CN103033627A - 一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体提供了一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法，所述方法包括形成固相-抗体-抗原-酶标二抗免疫夹心复合物以及用化学发光的方法检测所述免疫夹心复合物的步骤。本发明还提供了一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测试剂盒。本发明提供的检测方法和检测试剂盒适用于人肌红蛋白的检测分析，并且具有检测范围大、灵敏度和特异性高的优点。

Description

一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体提供了一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒，适用于人肌红蛋白的酶促化学发光检测分析。

背景技术

人肌红蛋白(myoglobin，Myo)是低分子量的细胞质蛋白，广泛存在于骨骼肌和肌细胞中，其在前者中的含量高于后者。当急性肌缺血(acute myocardial ischemia，AMI)发生时Myo即明显升高，可持续至12h，并且具有较高的敏感性。但由于骨骼肌疾病、肾功能损害、炎症、系统性红斑狼疮、皮肌炎均可引起Myo升高，其作为AMI的诊断指标特异性较低。但由于其较高的灵敏度，一般作为排查指标，对于排除肌梗死和再通后再梗死意义重大。

目前人肌红蛋白的检测方法主要有酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和胶体金免疫层析法(Gold-immunochromatography assay，GICA)。ELISA方法具有操作简单、技术可靠、试剂方便易得等优点，但其敏感性、特异性不够高，作为定量方法不够准确；GICA方法简便、快速、可单份或成批测定，但其灵敏度更低于ELISA方法，而且通常情况下只能做为定性方法，而不能作为定量方法。

化学发光(ChemiLuminescence，简称为CL)分析法是分子发光光谱分析法中的一类，其原理是在化学反应中生成的不稳定的激发态中间体，当其回到基态时，释放光子。化学发光分析法主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。在免疫检测分析中，使用化学发光技术，可以使检测的范围达到6个数量级，而且灵敏度很高，达10^-18摩尔水平，加上标记物稳定，有效期长，使其受到越来越多的关注与应用。

但目前尚没有利用化学发光分析法测量人肌红蛋白的研究和应用。

发明内容

为了进一步提高人肌红蛋白检测的敏感性、特异性和准确度，发明人将酶促化学发光分析方法应用于人肌红蛋白的检测中，经过大量的实验，摸索出一种灵敏、准确且稳定的检测方法，由此完成了本发明。

本发明一个方面涉及一种人肌红蛋白检测方法，其包括以下步骤：

(1)将抗人肌红蛋白抗体固定在固相表面，加入待测样本和标记的抗人肌红蛋白抗体，温育，然后用洗涤液洗涤；任选地，同时设立人肌红蛋白标准品的对照；

(2)加入化学发光底物工作液，放置一段时间；

(3)测量发光值，得到待测样本的人肌红蛋白浓度值。

其中步骤(1)中的温育为，在18-42℃条件下，优选为20-37℃条件下，温育5-120min，优选为温育10-60min，更优选为15-45min，在本发明的一个实施方案中，在37℃条件下，温育30min。

其中步骤(2)中的放置放一段时间是指1-30min，优选为2-20min。在本发明的一个实施方案中，放置时间为5min。

具体地，检测方法如下：

1.在固定有抗人肌红蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯微孔板中加入5-100μL血清或血浆样本，标准品，混匀；加入辣根过氧化物酶标记的抗人肌红蛋白单克隆抗体，37℃温育10-60分钟。在本发明的一个实施方案中，温育30min。

2.洗涤：可采用手工洗涤或洗板机洗涤。手工操作方法为：直接排除包被板中的液体，并加入洗涤液(300μL/孔)，倒出洗涤液并拍击以除去挂壁液体，重复三次，洗板机操作见仪器说明书。

3.加入化学发光底物工作液：每孔加入50-400μL，所述发光底物工作液包括底物溶液、辅助发光溶液和反应增强剂。混匀后2-20分钟测量。

4、读取发光值：在发光测定仪上测定每孔的发光值。

本发明的另一方面涉及人肌红蛋白检测试剂盒，其包括：连接有抗人肌红蛋白抗体的微孔板，标记的抗人肌红蛋白抗体和化学发光底物工作液。

在本发明中，所述化学发光底物工作液包括底物溶液、辅助发光溶液和反应增强剂。

在本发明中，所述试剂盒还可以包括洗涤液，人肌红蛋白标准品和质量控制血清。

在本发明中，待测样本可以为血清、血浆或其它体液，例如唾液，在本发明的一个实施方案中，待测样本为血清。

在本发明中，所述的固相化的抗人肌红蛋白抗体和用来标记的抗人肌红蛋白抗体各自独立地为单克隆抗体或多克隆抗体，在本发明的一个实施方案中，固相化的抗人肌红蛋白抗体和标记(酶标)的抗人肌红蛋白抗体均为单克隆抗体；

