CN108387743A - 一种检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片及其检测方法 - Google Patents
一种检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片及其检测方法，属于体外诊断检测技术领域，该检测法的特征是通过液相芯片的制备，形成“生物素标记的检测抗体‑缺陷型精神分裂症蛋白标志物‑捕获抗体‑微球”的四联复合体，将四联复合体与链霉亲和素‑藻红蛋白结合后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中与缺陷型精神分裂症相关蛋白标志物的存在及含量，本发明所述的方法具有灵敏度高、检测快速、所需样本量少，特异性强、高通量等优点，能够对多种缺陷型精神分裂症相关蛋白标志物同时进行定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断检测技术领域，具体涉及一种外周血蛋白标志物的筛查方法，特别是涉及多种缺陷型精神分裂症相关蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法。
背景技术
精神分裂症(Schizophrenia，SCH)是最严重的临床常见精神疾病之一，多青壮年起病且病程迁延，具有感知、思维、情感、行为等多方面的障碍，严重损害患者社会功能与生存质量。2009年Lancet报道我国精神病性障碍(主要为SCH)终生患病率为1％，估计罹患SCH人数为1,300万，我国精神科住院患者中超过50％为SCH患者。SCH导致患者及其家庭因病致贫，耗费巨大医疗资源和社会保障。我国广州市2010年-2012年间SCH造成的直接经济负担高达0.96亿万元、1.68亿和1.98亿元，间接经济负担达10.97亿、12.02亿和13.75亿，直接与间接经济负担比为1∶8.5。SCH是社会经济负担最大的精神疾病之一，已成为全球和我国政府高度重视的重大社会卫生问题。
SCH患者阳性、阴性、认知和心境症状群中，阴性症状已被公认与SCH患者心理社会功能具有显著相关性。原发性阴性症状者也被称为缺陷型精神分裂症(DeficitSchizophrenia，DS)，缺陷症状在随访研究中具有高度识别率，这些患者具有家族聚集性、临床疗效差、社会功能衰退早等特征。该群患者社会功能显著受损，阴性症状是独立于病程、教育程度等临床因素的主要临床症候群。因此，识别和区分阴性症状不同组成因子，是DS患者个体化全病程治疗关键难点。
外周生物学标志一直是精神疾病研究的主要内容，蛋白质是生理活动的功能执行体，直接体现个体生理或病理状态的功能机制，因此是反映特定疾病状态的最为理想的生物标志物。DS具有复杂微效致病基因遗传性质，建立多基因/多蛋白质综合指标可能是提高疾病识别效能的有效解决方案。本发明通过高通量蛋白质检测技术重点筛查与DS不良功能结局可能关联的外周血免疫蛋白质。希望通过便捷高效的高通量蛋白质检测技术，可以筛选出与阴性症状和功能结局相关的生物标志物，以指导DS早期评估和治疗。
目前，对于DS标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫荧光分析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分离酶联免疫分析(EIMA)等。但是这些技术一次只能针对一种标志物进行检测，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐等缺点。
液相芯片技术(xMAP))也叫流式荧光技术，该技术由一种微球作为反应载体，是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这三种荧光的比例不同，把球形基质分为500种，可以标记上500种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达500种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于筛查缺陷型精神分裂症相关蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法，该检测方法包括针对白细胞介素-2(IL-2)，脑源性神经营养因子(BDNF)，可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)，可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)，钙结合蛋白(S100B)等5种DS标志物的联合并行检测筛查，具有高灵敏度、高特异性、稳定性好、检测迅速等优点。
为解决上述技术问题，本发明的一种筛查缺陷型精神分裂症生物标志物的液相芯片联合并行检测方法，包括以下步骤：
(1)将不同编号的、表面羧基修饰的微球(BeSCHs，编号分别为48，15，35，74，21)活化后，使相应的捕获抗体(抗DS标志物的抗体)与相应的微球偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种DS标志物，从而使待测样品中的DS标志物与捕获抗体形成“DS标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；
(2)将不同的检测抗体进行生物素(Biotin)标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种DS标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位；
(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中的含有生物素标记的检测抗体混合，从而形成“生物素标记的检测抗体-DS标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；
