CN103130892A

CN103130892A - 黄曲霉毒素重组单链抗体2g7、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN103130892A
Application number: CN2013100292791A
Authority: CN
Inventors: 李培武; 李鑫; 张奇; 丁小霞; 张文; 李冉
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2033-01-25
Also published as: CN103130892B

Abstract

本发明涉及黄曲霉毒素重组单链抗体2G7、编码基因及其应用。黄曲霉毒素重组单链抗体2G7，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的编码基因，其特征在于：它的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示，其中重链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。该黄曲霉毒素重组单链抗体2G7灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀为10pg/mL，与黄曲霉毒素B2，G1，G2，M1交叉反应率分别仅为33%，25%，0.1%和11.1%；可用于黄曲霉毒素B1含量的检测。

Description

黄曲霉毒素重组单链抗体2G7、编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素重组单链抗体2G7、编码基因及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，在各种食物及农产品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黄曲霉毒素的污染。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法包括化学分析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中化学分析法是早期检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素的抗体。

随着抗体技术的发展，重组单链抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。与传统的多克隆抗体、单克隆抗体相比较而言，重组单链抗体具有其独特的优势，可以在原核表达体系里在很短的时间内大量生产并且生产费用低廉，对黄曲霉毒素的低成本、大规模检测有重要的应用价值，可以满足日益增长的黄曲霉毒素抗体的生产需要。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供黄曲霉毒素重组单链抗体2G7、编码基因及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

黄曲霉毒素重组单链抗体2G7，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的编码基因，其特征在于：它的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示，其中重链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。

黄曲霉毒素重组单链抗体2G7在黄曲霉毒素B1含量检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的黄曲霉毒素重组单链抗体2G7灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀为10 pg/mL，与黄曲霉毒素B2，G1，G2，M1交叉反应率分别仅为33%，25%，0.1%和11.1%。

(2)本发明提供的黄曲霉毒素重组单链抗体2G7可用于黄曲霉毒素B1含量的测定。

附图说明

图1为本实施例中scFv基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。图中，M：DNA Marker；1：scFv基因；

图2为黄曲霉毒素B1标准分析曲线。

具体实施方式

下述所用抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1分别是采用保藏编号为CCTCC NO：C201013、CCTCC NO: C201018、CCTCC NO: C201017、CCTCC NO: C201016、CCTCC NO: C201014的杂交瘤细胞株1C11、2C9、1C8、10G4、3G1，分别根据专利申请号为CN2010102450955、CN2011101082306、CN 2012101176204、CN2012101176149、CN201210117612X的专利中报道的方法预先制得。具体制备方法如下：相应用各杂交瘤细胞株注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得各抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

黄曲霉毒素阳性抗体基因库的构建

1. 黄曲霉毒素阳性抗体基因库构建中所需引物的合成

（1）单克隆抗体1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的重、轻链可变区基因序列扩增所需的引物：

重链可变区（Back）：5’- AGG TGC AGC TGC AGC AGT CTG G-3’

重链可变区（For）：5’- TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3’

轻链可变区（Back）：5’- GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’

轻链可变区（For）：5’- CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’

(2)扩增连接重、轻链可变区基因序列的连接肽（编码柔性短肽序列(Gly₄Ser)₃）的linker引物：

Linker正向引物：5’-TCC GGC GGT GGT GGC AGC GGT GGC GGC GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA -3’

Linker反向引物：5’-ACC GCT GCC ACC ACC GCC GGA GCC ACC GCC ACC TGA GGA TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT -3’

(3)在scFv基因片段的两端扩增至少包含15bp的载体pCANTAB 5E同源序列的引物RS Back/For；

RS（Back）：5’-TCC TTT CTA TGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA GGT GCA GCT GCA GC A GTC TGG-3’

RS（For）：5’-CGG CGC ACC TGC GGC CGC CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3’

其中：划横线部分表示与噬菌体载体pCANTAB 5E同源位点；

2. 各单克隆抗体重、轻链可变区基因片段的获得及定量：

（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的总RNA；

（2）合成cDNA：以步骤1获得的各杂交瘤细胞株系的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) ₁₅ 由Invitrogen购得；

（3）PCR法克隆可变区基因：以各杂交瘤细胞株系的cDNA为模板，分别相应取各cDNA第一链反应物2μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP (2.5mmol/L) 4μl，VH(或VL) (Back)引物(10μmol/L)1μl，VH(或VL) (For)引物(10μmol/L)1μl，无菌纯水37μl至50μl，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件为94℃变性2min，加入0.5μl Pyrobest DNA酶后，94℃变性30s，55℃（如果扩增轻链可变区退火温度改为60℃）退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min。PCR 产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段。

