CN112305228B - 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途 - Google Patents

一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112305228B
CN112305228B CN201910703810.6A CN201910703810A CN112305228B CN 112305228 B CN112305228 B CN 112305228B CN 201910703810 A CN201910703810 A CN 201910703810A CN 112305228 B CN112305228 B CN 112305228B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
myoglobin
strain
kit
tracer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910703810.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112305228A (zh
Inventor
张瑞
李敏
石晓强
徐建新
李福刚
马德敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Aopu Biomedical Co ltd
Original Assignee
Shanghai Aopu Biomedical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Aopu Biomedical Co ltd filed Critical Shanghai Aopu Biomedical Co ltd
Priority to CN201910703810.6A priority Critical patent/CN112305228B/zh
Publication of CN112305228A publication Critical patent/CN112305228A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112305228B publication Critical patent/CN112305228B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • G01N2333/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途。具体来说，本发明的试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，并且所述第一株抗体和第二株抗体为抗肌红蛋白的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的肌红蛋白特异性结合位点不同。本发明的试剂盒可以用于测定待测样本中是否含有肌红蛋白和/或肌红蛋白含量，灵敏度高、重复性好、反应时间短、操作简单、抗干扰性高。

Description

一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体涉及一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途。
背景技术
2007年10月，由欧洲心脏病学会(ESC)、美国心脏病学会(ACC)、美国心脏学会(AHA)和世界心脏联盟(WHF)全球心肌梗死的统一定义，将急性心肌梗死(AMI)定义为由于心肌缺血导致心肌细胞死亡，此定义在新版中没有变化。AMI是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种严重病症，发病凶险、死亡率高，治疗的最佳时间为发病后120分钟内，因此，临床快速检测对诊断和控制AMI病情颇为关键。现代医学研究表明，可以通过联合检测心肌早期标志物(MYO)、确定标志物(cTnI)和损伤标志物(CK-MB)，来提高临床对AMI诊断的早期性、快速性和正确性。
肌红蛋白(myoglobin，MYO)是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，主要存在于心肌和骨骼肌细胞中，正常人血清中肌红蛋白含量极少，当心肌细胞发生损伤时，肌红蛋白由于分子量小，可快速从梗死心肌细胞中释放到血管中。在AMI发病后1～3小时，血液中肌红蛋白浓度迅速上升，6～7小时达峰值，升高幅度大于各心肌酶，具有很高的敏感性，是AMI发生后出现最早的可测标志物之一。由于肌红蛋白半寿期短，仅有15min，胸痛发作后6～12小时不升高，有助于排除AMI的诊断，MYO阴性是筛查AMI很好的指标，预测价值为100％。在临床诊断中，MYO峰值的高度与心肌损伤或坏死的范围成正比，根据肌红蛋白动态变化曲线可以早期估测心梗范围。由于在AMI后血中肌红蛋白很快可以从肾脏清除，发病18～30小时内可完全恢复到正常水平，因此，肌红蛋白测定有助于在AMI病程中观察有无再梗塞或者梗塞再扩展。同时，也可通过肌红蛋白出现的增高幅度可以进行溶栓再通的判断，准确性可达95％以上。
