CN107764614A - 一种郫县豆瓣黄曲霉毒素b1检测的前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测的前处理方法，包括以下步骤：步骤1：利用萃取分离的方法提取郫县豆瓣中溶解的黄曲霉毒素B1溶液；步骤2：提取步骤1中下层沉淀的黄曲霉毒素B1溶液；步骤3：将步骤1与步骤2提取的黄曲霉毒素B1溶液合并；步骤4：检测步骤3合并溶液中黄曲霉毒素B1含量。本发明提高了黄曲霉毒素B1的检测效率和准确度。

Description

一种郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测的前处理方法

技术领域

本发明涉及食品质量安全检测技术领域，尤其涉及一种郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测的前处理方法。

背景技术

郫县豆瓣属中国传统发酵食品，迄今为止已有300多年的历史，被列为中国非物质文化遗产。郫县豆瓣不仅生产工艺独特，也以其味辣香醇、粘稠绒实、红棕油亮、酱香浓郁等特点在我国酱类产品中独树一帜，堪称川菜之魂。据权威统计，2015年“郫县豆瓣”品牌价值已达607.16亿元，位列“加工食品类地理标志产品”全国第一；当年产品总产量达到110万吨，实现工业产值102亿元，出口世界绝大部分国家和地区，创汇超过4000万美元。

随着“川菜、川味、川菜调味品”走出四川走向全国，我国已成为全球最大的辣椒生产、消费和出口国，中国辣椒产业的发展对全球辣椒产业发展具有重要的影响。据第三次全国经济普查统计，国内50万家规模以上餐饮企业当中，就有10万家是以川菜为主打菜品，更有超过100万家的小型川菜餐馆几乎分布于世界的各个角落，川菜之魂-郫县豆瓣作为川菜调味品代表也得到了广泛传播和使用。与此同时，据统计四川居民总食物消费中，调味品日均消费量占到了94.13g，其中豆瓣酱消费量占到了10.25g，远高于全国其它地区。

郫县豆瓣的生产包括前期发酵和后熟发酵两个阶段，前期发酵主要是指霉瓣子的制曲和辣椒坯的预处理。后熟发酵主要是将成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合，加入适量食盐和水，进入发酵池发酵，经过一定时期的翻晒和陈化，即是郫县豆瓣特有的日晒夜露工艺。但是，相当一部分生产企业不重视霉瓣子的制曲、后发酵期的管理和环境卫生，常出现黄曲霉毒素B1超过国家标准限量的问题，带来食品质量安全隐患。

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是目前发现毒性和致癌性最强的化学物质之一，于1993年被世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定为一类致癌物。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等产生的一类含有二氢呋喃环结构的次生代谢产物，常见的有B1、B2、G1、G2、M1五种，其中又以B1具有强烈致癌、致畸和致突变作用为甚。

黄曲霉毒素的LD50(半数动物致死量)为0.249mg/kg，毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍；黄曲霉毒素中毒主要是含超标毒素的食物经摄入后被消化道吸收，在体内进行羟基化、去甲基化和环氧化等代谢过程，主要代谢产物大部分分布在肝脏，在肾脏、血液、肌肉和脂肪中也有少量分布，具有毒性或致癌、致突变作用。

黄曲霉毒素B1的检测前提，是其高效特异性的提取。目前，国内专家关于食品当中黄曲霉毒素B1的检测做了大量卓有成效的工作，主要集中在利用高效液相色谱、酶联免疫吸附、亲和层析等技术实现对食用植物油、米面、酱油、花生、食源性动物组织等当中的黄曲霉毒素B1的快速检测。但是，对于郫县豆瓣当中黄曲霉毒素B1检测的前处理技术还很少报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测前处理针对性不强的问题，通过郫县豆瓣的采样、预处理、黄曲霉毒素B1的提取，实现快速高通量的郫县豆瓣黄曲霉毒素B1的精确测定。