（4）制备1.0%的琼脂糖凝胶，将克隆得到的1C11、2C9、1C8、10G4、3G1的轻、重链可变区基因分别各取2μl加入到3μl TE缓冲液中，并各加入1μl 6×loading buffer，混匀备用；将上述所有准备好的样品依次上样到琼脂糖凝胶上，同时在中间的两个泳道分别加入DL2000 DNA marker 125ng和250ng，电泳直至溴酚蓝迁移至凝胶的2/3处，EB染色后，凝胶成像系统成像，充分曝光使不同抗体可变区基因片段及DNA marker均清晰可见，然后通过与不同浓度DL2000 DNA marker染色强度的比较，估算得到每个抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段确切的量，根据估算结果，将各抗体的轻、重链可变区基因各取50ng分别对应加入到两个EP管中，分别标记为轻链可变区基因V_H混合与重链可变区基因V_L混合，作为下一步PCR反应的混合模板。

3. 轻、重链可变区基因的混合连接及scFv基因的构建

使用重叠延伸( splicing by overlap extension , SOE) PCR的方法将抗体重链可变区基因混合物与抗体轻链可变区基因混合物随机组合拼接，并引入连接肽(Linker) 编码序列（(Gly₄Ser)₃），以完成scFv基因的构建。另，为了便于下一步文库的构建，还在拼接完成后的scFv片段两端各加入至少15bp的载体pCANTAB 5E同源序列。具体方法如下：

PCR体系如下：

10× Ex taq Buffer 5μl

dNTP(2.5 mmol/L) 4μl

V_H 混合 50ng

V_L混合 50ng

Linker正向 1μl

Linker反向 1μl

Ex taq DNA 聚合酶 1μl

ddH2O 补至总体系 50μl

PCR程序为：94℃ 1min、63℃ 4min，共扩增7个循环，以完成scFv基因的构建；

然后在体系中补加如下物质：

10× Ex taq Buffer 5μl

dNTP(2.5 mmol/L) 4μl

RS（Back） 1μl

RS（For） 1μl

Ex taq DNA 聚合酶 1μl

ddH2O 补至总体系 50μl

PCR程序为：94℃ 1min、56℃ 2min、72℃ 2min，再扩增30个循环，以在scFv基因片段两端各引入至少包含15bp的载体pCANTAB 5 E同源序列。

反应完毕后，取出2μl PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测确认得到目的大小为750bp的拼接DNA片段，见图1。

为了获得更多的多样性，将V_H混合EP管与V_L混合EP管中的样品分批全部进行PCR扩增，反应体系与反应条件同上。扩增完成后，将所有扩增产物用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。

4. scFv混合片段与双酶切处理的pCANTAB 5 E载体的连接

（1）双酶切处理pCANTAB 5 E：

SfiⅠ单酶切：

按照如下体系配制反应液： pCANTAB 5 E vector 30μl

SfiⅠ 1μl

10×M Buffer 10μl

ddH₂O 补至总体系 100μl

50℃水浴2 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。

NotⅠ酶切：

按照如下体系配制反应液： pCANTAB 5 E SfiⅠ单酶切回收产物 30μl

NotⅠⅠ 1μl

10×H Buffer 10μl

ddH₂O 补至总体系 100μl

37℃水浴4 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收；

（2）按照如下体系进行In-Fusion连接：

SfiⅠ/NotⅠ双酶切处理的pCANTAB 5 E vector 120ng

scFv混合片段 40ng

5×In-Fusion buffer 2μl

In-Fusion Enzyme 1μl

ddH₂O补至总体系 10μl

37℃水浴15min后，放入50℃水浴15min，水浴后立即放在冰上5min, 加入40μl TE缓冲液，混匀后-20℃保存待用。

5. scFv混合片段与pCANTAB 5 E载体的连接物的电转化

将scFv混合片段与pCANTAB 5 E载体的连接产物取 5μl加入到50μl E. coli TG1电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的 0.1 cm 电转化杯 (Bio-RAD) 中，冰上放置10min，然后放在 Bio-rad 电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8 kV，200 Ω，25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入0.5 mL 2YT 液体培养基吹打后转移至一灭菌后的干净1.5 mL EP管中，37℃缓慢振摇复苏1 h。

为保证库容量，将用于建库的样品采用如上电转化方法在同样的电转化条件下分批进行电转化，以将样品全部电转化。电转化完毕后，可将电转化得到的样品全部涂布数块SOBAG平板，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜，次日将样品平板上长出的菌苔刮下，加入甘油后，-70℃保存备用。