(4)将步骤(3)中的四联复合体与链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)结合后，检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中各种DS标志物的存在及含量。
以上所述检测方法，还包括步骤：将步骤(4)中测定的可检测荧光信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种DS标志物的含量。
所述的微球是平均直径为4-8μm，优选5.6μm，且结合了不同荧光染料的聚苯乙烯磁性微球，即色彩编码微球(color-coded beSCHs)。
所述步骤(1)中的微球活化是指微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)溶液和活化缓冲液组成的三者混合液中进行活化，其中，三者混合液的用量比是：当微球数量为2.5×106个时，需要50mg/mlEDC溶液10μl：50mg/mlS-NHS溶液10μl：100mM NaH2PO4、pH6.3的活化缓冲液80μl，混合液的用量可以根据微球的数量进行相应的调整。
所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种可以自由组合的DS标志物的捕获抗体和检测抗体：
IL-2，BDNF，sICAM-1，sVCAM-1，S100B。
检测方法中所述的步骤(4)中用液相芯片法(xMAP)进行检测，所述的可检测荧光信号是红色激光激发的微球上的红色分类荧光信号和绿色激光激发的藻红蛋白所产生的报告荧光信号。本发明还涉及一种检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片，其特征是，包括：
(1)偶联抗体的微球：含有5种偶联了捕获抗体的羧基微球(微球编号为48，15，35，74和21)，即分别是：偶联了白细胞介素-2(IL-2)捕获抗体的微球48，偶联了可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)捕获抗体的微球15，偶联了可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)捕获抗体的微球35，偶联了脑源性神经营养因子(BDNF)捕获抗体的微球74，偶联了钙结合蛋白S100B捕获抗体的微球21，每种捕获抗体分别抗一种DS标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“捕获抗体-微球”的二联复合体；
(2)生物素标记的检测抗体：含有生物素标记的IL-2检测抗体，含有生物素标记的sICAM-1检测抗体，含有生物素标记的sVCAM-1检测抗体，含有生物素标记的BDNF检测抗体，含有生物素标记的S100B检测抗体其中，所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的DS标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该生物标志物的不同抗原表位；
(3)链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)：其中链霉亲和素可与生物素特异性结合，形成带藻红蛋白(PE)荧光素标记的检测抗体，通过液相芯片仪的绿色激光激发藻红蛋白进行荧光检测。
优选的，还包括各种DS相关生物标志物(抗原)的标准品。
优选的，还包括阳性对照和阴性对照的质控品。
其中所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下5种可以自由组合的DS标志物的捕获抗体和检测抗体：
IL-2，BDNF，sICAM-1，sVCAM-1，S100B。
本发明的一种检测缺陷型精神分裂症蛋白标志物的方法用于检测体外样品中DS相关生物标志物的存在及含量，IL-2，BDNF，sICAM-1，sVCAM-1，S100B五种因子的表达量在有缺陷症状和无缺陷症状的DS病人中的差异具有统计学意义，因此血液样本中中IL-2，BDNF，sICAM-1，sVCAM-1，S100B五种因子可以作为缺陷型精神分裂症相关的生物标志物用于指导临床早期诊断。
由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够准确定量检测DS的生物标志物并区分生物标志物表达的差异性，以期指导临床用于早期诊断DS和SCH疾病分型治疗。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明：
图1是本发明中检测DS患者与正常对照组中BDNF的浓度分布图。
图2是本发明中检测DS患者与正常对照组中IL-2的浓度分布图。
图3是本发明中检测DS患者与正常对照组中sICAM-1的浓度分布图。
图4是本发明中检测DS患者与正常对照组中sVCAM-1的浓度分布图。
图5是本发明中检测DS患者与正常对照组中S100B的浓度分布图。
图6是5种因子组合鉴别DS患者和NDS患者的敏感性和特异性。
具体实施方式
实验材料：
本发明所用的5种DS标志物(抗原)及相应抗体来源于RnD、cellsciences和Abcam公司；
不同编号的磁性微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于Merck公司；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素(S-NHS-Biotin)购置于Pierce公司。
缓冲液配制：
活化缓冲液(Activation buffer)：100mM NaH2PO4，pH6.3；
偶联缓冲液(Coupling buffer)：50mM HEPES，pH7.4；
磷酸缓冲液(PBS)：10mM NaH2PO4，150mMNaCl，pH7.4。
实施例1：5种精神分裂症标志物的液相芯片联合并行检测方法，具体的检测方法包括如下步骤：
1.所需微球的活化
1.1全速涡旋微球储存液至少3min，形成均一的微球悬液；
1.2分别称取10mg的EDC和S-NHS到两个离心管中；
