JP2008249534A - 免疫測定用担体 - Google Patents
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Abstract
【課題】 従来の免疫測定用担体では、高感度の測定ができないという問題があり、免疫測定法の測定感度を向上できる免疫測定用担体を提供する。
【解決手段】 抗体が結合したガラス担体において、官能基(A)を担体の表面積を基準として5×10-7mol/m2〜1×10-5mol/m2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ(オングストローム)が5〜25である二架橋性試薬(B)で結合することを特徴とする免疫測定用担体。
【選択図】なし
【解決手段】 抗体が結合したガラス担体において、官能基(A)を担体の表面積を基準として5×10-7mol/m2〜1×10-5mol/m2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ(オングストローム)が5〜25である二架橋性試薬(B)で結合することを特徴とする免疫測定用担体。
【選択図】なし
Description
本発明は、免疫測定用担体に関する。
従来、抗原や抗体を不溶性担体に結合させた固相化免疫試薬が多くの免疫学的測定用試薬として利用されている。不溶性担体上に抗体を結合させる方法は、ガラスとモノクローナル抗体を化学的に結合させる方法(特許文献1及び2参照)、およびプラスチックに抗体を物理吸着させる方法(非特許文献1参照)等がある。
米国特許第4280992号明細書
米国特許第3652761号明細書
イー・エングバール、ジェー・ジョンソン、ピー・パールマン、「バイオキミカ バイオフィジカ アクタ」、1971年、251巻、427〜434頁
しかし近年免疫測定法においては、更に測定感度を向上させる要求が高まっているが、上記の方法を用いた担体では大幅な感度の向上が望めない。
上記課題を解決するため鋭意検討した結果、不溶性担体上に抗体を結合させるための担体上の官能基の密度と担体と抗体との距離を特定の範囲内にすることで、大幅に感度が上昇することを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明は、抗体が結合したガラス担体において、官能基(A)を担体の表面積を基準として5×10-7mol/m2〜1×10-5mol/m2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ(オングストローム)が5〜25である二架橋性試薬(B)で結合することを要旨とする。
すなわち、本発明は、抗体が結合したガラス担体において、官能基(A)を担体の表面積を基準として5×10-7mol/m2〜1×10-5mol/m2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ(オングストローム)が5〜25である二架橋性試薬(B)で結合することを要旨とする。
本発明の免疫測定用担体は、微量の抗原に対しての反応性が良くなるため、低濃度域での測定感度を向上させることができる。従って、本発明の免疫測定用担体は、高感度な測定を必要とする臨床検査薬等へ適用できる。
ガラスの材質としては、ガラスであれば特に制限なく使用できるが、例えば、酸化物ガラス{ケイ酸塩ガラス(ケイ酸ガラス、ケイ酸アルカリガラス、ソーダ石灰ガラス、カリ石灰ガラス、鉛ガラス、バリウムガラス、ホウケイ酸ガラス等)、非酸化物ガラス(カルコゲナイトガラス、ハロゲン化物ガラス、炭酸塩ガラス、硝酸塩ガラス等)、金属ガラス(ジルコニア、ニッケル、銅等からなるガラス)及び有機ガラス等(アクリルガラス、ポリカーボネート等)が挙げられる。これらのうち、官能基(A)導入の容易さの観点から、酸化物ガラスが好ましく、さらに好ましくはケイ酸塩ガラス、特に好ましくはケイ酸ガラス(主要成分:SiO2)、ケイ酸アルカリガラス(主要成分:Na2O−SiO2)、ソーダ石灰ガラス(主要成分:Na2O−CaO−SiO2)、カリ石灰ガラス(主要成分:K2O−CaO−SiO2)、鉛(アルカリ)ガラス(主要成分:K2O−PbO−SiO2)、バリウムガラス(主要成分:BaO−SiO2−B2O3)及びホウケイ酸ガラス(主要成分:Na2O−B2O3−SiO2)、最も好ましくはソーダ石灰ガラス及びホウケイ酸ガラスである。
ガラス担体の形状としては、ビーズ状、試験管状、シャーレ状、チューブ状、トレイ状等が挙げられる。これらのうち、免疫学的測定法におけるB/F分離等の観点から、ビーズ状が好ましい。
ビーズの形状は、球状(真球状、楕円球状)、円盤状、棒状などが挙げられる。これらのうち、液中挙動等の観点から、球状が好ましく、さらに好ましくは真球状である。数平均ビーズ直径(mm)は、0.1〜20が好ましく、さら好ましくは1〜10、特に好ましくは2〜7である。
ガラス担体が試験管状の場合は、高さ(mm)が30〜70、底面の直径(mm)が1〜10であることが好ましい。シャーレ状の場合は、高さ(mm)が5〜20、底面の直径(mm)が10〜40であることが好ましい。チューブ状の場合は、高さ(mm)が10〜50であることが好ましく、トレイ状の場合は、高さ(mm)が5〜20、底面が20〜50四方であることが好ましい。
ガラスビーズを使用する場合は、市場から入手しうるガラスビーズは通常表面が滑面であるが、測定値の再現性等の観点から、表面スリ加工(表面の艶消し加工)を実施した後、使用するのが好ましい。スリ加工は従来公知の方法等が適用でき、例えば、化学大辞典(共立出版株式会社、1989年刊行)第5巻999頁記載の物理的方法及び化学的方法等が挙げられる。これらのうち、物理的方法が好ましく、さらに好ましくは加圧空気による砂吹き付け(サンドブラスト)法及び砂掛け磨き(ブラシを水で湿して磨く)法、特に好ましくはサンドブラスト法である。