实施例2：利用上述黄曲霉毒素阳性抗体基因库筛选黄曲霉毒素重组单链抗体、获得的黄曲霉毒素重组单链抗体2G7、特性鉴定及其应用

1. 黄曲霉毒素重组单链抗体的筛选

（1）黄曲霉毒素阳性抗体基因库的拯救：

将构建好的噬菌体展示黄曲霉毒素阳性抗体基因库的菌液稀释后涂布SOBAG平板，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜；次日，将平板上单菌落随机挑取于96孔细菌培养板中，每孔加入200μl 2YT-AG，225 rpm，30℃培养过夜，此板标记为master plate，并将其置于96孔细菌培养板垫有湿滤纸的盒子中保湿；次日，准备另一块新的96孔板，里面加入事先加好2.5×10¹⁰pfu的M13KO7辅助噬菌体的2YT-AG培养基，每孔180μl，此板编号为plate P1，然后在master plate中每孔取20 μl过夜培养的菌液加入到plate P1的对应孔中，37℃，150 rpm 缓慢轻摇2 h，此时菌液应该变浑浊，然后1500rpm离心20 min，用枪头小心吸去培养基上清，每孔加入200 μl 2YT-AK培养基（100 μg/ml氨苄青霉素；50 μg/ml卡那霉素）重悬菌体沉淀，250 rpm 37℃培养过夜；次日，将plate P1以1500 rpm离心20 min，上清转移至新的96孔细菌培养板中，4℃保存备用。

(2) 黄曲霉毒素重组单链抗体的筛选：

采用两步法进行筛选，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，具体为：

用AFB1-BSA（400ng/孔）及BSA（400ng/孔）（用作阴性对照）分别包被ELISA 板，4℃过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用4％ PBSTM 封闭1 h；PBST洗板3 次，每孔加入上述步骤（1）中黄曲霉毒素阳性抗体基因库的拯救中得到的上清50 μl后再加入50 ul 4% PBSTM，轻轻晃动ELISA板，混匀后，37℃保温1 h；PBST 洗板3 次后，每孔加入用封闭液按1：5000比例稀释的HRP/ANTI-M13 100μl，37℃保温1 h；PBST 洗板6次，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；加2mol/L H₂SO₄，每孔50μl中止反应，用酶标仪分别测定AFB1-BSA板及BSA板的OD450 值，P/N≥2.1的孔判为阳性克隆孔。

用包被液配制AFB1-BSA至终浓度2μg/ml，包被96孔ELISA 板，每孔100μl，4℃包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用4％ PBSTM 封闭1 h；取AFB₁标准品储存液，用封闭液梯度稀释至十个不同的工作浓度，按黄曲霉毒素B1浓度由小到大的次序依次加入到ELISA 板中间的十列中（50μl /孔），再每孔加入50μl适当稀释倍数的噬菌体，每个毒素浓度重复3次；ELISA板最后一列只加PBST作为空白对照，第一列加入50μl PBST以及50μl上述间接ELISA方法筛选到的阳性克隆上清，作为B₀，轻摇板子混匀后，置37℃温箱反应1 h；PBST 洗板3 次后，每孔加入100 ul用封闭液按1：5000比例稀释的HRP/ANTI-M13，37℃保温1 h；PBST 洗板6次，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；加2 mol/L H₂SO₄，每孔50 μl中止反应，用酶标仪分别测定OD₄₅₀ 值；根据黄曲霉毒素B1浓度对B/B₀值绘制竞争曲线，计算IC₅₀。由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔，挑取master plate中对应的菌液加以扩大培养即为黄曲霉毒素重组单链抗体2G7。

具体获得方法可为：

1)获得能分泌黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的菌液，在SOBAG平板上面划线培养分离出单菌落，随机挑取一个单菌落加入3 ml 2YT-AG液体培养基中，225 rpm，30℃培养过夜；

2) 取1 ml 过夜培养好的2G7小样接种于100 ml 2×YT-AG液体培养基中，37℃恒温摇床中培养至OD600＝0.5-0.8；

3）按大肠杆菌：辅助噬菌体个数比为1：5 的比例将辅助噬菌体M13KO7加入到步骤（2）所摇的菌液中，37 ℃恒温摇床培养1 h；

4）4℃，5 000 rpm，冷冻离心10 min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀用100 ml 2YT-AK液体培养基重悬，37℃，225 rpm培养过夜；