其中固相化的抗人肌红蛋白抗体与标记的抗人肌红蛋白抗体可以相同，也可以不相同。在本发明的一个实施方案中，所述的固相化的抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌红蛋白抗体购自Medix Biochemica公司。在本发明的一个具体实施方案中，所述的固相化的抗体和标记的抗体均为Medix Biochemica公司的抗人肌红蛋白单克隆抗体，克隆号为7001和7004，其对应的货号分别为100075和100076。在本发明的另一个具体实施方案中，所述的固相化的抗体和标记的抗体均为Medix Biochemica公司的抗人肌红蛋白单克隆抗体，克隆号为7004和7005，其对应的货号分别为100076和100078。对于上述的每一对抗体，当其中一个作为固相化抗体时，另一个即为标记的抗体。

所述人肌红蛋白抗体(包括固相化和标记的抗体)可以是利用免疫学中常用的动物制备的抗体，例如鼠抗人肌红蛋白抗体、兔抗人肌红蛋白抗体或羊抗人肌红蛋白抗体，在本发明的一个实施方案中，为鼠抗人肌红蛋白抗体。

在本发明中，所述的标记抗人肌红蛋白抗体的标记物为过氧化物酶，例如为辣根过氧化物酶或烟草过氧化物酶；所述底物为在一定条件下，能被所述酶激发发光的物质；在本发明的一个实施方案中，所述标记物为辣根过氧化物酶，所述底物为鲁米诺或其衍生物。

所述鲁米诺衍生物包括但不限于异鲁米诺、4-氨基己基-N一乙基异鲁诺、及N-(6-氨基己基)-N-乙基异鲁米诺(AHEI)和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。

在本发明中，所述辅助发光的溶液包括但不限于过氧化氢溶液、铁氰化钾溶液、碘化物溶液、高锰酸钾溶液，在本发明的一个实施方案中，为过氧化氢溶液；所述反应增强剂为能增强底物发光的物质，当底物为鲁米诺或其衍生物时，反应增强剂包括但不限于对碘苯酚、对溴苯酚，在本发明的一个实施方案中，为对碘苯酚。

底物溶液在辅助发光溶液和反应增强剂的作用下发光，发光的强度与样本中人肌红蛋白的含量成正比。

在本发明中，洗涤液为能够去掉抗原抗体间非特异性结合的液体，例如磷酸盐缓冲液(PBS溶液)或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，同时还含有吐温-20，吐温-20的浓度为0.1-1‰，优选为0.2-0.8‰，更优选为0.3-0.6‰。在本发明的一个实施方案中，洗涤液(1000ml)的成分包括氯化钠(NaCl)2g，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.12H₂O)2.9g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.2g，氯化钾(KCl)0.2g，曲拉通X-100 0.5mL，吐温-20 0.5mL，布兰尼道克斯(Bronidox-L)5g。

在本发明中，将抗人肌红蛋白单克隆抗体连接在聚苯乙烯微孔板作为固相试剂。所述的抗体与微孔板的连接，可以是直接的，也可以是间接的(如通过生物素-亲和素系统等)；可以通过物理吸附(静电作用、离子键或疏水作用等)或化学偶联连接。

所述的标记抗体偶联方法是使用过碘酸钠活化辣根过氧化物酶，与抗体以1∶2至2∶1的比例混合，并使用凝胶层析纯化酶标抗体。

在本发明中，在加入待测样本后加入的抗人肌红蛋白抗体即为酶标二抗，与微孔板固相连接的抗人肌红蛋白抗体为一抗。

在加入酶标二抗后，即形成固相-抗体-抗原-酶标二抗的免疫夹心复合物。

发明的有益效果

1.使用两个单克隆抗体，特异性强，避免了干扰物的影响，使免疫反应的亲和力更高，而且单抗的生产批间差异相对小，更容易保证产品的批间稳定。

2.使用化学发光底物溶液，使检测的灵敏度和特异性得到了提高，而且线性范围更宽。

3.使用固相偶联后的抗体，可以使用物理方法分离结合的抗原或抗体，降低了非特异性结合。

4.本发明提供的人肌红蛋白检测方法和试剂盒，对肌红蛋白检测的灵敏度、特异性更高，结合其他临床症状就可以辅助判断检查者是否患有心肌坏死的病变，如心肌梗塞，心肌炎等。