官能基(A)としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基などが挙げられる。抗体との結合性及び二架橋性試薬との結合性等の観点から、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、エポキシ基が好ましく、さらに好ましくは、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、特に好ましくはアミノ基、チオール基である。
担体に官能基(A)を導入する方法としては、化学吸着法でシランカップリング剤を用いて導入する方法(例えば、P.J. Robinsonら Biochim.Biophys.Acta, 242巻 1971年 p.659-661に記載の方法)等が挙げられる。
より具体的には、(A)がアミノ基の場合、N−2(アミノエチル)3-アミノプロピルメチルジメトキシシランや3−アミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を用いてガラス担体に化学吸着法で導入する方法等が挙げられる。(A)がチオール基の場合、3-メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン等のチオール基を有するシランカップリング剤で導入できる。(A)がエポキシ基の場合は、エポキシ基を有するシランカップリング剤を用いて導入できる。
担体へ導入する官能基(A)の量(mol/m2)は、免疫反応等の観点から、担体の表面積を基準として5×10-7〜1×10-5であり、好ましくは、7×10-7〜8×10-6、さらに好ましくは9×10-7〜5×10-6である。下限未満では、結合できる抗体量が少なくなり、上限を超える場合、抗原との反応性が低下する。
担体の表面積は、表面が滑面な担体の場合は計算で求める。すりガラスビーズの表面積は測定が困難なため、特開2002-098700号公報に記載の方法を用いて加工したすりガラスビーズを滑面のガラスビーズの表面積と仮定して求める。
導入する官能基(A)の量は、使用するシランカップリング剤の使用量で制御できる。官能基量は、アミノ基の場合は、ニンヒドリン試薬を用いてDYDA(ジケトヒドリンジリデン・ジケトヒドリンダミン)の吸光度を測定して求められ、チオール基の場合は、DTNB{5,5’-ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)}溶液をチオール基と反応させて生成される5−メルカプト-2-ニトロ安息香酸の吸光度を測定することで求められる。カルボキシル基の場合は、酸価測定で求められ、エポキシ基の場合は、エチレンジアミンを反応させ、反応したエチレンジアミンを前述したアミノ基の定量と同様の測定方法で測定することで求められる。
二架橋性試薬(B)は官能基(A)と抗体のアミノ基あるいはカルボキシル基とを結合させるために用いる。二架橋性試薬(B)としては、(A)がアミノ基の場合、アルデヒド{GA(Glutaraldehyde)、OA(Oxalaldehyde)等}、スクシンイミド{DSG(Disuccinimidyl glutarate)、DSP(Dithiobis[succinimidyl propionate])、DSS(Disuccinimidyl suberate)、MBS(m−Maleimidobenzyl−N−hydroxysuccinimide ester)、BS3(Bis[Sulfosuccinimidyl]suberate)等}、イミド{DMS(Dimethyl suberimidate・2HCl)、EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)等}等が使用できる。(A)がチオール基の場合、スルフィド{PDPH(3-[2-Pyridyldithio]propionyl hydrazide)、SPDP(N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionate)、Sulfo−LC−SPDP(Sulfosuccinimidyl 6-[3’-(2-pyridyldithio)-propionamide]hexanoate)等}、マレイミド{BMH(Bis-Maleimidohexane)、SMCC(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate)等}等が使用できる。(A)がカルボキシル基の場合、イミド{EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)等}等が使用できる。また(A)がエポキシ基の場合、カルボン酸{EMCA(N-ε-Maleimidocaproic acid)、KMUA(N-κ-Maleimidoundecanoic acid)等}等が使用できる。
さらに、両末端にアミノ基を有するジアミン及び/又は両末端にカルボキシル基を有するジカルボン酸と上記の二架橋性試薬とを反応させたものも二架橋性試薬(B)として用いることができる。ジアミンとしては、直鎖脂肪族ジアミン(尿素、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等)、芳香族ジアミン(ジアミノベンゼン、ジアミノフェノール、ジアミノメチルベンゼン等)等が挙げられる。ジカルボン酸としてはグルタル酸、アジピン酸、スベリン酸及びセバシン酸等が挙げられる。例えば官能基(A)がアミノ基の場合、アミノ基にグルタルアルデヒド、エチレンジアミン、グルタルアルデヒド、抗体の順に結合させることができるが、この場合グルタルアルデヒドとエチレンジアミンとグルタルアルデヒドとの反応物が二架橋性試薬(B)となる。
スペーサーアームの長さ(オングストローム)は、反応性及び測定感度の観点から、5〜25であり、好ましくは8〜20、さらに好ましくは12〜18である。
スペーサーアームの長さとは、官能基(A)と二架橋性試薬(B)と抗体との反応で形成した結合鎖のうち、二架橋性試薬(B)由来部分の結合鎖の長さである。
