CN103014012B

CN103014012B - 镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用

Info

Publication number: CN103014012B
Application number: CN201210574749.8A
Authority: CN
Inventors: 廖玉才; 胡祖权; 李和平; 张静柏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2032-12-26
Also published as: CN103014012A

Abstract

本发明公开了镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用，从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白，免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选、PhageELISA、表达ELISA和序列测定，获得了一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7，并与碱性磷酸酶基因构建融合蛋白表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达，得到镰刀菌特异单链抗体FvSG7和FvSG7-AP融合蛋白，该抗体和融合蛋白可用于在植物或植物来源产品中镰刀菌污染情况的免疫学检测，为镰刀菌病情调查及出入境粮食和饲料中镰刀菌污染情况的检验检疫提供可靠有效的检测手段。

Description

镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及镰刀菌特异单链抗体，还涉及镰刀菌特异单链抗体的制备方法，还涉及镰刀菌特异单链抗体在检测镰刀菌中的应用。

背景技术

镰刀菌（Fusarium）是世界范围内广泛存在的赤霉病病原真菌，能够侵染小麦（Triticumaestivum）、大麦（Hordeum vulgare）、燕麦（Avena sativa L.）、玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryzasativa）、黑麦（Secale cereale L.）等多种禾谷类作物，严重影响作物的生长发育状况及籽粒质量，或产生直接危害人畜健康的真菌毒素，引起各种急性或慢性疾病，从而造成严重的经济损失。镰刀菌侵染作物引起的各种病害是我国小麦、玉米和水稻等主要粮食作物生产上的重要病害，特别是在我国长江流域、华中、华南及东北小麦玉米种植区流行频繁，近年来已有向黄淮区扩展蔓延之势。调查也显示我国的主要粮食作物籽粒均不同程度受到镰刀菌及其产生的真菌毒素的污染。因此，监控镰刀菌的污染情况，有利于防止田间病害的大面积发生，也可控制真菌毒素进入食品或饲料中。串珠镰刀菌（F. verticillioides）是一种非常重要的镰刀菌，主要侵染玉米，引起穗腐和粒腐，产生有毒的伏马菌素（Fumonisins）、串珠镰刀菌素（Moniliformin）、镰刀菌素C（Fusarin C）和镰刀菌酸（Fusarinic acid）等真菌毒素。所以本发明选用串珠镰刀菌作为原始材料制备抗原。

目前用于检测镰刀菌的方法主要是生物方法和分子检测，但这些方法需要在检测前先培养真菌，样品处理过程繁琐，费时费力。此外，这些方法对技术人员和专业设备的要求也使得其难以在野外或偏远地区开展检测工作。酶联免疫吸附法（ELISA）检测除了具有很高的特异性和检测限外，还能高通量快速开展工作，不受地域和设备的限制，易于推广使用。传统的免疫学检测需要将酶或荧光染料标记到一抗或二抗上，用于ELISA检测与抗体化学交联最常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。但是，由于化学交联是一个随机的反应过程，所以有可能导致活性降低或完全失活，也可能产生抗体-抗体或酶-酶等非特异交联物。因此，需要专业的技术人员、复杂的操作和最优的反应条件来保证获得高质量的抗体-酶交联物。生物技术的发展使得这一策略发生了根本性的改变，通过基因工程技术构建表达单链抗体-碱性磷酸酶（scFv-AP）融合蛋白，被认为是快速免疫学检测的一个很好的选择。ScFv-AP融合蛋白通过原核表达系统高效表达纯化后用于抗原检测，不需要添加酶标记二抗，从而使免疫学检测的效率明显提高，而检测费用则大幅降低，应用前景十分广泛。本发明通过构建免疫抗体基因文库，利用噬菌体抗体库技术筛选获得镰刀菌特异单链抗体，再通过基因工程技术手段将单链抗体与AP在基因水平上进行融合，原核表达的scFv-AP融合蛋白可为检测和调查玉米等粮食作物、饲料以及食品或制品中镰刀菌的污染情况提供快速可靠的检测手段。

