光联合使用形成免疫磁珠化学发光检测法，以实现外周血术后脑卒中生物标志物胶质细胞纤维酸性蛋白和泛素C末端水解酶L1的高灵敏分析，用于早期预测术后脑卒中的发生。

Description

一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法及用途
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法及用途。
背景技术
术后脑卒中一般指术后30天内，发生的缺血性或出血性脑血管事件。其高风险手术类型包括：颈动脉手术、心肺转流、心脏手术、主动脉手术等。心脏手术和颈动脉手术术后脑卒中发生率为4-5％，而心脏瓣膜置换术术后脑卒中的风险可达10％。在非心脏、非血管和非神经外科的手术中，术后脑卒中的发生率为0.08％–0.7％。隐匿性脑卒中可能是显性脑卒中的早期病变，如不早期发现，部分可进展为显性脑卒中，从而致残、致死；隐匿性脑卒中也可直接导致术后认知功能障碍，延长患者住院时间，降低生活质量，增加死亡率。术后显性脑卒中多发生于术后6天内，高峰在术后40h，术后隐匿性脑卒中可能出现更早。但由于术中监测多以循环、氧和为主，尚缺乏确切的脑卒中术中监测设备；同时，由于术中药物的影响，患者活动受限，麻醉医生往往难以及时发现术后脑卒中，更无法预测是否会进展为术后脑卒中。
目前，脑卒中的诊断多在患者出现明显症状后，采用多层颅脑CT和MRI影像技术诊断。CT多用于脑卒中的初步诊断，不易发现6h内的微小病灶。MRI更利于脑卒中的早期诊断，出现了DWI、磁敏感加权成像(SWI)、酰胺质子转移(APT)成像、静息态功能磁共振(rs-fMRI)等新兴技术，可提高脑卒中早期诊断的灵敏度、特异度。DWI技术对于缺血性脑卒中的早期变化更敏感和特异，但仅能发现≥3mm的部分隐匿性脑卒中病灶；SWI对脑内微血管出血的敏感性更高，但是亚急性血肿的复杂构造会导致SWI的信号产生变化从而影响检测的准确性；APT成像、rs-fMRI等新兴技术仍处于研究阶段，尚未在临床上广泛使用；MRI检测费用昂贵、耗时长、需避免金属磁场作用、难以床旁监测等，难以推广开展为术后脑卒中的预防性普查检测。
相对于影像学检查，血清学检查价格低廉、方便及时，广泛应用于疾病的早期筛查。脑卒中生物标志物对于早期预测术后脑卒中有重要价值，其中，胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)和泛素C末端水解酶L1(UCHL1)分别由星形胶质细胞、神经元损伤释放入血，表现出良好的脑组织特异性。二者外周血含量达峰时间不同，GFAP于脑卒中症状出现后2至6h内显著升高，而UCHL1于脑卒中症状出现后3h内显著升高。GFAP与UCHL1在脑卒中的预测中可以互补，从而反映不同的损伤和病理生理机制。目前GFAP和UCHL1多用于患者出现临床症状后，急诊脑卒中的诊断与预后分析，尚未用于预测术后脑卒中的发生。根据术后隐匿性脑卒中的高发生率及病理机制，GFAP和UCHL1可能早期就有微量入血，但受限于检测的灵敏性而无法被及时检测。
纳米磁珠化学免疫检测法广泛用于临床甲状腺项目、肿瘤标志物、性激素类、肝炎系列、心脏功能等多种低浓度外周血生化指标的检测，但目前尚未见有用于检测外周血术后脑卒中生物标志物。
发明内容
基于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，该生物标志物为胶质细胞纤维酸性蛋白、泛素C末端水解酶L1中的一种或两种，该方法为：将待测样品与发光标记物-生物标志物多抗及链霉亲和素磁珠-生物素-单抗混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，通过检测光强度值，计算得到待测样品中的生物标志物的浓度；
其中，所述发光标记物-生物标志物多抗是将生物标志物多抗与发光标记物混合反应后得到；
所述链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗是将生物标志物单抗与生物素混合，避光反应，得到生物标志物-生物素-单抗；再将所述生物标志物-生物素-单抗与链霉亲和素磁珠充分混合孵育，去除上清液后得到。
优选地，包括以下步骤：
发光标记物-生物标志物多抗制备：