スペーサーアームの長さは、量子化学計算により求められる。該長さは、例えば、量子力学計算ソフトCACheのPM3法により算出できる。CACheシステムのPM3法は、例えば富士通社製のCAChe WORKSYSTEM5.02を使用して計算することができる。該長さは、WorkSpace上で計算したい分子構造を描き、PM3geometryで構造最適化することで算出できる。構造最適化においては、初期構造を基にして半経験的パラメータが選ばれ、分子のエネルギーと原子にかかる力が量子計算される。PM3法は計算に必要な積分を実験値から定めた半経験的分子軌道法の一種であり、真空中の部分電荷を求めることが出来る。上記PM3法は、「分子軌道法MOPACガイドブック、海文堂出版株式会社、1994年9月15日2訂版」等に記載の計算方法に基づくものである。
なお、市販の二架橋性試薬のスペーサーアームの長さは、試薬カタログに記載されている。
スペーサーアームの長さとは、官能基(A)と二架橋性試薬(B)と抗体との反応で形成した結合鎖のうち、二架橋性試薬(B)由来部分の結合鎖の長さである。
スペーサーアームの長さは、量子化学計算により求められる。該長さは、例えば、量子力学計算ソフトCACheのPM3法により算出できる。CACheシステムのPM3法は、例えば富士通社製のCAChe WORKSYSTEM5.02を使用して計算することができる。該長さは、WorkSpace上で計算したい分子構造を描き、PM3geometryで構造最適化することで算出できる。構造最適化においては、初期構造を基にして半経験的パラメータが選ばれ、分子のエネルギーと原子にかかる力が量子計算される。PM3法は計算に必要な積分を実験値から定めた半経験的分子軌道法の一種であり、真空中の部分電荷を求めることが出来る。上記PM3法は、「分子軌道法MOPACガイドブック、海文堂出版株式会社、1994年9月15日2訂版」等に記載の計算方法に基づくものである。
なお、市販の二架橋性試薬のスペーサーアームの長さは、試薬カタログに記載されている。
二架橋性試薬(B)としては、枝分かれがなく、(A)、(B)及び抗体の結合形成に関与する官能基間で立体障害が起こらない等の観点から、オキサルアルデヒド及び/又はグルタルアルデヒドと直鎖脂肪族アルキルジアミンとを結合させてなる試薬が好ましい。
抗体としては、例えば、次の抗原に対する抗体等が挙げられる。
(1)タンパク質関連物質:AFP、CEA、CA19−9、CA125、CA15−3、CA72−4、CA50、トロポニンI、トロポニンT、ペプシノゲンI、ペプシノゲンII、PSA、PAP、SCC,KMO1、NSE、IgE、特異IgE、β2−ミクログロブリン、フェリチン、IAP、C3、C4、C5、CRP、α2−MG、IgA、IgM、IgG、IgE、IgD、CK−MB、CK−MM、ミオグロビン、ミオシン、トランスフェリン、アポリポタンパク、糖タンパク、アルブミン、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、グリコヘモグロビン、フルクトサミン、HDL、LDL、RF、リンパ球サブセット、LE細胞、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体及びASO等。
(1)タンパク質関連物質:AFP、CEA、CA19−9、CA125、CA15−3、CA72−4、CA50、トロポニンI、トロポニンT、ペプシノゲンI、ペプシノゲンII、PSA、PAP、SCC,KMO1、NSE、IgE、特異IgE、β2−ミクログロブリン、フェリチン、IAP、C3、C4、C5、CRP、α2−MG、IgA、IgM、IgG、IgE、IgD、CK−MB、CK−MM、ミオグロビン、ミオシン、トランスフェリン、アポリポタンパク、糖タンパク、アルブミン、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、グリコヘモグロビン、フルクトサミン、HDL、LDL、RF、リンパ球サブセット、LE細胞、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体及びASO等。
(2)ホルモン関連物質:インスリン、HGC、β−HCG、成長ホルモン、TSH、LH、FSH、プロラクチン、T3、T4、FT3、FT4、TBG、C−ペプチド、T−Uptake、エストロゲン、HPL、E2、コルチゾール、プロゲステロン、テストステロン及びソマトスタチン等。
(3)薬物関連物質:ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール及びテオフィリン等。
(3)薬物関連物質:ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール及びテオフィリン等。
(4)感染症関連物質:真菌、連鎖球菌、大腸菌、結核菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、カンシダ、マイコプラズマ、トキソプラズマ、梅毒、マラリア原虫及び赤痢アメーバー等そのもの自体、並びにこれらに対する抗体及びこれらの代謝物等。
(5)環境・食品関連物質:環境ホルモン(エストラジオール等の性ホルモン、ペンタクロロフェノール、アトラジン、アラクロール、シマジン、メソミル、ドリン、アルディアルブ、ベミノル、PCB、ダイオキシン及びDDT等)、農薬(スミチオン、α−ベンゾピエン、フェンバレレート及びメトリブジン等)、貝毒・藍藻毒(サキシトキシン、マイクロシスチン及びゴニオトキシン等)、及びカビ毒(アフラトキシン、オクラトキシン及びゼラレノン等)等。
これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるF(ab’)2、Fab’又はFabであってもよい。
(5)環境・食品関連物質:環境ホルモン(エストラジオール等の性ホルモン、ペンタクロロフェノール、アトラジン、アラクロール、シマジン、メソミル、ドリン、アルディアルブ、ベミノル、PCB、ダイオキシン及びDDT等)、農薬(スミチオン、α−ベンゾピエン、フェンバレレート及びメトリブジン等)、貝毒・藍藻毒(サキシトキシン、マイクロシスチン及びゴニオトキシン等)、及びカビ毒(アフラトキシン、オクラトキシン及びゼラレノン等)等。
これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるF(ab’)2、Fab’又はFabであってもよい。
本発明の免疫測定用担体は、官能基(A)を導入した担体に、二架橋性試薬(B)と抗体とを化学反応させて得ることができる。すなわち、本発明の免疫測定用担体の製造方法としては、(A)を導入した担体と二架橋性試薬(B)とを化学結合させて二架橋性試薬結合担体を得る工程(1)、及び二架橋性試薬結合担体と抗体とを化学結合させて免疫測定用担体を得る工程(2)を含む。
工程(1)は、従来公知の方法、例えば米国特許第4280992号明細書及び同第3652761号明細書に記載された方法等に準じて行うことができる。
工程(2)は、工程(1)と同様に従来公知の方法が適用できる。
シランカップリング剤を用いた化学吸着法の一例を以下に示す。1%のγ−アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液にすりガラスビーズを加え、1時間、25℃で反応させ、反応後、水で洗浄する。次いで、2%のグルタルアルデヒド水溶液を加え、1時間、25℃で反応させ、反応後、水で洗浄する。さらに抗体を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)を加え、1時間、25℃で反応させ、反応後、抗体液を除去し、0.1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)に浸漬する。
本発明の免疫測定用担体の大きさとしては、免疫測定担体がビーズ状の場合は、ビーズ直径は測定対象物及び必要とする測定感度等により適宜選択することができ、この数平均直径(mm)は、0.1〜20が好ましく、さらに好ましくは1〜10、特に好ましくは2〜7である。この範囲であると、測定感度がさらに良好となる。試験管状、シャーレ状、チューブ状、トレイ状の場合の好ましい範囲は、前述したガラス担体と同様である。
本発明の免疫測定用担体は、従来公知の免疫測定用担体と同様に免疫測定に使用できる。免疫測定方法には、本発明の免疫測定用担体と測定対象物を含む検体とを反応させる工程、及びペルオキシダーゼ標識抗体を反応させる工程、ルミノール、過酸化水素溶液を用いて化学発光させる工程等が含まれる。免疫測定の方法は、発光を検出する方法であれば、特に限定はなく従来公知の方法、酵素免疫測定法(EIA法)、蛍光免疫測定法(FIA法)、化学発光免疫測定法(CLIA法)、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA法)が適用できる。本発明の免疫測定用担体は、適当な緩衝剤(リン酸緩衝液等のpH緩衝剤等)、化学発光試薬等と組み合わせて免疫測定用キットとすることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
実施例1 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−1)の作製
20mlポリエチレン瓶に0.2重量%のγ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液(ナカライテスク)10重量部を仕込み、さらにガラスビーズ((株)岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス)を特開2002-098700の方法を用いて加工したすりガラスビーズ22重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに5回行って、アミノ基導入ガラスビーズを得た。次いで、2重量%のグルタルアルデヒド(和光純薬工業(株)製)水溶液10重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行って、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。次に抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)10重量部を仕込み、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬した後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で3時間浸漬させた後、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−1)を得た。
20mlポリエチレン瓶に0.2重量%のγ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液(ナカライテスク)10重量部を仕込み、さらにガラスビーズ((株)岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス)を特開2002-098700の方法を用いて加工したすりガラスビーズ22重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに5回行って、アミノ基導入ガラスビーズを得た。次いで、2重量%のグルタルアルデヒド(和光純薬工業(株)製)水溶液10重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行って、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。次に抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)10重量部を仕込み、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬した後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で3時間浸漬させた後、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−1)を得た。