发明内容

本发明目的在于提供了一种镰刀菌特异单链抗体基因，从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白（SCWPs），免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、Phage ELISA和表达ELISA鉴定，并进行序列测定，最后获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7。该基因由810个核苷酸组成，其序列为SEQ ID NO：1所示。重链可变区V_H由372个核苷酸组成，其序列为SEQ ID NO：3所示。轻链可变区V_L由315个核苷酸组成，其序列为SEQID NO：5所示。

本发明的另一个目的是在于提供了一种镰刀菌特异单链抗体，其序列为SEQ ID NO：2所示，由269个氨基酸组成，本发明的镰刀菌特异单链抗体主要由抗体重链可变区V_H、抗体轻链可变区V_L和连接肽组成，抗体重链可变区V_H和抗体轻链可变区V_L通过连接肽(Gly₄Ser)₃连接共同完成镰刀菌的识别和结合。其重链可变区V_H由124个氨基酸组成，序列为SEQ ID NO：4所示，轻链可变区V_L由105个氨基酸组成，其序列为SEQ ID NO：6所示。

本发明的另一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体在检测镰刀菌中的应用。

本发明的另一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体的FvSG7-AP融合蛋白基因，其序列为SEQ ID NO：7所示。

本发明的还有一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白，其序列为SEQID NO.8所示，镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7构建到pDAP2/S载体中获得FvSG7-AP融合蛋白表达载体，FvSG7-AP融合蛋白在大肠杆菌中进行大量表达纯化后，可直接应用于镰刀菌的检测。

本发明最后一个目的是提供了一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白在检测镰刀菌中的应用。本发明克服现有检测技术存在的缺陷和不足，利用噬菌体抗体库技术筛选获得一种镰刀菌特异单链抗体，再与碱性磷酸酶构建表达融合蛋白，用于在植物或植物来源产品中镰刀菌污染情况的免疫学检测，为镰刀菌病情调查及出入境粮食和饲料中镰刀菌污染情况的检验检疫提供可靠有效的检测手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明是这样实现的：直接从串珠镰刀菌菌丝中抽提细胞壁蛋白（SCWPs），免疫来亨母鸡后提取脾脏细胞，利用分子克隆方法和技术构建单链抗体基因文库，再通过噬菌体展示技术筛选、Phage ELISA、表达ELISA和序列测定，最后获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因，申请人将其命名为FvSG7，该单链抗体与碱性磷酸酶构建融合蛋白表达载体，在大肠杆菌中进行可溶性表达，用于检测镰刀菌的污染情况。

一种镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7，其制备步骤是：

制备SCWPs，免疫来亨母鸡，提取其脾脏总RNA、纯化mRNA以及合成cDNA第一链，再经PCR扩增获得重链可变区（V_H）、轻链可变区（V_L）及单链抗体（scFv）基因；随后，scFv片段经酶切后连入pHENHi载体，构建单链抗体基因文库；最后，抗体基因文库经噬菌体展示淘选、Phage ELISA鉴定和序列测定得到镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7，其序列为SEQ ID NO：1所示。

一种镰刀菌特异单链抗体，其制备步骤是：

将含有镰刀菌特异单链抗体基因FvSG7的pHENHi载体（pHENHi-FvSG7）电转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，然后经Ni-NTA柱纯化得到FvSG7抗体，SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约35kD大小的目的蛋白，其序列为SEQ ID NO：2所示。

一种镰刀菌特异单链抗体在镰刀菌检测中的应用，其应用过程是：

表达纯化的FvSG7抗体通过酶联免疫反应（ELISA）或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于镰刀菌的检测。

1）在ELISA板孔中加入100μl串珠镰刀菌SCWPs（20μg/ml），37℃水浴包被2h。

2）用200μl PBS洗涤3次。

3）在抗原包被的孔及对照孔中分别加入150μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液），于37℃水浴封闭2h。