将生物标志物多抗与发光标记物混合，在37℃避光反应0.5h，将反应液在4℃条件下用PBS避光透析以去除未结合的发光标记物，得到所述发光标记物-生物标志物多抗；
链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗制备：
将生物标志物单抗与生物素混合，在37℃下避光反应1h，将反应液在4℃条件下用PBS避光透析以去除未结合的生物素，得到生物标志物-生物素-单抗；
将所述生物标志物-生物素-单抗与链霉亲和素磁珠混合反应，磁性分离去除上清液，得到所述链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗；
样品中生物标志物浓度检测：
将待测样品与所述发光标记物-生物标志物多抗及所述链霉亲和素磁珠-生物标志物生物素-单抗混匀孵育，检测反应产物的光强度值，再根据预先建立的生物标志物的浓度与反应产物的光强度值之间的关系的标准曲线，计算得到待测样品中的生物标志物的浓度。
优选地，所述生物标志物单抗与所述生物素的摩尔比为1∶10～20；
所述生物标志物-生物素-单抗与质量浓度为10mg/mL链霉亲和素磁珠溶液的体积比为5∶1；
所述生物标志物多抗与所述发光标记物的摩尔比为1∶5～15。
优选地，所述发光标记物为吖啶酯。
优选地，当生物标志物存在泛素C末端水解酶L1时，标准曲线的绘制方法为：
取泛素C末端水解酶L1标准品制备浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/m的标准品溶液，向不同浓度标准品溶液中分别加入所述发光标记物-泛素C末端水解酶L1多抗及所述链霉亲和素磁珠-泛素C末端水解酶L1-生物素-单抗，混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，检测光强度，绘制泛素C末端水解酶L1浓度-强度标准曲线；
所述标准品溶液与所述链霉亲和素磁珠-泛素C末端水解酶L1-生物素-单抗、质量浓度0.2μg/mL的所述发光标记物-泛素C末端水解酶L1多抗的体积比为2∶1∶1。
优选地，当生物标志物存在胶质细胞纤维酸性蛋白时，标准曲线的绘制方法为：
取胶质细胞纤维酸性蛋白标准品制备浓度分别为0ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/m的标准品溶液，向不同浓度标准品溶液中分别加入所述发光标记物-胶质细胞纤维酸性蛋白多抗及所述链霉亲和素磁珠-胶质细胞纤维酸性蛋白-生物素-单抗，混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，检测光强度，绘制胶质细胞纤维酸性蛋白浓度-强度标准曲线；
所述标准品溶液与所述链霉亲和素磁珠-胶质细胞纤维酸性蛋白-生物素-单抗、质量浓度0.2μg/mL的所述发光标记物-胶质细胞纤维酸性蛋白多抗的体积比为2∶1∶1。
优选地，所述孵育是在37℃下孵育15～20min。
优选地，所述链霉亲和素磁珠是按照以下方法制备得到：
用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基磁珠表面羧基后，磁性分离得到活化磁珠；将活化磁珠与链霉亲和素混合，在室温下反应2h，磁性分离去除上清后，加入乙酰胺与吐温-20的混合封闭液，在室温下反应2h，磁性分离去除上清液并洗涤磁珠，得到所述链霉亲和素磁珠。
优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基磁珠的质量比为1∶1；
所述羧基磁珠与所述链霉亲和素的质量比为20～40∶1；
所述乙酰胺与吐温-20的混合封闭液为含质量分数0.5％乙酰胺的吐温-20溶液。
本发明还提供一种所述检测方法在外周血术后脑卒中生物标志物检测及早期术后脑卒中预测中的用途。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明采用免疫磁珠化学发光分析法高灵敏检测UCHL1、GFAP，免疫磁珠富集法及化学发光的高灵敏检测优势互补，联合使用形成免疫磁珠化学发光检测法(简称UGCLIA法)，以实现外周血术后脑卒中生物标志物UCHL1、GFAP的高灵敏分析，用于早期预测术后脑卒中的发生。