目前，测定肌红蛋白的方法种类繁多，但分光光度法、电泳法及层析法等无法测定低于微克水平的肌红蛋白，不适宜检测AMI；放射免疫测定(RIA)灵敏度高，特异性强，但不稳定，效期仅为一个月，且放射性同位素的使用会对环境产生污染；酶联免疫吸附测定(ELISA)定量准确性差，操作时间长，自动化程度低，一般用于定性检测，与此同时，酶活性易受环境温度等外界因素影响，试剂稳定性差；工作曲线可能随时间漂移，低端斜率容易呈非线性下移，因此，每次检测都必须用6-12个点做标准曲线，浪费试剂；胶体金层析法(金标)虽然稳定性好，但灵敏度较低，只能定性，不能定量；免疫比浊法相较而言，操作简单，稳定性重复性较好，但该方法灵敏度较低，且定量准确度差，容易造成误差。化学发光免疫分析法将免疫反应与化学发光进行了偶联，灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强并且特异性高，不会对环境和操作人员产生任何影响，是目前世界公认先进的标记免疫测定技术。
化学发光免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能、传染性疾病、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功能等方面的体外诊断实验中，具有灵敏度高、线性动力学范围宽、光信号持续时间长、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等优势。化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类：直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
直接化学发光免疫分析是指用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，在氧化剂(H2O2)和NaOH的作用下，吖啶酯便可分解、发光，无需催化剂。强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光，发光强度同待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
化学发光酶免疫分析是采用参与某一化学发光反应的酶来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光。这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身又直接参与发光反应。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。
电化学发光免疫分析是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，是电化学和化学发光两个过程的结合。电化学发光免疫分析技术以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强，重复性较好。
但是，电化学发光的测量方式复杂；检测标记物时需要三个电极(一个激发电极，两个测定电极)，仪器成本及维护费用高；仪器采用流动比色池，存在交叉污染等潜在问题；并且，对环境因素和其他非特异性反应过于敏感。
目前，市面上虽然存在检测肌红蛋白的化学发光法试剂盒，但是，其中很多试剂盒存在着灵敏度不足、特异性不高等缺点。与此同时，吖啶酯在液体环境中不稳定，容易水解，不利于反应试剂的长期保存。
例如，CN102435752A、CN103278651A、CN107643284A、CN107655880A、CN108931652A均公开了一种通过化学发光方法对肌红蛋白进行检测的试剂盒。但是，前述文献中公开的试剂盒对于肌红蛋白的检测灵敏度仍然不够高，无法满足临床上对于肌红蛋白进行更加灵敏的检测的需求。
发明内容
发明要解决的问题
针对以上现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种肌红蛋白的检测试剂盒，该试剂盒具有更优的灵敏度和特异性，能够快速的得到检测结果。
本发明的另一目的在于提供肌红蛋白检测试剂盒的制备方法。
此外，本发明还提供了上述试剂盒的用途。
用于解决问题的方案
本发明提供的技术方案具体如下。
在一个技术方案中，本公开提供一种肌红蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗肌红蛋白的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的肌红蛋白特异性结合位点不同。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述磁性微球选自纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料的复合体，所述磁性微球的平均粒径为1-5μm。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述磁性微球表面可添加多个活性基团。在一个示例性的实施方式中，所述活性基团可以选自-OH和/或-COOH。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述示踪标记物选自吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和金刚烷中的一种或多种；可选的，所述示踪标记物为吖啶酯。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:0.25-1.5；所述示踪标记物与第二株抗体的质量比不低于15:1。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1；所述示踪标记物与第二株抗体的质量比为15-40:1。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述试剂盒包括肌红蛋白的稀释液；可选的，所述稀释液含有新生牛血清。