5) 过夜培养物以12000 rpm，4℃冷冻离心20 min，无菌操作台中将上清小心移至新的离心管中，加入1/5 体积的PEG/NaCl 水溶液，冰浴1 h，沉淀上清中的噬菌体；

6）4℃，12000 rpm，冷冻离心20 min，倒掉上清，将沉淀于离心管底部的噬菌体用10ml PBS重悬，4℃保存备用。

黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的特性及测序分析结果如下：

(1)采用间接竞争ELISA方法测定单链抗体特异性：抗体特异性用交叉反应率描述，将AFB₁, AFB₂, AFG₁, AFG₂和AFM₁五种不同标准品储存液，用封闭液梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50%时的标准品浓度，用IC₅₀表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率（%）=（AFB₁ IC₅₀/ 类似物IC₅₀）×100%。得到2G7对于黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀为10 pg/mL，对于五种主要黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为100%，33%，25%，0.1%和2.9%，可见该黄曲霉毒素重组单链抗体2G7是一种黄曲霉毒素B1特异性重组抗体。

(2)黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的特征性序列测定：

将黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的克隆菌液送至上海Invitrogen公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物R1：5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’，测序结果采用GENETOOL软件及上传网站IGMT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/)进行抗体可变区序列分析。得到其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，编码基因序列为SEQ ID NO:4所示，其中重链可变区编码基因序列为SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码基因序列为SEQ ID NO:6所示。

与传统的单克隆抗体或多克隆抗体的制备相比，单链抗体可以在很短的时间内大量生产。每500ml细菌培养液在2天时间内约能获得5mg-50mg单链抗体；而传统杂交瘤单克隆抗体每只小鼠需要2-8周的时间才能得到约5mg-10mg单克隆抗体。

将黄曲霉毒素重组单链抗体2G7用于花生样品中黄曲霉毒素B1的检测。具体方法如下：

（1）以2.5 μg/mL人工抗原AFB1-BSA 包被酶标板，每孔100μL，4 ℃过夜，0.01 mol/L pH7. 4 PBST 洗涤扣干；

（2）5%脱脂奶粉封闭，每孔200μL，37℃ 2 h ，洗涤扣干；

（3）配制0，0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4，8 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液(含20%甲醇的Pi/NaCl，pH7.2)，第一排每孔依次加入待测AFB1标准溶液50μL，其它孔作为检测孔，每个样品三个重复，每孔加黄曲霉毒素重组单链抗体2G7（稀释4000倍）50μL，37℃孵育2 h，洗涤扣干；

（4）每孔加1：5000羊抗鼠IgG-HRP 100μL，37℃ 2h ，洗涤扣干；

（5）底物显色反应：每孔加反应底物100μL (1 mg/mL四甲基联苯胺1.0mL，底物缓冲液10 mL，1% H₂O₂ 25μL，现配现用)，37℃避光反应15min，每孔50μL 2 mol/L H₂SO₄终止反应，5 min 后以空白对照孔调零，450nm 测吸光值；

（6）绘制标准曲线，所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个孔即标准孔（0标准）的吸光度值（B/B₀）再乘以100 %，即百分吸光度值。以黄曲霉毒素B1浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。并拟合得到该标准曲线方程（见图2）：y=41.13x+20.39，R²=0.988。

（7）样品中黄曲霉毒素B1的测定：分别称取25g粉碎花生样品置于三角瓶中，加入75mL含有4%NaCl（质量/体积）的80%的甲醇水溶液混合均匀，超声波处理10min。静置30min，使其完全分层，吸取上清，将上清用双层滤纸进行过滤。将滤液用含有1%BSA的PBS溶液稀释五倍后，用稀释液进行间接竞争ELISA。然后根据样品百分吸光度值，结合标准曲线，从曲线上得到对应点的横坐标，即为黄曲霉毒素B1浓度的对数值，由此即可得到测定液中黄曲霉毒素B1浓度（ng/ml）。样品经过稀释时应乘以相应稀释系数。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 黄曲霉毒素重组单链抗体2G7、编码基因及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