実施例2 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−2)の作製
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.02重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(A−2)を得た。
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.02重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(A−2)を得た。
実施例3 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−3)の作製
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.002重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(A−3)を得た。
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.002重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(A−3)を得た。
実施例4 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−4)の作製
実施例1と同様にして、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。このビーズに、さらに2重量%のエチレンジアミン水溶液10重量部を加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った。その洗浄後のガラスビーズを2重量%のグルタルアルデヒド水溶液10重量部に加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った後、抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)10重量部を加え、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬し、その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で、3時間浸漬させ、乾燥させ、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−4)を得た。
実施例1と同様にして、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。このビーズに、さらに2重量%のエチレンジアミン水溶液10重量部を加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った。その洗浄後のガラスビーズを2重量%のグルタルアルデヒド水溶液10重量部に加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った後、抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)10重量部を加え、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬し、その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で、3時間浸漬させ、乾燥させ、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−4)を得た。
実施例5 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−5)の作製
実施例4において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.02重量%とした以外、実施例4と同様にして、免疫測定用担体(A−5)を得た。
実施例4において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.02重量%とした以外、実施例4と同様にして、免疫測定用担体(A−5)を得た。
実施例6(A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−6)の作製
実施例4において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.002重量%とした以外、実施例4と同様にして、免疫測定用担体(A−5)を得た。
実施例4において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.002重量%とした以外、実施例4と同様にして、免疫測定用担体(A−5)を得た。
実施例7 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−7)の作製
実施例1と同様にして、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。このビーズに、さらに2重量%のへキサメチレンジアミン水溶液10重量部を加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った。その洗浄後のガラスビーズを2重量%のグルタルアルデヒド水溶液10重量部に加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った。その後、抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)10重量部を加え、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬し、その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で、3時間浸漬させ、乾燥させ、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−7)を得た。