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述稀释液还包括本领域常用的防腐剂。在一个可选的实施方式中，所述防腐剂为Proclin 300；优选的，所述稀释液中Proclin300的含量为0.1％。Proclin 300作为防腐剂添加进新生牛血清中，延长新生牛血清的有效期。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述试剂盒还包括校准品、磁性微球清洗液和底物液A、底物液B。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述磁性微球清洗液为PBST缓冲液，优选地，所述磁性微球清洗液包括防腐剂。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述底物液A为H2O2和HNO3的混合液，优选地，H2O2质量分数为0.01-5.0％，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，优选地，Triton X-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。
在另一个技术方案中，本公开还提供一种制备所述肌红蛋白检测试剂盒的方法，其中，所述方法包括将所述第一株抗体包被磁性微球的步骤和将所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，在所述第一株抗体包被磁性微球步骤中使用2-(N-吗啉代)乙磺酸(即MES)缓冲液。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述第一株抗体包被磁性微球步骤中还使用封闭液，所述封闭液含有1％酪蛋白的PBS。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，在所述第二株抗体标记示踪标记物步骤中使用的抗体偶联缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸(即HEPES)缓冲液。
在本公开提供的一个具体的实施方式中，所述第二株抗体标记示踪标记物的标记时间为0.5-2小时；可选的，所述第二株抗体标记示踪标记物的标记时间为1小时。
在另一个技术方案中，本公开还提供一种包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体在制备用于检测待测样品中是否含有肌红蛋白或肌红蛋白的含量的试剂或试剂盒中的用途。在一个可选的实施方式中，所述第一株抗体和第二株抗体为抗肌红蛋白的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的肌红蛋白特异性结合位点不同。
发明的效果
本发明提供的肌红蛋白的直接化学发光检测试剂盒及制备方法，利用肌红蛋白抗原与蛋白载体偶联而成的包被磁微粒，后与标记吖啶酯的肌红蛋白检测抗体特异性结合，测定待测样本中是否含有肌红蛋白和/或肌红蛋白含量，灵敏度高、重复性好、反应时间短、操作简单、抗干扰性高。
附图说明
图1示出的是本发明利用直接化学发光在血液中检测肌红蛋白的检测方法的反应原理图。
图2示出的是本发明涉及的检测试剂盒的线性相关性图。
图3示出的是本发明涉及的检测试剂盒的样本符合率图。
图4示出的是本发明涉及的检测试剂盒的钩状效应图。
具体实施方式
以下将参考附图详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
<肌红蛋白检测试剂盒>
本发明提供一种肌红蛋白的检测试剂盒，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗肌红蛋白的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的肌红蛋白特异性结合位点不同。
本发明检测MYO方法是双抗体夹心法，该法主要是使用两株不同的特异性单克隆抗体，其中被标记于示踪标记物的抗体的结合位点与包被于磁性微球上的抗体结合位点不同。选择这些结合位点不仅有利于示踪物的标记或磁性微球的包被，也不会阻碍抗体与抗原结合形成夹心复合物，因此，提高了反应的特异性和灵敏度。
在一个实施方式中，为了使得检测血清和血浆样品的信号、样本符合率更佳，优选地，本发明所述第一株抗体为抗体2：MYO-3B2(菲鹏，Cat：MYO-Ab3)，所述第二株抗体为抗体4：MYO-7004(MEDIX，Cat：100354)。
适用于本发明的示踪标记物有多种，如鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯和金刚烷等，其中，优选的为吖啶酯，因为将其应用于化学发光检测中，其反应不需要催化剂，只要碱性环境即可，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，底物液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
在一个示例性的实施方式中，所述吖啶酯示踪标记物可以选自NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS。
在一个实施方式中，适用于本发明的磁性微球，简称为磁珠或磁微粒，可以是本领域常用的磁珠。示例性的，本发明所使用的磁珠为纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料进行复合后，形成的具有顺磁性和极大蛋白吸附量的微米级固相微球，该磁性微球可以在外加磁场的作用下迅速磁化，在磁场消失后剩磁为零。而其复合所用的高分子材料种类没有限制。