2、本发明利用免疫磁珠化学发光检测技术的高灵敏特性，检测外周血神经元、星形胶质细胞特异性蛋白UCHL1与GFAP，作为预防术后脑卒中的筛查检测，以降低术后脑卒中的发生率、严重程度；含有高风险疾病、围术期特殊处理、高风险手术的术后脑卒中高危患者，均可进行术后UCHL1、GFAP外周血检测，且检测费用低廉，能够大大减轻患者的经济负担，具有较大的社会价值。
3、本发明提供的链霉亲和素磁珠制备方法简单，在降低生产成本的同时，具有良好的超顺磁性、磁响应性、均一性、单分散性、重悬性，同时可以实现良好的特异蛋白捕获及富集功能，可与化学放光多抗结合，用于本发明提供的免疫磁珠化学发光检测技术。
附图说明
图1是链酶亲和素磁珠磁性检测；A、置于磁铁架；B、撤离磁铁架后分散；
图2是Bradford法测定UCHL1、GFAP抗原浓度标准曲线；
图3是UGCLIA法标准曲线及相关系数；A、UCHL1；B、GFAP；
图4是UGCLIA法最低检测值计算；A、UCHL1最低检测线；B、GFAP最低检测线；
图5是UGCLIA法诊断患者脑出血ROC曲线；A、UCHL1；B、GFAP；
图6是UCHL1、GFAP联合诊断脑出血ROC曲线。
具体实施方式
下面通过结合具体实施案例进一步对本发明进行进一步详细说明。各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施案例所描述的具体实施例仅用以解释本发明而用于限定本发明。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、时间、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想效果的不同而加以改变。
本发明提供一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，该生物标志物为胶质细胞纤维酸性蛋白、泛素C末端水解酶L1中的一种或两种，该方法为：将待测样品与发光标记物-生物标志物多抗及链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，通过检测光强度值，计算得到待测样品中的生物标志物的浓度；
其中，所述发光标记物-生物标志物多抗是将生物标志物多抗与发光标记物混合反应后得到；
所述链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗是将生物标志物单抗与生物素混合，避光反应，得到生物标志物-生物素-单抗；再将所述生物标志物-生物素-单抗与链酶亲和素磁珠充分混合孵育，去除上清液后得到。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：链霉亲和素磁珠制备：
①取100uL(10mg/mL)羧基磁珠到1mL离心管中，加磁场去上清，用200μL0.1M2-(N-吗啉代)乙烷磺酸水溶液，用PH5.0、0.05％吐温-20(MEST)重悬，清洗2次；②加入100μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mg/mL，以MEST为溶剂)，活化羧基磁珠，混匀后置于室温反应30分钟，保持磁珠悬浮；③加50μg链霉亲和素(1mg/mLMEST稀释)，混匀后置于室温反应2小时，保持磁珠悬浮；④加磁场去上清，用200μLMEST清洗3次，加100μL封闭液(含0.5％BSA的MEST)，混匀后置于室温反应2小时，保持磁珠悬浮；⑤加磁场去上清，用200μLPBST(0.01M的PBS，PH0.74，0.05％吐温-20)清洗3次；⑥加100μLPBST重悬，加0.05％procline300置于4℃保存。
磁性和重悬性：将0.25mg/mL链霉亲和素磁珠加磁场，观察其是否能迅速聚集，再撤离磁场，柔和充分混匀，观察其是否能完全分散。
如图1所示，对0.25mg/mL工作浓度链霉亲和素磁珠加磁后，液体中的磁珠能迅速聚集，8秒钟左右绝大部分都聚集；撤离磁场，充分混匀后，能完全分散，没有集结的颗粒；静止放置，15分钟内没有显著沉降，说明链霉亲和素磁珠具有良好的超顺磁性、磁响应性、均一性、单分散性、重悬性。