4）用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。

5）在抗原包被孔及其对照孔中分别加入100μl封闭液稀释的含200nM FvSG7抗体，37℃反应2h。

6）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

7）每孔加入100μl封闭液稀释（体积比为1：5000）的抗His单克隆抗体，37℃反应1.5h。

8）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

9）每孔加入100μl封闭液稀释（体积比为1：5000）的AP标记羊抗鼠IgG抗体，37℃反应1.5h。

10）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

11）每孔加入100μl显色液（0.2%（W/V）对硝基苯磷酸二钠（pNPP）溶液），黑暗条件下反应15～30min。

12）每孔加入50μlNaOH溶液（3M）终止反应，用酶标仪测OD_405nm读值。

表达ELISA结果显示，FvSG7抗体对串珠镰刀菌SCWPs具有很强的结合能力，OD_405nm平均读值达到2.331，比阴性对照（0.055）高出42.4倍。在检测镰刀菌时，不需要提取SCWPs，将采集的样品直接研磨后即可检测。

一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白，其制备步骤是：

镰刀菌单链抗体基因FvSG7通过酶切连入pDAP2/S载体，重组载体pDAP2/S-FvSG7电转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，然后经Ni-NTA柱纯化得到FvSG7-AP融合蛋白。FvSG7-AP融合蛋白表达纯化后，SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约80kD大小的目的蛋白，其序列为SEQ ID NO：8所示。

一种镰刀菌特异单链抗体的融合蛋白在镰刀菌检测中的应用，其应用过程是：

表达纯化的FvSG7-AP融合蛋白通过酶联免疫反应（ELISA）或制备检测试剂盒或蛋白芯片等应用于镰刀菌的检测。

1）在ELISA板孔中加入100μl抗原SCWPs（20μg/ml），37℃温育2h。

2）用200μl PBS洗涤3次。

3）加入150μl封闭液，37℃封闭2h，同时封闭空白孔作对照。

4）用200μl PBS洗涤3次。

5）每孔加入100μl封闭液稀释的纯化的FvSG7-AP融合蛋白（200nM），37℃温育2h。

6）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次。

7）加入100μl0.2%（W/V）pNPP显色液显色15～30min，读取OD_405nm值。

ELISA结果显示，FvSG7-AP融合蛋白对串珠镰刀菌SCWPs仍保持很强的结合能力，OD_405nm平均读值达到2.304，比阴性对照（0.052）高出44.3倍。在检测镰刀菌时，不需要提取SCWPs，将采集的样品直接进行研磨处理后即可检测。

本发明的有益效果：

1、本发明的有益效果之一是利用噬菌体抗体库技术，构建了镰刀菌特异单链抗体基因文库，通过噬菌体展示技术筛选获得一个高亲和力的镰刀菌特异单链抗体及其编码基因FvSG7。

2、本发明的有益效果之二是镰刀菌特异单链抗体FvSG7可在大肠杆菌中可溶性表达，操作简单，生产成本低。

3、本发明的有益效果之三是表达纯化的FvSG7抗体可用于镰刀菌的检测，包括制备检测试剂盒或蛋白芯片等用于在田间作物、饲料、粮食或食品镰刀菌污染中的检测。

4、本发明的有益效果之四是FvSG7抗体与AP在大肠杆菌中融合表达，提供的FvSG7-AP融合蛋白可在重组大肠杆菌中进行大量可溶性表达，不需要贵重的仪器设备和繁锁的操作，成本低，适合大规模的生产。

5、本发明的有益成果之五是表达纯化的FvSG7-AP融合蛋白可用于镰刀菌的检测，包括制备检测试剂盒或蛋白芯片等用于在田间作物、饲料、粮食或食品镰刀菌污染中的快速检测。在检测过程中不需要标签抗体和酶标记抗体，降低了检测成本，缩短了检测时间。