実施例1と同様にして、グルタルアルデヒド結合ガラスビーズを得た。このビーズに、さらに2重量%のへキサメチレンジアミン水溶液10重量部を加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った。その洗浄後のガラスビーズを2重量%のグルタルアルデヒド水溶液10重量部に加え、1時間、25℃で反応させた。反応後、脱イオン水15重量部を加えて反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行った。その後、抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)10重量部を加え、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬し、その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で、3時間浸漬させ、乾燥させ、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−7)を得た。
実施例8 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−8)の作製
実施例7において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.02重量%とした以外、実施例7と同様にして、免疫測定用担体(A−8)を得た。
実施例7において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.02重量%とした以外、実施例7と同様にして、免疫測定用担体(A−8)を得た。
実施例9 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(A−9)の作製
実施例7において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.002重量%とした以外、実施例7と同様にして、免疫測定用担体(A−9)を得た。
実施例7において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.002重量%とした以外、実施例7と同様にして、免疫測定用担体(A−9)を得た。
実施例10 (A)がチオール基の場合の免疫測定用担体(A−10)の作製
20mlポリエチレン瓶に0.02重量%3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液(東京化成工業(株)製)に10重量部を仕込み、さらにガラスビーズ((株)岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス)を特開2002-098700の方法を用いて加工したすりガラスビーズ22重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに5回行って、チオール基導入ガラスビーズを得た。次いで8.0×10-4mol/lのSulfo−GMBS (N-(4-Maleimidobutyryloxy)-sulfosuccinimide sodium salt)(同仁化学研究所製)水溶液10重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行って、スクシンイミド基結合ガラスビーズを得た。次に抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)15重量部を仕込み、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬し反応液をアスピレーターで吸引除去した。その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で3時間浸漬させた後、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−10)を得た。
20mlポリエチレン瓶に0.02重量%3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液(東京化成工業(株)製)に10重量部を仕込み、さらにガラスビーズ((株)岡部製作所製、ケイ酸塩ガラス)を特開2002-098700の方法を用いて加工したすりガラスビーズ22重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作をさらに5回行って、チオール基導入ガラスビーズを得た。次いで8.0×10-4mol/lのSulfo−GMBS (N-(4-Maleimidobutyryloxy)-sulfosuccinimide sodium salt)(同仁化学研究所製)水溶液10重量部を仕込み、1時間、25℃で反応させた。反応後、反応液をアスピレーターで吸引除去した。脱イオン水15重量部を加えて、ポリエチレン瓶をゆっくりと2回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を10回行って、スクシンイミド基結合ガラスビーズを得た。次に抗AFPモノクローナル抗体(Dako社製)を20μg/mLの濃度で含む0.02Mリン酸緩衝液(pH8.7)15重量部を仕込み、2時間、25℃で反応させた。反応後、抗AFP抗体含有リン酸緩衝液を除去し、抗AFP抗体結合ガラスビーズを作製した。これを1%の牛血清アルブミン含有の0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2)15重量部に2〜8℃の冷蔵で、12時間浸漬し反応液をアスピレーターで吸引除去した。その後15重量%のショ糖含有ADA緩衝液15重量部に25℃で3時間浸漬させた後、ろ紙上で風乾させて、免疫測定用担体(A−10)を得た。
実施例11 (A)がチオール基の場合の免疫測定用担体(A−11)の作製
実施例10において、Sulfo−GMBSをSulfo−KMUS (N-(4-Maleimidoundecanoyloxy)-sulfosuccinimide sodium salt)(同仁化学研究所製)とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(A−11)を得た。
実施例10において、Sulfo−GMBSをSulfo−KMUS (N-(4-Maleimidoundecanoyloxy)-sulfosuccinimide sodium salt)(同仁化学研究所製)とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(A−11)を得た。
実施例12 (A)がチオール基の場合の免疫測定用担体(A−12)の作製
実施例10において、Sulfo−GMBSをSulfo−LC−SMPT (Sulfosuccinimidyl-6-[α-(2-pyridyldithio)toluamido]hexanoate) (同仁化学研究所製)とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(A−12)を得た。
実施例10において、Sulfo−GMBSをSulfo−LC−SMPT (Sulfosuccinimidyl-6-[α-(2-pyridyldithio)toluamido]hexanoate) (同仁化学研究所製)とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(A−12)を得た。
比較例1 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(H−1)の作製
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から1重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(H−1)を得た。
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から1重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(H−1)を得た。
比較例2 (A)がアミノ基の場合の免疫測定用担体(H−2)の作製
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.0002重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(H−2)を得た。
実施例1において、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液の濃度を0.2重量%から0.0002重量%とした以外、実施例1と同様にして、免疫測定用担体(H−2)を得た。
比較例3 (A)がチオール基の場合の免疫測定用担体(H−3)の作製
実施例10において、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液の濃度を0.02重量%から1重量%とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(H−3)を得た。
実施例10において、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液の濃度を0.02重量%から1重量%とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(H−3)を得た。
比較例4 (A)がチオール基の場合の免疫測定用担体(H−4)の作製
実施例10において、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液の濃度を0.02重量%から0.0002重量%とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(H−4)を得た。
実施例10において、3−メルカプトプロピルトリメトキシシラン水溶液の濃度を0.02重量%から0.0002重量%とした以外、実施例10と同様にして、免疫測定用担体(H−4)を得た。
<測定感度の評価>
実施例1〜12及び比較例1〜4の免疫測定用担体(A−1)〜(A−12)及び(H−1)〜(H−4)を用いて、以下の測定方法により測定し、測定感度を求めた。
測定は全自動酵素免疫測定装置{スフィアライト180(オリンパス(株)製)}を用いで行った。「AFP測定用臨床検査薬{三洋化成工業(株)製、商品名:スフィアライトAFP}添付文書記載の方法」(a.免疫測定用担体1個が入った反応層に検体10μL及び免疫反応用緩衝液130μLを加え、37℃、約7分間反応させる(第1反応)。b.B/F分離、洗浄を行なう。c.酵素標識抗体液140μLを加えて、37℃、7分間反応させる(第2反応)。d.B/F分離、洗浄を行なう。e.基質液70μL及び過酸化水素液70μLを加える(酵素反応)。e.発光量を測定する。)に準じて、標準AFP溶液(AFP濃度0及び5ng/mL)を測定した。得られた化学発光量を、表1に示した。なお、AFP濃度0ng/mLの溶液を用いた場合の発光量を、ブランクの発光量(D)とし、AFP濃度5ng/mLの溶液を用いた場合の発光量を、化学発光量(C)とした。また、化学発光量(C)を、ブランクの発光量(D)で除した値(C/D)を測定感度として表1に示した。
実施例1〜12及び比較例1〜4の免疫測定用担体(A−1)〜(A−12)及び(H−1)〜(H−4)を用いて、以下の測定方法により測定し、測定感度を求めた。
測定は全自動酵素免疫測定装置{スフィアライト180(オリンパス(株)製)}を用いで行った。「AFP測定用臨床検査薬{三洋化成工業(株)製、商品名:スフィアライトAFP}添付文書記載の方法」(a.免疫測定用担体1個が入った反応層に検体10μL及び免疫反応用緩衝液130μLを加え、37℃、約7分間反応させる(第1反応)。b.B/F分離、洗浄を行なう。c.酵素標識抗体液140μLを加えて、37℃、7分間反応させる(第2反応)。d.B/F分離、洗浄を行なう。e.基質液70μL及び過酸化水素液70μLを加える(酵素反応)。e.発光量を測定する。)に準じて、標準AFP溶液(AFP濃度0及び5ng/mL)を測定した。得られた化学発光量を、表1に示した。なお、AFP濃度0ng/mLの溶液を用いた場合の発光量を、ブランクの発光量(D)とし、AFP濃度5ng/mLの溶液を用いた場合の発光量を、化学発光量(C)とした。また、化学発光量(C)を、ブランクの発光量(D)で除した値(C/D)を測定感度として表1に示した。
<官能基(A)の量の測定>
(1)(A)がアミノ基の場合
実施例1〜9および比較例1〜2で作製した免疫測定用担体を用いて以下の方法により(A)の量を求めた。(A)の量を表1に示した。
免疫測定用担体10個を試験管にとり、脱イオン水1.0mlを加える。L8500形日立高速アミノ酸分析計用のニンヒドリン試薬(A液)7.5mlと緩衝液(B液)2.5ml(和光純薬工業(株))を混合した混合液2.0mlを試験管に加えよく混合する。試験管をパラフィルムで蓋をし、沸騰水中で15分間加熱し、加熱後5分間20℃の冷水で冷却する。アミノ基とニンヒドリンを反応させて生成するDYDA(ジケトヒドリンジリデン・ジケトヒドリンダミン)の570nmの吸光度を測定し、DYDAの分子吸光係数より免疫測定用担体1個あたりのアミノ基量を求める。
(2)(A)がチオール基の場合
実施例10〜12および比較例3〜4で作製した免疫測定用担体を用いて以下の方法により(A)の量を求めた。
免疫測定用担体10個を試験管にとり、リン酸緩衝液3.0mlを加える。20±10mmHgの減圧度で気泡を発生しなくなるまで脱気する。DTNB(5,5’-ジチオビス(2−ニトロ安息香酸))(和光純薬工業(株)製)を40mgをリン酸緩衝液10mlに溶解したDTNB試薬を20μl加え、混合する。試験管をパラフィルムで蓋をし、2時間振動攪拌する。チオール基にDTNBを反応させて生成する5−メルカプト-2-ニトロ安息香酸の412nmの吸光度を測定し、5−メルカプト-2-ニトロ安息香酸の分子吸光係数より免疫測定用担体1個あたりのチオール基量を求める。
(1)(A)がアミノ基の場合
実施例1〜9および比較例1〜2で作製した免疫測定用担体を用いて以下の方法により(A)の量を求めた。(A)の量を表1に示した。
免疫測定用担体10個を試験管にとり、脱イオン水1.0mlを加える。L8500形日立高速アミノ酸分析計用のニンヒドリン試薬(A液)7.5mlと緩衝液(B液)2.5ml(和光純薬工業(株))を混合した混合液2.0mlを試験管に加えよく混合する。試験管をパラフィルムで蓋をし、沸騰水中で15分間加熱し、加熱後5分間20℃の冷水で冷却する。アミノ基とニンヒドリンを反応させて生成するDYDA(ジケトヒドリンジリデン・ジケトヒドリンダミン)の570nmの吸光度を測定し、DYDAの分子吸光係数より免疫測定用担体1個あたりのアミノ基量を求める。
(2)(A)がチオール基の場合
実施例10〜12および比較例3〜4で作製した免疫測定用担体を用いて以下の方法により(A)の量を求めた。
免疫測定用担体10個を試験管にとり、リン酸緩衝液3.0mlを加える。20±10mmHgの減圧度で気泡を発生しなくなるまで脱気する。DTNB(5,5’-ジチオビス(2−ニトロ安息香酸))(和光純薬工業(株)製)を40mgをリン酸緩衝液10mlに溶解したDTNB試薬を20μl加え、混合する。試験管をパラフィルムで蓋をし、2時間振動攪拌する。チオール基にDTNBを反応させて生成する5−メルカプト-2-ニトロ安息香酸の412nmの吸光度を測定し、5−メルカプト-2-ニトロ安息香酸の分子吸光係数より免疫測定用担体1個あたりのチオール基量を求める。
表1より(A)の量を本発明の範囲にした実施例は、低濃度域の感度が上昇した。また特にスペーサーアームの長さが約16オングストロームの場合(実施例5)に、比較例1(H−1)と比べて低濃度域の感度を約2倍以上上昇させることができた。
本発明の免疫測定用担体を用いることで、低濃度域での測定感度を向上させることができる。従って、本発明の免疫測定用担体は、高感度な測定を必要とする臨床検査薬等へ適用でき、高感度な臨床検査が可能になる。
Claims (5)
- 抗体が結合したガラス担体において、官能基(A)を担体の表面積を基準として5×10-7mol/m2〜1×10-5mol/m2有する担体と抗体とを、スペーサーアームの長さ(オングストローム)が5〜25である二架橋性試薬(B)で結合することを特徴とする免疫測定用担体。
- (A)がアミノ基、チオール基及びカルボキシル基からなる群より選ばれる少なくとも1種の官能基である請求項1に記載の免疫測定用担体。
- (B)がグルタルアルデヒドと直鎖アルキルジアミンを結合させてなる試薬である請求項1又は2に記載の免疫測定用担体。
- ガラス担体がすりガラスビーズである請求項1〜3のいずれかに記載の免疫測定用担体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の免疫測定用担体と測定対象物を含む検体とを反応させる工程、ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させる工程、ルミノール及び過酸化水素溶液を用いて化学発光させる工程、並びに、発光強度を計測する工程を含んでなることを特徴とする免疫測定法。
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