一种郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测的前处理方法，包括以下步骤：

步骤1：利用萃取分离的方法提取郫县豆瓣中溶解的黄曲霉毒素B1溶液；

步骤2：提取步骤1中下层沉淀的黄曲霉毒素B1溶液；

步骤3：将步骤1与步骤2提取的黄曲霉毒素B1溶液合并；

步骤4：检测步骤3合并溶液中黄曲霉毒素B1含量。

进一步地，如上所述的方法，所述步骤1包括：利用甲醇溶解郫县豆瓣中的黄曲霉毒素B1，利用正己烷溶解去除郫县豆瓣中的脂肪，利用三氯甲烷溶解去郫县豆瓣中的除蛋白质。

进一步地，如上所述的方法，所述步骤1包括：

1)将郫县豆瓣捣碎，随后加入甲醇溶液，再加入正己烷，然后在实验摇床中以250r/min的速度震荡5-10分钟；

2)取一定量的步骤1)振荡后的溶液进行离心；

3)离心后，取中间层加入三氯甲烷，在实验摇床中以250r/min的速度震荡5-10分钟；取下层三氯甲烷溶液，然后加入甲醇溶液复溶，最后加蒸馏水稀释待用

取25g郫县豆瓣，在碾钵中充分捣碎，随后加入125ml甲醇溶液(60％，v/v)，再加入50ml正己烷，在实验摇床中剧烈震荡(250r/min)5-10分钟；随后5000-10000g离心15分钟；取中间层(甲醇层)置于分液漏斗中，随后加入100ml三氯甲烷，在实验摇床中剧烈震荡(250r/min)5-10分钟；取下层三氯甲烷约10ml，加入1mL 60％甲醇溶液(60％，v/v)复溶，再加入4ml蒸馏水稀释待用。

进一步地，如上所述的方法，所述步骤2包括：

①将步骤1中离心后的下层沉淀按料液体积比1︰5加入甲醇溶液，在高压均质机中均质处理，均质压力50Mpa，保持15min；降温系统保持物料25℃，将均质后的样品取出离心15分钟；

②将步骤①中的上清液旋转蒸发浓缩得到黄曲霉毒素B1浓缩液。

进一步地，如上所述的方法，所述甲醇溶液的体积百分比浓度为60％。

有益效果：

本发明方法可以快速准确地测量郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1的含量。而且方法步骤简单，容易操作。

附图说明

图1为本发明试验例中黄曲霉毒素B1标准曲线拟合图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的技术方案如下：

一种郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测的前处理方法，包括如下步骤：

溶解的黄曲霉毒素B1的提取

取25g郫县豆瓣，在碾钵中充分捣碎，随后加入125ml甲醇溶液(60％，v/v)，再加入50ml正己烷，在实验摇床中剧烈震荡(250r/min)5-10分钟；随后5000-10000g离心15分钟；取中间层(甲醇层)置于分液漏斗中，随后加入100ml三氯甲烷，在实验摇床中剧烈震荡(250r/min)5-10分钟；取下层三氯甲烷约10ml，加入1mL 60％甲醇溶液(60％，v/v)复溶，再加入4ml蒸馏水稀释待用。

下层沉淀中黄曲霉毒素B1的提取

将前述离心后的下层沉淀约5-10g，按料液体积比1︰5加入甲醇溶液(60％，v/v)；在高压均质机中均质处理，均质压力50Mpa，保持15min，降温系统保持物料25℃(上海申鹿均质机有限公司，申鹿SRH100型)。将均质后的样品取出，5000-10000g离心15分钟，将上清液旋转蒸发浓缩至10ml。

黄曲霉毒素含量检测

将前述两种处理方式得到的黄曲霉毒素B1提取液可通过高效液相色谱或者酶联免疫吸附(ELISA)等不同方法进行检测，即可得到样品当中黄曲霉毒素B1的准确含量。

本发明针对郫县豆瓣高盐含量(15-22％)、高蛋白含量、高辣椒红色素等特点，将溶解的黄曲霉毒素B1和非溶解状态的黄曲霉毒素B1进行并合并后通过高效液相色谱或者酶联免疫吸附(ELISA)等不同方法进行检测，可充分高效的实现郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1的提取检测精度。