在一个实施方式中，本发明所使用的磁性微球平均粒径范围为1-5μm，并且，磁性微球可通过表面改性而添加多个活性基团，包括但不限于-OH和-COOH。与此同时，考虑到如果磁珠使用前固相的不完全沉降，则会影响精确度，因此选择时应选分散性好，沉降速度慢的磁珠。
在一个实施方式中，本发明选择所述磁珠的内核为Fe3O4，所述的磁微粒可直接与肌红蛋白捕获抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记肌红蛋白捕获抗体。
在一个实施方式中，本发明提供一种肌红蛋白的直接化学发光检测试剂盒，微磁粒偶联的肌红蛋白捕获抗体，吖啶酯标记的肌红蛋白检测抗体。
在一个实施方式中，本发明提供的肌红蛋白试剂盒还可以包括肌红蛋白校准品。
在一个实施方式中，本发明提供的肌红蛋白试剂盒还可以包括化学发光底物液A、化学发光底物液B。
在一个实施方式中，本发明提供的肌红蛋白试剂盒还可以包括清洗液。
在一个示例性的实施方式中，本发明在制备微磁粒偶联捕获抗体的过程中，所述偶联抗体的缓冲液为MES缓冲液。可选的，所述MES缓冲液的浓度为0.01mol/L。
在一个示例性的实施方式中，本发明在制备吖啶酯标记检测抗体的过程中，吖啶酯标记抗体完成后所使用的封闭缓冲液为含100mg/mL赖氨酸溶液。
在一个示例性的实施方式中，本发明在制备吖啶酯标记检测抗体的过程中，所述的吖啶酯标记肌红蛋白检测抗体的过程中可以使用缓冲液。可选的，前述缓冲液是pH4.5、浓度为0.01mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
在一个示例性的实施方式中，本发明的吖啶酯标记肌红蛋白检测抗体的缓冲液还含有表面活性剂。如非离子型表面活性剂Triton X-100、Triton X-405、Tween 20、Tween80、Tween 100的一种或多种。可选的，本发明采用的表面活性剂为质量分数为0.05-0.1％的Tween 100。
在一个示例性的实施方式中，本发明所述校准品包含新生牛血清作为基质，加入肌红蛋白纯品配置而成。
在另一个示例性的实施方式中，本发明所述校准品还含有防腐剂。在一个可选的实施方式中，所述防腐剂为Proclin 300。在一个可选的实施方式中，所述防腐剂为含有0.1％的Proclin 300。
在一个示例性的实施方式中，本发明所述校准品还包含防腐剂。本发明所适用的防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、Proclin300(主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮)和抗生素中的一种或多种。
在一个示例性的实施方式中，所述的化学发光底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.01-5.0％，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L。
在一个示例性的实施方式中，所述的化学发光底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。
在一个示例性的实施方式中，本发明所述清洗液为pH值7.0-9.0、浓度为0.02mol/L的PBST溶液，其中含质量分数为0.5％的Tween-20。
<肌红蛋白检测试剂盒的制备方法>
在另一个实施方式中，本发明提供一种肌红蛋白检测试剂盒的制备方法。
在一个实施方式中，本发明提供的方法包括将所述第一株抗体包被磁性微球的步骤和将所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤。
在另一个实施方式中，本发明提供的方法包括如下步骤：包被MYO单抗的磁性微球悬浮液；制备标记吖啶酯的MYO单抗溶液；配制化学发光底物液；配制清洗液。
在一个优选的实施方式中，本发明提供的方法还包括制备校准品的步骤。
<肌红蛋白检测试剂盒的用途>
在另一个实施方式中，本发明提供了一种肌红蛋白检测试剂盒的用途。
在一个实施方式中，本发明提供了一种包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体在制备用于检测待测样品中是否含有肌红蛋白或肌红蛋白的含量的试剂或试剂盒中的用途。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于检测肌红蛋白的检测试剂盒，其可以用于检测受试者是否患有急性心肌梗死或者其患有急性心肌梗死的风险。
实施例
以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。
除非另有说明，否则实施例中涉及的所有试剂或设备均可以通过商业途径购买。
实施例1：心肌蛋白检测试剂盒的制备方法
制备1：包被MYO单抗的磁性微球悬浮液
(1)量取10mg磁性微球溶液，加入1mL 0.01M的MES缓冲液，涡旋混匀，磁铁吸附5～10min，至磁珠被完全吸附至管壁一侧后，弃上清，重复上述清洗步骤3～5次，加入1mL0.01M MES，涡旋混匀；
(2)加入100μg MYO第一株单克隆抗体(磁珠：抗体的质量比为100:1)涡旋混匀，37℃孵育30min；
(3)加入10μL 10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(EDC)，涡旋混匀，放入37℃培养箱，孵育1.5h；
(4)加入200μL含1％酪蛋白的PBS溶液(0.02M)，封闭2h。