免疫效能初步验证：苏州汉思克生物β-HCG化学发光试剂盒标内含β-HCG生物素单抗、β-HCG吖啶酯多抗，标配为进口Dynal链霉亲和素磁珠(Thermo)，为验证本发明制备的链霉亲和素磁珠的免疫效能，以标配Dynal链霉亲和素磁珠做对照，各取两种10mg/mL磁珠，以相同比例稀释(1∶40)，按β-HCG试剂说明书进行操作，检测0、20、2000mIU/mL三个浓度点，每点做两个平行测试β-HCG浓度，并计算20、2000mIU/mL浓度与0mIU/mL浓度测量值的比值。结果见表1。
表1链霉亲和素磁珠免疫反应效果
Figure BDA0003772720400000091
如表1所示，本发明链霉亲和素磁珠与阳性对照Dynal链霉亲和素磁珠对相同浓度β-HCG化学发光的检测数据相近，与空白浓度光强比值可实现相同量级，偏差值均<15％，说明本发明磁珠可以实现良好的特异蛋白捕获及富集功能，可与化学放光多抗结合，与同类进口磁珠相比，化学发光免疫反应的效果差异很小，可用于磁珠/吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立。
步骤2：检测方法建立：
具体是按照以下步骤进行：
1、UCHL1或GFAP生物素-单抗制备：取100μgUCHL1单抗，稀释至1mg/mL，按1∶20分子比加入已活化的生物素，混匀，37℃避光反应1h，将溶液移至透析袋中(2KD孔径)，在4℃条件下，用PBS透析(避光)20小时左右，换液6次，每次不少于0.5L，去除未结合的生物素，取出UCHL1生物素-单抗，加质量浓度1％BSA和质量浓度0.05％procline300置于2-8℃保存备用。
同样方法制备GFAP生物素-单抗。
2、链霉亲和素磁珠-生物素-抗体复合物制备：
取1mL抗体稀释液(由0.01M的PH7.4PBS、1％BSA、0.05％procline300配制而成)，加入100μL链霉亲和素磁珠(10mg/mL，加之前充分混匀)，混匀后加磁场，去上清，再加入1mL抗体稀释液，混匀重悬磁珠；加入20uL UCHL1生物素-单抗(过量)，混匀后置于室温反应20分钟(震摇，保持磁珠悬浮)，加磁场，去上清；再加1mL抗体稀释液清洗磁珠一次，混匀重悬磁珠，再加磁场，去上清；再清洗一次；最后加入4mL抗体稀释液重悬链霉亲和素磁珠-UCHL1生物素-单抗，置于4℃备用。同样方法制备链霉亲和素磁珠-GFAP生物素-单抗。
3、免疫磁珠化学发光检测法(简称UGCLIA法)标准曲线绘制：
3.1、UCHL1或GFAP吖啶酯-多抗
取100μgUCHL1多抗，稀释至浓度约1mg/mL，按1∶15分子比加入吖啶酯，37℃避光反应0.5h，将溶液移至透析袋中(2KD孔径)，在4℃条件下，用PBS透析(避光)20h，换液6次，每次不少于0.5L，去除未结合的吖啶酯，取出吖啶酯-UCHL1多抗，加1％BSA和0.05％procline300备用。
同样方法制备吖啶酯-GFAP多抗。
3.2、UCHL1或GFAP标准品定值
用Bradford试剂盒(碧云天公司)测定，按说明书操作，制作标准曲线(确保R值>0.99)，再用PBS分别1：2和1：4稀释UCHL1抗原，用酶标仪测量595nm处吸光度(OD)值，代入标准曲线计算对应浓度值(注意乘以稀释倍数)，所得两个浓度值取平均值即为UCHL1抗原原液浓度值。
同样方法测量GAFP抗原浓度。
3.3、UGCLIA法标准曲线及相关系数
用标准品稀释液和已经定值的抗原，按设定的浓度分别配制UCHL1和GFAP的系列浓度点。UCHL1标准品各点浓度依次设为：0ng/mL(A点)、5ng/mL(B点)、20ng/mL(C点)、50ng/mL(D点)、100ng/mL(E点)、200ng/mL(F点)；GFAP标准品各点浓度依次设为0ng/mL(A点)、4ng/mL(B点)、10ng/mL(C点)、20ng/mL(D点)、50ng/mL(E点)、100ng/mL(F点)。标准点A做10个平行管，B-F标准点做3个平行管，共25个反应管。各反应管分别加入50μL链霉亲和素磁珠-生物素抗体复合物、50μL(0.2μg/mL)吖啶酯-多抗、100μL相应浓度点校准品，充分混匀后，37℃孵育15min，磁性分离弃上清，加300μL洗液(PBS，含吐温-20)混匀，加磁后弃上清，重复三次。加激发液A(为0.1mol/LHNO3溶液，其中含有1％H2O2)，重悬混匀磁珠，将反应管依次放置于半自动发光仪的检测舱内，关闭舱门后，仪器自动将激发液B(为0.1mol/LNaOH溶液)泵入到反应管内，半自动化学发光检测仪检测光信号并显示相对光强度值(RLU值)。以双对数模型拟合剂量-反应曲线，以标准品浓度的对数为横坐标，以每个标准品的平均RLU值的对数为纵坐标作散点图，标示出曲线方程和线性相关系数R值，行业标准为R值≥0.990。