Met Ala Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

1 5 10 15

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr

20 25 30

Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Ala Glu Lys

35 40 45

Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr

50 55 60

Tyr Pro Dsp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75

Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu

80 85 90

Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser His Asp Tyr Ala Trp Ser

95 100 105

Phe Gly Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Pro

110 115 120

Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

125 130 135

Ser Leu Cys Asp Ser Gly Ile Cys Thr His His Ile Thr Trp Val

140 145 150

Asn Ser His Thr His Leu Ser Leu Lys Lys Trp Gly Cys Tyr Asn

155 160 165

Tyr Tyr Leu Arg Gln Leu Asp Pro Arg Lys Ser Arg Ser Phe Ile

170 175 180

His Trp Ser Asn Arg Trp His Tyr Gln Ala Ser Ser Arg Cys Ser

185 190 195

Cys Gln Ile Leu Arg Leu Pro Asp Trp Arg Gln Gly Cys Pro His

200 205 210

His His Arg Gly Thr Asp Cys Gly Cys Gly Ser Ile Phe Leu Cys

215 220 225

Ser Met Gly Gln Gln Pro Phe Gly Val Arg Trp Arg Asn Gln Thr

230 235 240

Asp Cys Pro Ser

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Met Ala Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

1 5 10 15

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr

20 25 30

Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Ala Glu Lys

35 40 45

Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr

50 55 60

Tyr Pro Dsp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

65 70 75

Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu

80 85 90

Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser His Asp Tyr Ala Trp Ser

95 100 105

Phe Gly Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Pro

110 115 120

Gln

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

Leu Cys Asp Ser Gly Ile Cys Thr His His Ile Thr Trp Val Asn

1 5 10 15

Ser His Thr His Leu Ser Leu Lys Lys Trp Gly Cys Tyr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Leu Arg Gln Leu Asp Pro Arg Lys Ser Arg Ser Phe Ile His

35 40 45

Trp Ser Asn Arg Trp His Tyr Gln Ala Ser Ser Arg Cys Ser Cys

50 55 60

Gln Ile Leu Arg Leu Pro Asp Trp Arg Gln Gly Cys Pro His His

65 70 75

His Arg Gly Thr Asp Cys Gly Cys Gly Ser Ile Phe Leu Cys Ser

80 85 90

Met Gly Gln Gln Pro Phe Gly Val Arg Trp Arg Asn Gln Thr Asp

95 100 105

Cys Pro Ser

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 4

atggccgagg tgaaggtggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60

aaactctcct gttcagcctc tggattcact ttcagtaact atggcatgtc ttggcttcgc 120

cagaccgcgg agaagaggct ggagtgggtc gcaagtatta gtggtggtgg ttatagctac 180

tatccagaca gtgtgaaggg gcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaacctg 240

tatctacaaa tgagtagtct gaagtctgag gacacggcct tgtatttctg tgcaagtcat 300

gattacgcct ggtccttcgg tgtctggggc gcagggacct cagtcaccgt ctcctctcct 360

cagggtggcg gtggctccgg cggtggtggc agcggtggcg gcggttctct ctgtgactca 420

ggaatctgca ctcaccacat cacctggtga aacagtcaca ctcacttgtc gctcaagtag 480

tggggctgtt acaactacta cctccgccaa ctggatccaa gaaaaagcag atcatttatt 540

cactggtcta ataggtggca ttaccaagcg agctccaggt gttcctgcca gattctcagg 600

ctccctgatt ggagacaagg ctgccctcac catcacaggg gcacagactg cggatgcggc 660

agtatatttc tgtgctctat gggacagcaa ccatttggtg ttcggtggag gaaccaaact 720

gactgtccta gc 732

<210> 5

<211> 363

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 5

atggccgagg tgaaggtggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60

aaactctcct gttcagcctc tggattcact ttcagtaact atggcatgtc ttggcttcgc 120

cagaccgcgg agaagaggct ggagtgggtc gcaagtatta gtggtggtgg ttatagctac 180

tatccagaca gtgtgaaggg gcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaacctg 240

tatctacaaa tgagtagtct gaagtctgag gacacggcct tgtatttctg tgcaagtcat 300

gattacgcct ggtccttcgg tgtctggggc gcagggacct cagtcaccgt ctcctctcct 360

cag 363

<210> 6

<211> 324

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 6

ctctgtgact caggaatctg cactcaccac atcacctggt gaaacagtca cactcacttg 60

tcgctcaagt agtggggctg ttacaactac tacctccgcc aactggatcc aagaaaaagc 120

agatcattta ttcactggtc taataggtgg cattaccaag cgagctccag gtgttcctgc 180

cagattctca ggctccctga ttggagacaa ggctgccctc accatcacag gggcacagac 240

tgcggatgcg gcagtatatt tctgtgctct atgggacagc aaccatttgg tgttcggtgg 300

aggaaccaaa ctgactgtcc tagc 324

Claims

1.黄曲霉毒素重组单链抗体2G7，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.黄曲霉毒素重组单链抗体2G7的编码基因，其特征在于：它的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示，其中重链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。

3.黄曲霉毒素重组单链抗体2G7在黄曲霉毒素B1含量检测中的应用。