CN102719405A

CN102719405A - 杂交瘤细胞株1c8及其产生的抗黄曲霉毒素g1单克隆抗体

Info

Publication number: CN102719405A
Application number: CN2012101176204A
Authority: CN
Inventors: 李培武; 李鑫; 张奇; 丁小霞; 张文; 李冉; 张兆威
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: CN102719405B

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株1C8及其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。本发明提供的杂交瘤细胞株1C8（CCTCC NO：C201017）可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，抗黄曲霉毒素G1鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达8.19×10⁵。(2)本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体灵敏度高、特异性较好，对黄曲霉毒素G1的50%抑制浓度IC₅₀为13.92ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2及M1没有交叉反应，可应用于测定G1黄曲霉毒素。

Description

杂交瘤细胞株1C8及其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株1C8及其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、AFG和 M1（AFM1）等。其中AFB1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，AFG的毒性次之，这些毒素具有很强的致癌性，其中：AFG在我国胃癌、食管癌高发区居民饮食中的检出率很高。为此，世界各国都在食品安全领域限定了AFG在食品等中的含量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强农产品中黄曲霉毒素G的检测、特别是速测，及时了解和掌握农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是较早用于检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，该法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，这些方法灵敏度高，准确性好，但又有仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测。免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，而抗体的特异性、灵敏度等直接影响检测结果，所以要研究建立针对黄曲霉毒素G1的免疫学检测技术，必须先制得高质量的抗黄曲霉毒素G1抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株1C8及其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。

本发明提供了杂交瘤细胞株1C8，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201017，分类命名为小鼠杂交瘤细胞1C8。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体轻链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体重链可变区编码基因序列。

抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC C201017的杂交瘤细胞株1C8分泌产生。其轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素G1，对黄曲霉毒素G1的50%抑制浓度IC₅₀为13.92 ng/mL。

抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体在黄曲霉毒素G1测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株1C8是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFG1-BSA（见CN101270146.X公开的AFG1-BSA完全抗原）免疫4-6次后，用2倍于第一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFG1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行融合细胞筛选：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，用黄曲霉毒素G1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株1C8。

本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株1C8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。

按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35 μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株1C8可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，抗黄曲霉毒素G1鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达8.19×10⁵。

(2)本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体灵敏度高、特异性较好，对黄曲霉毒素G1的50%抑制浓度IC₅₀为13.92ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2及M1没有交叉反应。

(3)本发明提供的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体可应用于测定黄曲霉毒素G1。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株1C8的制备

1. 抗原合成及动物免疫

购买市售黄曲霉毒素G1标准品，根据CN101270146.X中的具体实施方式的实施例1中公开的AFG1-BSA的合成方法进行AFG1-BSA完全抗原的合成；

购买6周龄雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黄曲霉毒素G1完全抗原AFG1-BSA。第一次免疫将完全抗原AFG1-BSA与等量福氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积完全抗原AFG1-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔时间4周，免疫方式及剂量与第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式及免疫剂量与第二次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠50μg。前3次每次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。

2.细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640基础培养液为含有20%（体积百分数）胎牛血清，2%（重量百分数）生长因子和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素G1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素G1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小），采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株1C8。

实施例2：抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体杂交瘤细胞株系1C8抗体可变区序列测定

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系1C8的总RNA；

（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) ₁₅ 由Invitrogen购得；

（3）PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃ 30s、55℃ 1min、72℃ 1min ，扩增 30 个循环，最后 72℃延伸 10min。PCR 产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5^，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3^，（22mer）和5^，-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3^，（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5^，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3^，（24mer）和5^，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3^，（24mer）。

得到的基因序列结果：轻链可变区编码基因序列长332bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由110个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。重链可变区编码基因序列长362bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由120个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。

实施例3：抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定

将实施例2获得的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体杂交瘤细胞株系1C8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株1C8分泌的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的亚型为IgG_2a。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得1C8的鼠腹水抗体的效价可达8.19×10⁵，即鼠腹水抗体稀释8.19×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素G1的灵敏度（IC₅₀）为13.92ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2及M1没有交叉反应。

实施例4：抗体应用

将杂交瘤细胞株1C8分泌的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体用于黄曲霉毒素G1的添加回收试验，具体包括以下步骤：

（1）以2.5 μg/mL人工抗原AFG1-BSA 包被酶标板，每孔100μL，4 ℃过夜，0.01 mol/L pH 7. 4 PBST 洗涤扣干；

（2）5%脱脂奶粉封闭，每孔200μL，37℃ 2 h ，洗涤扣干；

（3）配制0，0.03125，0.3125，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200 ng/mL的黄曲霉毒素G1标准溶液(含20%甲醇的磷酸盐缓冲液，)，第一排每孔依次加入待测AFG1标准溶液50μL，其它孔作为检测孔，每个样品三个重复，每孔抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体（稀释4000倍）50μL，37℃孵育2 h，洗涤扣干；