试验例：

其他方法与本发明方法检测郫县豆瓣当中黄曲霉毒素B1的差异

方法一：基于酶联免疫吸附技术(ELISA)的一般样品处理方法

1)取10g粉碎的样品，加20ml 70％甲醇溶液；

2)强力振荡3分钟；

3)用Whatman No 1滤纸过滤；

4)取100μl处理后的样品，加入400μl样本稀释液；

5)取100μl稀释液作为待测液进行分析。

方法二：在方法一的基础上加入除脂环节

1)取10g粉碎的样品，加20ml 70％甲醇溶液，再加入10ml石油醚；

2)强力震荡3分钟，混匀后置于分液漏斗中；

3)放出甲醇层用Whatman No 1滤纸过滤；

4)取100μl处理后的样品，加入400μl样本稀释液；

5)混匀后取100μl稀释液作为待测液进行分析。

方法三：国标法(参照国标(GB/T5009.22-2003))

1)称取20.00g研磨均匀的试样，置于250ml具塞锥形瓶中，加入20mL石油醚与50mL甲醇水溶液(55+45)；

2)振荡30min,静置片刻，以中速定性滤纸过滤；

3)滤液静置分层后，取24mL甲醇水层(相当8g试样，其中包括8g豆瓣酱本身约含有4mL水的体积在内)置于分液漏斗中；

4)加人20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层；

5)放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中；

6)再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中；

7)将蒸发皿放在通风柜于65℃水浴上通风挥干；

8)用2.0mL 20％甲醇-PBS分三次(0.8mL,0.7mL,0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置，此液每毫升相当2.0g试样；

9)取100μl处理后的样品，加入400μl样本稀释液；

10)混匀后取100ul稀释液作为待测液进行分析定为样品待测液。

方法四：本方法只检测溶解的黄曲霉毒素B1

方法五：本方法

对于用于黄曲霉毒素B1检测的郫县豆瓣前处理方法，分别利用以上五种方法对两组黄曲霉毒素B1含量不同的郫县豆瓣样品利用酶联免疫吸附试剂盒进行4次平行测定，数据见表1。

表1五种不同前处理方法的检出值对比

通过ELISA测定五类食品中黄曲霉毒素B1，发现由于ELISA法本身的局限，如酶的活性较敏感，为了避免样品除黄曲霉毒素B1外的其他物质对酶活性造成影响而导致检测会出现假阳性(阴性)的结果，针对某些特殊样品需经特殊的前处理。

盐浓度、重金属离子、油脂等基质效应及pH值等条件都会对检测结果造成不同程度的影响。当提取液处于酸性条件即pH值低的时候，酶的活性会受到抑制，从而导致显色反应时颜色较浅，出现假阳性；而当样品提取液中存在含量较高的油脂时，油脂会对抗原抗体反应产生一定屏蔽效应，原因是油脂会黏附在抗体板条微空的四壁，在一定程度上阻碍了酶标抗原和微空内抗体的特异性结合，使得结果偏阳性；提取液盐浓度较大，重金属离子较多时，均会不同程度地使测得的结果偏向假阳性。问题的关键是样品的预处理。

从实验数据对比中可直观反映出，方法1和方法2的检测结果明显偏大，显然是不可取的。

方法1中只是用甲醇溶液直接粗略地提取，用pH试纸测定pH值在4左右，偏酸性，而且此时提取液里除了黄曲霉毒素B1外还含有油脂、盐浓度、重金属离子等杂质，最终结果是测出的数据过大，强假阳性。

方法2中加入了除脂步骤，用石油醚脱脂，可使郫县豆瓣中油脂的影响降到最低，可其他的基质仍然过多地留存，所以尽管与方法1相比数值有所降低却还是偏大不准确。

方法3和方法4在前面的基础上进一步用三氯甲烷萃取后，吹干再复溶，可基本排除PH值、油脂、盐浓度、重金属离子等有基质效应的因素，从而使得最终测定的影响控制在允许的范围之内。