(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1mL发光恢复液1(5g的牛血清白蛋白+400mL的0.025M的Tris-HCl缓冲液溶解+1-2‰的Tween-80+100mL新生牛血清)，磁铁吸附，去上清，重复上述清洗步骤3～5次。
(6)向上述制备好的磁珠加入1mL的发光恢复液1，2～8℃长期保存。
制备2：标记吖啶酯的MYO单抗溶液的制备
(1)将1mg MYO第二株单克隆抗体置于透析袋中，使用不少于2L的0.05M HEPES缓冲液(pH＝8.0)透析24h，中途换液四次。透析完成后将抗体加入Millipore Amicon Ultra超滤离心管进行浓缩，使抗体浓度大于5mg/mL。
(2)将经过浓缩的MYO单克隆抗体置于0.5mL的离心管内，加入100μL的溶于DMF的5mg/mL的NSP-SA-NHS溶液，使NSP-SA-NHS与MYO单克隆抗体的摩尔比不小于15:1，混匀后，室温(避光)反应1h，加入100μL浓度为100mg/mL的赖氨酸溶液作为封闭缓冲液，反应30min，终止反应。
(3)将标记物置于透析袋中，用不少于2L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH＝4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的NSP-SA-NHS。
(4)收集透析过后的标记物，加入5％BSA溶液使BSA终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存。
制备3：校准品的制备
取MYO工作液，使用含0.1％Proclin 300的新生牛血清稀释至30ng/mL和800ng/mL的高低点标准品溶液。
使用制备1中的制备得到的包被有第一株抗MYO的抗体的磁性微球混悬液，制备2中标记有吖啶酯的第二株MYO抗体，制备3高低点校准品分别构成试剂盒的组分。
制备4：化学发光底物液的配制
化学发光底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.01-5.0％，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L。
化学发光底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。
制备5：清洗液的配制
本发明所述清洗液为pH值7.0-9.0、浓度为0.02mol/L的PBST溶液，其中含质量分数为0.5％的Tween-20。
实施例2：心肌蛋白检测试剂盒的使用方法
使用上述实施例1中制备的试剂盒，通过化学发光分析仪，检测待测样本中的MYO浓度。
具体的，按照如下步骤使用化学发光分析仪：
将实施例1的制备1中制备的磁珠-MYO单抗溶剂按磁珠使用浓度稀释到50μg/mL，将实施例1中制备2制备的吖啶酯标记抗体稀释到1μg/mL；
反应杯中依次加入50μL的试剂1(磁珠混悬液)和50μL的试剂2(吖啶酯溶液)；
3.将5μL的待测样本或/和校准品加入反应杯中，整个加样过程需要30s；
4.反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；
5.置于磁性条件下，使用磁珠清洗液清洗三次，整个过程需要2分钟；
6.向反应杯中加入100μL的底物液A以及底物液B，检测光子值；
7.根据反应杯中检测的光强度，仪器自动计算待测样本中MYO的浓度，整个检验，计算过程需要1分钟。
实施例3：心肌蛋白检测试剂盒中使用的抗体的配组筛选
(1)抗体配组筛选
本发明使用的MYO抗体共有五种：抗体1：MYO-3A7(菲鹏，Cat：MYO-Ab2)、抗体2：MYO-3B2(菲鹏，Cat：MYO-Ab3)；抗体3：MYO-7001(MEDIX，Cat：100378)、抗体4：MYO-7004(MEDIX，Cat：100354)、抗体5：MYO-7005(MEDIX，Cat：100078)。将抗体1、2、3分别包被磁性微球，形成抗体1-磁性微球、抗体2-磁性微球、抗体3-磁性微球，同时将另外两种抗体标记吖啶酯，形成抗体4-吖啶酯、抗体5-吖啶酯。将以上抗体进行组合配对，检测血清样本，从中筛选最优组合。
表1抗体配对组合筛选结果
Figure BDA0002151532710000121
如表1所示，组合1和5中，抗体1、抗体3同抗体4组合，均无法与血清样本中的肌红蛋白结合；组合2及组合4中，抗体2、抗体3与抗体5的配对，检测肌红蛋白整体信号值偏低，区分度较低；组合3和组合6，抗体2与抗体4和抗体3与抗体5的配对，各项指标结果较好。
表2血清样本符合率检测结果
Figure BDA0002151532710000122
Figure BDA0002151532710000131
表3同源样本符合率检测结果
Figure BDA0002151532710000132
Figure BDA0002151532710000141
参照表2结果，两组抗体配对检测血清样本的符合率相近，但参照表3结果，两组抗体配对分别检测同源血清血浆样本，对比血清血浆信号值差值，抗体2-抗体4组合结果明显优于抗体3-抗体5组合。
实施例4：心肌蛋白检测试剂盒中使用的反应试剂及反应条件的筛选
(1)抗原稀释液筛选
本实施例提供三种稀释液稀释抗原，用于制备校准品，其抗原稀释液热加速稳定性结果如下表所示：
表4抗原稀释液热加速稳定性结果
Figure BDA0002151532710000142
结果如表4所示，使用1％酪蛋白和蛋白质稳定剂稀释抗原，37℃加速7天后，稳定性下降超过80％，而抗原经过新生牛血清稀释后，在37℃保存7天，与4℃保存相比，稳定性下降在10％以内。因此，本发明选择含有0.1％Proclin 300的新生牛血清作为校准品稀释液，以延长新生牛血清的有效期。