附图说明

图1：为一种技术流程图

图2：为V_H、V_L和scFv片段的凝胶电泳图。

图中：M：DNA分子质量标准；泳道1：重链可变区片段（V_H）；泳道2：轻链可变区片段（V_L）；泳道3：单链抗体基因片段（scFv）。

图3：为一种pHENHi载体结构图。

图4：为一种Phage ELISA鉴定SCWPs免疫鸡源淘选抗体库示意图。

图中：★标记为测序的10个单克隆。

图5：为一种FvSG7抗体免疫标记串珠镰刀菌孢子和菌丝的显微图像。

图中：a和c：显微镜明场下的串珠镰刀菌孢子；e和g：显微镜明场下的串珠镰刀菌菌丝；b和f：Cy3荧光检测FvSG7抗体与a和e中串珠镰刀菌孢子和菌丝的结合情况；d和h：Cy3荧光检测PIPP抗体（对照）与c和g中串珠镰刀菌孢子和菌丝的结合情况；标尺为10μm。

图6：为一种SDS-PAGE电泳检测纯化的FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白示意图。

图中：M：蛋白分子量标准；泳道1：scFv-AP融合蛋白；泳道2：FvSG7单链抗体。

图7：为一种Western blot分析FvSG7及其融合蛋白对串珠镰刀菌SCWPs的结合情况示意图。

图中：a：FvSG7抗体检测；b：FvSG7-AP融合蛋白检测；M：蛋白分子质量标准。

图8：为一种表面等离子共振（SPR）分析FvSG7抗体及FvSG7-AP融合蛋白的结合力示意图。

图9：为一种ELISA检测FvSG7抗体及FvSG7-AP融合蛋白的最低检测限示意图。

图10：为一种ELISA检测FvSG7-AP融合蛋白的最低定量限示意图。

具体实施方式

实施例1：串珠镰刀菌细胞壁蛋白（SCWPs）制备

1）用接种针挑取串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）wh1-2（该菌株已于2010年10月28日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号为：CCTCC M2010283），接种于20ml CMC培养基（成分：0.75%（W/V）羧甲基纤维素酯，0.05%（W/V）NH₄NO₃，0.05%（W/V）KH₂PO₄，0.025%（W/V）MgSO₄·7H₂O，0.05%（W/V）酵母粉）中，28℃，200r/min振荡光照培养3天，用两层灭菌纱布过滤，收集孢子液。

2）取1ml孢子液接种于160ml Czapek培养基（成分：3%（W/V）蔗糖，0.3%（W/V）NaNO₃，0.1%（W/V）K₂HPO₄，0.05%（W/V）MgSO₄·7H₂O，0.05%（W/V）KCl，0.001%（W/V）FeSO₄，pH9.0）中，28℃，225r/min振荡避光培养5～7天。

3）用2层灭菌纱布过滤培养液，并用灭菌水洗涤3次后将菌丝置于超净工作台上吹干。

4）在研钵中加入液氮研磨菌丝，装入2ml离心管中，置于冰上。

5）加入1.5～2ml CWP缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM苯甲基磺酰氟（PMSF），pH7.8）混匀。

6）4℃，50r/min旋转洗涤30min。

7）4℃，4600r/min离心10min，弃上清。

8）用预冷的CWP洗脱液（1M NaCl，1mM PMSF）洗涤3～5次，每次4℃，50r/min旋转洗涤30min，再4℃，4600r/min离心10min后弃上清。