附图说明

图1检测Myo浓度和发光值的标准曲线图。

其中横坐标为Myo浓度，单位为μg/L；纵坐标为发光值，单位为RLU(相对发光强度)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明中，所述的固相化的抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌红蛋白抗体购自芬兰Medix Biochemica公司，其均为抗人肌红蛋白单克隆抗体，其中一对克隆号为7001和7004，其对应的货号分别为100075和100076；另一对克隆号为7004和7005，其对应的货号分别为100076和100078。对于上述的每一对抗体，当其中一个作为固相化抗体时，另一个即为标记的抗体。

实施例1辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的制备

将抗人肌红蛋白单克隆抗体，浓度浓缩至2mg/mL。使用改良过的碘酸钠法进行标记，具体步骤为：

(1)5mg HRP(购自美国sigma公司)溶于0.5ml双蒸水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO₄水溶液0.5ml，混匀，置4℃，30min；

(2)加入0.16Mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min；

(3)加入含5mg纯化抗人肌红蛋白单克隆抗体(克隆号7001)的水溶液2.5ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；

(4)取出透析袋中溶液，加入NaBH₄溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃，2h；

(5)在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4PBS溶液溶解，装入透析袋，以0.02Mol/L pH7.4PBS液在4℃透析除盐，过夜；

(6)次日取出透析袋中溶液，离心，以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物(HRP标记的抗体)，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml。然后使用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和酶，将连接物保存于4℃。使用含0.1％牛血清白蛋白的Tris-HCI缓冲液(pH7.4)，将HRP标记的二抗稀释到1.0ug/mL，作为工作液。

实施例2包被抗体的吸附固定化

用0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲液(PBS溶液)稀释抗人肌红蛋白单克隆抗体(克隆号7004)到2.5μg/ml，加入聚苯乙烯的微孔板，100μL/孔，4℃过夜，用洗涤液清洗三次，用1％牛血清白蛋白300μL/孔常温封闭2小时后拍干备用。

洗涤液配制方法为：氯化钠(NaCl)2g，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.12H₂O)2.9g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.2g，氯化钾(KCl)0.2g，曲拉通X-100 0.5mL，吐温-20 0.5mL，布兰尼道克斯(Bronidox-L)5g，用纯化水配成1000mL，用0.2μm过滤器过滤，于室温保存。

实施例3包被抗体的亲和固定化

用0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲液稀释亲和素至1.0μg/ml，加入聚苯乙烯微孔板中，100μL/孔，4℃过夜，用洗涤液(配制方法同实施例2)清洗三次，加入生物素标记的抗人肌红蛋白抗体(克隆号7004)(生物素标记方法参看Thermofisher的Sulfo-NHS-Biotin的使用说明，货号是21217)，浓度1.0μg/ml，100μL/孔，4℃过夜，用洗涤液清洗三次，用1％牛血清白蛋白300μL/孔常温封闭2小时后拍干备用。

实施例4人肌红蛋白的酶促化学发光免疫检测

材料与设备：

1.人肌红蛋白标准品2-300μg/L。

其配制方法为：2g氯化钠，2.42g三羟基氨基甲烷，5g牛血清白蛋白，0.5mL普劳可林300。用1000mL纯化水溶解，用盐酸调pH至7.6，0.2μm过滤器过滤，于4℃保存，作为标准品稀释的缓冲液。按照pierce蛋白定量检测试剂BCA法确定人肌红蛋白纯品浓度，然后使用缓冲液进行稀释(标准品范围为2-300μg/L)，于4℃保存，用于制作标准曲线。

2.抗体固相包被微孔板：具体见实施例2。

3.辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体：具体见实施例1。

酶标抗体用稀释液稀释，稀释液配制方法为使用小牛血清加入0.5％普劳可林300，用0.45μm过滤器过滤.