1.3用去离子水溶解使其终浓度为50mg/ml；
1.4取1ml的微球悬液10000g离心3min，小心移除上清；
1.5加入80μl的活化缓冲液将微球重悬；
1.6分别加入10μl的EDC溶液(50mg/ml)和10μl的S-NHS溶液(50mg/ml)，混合均匀，室温(15-25℃)，避光，振荡孵育20min。
2.相应的捕获抗体与活化的微球偶联
2.1用偶联缓冲液将捕获抗体稀释成体积为500μl，浓度为0.1mg/ml的溶液；(抗体溶液中不能含有外源蛋白，叠氮化物，氨基乙酸，Tris或其他任何含有氨基的试剂。如果含有这些试剂，通过透析或凝胶过滤层析除去)。
2.2将微球在10000g离心3min，小心移除上清；
2.3加入步骤2.1中已经稀释好的抗体溶液(500μl)；
2.4将活化的微球与抗体溶液，在室温(15-25℃)下，避光，振荡孵育2h(离心管必须用锡纸包裹避光)；
2.5将微球在10000g离心3min，小心移除上清；
2.6加入500μl PBS将微球重悬，10000g离心3min，小心移除上清；
2.7加入1ml PBS/1％BSA(BSA：牛血清白蛋白)将微球重悬；
2.8通过血小板计数器对微球计数；
3.生物素标记检测抗体
3.1将生物素试剂(S-NHS-Biotin)从冰箱的冷藏室中取出，在室温下平衡，使其恢复到室温；
3.2依据检测抗体的浓度，用PBS将抗体稀释到1mg/ml；
3.3用超纯水配置10mM的生物素溶液；
3.4按摩尔比1∶20(抗体∶生物素)，计算生物素所需要的量，加入到浓度为1mg/ml的抗体溶液中；
计算公式：
3.5将反应液在冰上孵育2h，或是在室温孵育30min；
3.6将反应液转移到透析盒，除去其中未反应的S-NHS-Biotin。
4.抗原标准品的配置
IL-2按2,000，400，80，16，3.2和0.64pg/mL的浓度进行配制，BDNF按10000，2500，625，156，39，10和2.4pg/ml的浓度进行配制，sICAM-1按100000，25000，6250，1563，391，98和24pg/ml的浓度进行配制，sVCAM-1按250000，62500，15625，3906，977，244和61pg/ml的浓度进行配制，S100B按10000，3333.3，1111.1，370.4，123.5，41.2和13.7pg/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为STD7，STD6，STD5，STD4，STD3，STD2，STD1，STD0。
5.偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)的配制
分别取偶联了5种DS标志物的捕获抗体的微球，如下列：偶联了白细胞介素-2(IL-2)捕获抗体的微球48，偶联了可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)捕获抗体的微球15，偶联了可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)捕获抗体的微球35，偶联了脑源性神经营养因子(BDNF)捕获抗体的微球74，偶联了钙结合蛋白S100B捕获抗体的微球21，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。
6.含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)的配制
分别取进行了生物素标记的IL-2检测抗体sICAM-1检测抗体，sVCAM-1检测抗体，BDNF检测抗体，S100B检测抗体，加入pH7.4的PBS，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。
7.对照品
对照品包括阳性对照和阴性对照。
8.血清样品中5种DS生物标志物的含量检测
8.1血清样品包括正常人血清样本60份，SCH患者血清样本88份，其中有缺陷症状的SCH样本(DS)40份，无缺陷症状的SCH样本(NDS)48份。
8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(I混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；
8.3加入标准品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、DS病人血清样本1-88号、正常人血清样本1-60号，25μl/孔；
8.4用多孔板混匀仪混匀，盖上盖子，在4℃下避光孵育过夜；
8.5将多孔板放置在磁力架上30s，弃去每孔上清液；
8.6加入含生物素标记的检测抗体混合液(II混合液)，25μl/孔；盖上盖子，放置于多孔板振荡器，在室温下避光孵育60min；
8.7用PBS/1％BSA将链霉亲和素-藻红蛋白稀释成浓度为200μg/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，盖上盖子，放置于多孔板振荡器，在室温下避光孵育30min；
8.8在液相芯片仪(FLEX MAP 3D，LUMINEX公司)上，对反应的混合物进行分析，利用Milliplex Analyst5.0软件绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中5种DS蛋白标志物的含量并比较有缺陷症状SCH样本和无缺陷症状的SCH样本各蛋白表达量的差异性。
8.9检测结果及分析，参见表1和图1-6。
(1)表1为5种组间差异具有统计学意义的血清蛋白的检测结果(中位数和范围)，组间比较显示(表1)：其中有缺陷症状的DS血清样本IL-2、sICAM-1和BDNF表达量高于正常人样本，而sVCAM-1和S100B表达量则低于正常人样本。
表1. 5种生物因子的检测结果和组间比较
以上结果表明，用本发明方法可以同时对5种血清DS标志物进行联合并行检测。该方法包含5种鉴别DS患者和正常人的生物标志物，其中鉴别的归类正确率为87.3％，该方法的敏感性为91.9％，特异性为93.6％。该发明对于缺陷型精神分裂症的临床样本早期诊断和筛查具有指导意义。