(2)磁珠包被抗体优化工艺
表5磁珠包被抗体偶联缓冲液优化
MES MOPSO 硼酸缓冲液
S5 1538122 301424 1466387
S4 590068 115293 542092
S3 217178 40552 187361
S2 59158 8922 48814
S1 13881 1746 11254
S0 515 332 389
符合率 0.9817 0.9805 0.977
综合比较各组数据，选择MES缓冲液作为磁珠包被偶联缓冲液。
表6磁珠抗体使用比例筛选结果
磁珠：抗体 100：1.5 100：1 100：0.5 100：0.25
ng/mL
5000 OVRFLW 3376631 1865542 784026
2000 3911726 2992014 1609063 703221
1000 2011752 1556988 898104 375534
500 782105 640318 335179 145204
250 353683 236506 114014 50941
100 109442 67406 26898 12630
30 30851 17418 6164 2839
0 2845 606 253 183
符合率 0.9862 0.9874 0.9777 0.9814
抗体加入量增加，抗原检测信号值也随之增加，并对抗原符合率没有明显影响，当磁珠：抗体达到100:1.5时，5000ng/mL浓度的抗原稀释液检测值超出上限，因此，本发明选择100：1作为磁珠：抗体加入比例。
表7封闭液筛选
1M Gly 5％BSA 含1％酪蛋白的PBS
S5 1549027 1424556 1515782
S4 585580 541742 586398
S3 247011 242711 247055
S2 68201 66141 71350
S1 18476 17751 19697
S0 2814 1744 2425
符合率 0.9825 0.9846 0.9842
三种封闭液对抗原稀释液检测符合率没有明显影响，1M Gly及含1％酪蛋白的PBS整体信号值略高，且PBS检测低值区分度略高，所以，选择含1％酪蛋白的PBS作为封闭液。
(3)吖啶酯标记抗体优化工艺
表8吖啶酯标记抗体偶联缓冲液优化
HEPES TAPS CB
S5 1543427 793560 1582360
S4 600236 284619 583735
S3 226019 115138 242808
S2 64606 30527 60720
S1 17093 7668 15227
S0 1295 678 1146
符合率 0.9802 0.9769 0.9832
三种偶联缓冲液对抗原稀释液检测符合率无明显影响，HEPES样本检测信号值整体较高，且低值区分范围较大，本发明选择HEPES作为吖啶酯标记抗体偶联缓冲液。
表9吖啶酯标记抗体偶联时间优化
0.5h 1h 2h
S5 1296210 1460628 1467828
S4 522576 566955 612075
S3 207049 208350 225344
S2 54216 57256 58896
S1 10360 11119 14686
S0 612 651 1326
符合率 0.9875 0.9828 0.9882
抗体与吖啶酯偶1h，反应达到平台期。
表10吖啶酯抗体使用比例筛选
吖啶酯：抗体 5：1 15：1 25：1 40：1
S5 697152 1263511 1307152 1293517
S4 261338 522103 561338 572183
S3 102999 214176 232999 224128
S2 26531 61892 62542 61879
S1 7351 17103 20411 19956
S0 382 1674 1966 1847
符合率 0.9807 0.9896 0.9842 0.9871
根据上表实验数据，吖啶酯：抗体应不得低于15：1。
实施例5：心肌蛋白检测试剂盒的技术效果检测
(1)空白限的检测
其检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1233-2014《心肌肌钙蛋白-I定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)》的试验方法进行。
重复检测零浓度的校准品20次，通过Mean、SD的计算得出MYO定量测定试剂盒的最低检出限，实验结果如表2所示。
表11初始校准曲线的检测结果
RLU 浓度(ng/mL)
S0 912 0
S1 15752 30
S2 65290 100
S3 201743 250
S4 562327 500
S5 1292555 1000
表12空白限的检测结果
Figure BDA0002151532710000171
根据零浓度校准品(S0)和相邻的校准品(S1)之间的浓度-化学发光(RLU)值的结果进行两点回归拟合得出一次方程，再将20孔空白样本(S0)检测获得的Mean+2SD所对应的RLU值代入上述方程，所获得的浓度值，即为分析灵敏度，本发明的分析灵敏度可达到0.3582ng/mL。
(2)精密度的检测
重复检测高、低标准品各10次，再根据检测结果，计算CV，结果见表13。
表13精密度的检测结果
Figure BDA0002151532710000181
本发明的精密度可达到3.91％和5.92％，说明本发明建立的试剂盒重复性良好。
(3)线性相关性的检测
复孔检测线性样本，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数，结果见表14.