9）加入10ml含1mM PMSF的灭菌水混匀，4600r/min离心10min，弃上清。

10）加入5ml处理液（50mM Tris-HCl（pH8.0），0.1M EDTA，2%（W/V）SDS，10mM DTT）悬浮沉淀，煮沸10min。

2）室温15000r/min离心10min。

3）吸取上清，加入4倍体积的丙酮和等体积的三氯乙酸（TCA），充分混匀后冰上放置30min。

4）4℃，15000r/min离心45min，弃上清。

5）加入25ml预冷丙酮重悬沉淀，-20℃放置1h或过夜。

6）重复步骤4和5操作2～3次。

7）弃上清，干燥5～10min直至丙酮完全挥发。

8）加入2mlPBS，超声波助溶30min。

9）4℃，12000r/min离心10min，保留上清。

10）重复步骤8和9，合并上清。

11）4℃，12000r/min离心10min，取上清加入超滤管，加入10ml PBS超滤2～3次（4℃，4000r/min离心30～60min）。

12）吸取超滤液至离心管，4℃，12000r/min离心10min，取上清保存于-20℃备用。

实施例2：SCWPs免疫来亨母鸡

用制备的串珠镰刀菌SCWPs免疫来亨母鸡（购自华中农业大学养鸡场）4次，每次间隔14天。第一次取500μl免疫抗原（100μg）与500μl弗氏完全佐剂混合后免疫，后三次取500μl免疫抗原与500μl弗氏不完全佐剂混合后免疫。第三次免疫后第5天取血清从1：10³倍比稀释至1：128×10³，参照林巧爱、董海艳主编，《医学免疫学与微生物学实验指导》，浙江大学出版社，2006年出版介绍的间接ELISA法检测免疫鸡血清中抗体的水平。检测结果显示被免疫后的鸡血清中产生了较高的抗体滴度（稀释度>1：10⁵）。

实施例3：提取脾脏总RNA、纯化mRNA以及合成cDNA第一链

1）最后一次免疫后第7天取免疫后产生较高抗血清反应的鸡的脾脏。

2）利用TRNzol-A⁺总RNA提取试剂（购自天根生化科技（北京）有限公司产品，按照该试剂的说明书操作）提取脾脏总RNA。

3）用mRNA纯化试剂盒（购自QIAGEN公司，按该试剂盒的说明书操作）对步骤2提取的总RNA进行纯化。

4）用SuperScript^TM III反转录酶（购自Invitrogen公司，按照该酶的说明书操作）分别以步骤3得到的mRNA为模板，用特异引物chicVHM（CGGTGGGGGACATCTGAGTGGG）反转录合成抗体重链可变区（V_H）的cDNA第一链；用特异引物chicVLM（AGGGGTGGAGGACCTGCACCTC）反转录合成轻链可变区（V_L）的cDNA第一链。

实施例4：PCR扩增重链可变区（V_H）、轻链可变区（V_L）及单链抗体（scFv）基因

1）PCR扩增V_H和V_L基因

以实施例3反转录合成的V_H的cDNA为模板，用正向引物CPDVHF（ATCTAGGCATCCCTTGGCCCAG CCGGCCATGGCTGCCGTGACGTTGGACGAGTCC）和反向引物CHIC Gly（GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGATGACCTCGGTCCC）进行PCR扩增获得V_H片段；以实施例3反转录合成的V_L的cDNA为模板，用正向引物CHIC Ser（GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGC GCTGACTCAGCCGTCCTCGGTG）和反向引物CPDVLB（TGACCTTCGAGGATGCGCGGCCGCGTCGACGGGCTGGCCTAGGACGGTCAG）进行PCR扩增获得V_L片段。在50μl PCR反应体系中，含有4μl cDNA，5μl PCR缓冲液（含Mg²⁺），8μl1.25mM dNTPs，2μl正向引物（10μM），2μl反向引物（10μM），2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃80sec，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，V_H和V_L片段大小与预期相一致。

2）用DNA凝胶回收试剂盒（购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作）分别纯化步骤1扩增得到的V_H和V_L片段。

3）SOE-PCR扩增scFv基因

加入近等摩尔的V_H和V_L片段作为模板，用正向引物CPDVHF和反向引物CPDVLB进行SOE-PCR扩增，获得scFv基因。SOE-PCR分两步反应完成，第一步反应在50μl PCR反应体系中，含有V_H和V_L片段各400ng，5μl PCR缓冲液（含Mg²⁺），8μl1.25mM dNTPs，2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min，55℃2min，72℃15min，7个循环；第二步反应在50μlPCR反应体系中，含有10μl第一步反应PCR产物，4μl PCR缓冲液（含Mg²⁺），8μ1.25mM dNTPs，2μl正向引物（10μM），2μl反向引物（10μM），2.5U Taq聚合酶。PCR反应条件为：95℃5min；94℃1min，55℃80sec，72℃2min，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示，scFv片段大小与预期相一致。

4）用DNA凝胶回收试剂盒（购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作）回收纯化步骤3获得的scFv片段。