在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。
Claims (9)
1.一种检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片，其特征是，包括：
(1)偶联抗体的微球：含有分别偶联了不同捕获抗体的5种微球，分别是：偶联了白细胞介素-2捕获抗体的微球，偶联了可溶性细胞间粘附分子-1捕获抗体的微球，偶联了可溶性血管细胞黏附分子-1捕获抗体的微球，偶联了脑源性神经营养因子捕获抗体的微球，偶联了钙结合蛋白捕获抗体的微球，每种捕获抗体分别抗一种精神分裂症相关蛋白标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“抗体-微球”的二联复合体；
(2)生物素标记的检测抗体：含有生物素标记的白细胞介素-2检测抗体，生物素标记的可溶性细胞间粘附分子-1检测抗体，生物素标记的可溶性血管细胞黏附分子-1检测抗体，生物素标记的脑源性神经营养因子检测抗体，生物素标记的钙结合蛋白检测抗体，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的精神分裂症相关蛋白标志物且对应于相应的捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该蛋白标志物的不同抗原表位；
(3)链霉亲和素-藻红蛋白：其中链霉亲和素能与生物素特异性结合，形成带藻红蛋白荧光素标记的检测抗体。
2.如权利要求1所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片，其特征在是：还包含各种精神分裂症相关蛋白标志物的标准品。
3.如权利要求1所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片，其特征在是：还包含阳性对照和阴性对照的质控品。
4.如权利要求1所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片，其特征在是：所述的微球是一种色彩编码微球，平均直径为4-8μm，且结合了不同荧光染料的表面羧基修饰的聚苯乙烯微球。
5.如权利要求1所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片，其特征在是：所述捕获抗体和检测抗体是针对以下5种缺陷型精神分裂症相关蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体：白细胞介素-2、可溶性细胞间粘附分子-1、可溶性血管细胞黏附分子-1、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白。
6.权利要求1-5任一项所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片的检测方法，其特征是，步骤如下：
(1)将不同编号的、表面羧基修饰的微球活化后，使相应的捕获抗体，抗缺陷型精神分裂症标志物的抗体与相应的微球偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种缺陷型精神分裂症标志物，从而使待测样品中的缺陷型精神分裂症标志物与捕获抗体形成“缺陷型精神分裂症标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；
(2)将不同的检测抗体进行生物素标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种缺陷型精神分裂症标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位；
(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中的含有生物素标记的检测抗体混合，从而形成“生物素标记的检测抗体-缺陷型精神分裂症标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；
(4)将步骤(3)中的四联复合体与链霉亲和素-藻红蛋白结合后，检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中各种缺陷型精神分裂症标志物的存在及含量。
7.如权利要求6所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片的检测方法，其特征在于：步骤(4)中将测定的可检测荧光信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种缺陷型精神分裂症标志物的含量。
8.如权利要求6所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片的检测方法，其特征在于：步骤(1)中微球活化是指微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺S-NHS溶液和活化缓冲液组成的三者混合液中进行活化；其中，三者混合液的用量比是：当微球数量为2.5×106个时，需要50mg/mL EDC溶液10μL∶50mg/mL S-NHS溶液10μL∶100mMNaH2PO4、pH6.3的活化缓冲液80μL，混合液的用量根据微球的数量进行相应的调整。
9.如权利要求6所述检测缺陷型精神分裂症外周血蛋白标志物的液相芯片的检测方法，其特征在于：所述捕获抗体和检测抗体是针对以下5种缺陷型精神分裂症相关蛋白标志物的捕获抗体和检测抗体：白细胞介素-2、可溶性细胞间粘附分子-1、可溶性血管细胞黏附分子-1、脑源性神经营养因子、钙结合蛋白。
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| GR01 | Patent grant | ||
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