4.洗涤液100mL，配制见实施例2。

5.化学发光底物工作液，参见专利“超高敏酶促化学发光液”，专利号为ZL91110621.9，其具体配方为1.25mmol/L鲁米诺，0.136mmol/L对-碘苯酚，10mmol/L Tris·HCL(pH8.6)，0.2％乙醇，0.3mmol/L NaCl，5mmol/L环己二胺四乙酸(CDTA)，4mmol/L的H₂O₂与4mmol/L的NaBO₃混合。

6.患者血清100份(其中50例临床诊断为心肌梗塞，50例为心肌缺血)，正常人血清100份。

7.MPC-1化学发光测定仪(北京源德医学生物工程有限公司)。

8.水浴箱(用于37℃温浴)。

操作步骤：

1.加样与免疫反应：在实施例2制备的抗体固相包被微孔板中加入20μL患者或正常血清样本，人肌红蛋白标准品，在每一微孔中加入实施例1制备的酶标抗体工作液100μL，混匀后，37℃温育30分钟。

2.洗涤：每孔加入300μL洗涤液，然后甩干。重复两次。

3.加入化学发光底物工作液：每孔加入100μL化学发光底物工作液。

4.加入底物和增强剂混合液后5分钟读取发光值：在发光测定仪测定每孔的发光值，测定时间为1秒钟。

5.检测结果：检测Myo浓度和发光值的标准曲线见图1。

对零标准点进行20次重复测试，取零标准点测定的平均值加上2倍的标准差，即为其灵敏度。本方法的灵敏度为＜0.5μg/L(摩尔浓度为0.75×10^-7M)。

对200例临床血清进行测定，化学发光法测定的正常范围上限为100μg/L，根据这个判断标准可以得到表1中的结果，同时胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附实验法的检测方法按照各自的说明书进行(胶体金试剂盒购自天津新湾生物科技有限公司，货号为TNG03A-1；ELISA检测试剂盒购自美国genway公司，货号为40-052-115041)。

检测结果见表1。

表1.各方法对于200份临床血清的检出情况

从以上结果可以看出，与胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附实验相比，本发明的化学发光免疫检测方法具有更高的灵敏度和特异性。

在本实施例中，所使用的固相化的抗人肌红蛋白抗体和酶标记的抗人肌红蛋白抗体分别为克隆号为7001和7004的抗体；发明人已证明，将两种抗体的位置交换(即固相化和酶标记的抗体的克隆号分别为7001和7004)也能取得相同的检测效果。同时，发明人还证明使用克隆号7004和7005的一对抗体也能达到相同的检测效果，其位置也可以互换。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (9)

1.一种人肌红蛋白检测方法，其包括以下步骤：

(1)将抗人肌红蛋白抗体固定在固相表面，加入待测样本和标记的抗人肌红蛋白抗体，温育，然后用洗涤液洗涤；任选地，同时设立人肌红蛋白标准品的对照；

(2)加入化学发光底物工作液，放置一段时间；

(3)测量发光值，得到待测样本的人肌红蛋白浓度值。

2.人肌红蛋白检测试剂盒，其包括：连接有抗人肌红蛋白抗体的微孔板，标记的抗人肌红蛋白抗体和化学发光底物工作液，所述化学发光底物工作液包括底物溶液、辅助发光溶液和反应增强剂。

3.权利要求2的试剂盒，其还包括洗涤液和人肌红蛋白标准品。

4.权利要求1的检测方法或权利要求2的试剂盒，其中所述的固相化抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌红蛋白抗体各自独立地为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体；所述的固相化抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌红蛋白抗体可以相同，也可以不相同。

5.权利要求1的检测方法或权利要求2的试剂盒，其中所述的标记物为过氧化物，优选为辣根过氧化物酶或烟草过氧化物酶。

6.权利要求5的检测方法或试剂盒，其中所述的底物为鲁米诺或其衍生物。

7.权利要求1的检测方法，其中步骤(1)中的温育为，在18-42℃、优选为20-37℃、例如为37℃条件下，温育5-120min，优选为温育10-60min，更优选为15-45min。

8.权利要求1的检测方法，其中步骤(1)中的洗涤液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，同时还含有吐温-20，其浓度为0.1-1‰，优选为0.2-0.8‰，更优选为0.3-0.6‰。

9.权利要求1的检测方法，其中步骤(2)中的放置一段时间为1-30min，优选为2-20min。

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