（4）每孔加1：2000羊抗鼠IgG-HRP 100μL，37℃ 2h ，洗涤扣干；

（5）底物显色反应：每孔加底物显色液100μL (所述底物显色液的配制：1 mg/mL四甲基联苯胺1.0mL，底物缓冲液10 mL，1% H₂O₂ 25μL，现配现用)，37℃避光反应15min，每孔50μL 2 mol/L H₂SO₄终止反应，5 min 后以空白对照孔调零，450nm 测吸光值；

（6）绘制标准曲线，并计算黄曲霉毒素G1对抗原抗体结合反应的抑制率在50%时的浓度（I₅₀）。

（7）添加回收试验：分别称取25g粉碎样品置于三角瓶中，加入75mL含有4%NaCl（质量/体积）的80%的甲醇水溶液混合均匀，超声波处理10min。静置30min，使其完全分层，吸取上清，将上清用双层滤纸进行过滤。将滤液用含有1%BSA的PBS溶液稀释五倍后，向其中分别准确添加1ng/mL、10ng/mL和40ng/mL AFG1的标准品，采用间接竞争ELISA方法进行添加回收试验，并测定花生样品的添加回收率，依次为86%，92%，90%。

ELISA所需溶液配制：

磷酸盐缓冲液（pH7.4 PBS）: Na₂HPO₄.12H₂O 8.7g；NaCl 24g；KCl 0.6g，KH₂PO₄ 0.6g，加纯水定容至3000mL。

包被缓冲液（PH9.6碳酸盐缓冲液）：1.59g Na₂CO₃；2.93g NaHCO₃；加纯水定容至1000mL。

1%吐温20的PBS溶液（PBST溶液）：Na₂HPO₄.12H2O 8.7g；NaCl 24g；KCl 0.6g，KH₂PO₄ 0.6g，Tween20 1.5mL，定容至3000mL。

封闭液：0.1gOVA溶于100mL PBST。

底物缓冲液：Na₂HPO₄.12H₂O 1.843g，柠檬酸0.933g，纯水100mL。

序列表

＜110＞中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞杂交瘤细胞株1C8及其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体

＜160＞ 4

＜210＞ 1

＜211＞ 332bp

＜212＞ DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 1

ccgttttatt tccagcttgg tcccccctcc gaacgtgtaa gctccctaat 50

gtgctgacag taataggttg cagcatcctc ctcctccaca ggatggatgt 100

tgagggtgaa gtctgtccca gacccactgc cactgaacct ggcagggacc 150

ccagattcta ggttggatac aagatagatg aggagtctgg gtggctgtcc 200

tggtttctgt tggttccagt gcatataact atagccagat gtactgacac 250

ttttgctggc cctgtatgag atggcggccc tctgccccag agatacagct 300

aaggaagctg gagactgggt gagctcaatg tc 332

＜210＞ 2

＜211＞ 362bp

＜212＞ DNA

＜213＞小鼠

＜400＞ 2

aggtgcagct gcagcagtca ggacctgagc tggtgaggcc tgggacttca 50

gtgaagatat cctacaaggc ttctggctgt accttcctca cctactggat 100

gagctgggtg aagttgaggc ctgcacaggg ccttgagtgg attggacaga 150

tttttcctgc aggtggtagt gctaacttca atgagatttt cagggtcaag 200

gccacattga ctgtaggcac atcctccagt tcagcctaca tgcagctaat 250

cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcaa tttctgtgca agagaggagg 300

gcctattact atcttatggt agggacttct ggggccaagg gaccacggtc 350

accgtctcct ca 362

＜210＞ 3

＜211＞ 110

＜212＞ PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 3

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Ala

1 5 10 15 20

Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Thr Ser Tyr Met His Trp Asn

25 30 35 40

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

45 50 55 60

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ale Ale Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg

85 90 95 100

Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Leu Asn

105 110

＜210＞ 4

＜211＞ 120

＜212＞ PRT

＜213＞小鼠

＜400＞ 4

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser

1 5 10 15 20

Tyr Lys Ala Ser Gly Cys Thr Phe Leu Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Lys Leu Arg Pro

25 30 35 40

Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ala Asn Phe Asn

45 50 55 60

Glu Ile Phe Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Val Gly Thr Ser Ser Ser Ser Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Asn Phe Cys Ala Arg Glu Glu Gly

85 90 95 100

Leu Leu Leu Ser Tyr Gly Arg Asp Phe Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

105 110 115 120

Claims

1.杂交瘤细胞株1C8，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO. C201017。

2.黄曲霉毒素G1单克隆抗体，其特征在于：它由保藏编号为CCTCC NO. C201017的杂交瘤细胞株1C8分泌产生。

3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素G1单克隆抗体在黄曲霉毒素G1测定中的应用。

4.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体的制备方法，其特征在于：它是将获得的杂交瘤细胞株1C8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体。