表14线性相关性的检测结果
浓度1(ng/mL) 浓度2(ng/mL) 实测值(ng/mL) 理论值(ng/mL)
样本1 0 0 0 0
样本2 6.50 6.24 6.37 0.675
样本3 54.63 53.72 54.18 41.56
样本4 143.39 148.53 145.96 135.61
样本5 342.03 334.78 338.40 338.00
样本6 743.38 746.82 745.10 675.34
样本7 1015.59 1019.48 1017.54 1020.67
样本8 1404.53 1363.81 1384.17 1350
线性相关性 0.9979
本发明的线性相关性R>0.990。复孔检测线性样本(7点)，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数。其中，理论浓度未利用校准曲线计算所得的浓度，而实测值为利用比对机器罗氏检测后的样本值。附图2表明线性相关性良好。
(4)准确度的检测
血清添加比例按照1：5、1：7和1：9稀释后检测。
采取回收试验检测试剂盒的准确度，检测结果见表15.
表15回收试验的检测结果
Figure BDA0002151532710000191
回收试验结果可达到90％，说明本发明建立的MYO检测方法的准确度良好，并且基本没有基质效应。
(5)钩状效应
表16钩状效应的检测结果
RLU 浓度(μg/mL)
S0 423.5 0
S1 11519.5 0.03
S2 52658.5 0.1
S3 195061 0.25
S4 527804 0.5
S5 1405565 1
S6 2586671 2
S7 2799114 5
S8 2788533 10
S9 2737534 20
S10 2631734 40
S11 2502399 60
S12 2268713 100
使用本发明建立的MYO试剂盒检测高浓度抗原样本，当样本浓度达到5μg/mL时，开始出现钩状效应，但增加样本浓度直至100μg/mL，检测值仍大于1μg/mL，超过检测上限，因此，说明本试剂盒检测样本可忽略钩状效应的影响。
(6)方法学比对
同时使用罗氏诊断生产的肌红蛋白检测试剂盒(电化学发光法)(MYOSTAT)及本发明建立的MYO试剂盒分别检测血清或血浆样本，检测结果见附图3。将罗氏试剂盒检测的的浓度值(ng/mL)与本发明试剂盒的检测信号值做散点图，发现符合率较好，整体符合率R值可达0.9853。可见，本发明的试剂盒与国内外公认的罗氏MYO试剂盒有较好的相关性。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种肌红蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗肌红蛋白的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的肌红蛋白特异性结合位点不同；其特征在于，所述第一株抗体和第二株抗体分别为MYO-3B2和MYO-7004；所述磁性微球选自纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料的复合体，所述磁性微球的平均粒径为1-5μm；所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1；所述试剂盒包括肌红蛋白的稀释液；所述稀释液为含有0.1％Proclin 300的新生牛血清；所述示踪标记物与第二株抗体的质量比不低于15:1；所述示踪标记物为吖啶酯。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪标记物与第二株抗体的质量比为15-40:1。
3.一种制备根据权利要求1或2所述的试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括所述第一株抗体包被磁性微球的步骤和所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤；所述示踪标记物为吖啶酯；在所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤中使用的抗体偶联缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；在所述第一株抗体包被磁性微球的步骤中使用2-(N-吗啉代)乙磺酸作为缓冲液；所述第一株抗体包被磁性微球步骤中还使用封闭液，所述封闭液为含有1％酪蛋白的PBS。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二株抗体标记示踪标记物的标记时间为0.5-2小时。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第二株抗体标记示踪标记物的标记时间为1小时。
6.包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体在制备用于检测待测样品中是否含有肌红蛋白或肌红蛋白的含量的根据权利要求1或2所述的试剂盒或权利要求3-5任一项所述的方法制备得到的试剂盒中的用途，其特征在于，所述第一株抗体和第二株抗体为抗肌红蛋白的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的肌红蛋白特异性结合位点不同。
CN201910703810.6A 2019-07-31 2019-07-31 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途 Active CN112305228B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910703810.6A CN112305228B (zh) 2019-07-31 2019-07-31 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910703810.6A CN112305228B (zh) 2019-07-31 2019-07-31 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112305228A CN112305228A (zh) 2021-02-02
CN112305228B true CN112305228B (zh) 2023-05-09

Family

ID=74485123

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910703810.6A Active CN112305228B (zh) 2019-07-31 2019-07-31 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112305228B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113092789A (zh) * 2021-04-15 2021-07-09 江苏优尼泰克生物科技有限公司 用于肌红蛋白检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
CN113588949A (zh) * 2021-08-17 2021-11-02 广州艺得诺生物科技有限公司 一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备及使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102435752A (zh) * 2011-08-31 2012-05-02 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 人的肌红蛋白(Myoglobin)定量测定试剂盒及其检测方法