UCHL1、GFAP抗原浓度标准曲线如图2所示，UCHL1、GFAP抗原浓度如表2所示。
表2Bradford法测定UCHL1、GFAP抗原浓度
Figure BDA0003772720400000111
结合图2及表2可知，Bradford法在595nm处OD值与UCHL1、GFAP蛋白浓度标准方程分别为y＝0.7878x+0.5498、y＝0.8979x+0.6594，相关性均>0.99,说明均具有良好得线性关系。原液稀释2倍、4倍后测得的原液浓度均值分别为1.023mg/mL、1.161mg/mL。
UGCLIA法标准曲线及相关系数如图3所示。UCHL1标准曲线方程为y＝0.8037x+0.4068，R2＝0.9962，计算得R＝0.9981，GFAP标准曲线方程为y＝0.8362x+0.3467，R2＝0.9949，计算得R＝0.9974，行业标准一般要求是R值不小于0.990，所以两条标准曲线均满足要求。
实施例2
一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，与实施例1的不同在于：取100μgUCHL1单抗，稀释至1mg/mL，按1∶20分子比加入已活化的生物素，混匀，37℃避光反应1h。
实施例3
一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，与实施例1的不同在于：取100μgUCHL1多抗，稀释至浓度约1mg/mL，按1∶5分子比加入吖啶酯，37℃避光反应0.5h。
实施例4
一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，与实施例1的不同在于链霉亲和素磁珠的制备过程不同，具体为：取200uL(10mg/mL)羧基磁珠到1mL离心管中，加磁场去上清，用200μL0.1M2-(N-吗啉代)乙烷磺酸水溶液，用PH5.0、0.05％吐温-20(MEST)重悬，清洗2次；②加入100μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mg/mL，以MEST为溶剂)，活化羧基磁珠，混匀后置于室温反应30分钟，保持磁珠悬浮。
由于实施例1～4提供的方法的检测效果基本相同，故以下仅以实施例1为例对本发明提供的检测方法的检测效果进行说明。
UGCLIA法性能评价
1、未知浓度检测、最低检测值
准备待测样本，按如上标准品的磁吸附化学发光检测流程进行测定，得到每个样本的RLU值，代入到标准曲线方程，即可得到每个样本的浓度值。计算10个A点RLU值的平均值与标准差，将平均值与2倍标准差之和代入A点与B点的直线方程(RLU均值与对用浓度的直线方程)求得对用浓度值，即是本分析方法的最低检测限。UCHL1标准品A点、B点浓度分别为0ng/mL、5ng/mL，GFAP标准品A点、B点浓度分别为0ng/mL、4ng/mL。结果见图4及表3。
表3UGCLIA法基本性能指标
Figure BDA0003772720400000131
图4、表3所示为UCHL1、GFAP最低检测线，UCHL1标准曲线方程为y＝1.832x+0.34，GFAP标准曲线方程为y＝1.585x+0.39。计算10个UCHL1A点RLU值的平均值为0.34与标准差0.08，将平均值与2倍标准差之和代入A点与B点的直线方程(RLU均值与对应浓度的直线方程)求得浓度值，即为UCHL1最低检测值0.09ng/mL。计算10个GFAP点RLU值的平均值为0.39与标准差0.10，将平均值与2倍标准差之和代入A点与B点的直线方程(RLU均值与对应浓度的直线方程)求得浓度值，即为GFAP最低检测值0.13ng/mL。
2、批内精密度与准确度