实施例5：pHENHi载体及scFv片段酶切、连接

1）分别用SfiI和NotI限制性内切酶（购自NEB公司，按照该酶的说明书操作）双酶切载体pHENHi（Peschen D,Li HP，et al.Fusion proteins comprising a Fusarium-specific antibodylinked to antifungal peptides protect plants against a fungal pathogen.Nat.Biotechnol.,2004,22:732-738，如图3所示）和实施例4得到的scFv片段。

2）用DNA凝胶回收试剂盒（购自QIAGEN公司，按照该试剂盒的说明书操作）纯化步骤1酶切后的pHENHi载体和scFv片段。

3）用T4DNA连接酶（购自NEB公司，按照该酶的说明书操作）连接步骤2回收的pHENHi载体和scFv片段，得到酶连接产物pHENHi-scFv。

4）参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法对步骤3得到的酶连接产物pHENHi-scFv进行乙醇沉淀除盐。

实施例6：单链抗体基因文库构建

1）大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞制备

用无菌牙签蘸取大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF’（购自Stratagene公司），在LB固体培养基（成分：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）NaCl，1.5%（W/V）琼脂，pH7.0）平板上划线，于37℃恒温箱培养16h后，挑取一单克隆菌落接种到5ml LB液体培养基（成分：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）NaCl，pH7.0）中，37℃，200r/min振荡过夜培养16h。取1.6ml菌液加入到160ml LB液体培养基中，37℃，230r/min振荡培养至OD_600nm达到0.45左右时，取出培养菌的三角瓶置于冰上冷却30min后，将菌液分装于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，然后用30ml预冷的10%（V/V）甘油洗涤菌体沉淀两次（4℃，4000r/min离心15min后弃上清）。最后每个离心管中加入100μl预冷的GYT培养基（成分：0.25%（W/V）胰蛋白胨，0.125%（W/V）酵母提取物，10%（V/V）甘油）悬浮菌体，分装成100μl/管，立即保存于-80℃冰箱。

2）电转化酶连接产物

将-80℃保存的大肠杆菌XL1-Blue MRF’感受态细胞取出，置冰上溶化后，每管感受态细胞（100μl）中加入5μl酶连接产物pHENHi-scFv，小心轻微地混匀后放冰上静置3min，然后将感受态细胞转移至冰上预冷的电转化杯（0.2cm）（购自BIO-RAD公司）中，用BIO-RAD公司的MicroPulser^TM电转化仪进行电转化（设置Bacteria Ec2程序）。转化后立即加入1ml SOC培养基（成分：2%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，0.05%（W/V）NaCl，20mM葡萄糖，pH7.0）到电转化杯中，并将菌液转移至离心管中，37℃，200r/min振荡培养1h使细胞复苏。

3）电转化感受态细胞涂布平板培养

取出复苏后的感受态细胞，取100μl涂布于含1%（W/V）葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板用于计算单克隆菌落数。其余的菌液通过6000r/min离心1min后吸弃部分上清，每管保留约100～150μl上清重悬菌体，涂布于含1%（W/V）葡萄糖和100μg/ml Amp的LB固体培养基平板，置于37℃恒温箱过夜培养12～16h至长出单克隆菌落。

4）抗体基因文库收集保存

计算电转化感受态细胞涂布平板培养后长出的单克隆菌落数量，估算抗体基因文库容量。收集LB固体培养基平板上长出的菌落，加入等体积50%（V/V）甘油保存于-80℃冰箱。

通过以上步骤操作，最后构建的镰刀菌特异单链抗体基因文库容量约为4.7×10⁷cfu。

实施例7：单链抗体基因文库鉴定

1）从实施例6平板上长出的转化子中随机挑取20个单克隆菌落接种到含1%（W/V）葡萄糖和100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡过夜培养16h。

2）参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的煮沸裂解法提取质粒DNA，通过0.8%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。