CN104634980A (zh) * 2015-02-10 2015-05-20 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5573957A (en) * 1994-09-28 1996-11-12 Spectral Diagnostics, Inc. Monoclonal antibody to human cardiac myoglobin
CN103033627A (zh) * 2011-09-29 2013-04-10 北京源德生物医学工程有限公司 一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒
CN102680703B (zh) * 2012-04-28 2014-12-17 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 一种快速定量检测肌红蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法
CN102749452B (zh) * 2012-07-26 2015-01-14 山东大学 一种近红外的电致化学发光免疫检测方法
CN103278651B (zh) * 2013-06-14 2015-07-15 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN106443018A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 上海科华生物工程股份有限公司 一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合及其制备方法和检测试剂盒
CN108254562B (zh) * 2016-12-28 2019-11-08 广州瑞博奥生物科技有限公司 检测myo的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
CN107356743B (zh) * 2017-07-31 2020-05-15 北京丹大生物技术有限公司 一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒
CN107664700A (zh) * 2017-09-19 2018-02-06 威海纽普生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i及肌酸激酶同工酶及肌红蛋白三合一检测试剂盒及其制备方法
CN109991425A (zh) * 2019-03-27 2019-07-09 迪瑞医疗科技股份有限公司 肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102435752A (zh) * 2011-08-31 2012-05-02 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 人的肌红蛋白(Myoglobin)定量测定试剂盒及其检测方法
CN104634980A (zh) * 2015-02-10 2015-05-20 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Highly sensitive detection of human cardiac myoglobin using a reverse sandwich immunoassay with a gold nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance biosensor;Oksana V.Gnedenko 等;Anal Chim Acta;759;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112305228A (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11959912B2 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
US10472400B2 (en) Cardiac troponin I ultra-sensitive detection reagent kit, and ultra-sensitive detection method therefor
CN104849469A (zh) 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法
US20110136256A1 (en) Methods and kits for decreasing interferences in plasma or serum containing assay samples of specific binding assays
CN112305228B (zh) 一种肌红蛋白直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途
CN112014566A (zh) 一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒、制备方法及用途
CN107918022B (zh) 一种cTnI检测试剂盒及其使用方法
WO2016127319A1 (zh) 用于检测脂蛋白相关磷脂酶a2的试剂盒及其制备和应用
CN105181694B (zh) 癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒
CN111175491A (zh) 一种sBCMA磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
CN110806487A (zh) 一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法
CN101949945B (zh) 以磁性微粒为固相载体检测游离甲状腺素的试剂盒及其制备方法
CN110988368A (zh) 一种游离甲状腺素发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN115639367A (zh) 一种检测抗角蛋白抗体IgG的化学发光免疫试剂盒及应用
CN111007266A (zh) 一种检测血浆中b型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒
CN113376378A (zh) 一种d-二聚体检测试剂盒、制备方法及用途
CN111766390A (zh) 脂联素化学发光免疫检测试剂盒
CN111521809A (zh) 一种心肌肌钙蛋白t检测试剂盒及其制备方法和用途
WO2018000446A1 (zh) 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN110618280A (zh) 一种促甲状腺素测定试剂盒及其制备方法
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
CN116027051A (zh) 一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法
CN112858678B (zh) 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途
CN114371292A (zh) 一种检测可溶性st2蛋白的试剂盒
CN114509569A (zh) 一种检测白介素6的试剂盒、检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant