CN103063831A

CN103063831A - 烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法

Info

Publication number: CN103063831A
Application number: CN2013100133117A
Authority: CN
Inventors: 陈欢; 刘彤; 侯宏卫; 韩书磊; 庞永强; 姜兴益; 李中皓; 张洪非; 李雪; 刘楠; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2033-01-15
Also published as: CN103063831B

Abstract

本发明涉及一种烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，适用于烟叶样品和烟丝样品中黄曲霉毒素的准确测定。本发明方法包括样品的前处理，样品中黄曲霉毒素的提取，标准工作溶液的配制，检测方法的优化，酶联免疫测定方法的建立等步骤，该方法能快速、准确检测烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的含量，实验操作简单，非特异性吸附少，仪器设备投资少，测定成本低廉测定结果准确可靠。

Description

烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法

技术领域：

本发明涉及烟草及烟草制品中黄曲霉毒素（AFT）的测定技术，具体说是涉及一种烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法。

背景技术：

烟草是世界许多地区的主要经济作物。但是，在烟叶初加工、贮运、烟厂生产和烟制品销售等环节中，一旦温度、湿度和水分等环境条件适宜,极易滋生各种微生物而使烟叶发霉变质，致使烟叶及其制品产量降低，品质下降，造成重大的经济损失。在烟草行业中，控制烟叶的霉变，不仅仅为了降低因烟叶霉变造成的经济损失，更是出于保障卷烟产品安全性的目的。

已报道的能使烟叶、烟丝和卷烟霉变的霉菌多达130属231种。常见霉菌的优势菌主要有曲霉、青霉和毛霉等。这些霉菌除了影响烟叶品质外，还包括黄曲霉、赭曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、桔青霉等产毒霉菌，产毒霉菌会通过自身代谢产生对人体有显著毒性霉菌毒素，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等。其中，黄曲霉毒素是目前发现最强的化学致癌物质，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。目前，食品及饲料中真菌毒素的检测已引起了国际上许多国家的高度重视。我国针对食品及饲料中的真菌毒素制定了严格的检测标准和限量要求，是重要的安全性评价指标。卷烟作为一种供消费者吸食的特殊商品，其卫生指标和安全性一直受到消费者和烟草行业的高度关注。目前，还没有相关文献和专利报道我国烟草及烟草制品中真菌毒素的测定方法。

目前针对食品中黄曲霉毒素的检测方法主要为两种，一种是液相色谱与荧光检测器或质谱检测器联用技术，另一种是酶联免疫测定方法（ELISA）。后者利用免疫、酶及生化技术联用实现黄曲霉毒素含量的测定。该方法具有特异性好，检测结果稳定准确，实验操作简便，检测通量高、可实现现场分析等优势。

发明内容：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种适用于烟草及烟草制品中黄曲霉毒素测定的酶联免疫测定方法，本发明通过优化烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的提取方法，使用表面修饰抗体，内部包埋辣根过氧化物酶（HRP酶）的脂质体作为信号放大技术，提高酶联免疫检测方法的灵敏度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，包括以下工艺步骤：

（1）样品前处理：烟叶样品或烟丝在40 ℃下烘干，在粉碎机上粉碎，过40目筛；

（2）样品中黄曲霉毒素的提取：称取5 g经前处理的烟末样品和0.5 g氯化钠置于100 mL具塞锥形烧瓶中，加入20 mL的80%的甲醇水溶液，盖好盖子置于振荡器上高速振荡5分钟，静置3分钟使样品沉淀，用玻璃纤维滤纸过滤10 mL萃取液，收集滤液到干净容器中，取5 mL萃取液，加入20 mL水稀释，混匀后待测；

（3）标准工作液的配制：用16%的甲醇水溶液配制不同浓度的黄曲霉毒素标准工作溶液，浓度分别为1 ng/mL,2 ng/mL,7.5 ng/mL，25 ng/mL,100 ng/mL。

（4）酶联免疫法测定：在96孔板表面固定黄曲霉毒素-牛血清白蛋白（AFT-BSA）偶联物，加入标准工作溶液或检测样品，随后立即加入表面抗体修饰、辣根酶包埋的脂质体溶液，反应20分钟后清除微孔板内溶液并洗涤，加入含有1%十二烷基磺酸钠（SDS）的四甲基联苯胺（TMB）底物，避光反应20分钟，加入终止液，在450nm处检测紫外吸收。

本发明中，在酶标板中进行偶联抗原的包被，通过对包被抗原浓度进行优化，偶联物浓度达到25μg/mL时为最佳，向96孔微孔板中加入由包被液稀释的25μg/mL的偶联抗原（AFT-BSA），每孔100μL，4℃过夜。

酶联免疫法测定的具体步骤如下：

(1)抗原包被：酶标板中加入由包被液稀释的25μg/mL的黄曲霉毒素-牛血清白蛋白（AFT-BSA）偶联抗原，每孔100μL，4℃过夜；

(2)洗板：用PBS缓冲液洗板3次，每次5min；

(3)封闭：每孔加入100μL封闭液，37℃封闭1h，重复洗板过程；

(4)加AFT标准品和抗体标记的脂质体：加入50μL不同浓度的AFT标准品或待测样品；随后加入50μL表面标记抗体内部包埋HRP酶的脂质体溶液，室温下孵育30min，进行间接竞争ELISA反应，重复洗板过程，最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻转微孔板在吸水纸上拍干；

(5)加入底物：每孔加入100μL含有1%十二烷基磺酸钠（SDS）的四甲基联苯胺（TMB）底物，室温下避光反应30min；

(6)终止反应：每孔加入100μL终止液，终止反应；

(7)检测：用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度。

本发明所采用的包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6；洗涤液：磷酸盐缓冲液，pH7.3；封闭液：含1%BSA的磷酸盐缓冲液；抗体稀释液：磷酸盐缓冲液，pH7.3；终止液：1M 盐酸。

本发明中制备AFT-BSA偶联物的方法：由于黄曲霉毒素是小分子半抗原，因此采用碳二亚胺方法将其与载体蛋白进行偶联。其反应原理是利用碳二亚胺使羧基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，然后再BSA蛋白交联形成偶联物。

本发明中制备表面标记抗体，包埋HRP酶的脂质体的方法：脂质体可以通过内部包埋或表面修饰等方法，成为多种功能团分子的通用载体。脂质体的内部水相可以包裹几乎任何标记物，脂质体表面可以通过各种物理或化学方法修饰官能团。本方法中，通过脂质体制备过程中加入HRP酶成份，从而在脂质体内部包埋HRP酶。此外，通过在脂质体的制备原料中加入含有氨基基团的PE成分，从而在脂质体表面引入氨基。通过戊二醛共价交联法在脂质体表面标记兔抗黄曲霉毒素抗体。

本发明的方法克服了现有黄曲霉毒素酶联免疫测定方法的不足，利用表面修饰抗体，内部包埋HRP酶的脂质体作为信号放大技术提高了检测灵敏度，简化了样品前处理步骤，加快了样品检测速度，并优化了实验条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

①利用表面修饰抗体，内部包埋HRP酶的脂质体作为信号放大技术提高了检测灵敏度。

②本发明方法具有操作步骤简单，成本低，消耗少的特点。

③本方法具有高通量的优势，能同时实现96个样品的同时测定。

④本发明具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。方法检出限为0.524ng/mL，平均回收率为101.0%，平均相对标准偏差为5.2%。

附图说明

图 1.本发明的测定方法流程图。

图 2. 黄曲霉毒素的标准工作曲线示图。

图3. 脂质体中脑磷脂成分含量的优化示图。

图4. 黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联抗原的包被浓度的优化示图。

具体实施方式

本发明以下结合附图将具体的工艺过程进一步详述如下：

1. 样品前处理：称取烟叶样品或烟草制品约20克，不立即分析的样品应置于冰箱中冷藏保存。将收集的烟叶样品或烟丝样品在40℃下烘干，然后粉碎并过40目筛，并在取样前充分混合。

2. 样品中黄曲霉毒素的提取：称取5g（精确到0.1g）烟末样品和0.5g氯化钠置于100mL具塞锥形烧瓶中。加入20mL的80%的甲醇水溶液。盖好盖子置于振荡器上高速涡旋5分钟。静止3分钟使样品沉淀。用玻璃纤维滤纸过滤10mL萃取液。收集滤液到干净容器中。取5mL萃取液，加入20mL水稀释，混匀后待测。

3. AFT-BSA偶联物的制备：将AFT（25mg， 0.1 mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（13.8mg，0.12mmol）、碳化二亚胺盐酸盐（EDC）（23.0mg，0.12mmol）溶于1mL无水DMF中，室温下搅拌5h，离心取上清液。30mg 牛血清白蛋白（BSA）溶于2mL的碳酸盐缓冲液中，逐滴加入50μL上清液，室温下搅拌4h，反应结束后，装入透析管，用磷酸缓冲液（0.01mol/L， pH7.4）透析，每8h换液一次，共换液3次。透析后保存于4℃待用。

4. 工作曲线的绘制：用本方法对不同浓度的黄曲霉毒素标准工作溶液进行测定，测定结果如图2所示，当黄曲霉毒素浓度在1-25ng/mL范围内，吸光度与浓度呈良好的线性关系，回归方程为Y=-0.0736X+2.6365，相关系数R²为0.9933。根据空白溶剂检测值加三倍标准偏差对应的信号值，计算得出最低检测限为0.524ng/mL。

5. 包埋HRP酶的脂质体的制备：包埋HRP酶的脂质体是参考文献报道的步骤制备的，过程如下：称取1mg的卵磷脂（PC）和脑磷脂（PE）的磷脂混合物置于5毫升的圆底烧瓶中。磷脂混合物用体积比为6：1的氯仿、甲醇混合溶液分散。然后有机溶剂通过减压旋转蒸馏的方法除去，剩余一层很薄的磷脂膜在圆底烧瓶的内壁。加入2毫升的含有HRP酶的磷酸缓冲溶液后，磷脂膜置于50℃的水浴中溶涨1小时，通过混匀器剧烈混匀得到多层脂质体。这些多层脂质体溶液用探头超声仪超声后得到均匀体积的单层脂质体。制备的脂质体溶液在644g离心力下离心15分钟，除去可能残留的多层脂质体或团聚的脂质体。脂质体溶液储存在4℃下备用。

6. 包埋HRP脂质体表面的抗体修饰：脂质体表面通过戊二醛共价交联法标记兔抗黄曲霉毒素抗体。向0.5 mL 2.5%的戊二醛溶液中逐滴加入包埋了HRP酶的脂质体，25 ℃.搅拌反应1小时。过量的戊二醛在4 ℃环境下磷酸盐缓冲液中透析过夜除去。然后，再逐滴加入到45 μL 2.1 mg mL^-1兔抗黄曲霉毒素抗体溶液中，25 ℃搅拌反应1小时。脂质体表面未反应的醛基通过加入60 μL 3 M的甘氨酸-氢氧化钠溶液封闭，4 ℃反应过夜。未标记的抗体通过葡聚糖凝胶色谱柱分离除去，所得产物4 ℃储存待用。

脂质体成分中的PE分子含有氨基官能团能与抗体共价交联，因此脂质体表面抗体的覆盖率可以通过调解脂质体成分中PE的含量来控制。图4为脂质体成分中PE的含量对吸光度结果的影响。由图3可知，当脂质体溶液中脑磷脂的摩尔成分为1/4时，吸光度响应达到最大值。当PE含量超过1/4时，尽管引入了更多的氨基基团，但对抗体的共价结合形成了空间位阻，也影响了脂质体的稳定性。所以，脂质体成分中PE含量的摩尔比例为1/4。

7. 酶联免疫法测定方法：

7.1抗原包被：酶标板中加入由包被液稀释的一定浓度的偶联抗原（AFT-BSA），每孔100μL，4℃过夜。对包被抗原浓度进行优化，用碳酸盐缓冲液将偶联物逐级稀释，浓度分别为0.05μg/mL,0.5μg/mL,5μg/mL,25μg/mL,75μg/mL,100μg/mL。结果如图4所示，随着偶联物浓度的增大，吸光度随之增大，当偶联物浓度达到25μg/mL时，吸光度趋于稳定，因此微孔板上偶联物抗原的包被浓度为25μg/mL。

7.2 洗板：用PBS缓冲液洗板3次，每次5min。

7.3 封闭：每孔加入100μL封闭液，37℃封闭1h，重复洗板过程。

7.4加AFT标准品和抗体标记的脂质体：加入50μL不同浓度的AFT标准品（2.0ng/mL，7.5ng/mL，25ng/mL，100ng/mL）或样品。随后加入50μL表面标记抗体内部包埋HRP酶的脂质体溶液，室温下孵育30min，进行间接竞争ELISA反应，重复洗板过程。最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻转微孔板在吸水纸上拍干。

7.5加入底物：每孔加入100μL含有1%SDS的TMB底物，室温下避光反应30min。

7.6终止反应：每孔加入100μL终止液，终止反应；

7.7检测：用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度。

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．试剂与仪器：

酶标仪（MD，美国）；96孔酶标板（corning，美国）、黄曲霉毒素，卵磷脂（PC），脑磷脂（PE）辣根过氧化物酶（HRP），牛血清白蛋白（BSA），碳化二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），四甲基联苯胺（TMB）均购于SIGMA公司。兔抗黄曲霉毒素抗体购于格朗瑞生物科技公司（Glory Science,美国德州）。其余试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。

2．样品前处理以及黄曲霉毒素的提取：称取烟叶样品约5片，用剪刀将烟叶样品剪成不大于3cm×3cm的碎片，将剪裁后的样品置于天平上称量，精确至0.1g。记录称量值后将烟叶样品置于称量瓶中在40℃下烘干，然后粉碎并过40目筛，并在取样前充分混合。称取5.02g烟末样品和0.51g氯化钠置于100mL具塞锥形烧瓶中。加入20mL的80%的甲醇水溶液。盖好盖子置于振荡器上高速涡旋5分钟。静止3分钟使样品沉淀。用玻璃纤维滤纸过滤10mL萃取液。收集滤液到干净容器中。取5mL萃取液，加入20mL水稀释，混匀后待测。

3.不同标准溶液的制备：用16%的甲醇水溶液配制不同浓度的标准工作溶液，黄曲霉毒素的浓度分别为1 ng/mL,2 ng/mL,7.5 ng/mL，25 ng/mL,100 ng/mL。

4．根据酶联免疫法测定步骤，检测测得烟叶样品A的黄曲霉毒素含量为0μg/mL。

实例2：

按实例1所述方法，测得烟叶样品B和烟丝样品C的黄曲霉毒素含量分别为0μg/mL和0 μg/mL。

在不含黄曲霉毒素的烟叶样品中加入黄曲霉毒素标准溶液，然后进行样品前处理，黄曲霉毒素的提取，酶联免疫法的测定，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表1。从高、中、低不同浓度水平的标准物溶液加标回收率情况来看，回收率在99.6%-102.0%之间，相对偏差在小于6%，说明本方法的回收率较高，重复性较好。

Claims

1.一种烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

（3）标准工作液的配制：用16%的甲醇水溶液配制不同浓度的黄曲霉毒素标准工作溶液；

2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，其特征在于：黄曲霉毒素的浓度分别为1 ng/mL,2 ng/mL,7.5 ng/mL，25 ng/mL,100 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，其特征在于：偶联物浓度为25μg/mL。

4.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，其特征在于：酶联免疫法测定的具体步骤如下：

(2)洗板：用PBS缓冲液洗板3次，每次5min；

(3)封闭：每孔加入100μL封闭液，37℃封闭1h，重复洗板过程；

(6)终止反应：每孔加入100μL终止液，终止反应；

(7)检测：用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度。

5.根据权利要求4所述的烟草及烟草制品中黄曲霉毒素的酶联免疫测定方法，其特征在于：所述包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6；洗涤液：磷酸盐缓冲液，pH7.3；封闭液：含1%BSA的磷酸盐缓冲液；抗体稀释液：磷酸盐缓冲液，pH7.3；终止液：1M 盐酸。