3）以步骤2得到的质粒DNA为模板，用正向引物pHENpel（GCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGC）和反向引物pHENmyc（ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG）进行PCR扩增。在25μl PCR反应体系中，含有50ng质粒DNA，2.5μl PCR缓冲液（含Mg²⁺），2μl1.25mM dNTPs，1μl正向引物pHENpel（10μM），1μl反向引物pHENmyc（10μM），1.25U Taq聚合酶。PCR反应条件为：94℃5min；94℃50sec，48℃90sec，72℃90sec，30个循环；最后72℃10min。PCR产物通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的阳性率。

4）用BstNI限制性内切酶（购自NEB公司，按照该酶的说明书操作）酶切步骤3扩增的PCR产物，酶切产物通过1.5%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测抗体基因文库的多样性。

鉴定结果显示，构建的抗体基因文库阳性率达到100%，多样性高于70%，说明构建的文库质量较高，可用于特异单链抗体的筛选。

实施例8：噬菌体展示筛选单链抗体基因文库

1）取实施例6收集保存的菌液（抗体基因文库）500μl加入到50ml含1%（W/V）葡萄糖和100μg/mlAmp的2×TY培养基（成分：1.6%（W/V）胰蛋白胨，1%（W/V）酵母提取物，0.5%（W/V）NaCl，pH7.0）中，37℃，200r/min振荡培养至OD_600nm达到0.5。

2）取5ml菌液于50ml离心管中，加入0.5μl M13KO7辅助噬菌体（购自AmershamBiosciences公司，参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备保存，其中：噬菌体的量为大肠杆菌的20倍），混匀后于37℃水浴静置30min。

3）4000r/min离心10min，弃上清，然后重悬于140ml含100μg/ml Amp和25μg/ml卡那霉素（Kan）的2×TY培养基中，30℃，200r/min振荡过夜培养至少15h。

4）将过夜培养的菌液分装于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心30min。

5）取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液（20%（W/V）聚乙二醇（PEG）6000，2.5M NaCl），充分混匀后置冰上沉淀1h。

6）4℃，8000r/min离心30min，弃上清，将沉淀重悬于40ml灭菌水中，并立即加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，充分混匀后4℃放置20min。

7）4℃，4000r/min离心30min，弃上清。

8）轻微离心，去除残留的PEG/NaCl溶液。

9）加入1.6ml灭菌水重悬沉淀，4℃，12000r/min离心10min，取上清于4℃保存。

10）用串珠镰刀菌SCWPs包被ELISA板（共20孔，每孔100μl），37℃水浴2h。

11）用磷酸盐缓冲液（PBS）（成分：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.2～7.4）洗涤3次。

12）每孔加入150μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液），37℃水浴封闭2h（用封闭液封闭一空白孔作为阴性对照）。

10）用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。

11）每孔中加入100μl步骤9保存的上清（噬菌体），37℃水浴2h。

12）用200μl PBST（含0.1%（V/V）Tween20的PBS）和PBS分别洗涤5次，每次3min（第二轮和第三轮淘选时增加洗涤次数至10次和15次）。

13）每孔加入100μl三乙胺溶液（100mM），室温放置10min。

14）立即加入50μl Tris-HCl溶液（1M，pH7.4）中和，并转移至50ml离心管中。

15）取6ml在37℃，230r/min振荡培养条件下生长至OD_600nm为0.5～0.9的大肠杆菌XL1-Blue MRF’加入到50ml离心管中，37℃水浴侵染30min。

16）4000r/min离心10min，弃上清。

17）加入800μl LB培养基重悬菌体后涂布于TYE固体培养基（成分：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，0.8%（W/V）NaCl，1.5%（W/V）琼脂，pH7.0）平板上，37℃恒温箱过夜培养12～16h至长出菌落。

18）收集TYE固体培养基平板上长出的菌落，进行下一轮淘选或加入等体积50%（V/V）甘油保存于-80℃冰箱。

实施例9：Phage ELISA鉴定淘选抗体库

1）在96孔细胞培养板孔中加入180μl含1%（W/V）葡萄糖和100μg/mlAmp的2×TY培养基，用灭菌牙签从第三轮淘选抗体库的菌落中随机挑取48个单克隆接种，30℃，150r/min振荡过夜培养16h。