用标准品稀释液和定值抗原分别足量配制UCHL1和GFAP的高值质控品与低值质控品，UCHL1的高值质控品与低值质控品浓度分别为30ng/mL、120ng/mL，GFAP的高值质控品与低值质控品浓度分别为15ng/mL、60ng/mL，按磁吸附化学发光检测流程进行检测，高值质控品与低值质控品各做20个平行测试。
计算各组20个RLU值变异系数(CV％)：
CV％＝(标准差/平均值)×100％ (公式1)
取每组20个RLU值的前两个用于计算准确度，计算其平均值，将平均值代入标准曲线方程求得浓度值，准确度用相对误差表示：
相对误差＝(测定值-理论值)/理论值×100％ (公式2)
结果如表3所示。
如表3所示，UCHL1磁珠/吖啶酯化学发光免疫分析方法批内30ng/mL低值质控品变异系数为9.46％，120ng/mL高值质控品变异系数为8.63％；低值相对误差为5.54％，高值质控品相对误差为5.04％。GFAP磁珠/吖啶酯化学发光免疫分析方法批内30ng/mL低值质控品变异系数为8.24％，120ng/mL高值质控品变异系数为9.52％；低值相对误差为6.88％，高值质控品相对误差为1.19％。UCHL1、GFAP磁珠/吖啶酯化学发光免疫分析方法手动操作批内变异系数均≤15％行业一般标准要求，相对误差均≤10％行业一般标准要求，说明本发明提供的UCHL1、GFAP磁珠/吖啶酯化学发光免疫分析方法具有良好精密度和准确度。
3、蛋白检测特异性
以标准品稀释液为基质，分别加10mg/mL的BSA、20mg/mL的人IgG和5mg/mL人IgM，三份样本按本发明提供的磁吸附化学发光检测流程进行检测并计算UCHL1、GFAP浓度。结果如表4所示。
表4UGCLIA法蛋白识别特异性
Figure BDA0003772720400000151
如表4所示，对于测量已知不含UCHL1和GFAP的10mg/mLBSA、20mg/mL人IgG和5mg/mL人IgM标准品稀释液，UCHL1、GFAP两项的检测值均小于2ng/ml，具有良好特异性。
4、脑出血患者诊断灵敏性、特异性
选择西安交通大学第一附属医院10例急诊脑出血拟行全麻患者、10例无脑部疾病患者术前血清，急诊入手术室后抽取静脉血3mL，离心取血清备用。选择无脑血管疾病ASAI-II级患者10例，入手术室后抽取静脉血3mL，离心取血备用。每位患者各取6份50μL血清，采用UGECLIA法检测UCHL1、GFAP含量，并将用均数±标准差表示蛋白含量，以是否脑出血标记对应含量，制作ROC曲线，采用拟合曲线，计算UCHL1、GFAP指标预测脑卒中的灵敏性与特异性。结果如图5-6所示。
如图5-6所示UGCLIA法诊断脑出血患者，UCHL1截点值为10pg/mL，GFAP截点值为140pg/mL。单独诊断UCHL1曲线下面积为0.666、灵敏度0.661、特异度0.643；单独诊断GFAP曲线下面积为0.798、灵敏度0.768、特异度0.786；联合诊断GFAP曲线下面积为0.841、灵敏度0.821、特异度0.857。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种外周血术后脑卒中生物标志物的检测方法，其特征在于，该生物标志物为胶质细胞纤维酸性蛋白、泛素C末端水解酶L1中的一种或两种，该方法为：将待测样品与发光标记物-生物标志物多抗及链霉亲和素磁珠-生物素-单抗混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，通过检测光强度值，计算得到待测样品中的生物标志物的浓度；
其中，所述发光标记物-生物标志物多抗是将生物标志物多抗与发光标记物混合反应后得到；
所述链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗是将生物标志物单抗与生物素混合，避光反应，得到生物标志物-生物素-单抗；再将所述生物标志物-生物素-单抗与链霉亲和素磁珠充分混合孵育，去除上清液后得到。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
发光标记物-生物标志物多抗制备：
将生物标志物多抗与发光标记物混合，在37℃避光反应0.5h，将反应液在4℃条件下用PBS避光透析以去除未结合的发光标记物，得到所述发光标记物-生物标志物多抗；