方法3与方法4和方法5相比，方法3步骤相对复杂，且检测结果数据有一定偏差。

基于酶联免疫吸附(ELISA)技术的郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测方法

AFB1含量检测

1实验准备

实验开始前将试剂盒(黄曲霉毒素ELISA Kit德国R-Biopharm公司)充分回至室温(25±2℃)，时间约达2小时。回温至室温(25±2℃)后，取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2～8℃干燥保存。事先用蒸馏水按1:20(1+19)把浓缩洗涤液稀释成工作液。操作一旦开始后不能中断任何程序。取出的微孔条预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置。

2进样、洗涤

(1)在B0孔中加入50μl0.0ppb标准品溶液；

(2)在各标准孔中加入50μl的标准品溶液；

(3)在各样品孔中加入50μl样品溶液；

(4)在所有孔中加入50μl的抗黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体酶结合物；

(5)轻轻晃动反应板几秒钟；

(6)37℃温浴30min(温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差)；

(7)甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次在滤纸上拍打以完全除去孔中液体。

3反应

(1)洗涤程序完成后，立即用移液枪在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加50μl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀；

(2)37℃温浴10min；

(3)每孔中加入50μl终止液，混匀；

(4)在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。

4结果计算

(1)以黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度的对数值(lgC)为X轴，百分吸光度值(A/A0)为Y轴，绘制标准曲线图；

(2)根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度的对数值，求得反对数即为测定液中黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度C(ppb)；

(3)根据以下公式计算出样品中的AFB1的含量：

式中：C———由标准曲线查出的浓度值；

V———样品提取液的体积；

K———样品提取液的稀释倍数；

M———称取样品的质量。

标准曲线拟合分析

本次实验选用二次多项式方程进行标准曲线拟合。

对不同黄曲霉毒素B1标准品浓度的溶液(0.0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2ug/kg)各做2个平行孔，表2是标准系列样品的检测结果。见表2

表2系列标准溶液吸光度值

以百分吸光度值(A/A0)作为Y轴,标准品浓度对数值(lgC)作为X轴，选用二次多项式拟合曲线为y＝0.07021x2-0.1346x+0.09587，R2＝0.99747，见图1。

通过表1及图1发现，采用本发明方法提取郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1的结果更加准确。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种郫县豆瓣黄曲霉毒素B1检测的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：利用萃取分离的方法提取郫县豆瓣中溶解的黄曲霉毒素B1溶液；

步骤2：提取步骤1中下层沉淀的黄曲霉毒素B1溶液；

步骤3：将步骤1与步骤2提取的黄曲霉毒素B1溶液合并；

步骤4：检测步骤3合并溶液中黄曲霉毒素B1含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括：利用甲醇溶解郫县豆瓣中的黄曲霉毒素B1，利用正己烷溶解去除郫县豆瓣中的脂肪，利用三氯甲烷溶解去郫县豆瓣中的除蛋白质。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括：

1)将郫县豆瓣捣碎，随后加入甲醇溶液，再加入正己烷，然后在实验摇床中以250r/min的速度震荡5-10分钟；

2)取一定量的步骤1)振荡后的溶液进行离心；

3)离心后，取中间层加入三氯甲烷，在实验摇床中以250r/min的速度震荡5-10分钟；取下层三氯甲烷溶液，然后加入甲醇溶液复溶，最后加蒸馏水稀释待用

取25g郫县豆瓣，在碾钵中充分捣碎，随后加入125ml甲醇溶液(60％，v/v)，再加入50ml正己烷，在实验摇床中剧烈震荡(250r/min)5-10分钟；随后5000-10000g离心15分钟；取中间层(甲醇层)置于分液漏斗中，随后加入100ml三氯甲烷，在实验摇床中剧烈震荡(250r/min)5-10分钟；取下层三氯甲烷约10ml，加入1mL 60％甲醇溶液(60％，v/v)复溶，再加入4ml蒸馏水稀释待用。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2包括：

①将步骤1中离心后的下层沉淀按料液体积比1︰5加入甲醇溶液，在高压均质机中均质处理，均质压力50Mpa，保持15min；降温系统保持物料25℃，将均质后的样品取出离心15分钟；

②将步骤①中的上清液旋转蒸发浓缩得到黄曲霉毒素B1浓缩液。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述甲醇溶液的体积百分比浓度为60％。