链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗制备：
将生物标志物单抗与生物素混合，在37℃下避光反应1h，将反应液在4℃条件下用PBS避光透析以去除未结合的生物素，得到生物标志物-生物素-单抗；
将所述生物标志物-生物素-单抗与链霉亲和素磁珠混合反应，磁性分离去除上清液，得到所述链霉亲和素磁珠-生物标志物-生物素-单抗；
样品中生物标志物浓度检测：
将待测样品与所述发光标记物-生物标志物多抗及所述链霉亲和素磁珠-生物标志物生物素-单抗混匀孵育，检测反应产物的光强度值，再根据预先建立的生物标志物的浓度与反应产物的光强度值之间的关系的标准曲线，计算得到待测样品中的生物标志物的浓度。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述生物标志物单抗与所述生物素的摩尔比为1∶10～20；
所述生物标志物-生物素-单抗与质量浓度为10mg/mL链霉亲和素磁珠溶液的体积比为5∶1；
所述生物标志物多抗与所述发光标记物的摩尔比为1∶5～15。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述发光标记物为吖啶酯。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，当生物标志物存在泛素C末端水解酶L1时，标准曲线的绘制方法为：
取泛素C末端水解酶L1标准品制备浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/m的标准品溶液，向不同浓度标准品溶液中分别加入所述发光标记物-泛素C末端水解酶L1多抗及所述链霉亲和素磁珠-泛素C末端水解酶L1-生物素-单抗，混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，检测光强度，绘制泛素C末端水解酶L1浓度-强度标准曲线；
所述标准品溶液与所述链霉亲和素磁珠-泛素C末端水解酶L1-生物素-单抗、质量浓度0.2μg/mL的所述发光标记物-泛素C末端水解酶L1多抗的体积比为2∶1∶1。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，当生物标志物存在胶质细胞纤维酸性蛋白时，标准曲线的绘制方法为：
取胶质细胞纤维酸性蛋白标准品制备浓度分别为0ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/m的标准品溶液，向不同浓度标准品溶液中分别加入所述发光标记物-胶质细胞纤维酸性蛋白多抗及所述链霉亲和素磁珠-胶质细胞纤维酸性蛋白-生物素-单抗，混匀孵育，磁性分离弃上清并洗涤磁珠，分散磁珠后，检测光强度，绘制胶质细胞纤维酸性蛋白浓度-强度标准曲线；
所述标准品溶液与所述链霉亲和素磁珠-胶质细胞纤维酸性蛋白-生物素-单抗、质量浓度0.2μg/mL的所述发光标记物-胶质细胞纤维酸性蛋白多抗的体积比为2∶1∶1。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述孵育是在37℃下孵育15～20min。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠是按照以下方法制备得到：
用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基磁珠表面羧基后，磁性分离得到活化磁珠；将活化磁珠与链霉亲和素混合，在室温下反应2h，磁性分离去除上清后，加入乙酰胺与吐温-20的混合封闭液，在室温下反应2h，磁性分离去除上清液并洗涤磁珠，得到所述链霉亲和素磁珠。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述羧基磁珠的质量比为1∶1；
所述羧基磁珠与所述链霉亲和素的质量比为20～40∶1；
所述乙酰胺与吐温-20的混合封闭液为含质量分数0.5％乙酰胺的吐温-20溶液。
10.一种权利要求1～9任一项所述检测方法在外周血术后脑卒中生物标志物检测及早期术后脑卒中预测中的用途。
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