2）在另一96孔培养板孔中加入180μl2×TY培养基（含1%（W/V）葡萄糖，100μg/mlAmp以及约10⁸辅助噬菌体M13KO7），再加入20μl过夜培养菌液，37℃，150r/min振荡培养2h。

3）室温1800r/min离心10min，弃上清。

4）加入180μl含100μg/mlAmp和50μg/ml Kan的2×TY培养基至培养板孔中，37℃，150r/min振荡过夜培养16h。

5）1800r/min离心10min，培养基上清用于phage ELISA检测。

6）在ELISA板孔中加入100μlSCWPs（50μg/ml）或PBS（对照），37℃水浴包被2h。

7）用200μlPBS洗涤3次。

8）加入150μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液），37℃水浴封闭2h。

9）用200μl PBS洗涤3次。

10）加入50μl步骤5收集的培养基上清，并加入50μl封闭液，37℃反应2h。

11）用PBST和PBS分别洗涤3次。

12）加入100μl1：5000（V/V）稀释的HRP标记鼠抗M13抗体，37℃反应2h。

13）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次。

14）加入100μl可溶性单组份TMB底物（购自天根生化科技（北京）有限公司），黑暗条件下反应15～30min。

15）加入50μl H₂SO₄溶液（2M）终止反应，用酶标仪测OD_450nm读值。

Phage ELISA鉴定结果显示，48个单克隆样品中有33个显色（如图4所示），从其中挑取显色较高的10个单克隆样品（图4中★标注）的培养菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，分析结果显示它们具有一致的核苷酸序列（命名为FvSG7），其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。含有该基因的大肠杆菌命名为重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-FvSG7，单克隆培养菌液加等体积50%（V/V）甘油保存于-80℃冰箱。

实施例10：重组大肠杆菌超量表达、纯化FvSG7抗体

1）取5μl甘油保存的重组大肠杆菌XL1-Blue MRF’/pHENHi-FvSG7接种于20ml含1%（W/V）葡萄糖和100μg/mlAmp的2×TY培养基中，37℃，200r/min振荡过夜培养12h。

2）取8ml过夜培养菌液加入160ml含1%（W/V）葡萄糖和100μg/ml Amp的2×TY培养基中，37℃，200r/min振荡培养至OD_600nm达到0.5左右。

3）加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），置于30℃，200r/min诱导表达8h。

4）取培养菌液分装到50ml离心管中，4℃，5000r/min离心10min，弃上清。

5）每管中加入500μl PPP溶液（30mM Tris-HCl，20%（W/V）蔗糖，pH8.0）重悬菌体，再加入1μl乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（终浓度1mM），冰上放置15min。

6）4℃，5000r/min离心15min，上清装入另一离心管中。

7）每管中加入1ml MgCl₂溶液（终浓度5mM）重悬菌体，再加入2μlEDTA溶液（终浓度1mM），冰上放置15min。

8）4℃，5000r/min离心15min，上清与步骤6上清合并。

9）取收集步骤6和8上清的离心管于4℃，12000r/min离心15min。

10）取上清用PBS透析72h。

11）安装纯化柱（购自BIO-RAD公司），加入400μl充分混匀的基质（购自QIAGEN公司），使其固定2h以上。

12）剪去下端封口，使液体流下，用5ml PBS进行平衡。

13）加入步骤10透析后的单链抗体样品过柱，收集保存过柱后的样品流出液。

14）加入1ml缓冲液B（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0）洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为B1、B2、B3（杂蛋白）。

15）加入400μl缓冲液C（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脱纯化柱3次，分别收集洗脱液为C1、C2、C3（目的蛋白）。

16）加5ml PBS平衡纯化柱后，加入1ml30%（V/V）酒精4℃保存纯化柱。

17）重组抗体通过SDS-PAGE电泳检测（实施例11）后用PBS.透析。

实施例11：SDS-PAGE电泳检测纯化的FvSG7抗体

1）取10μl实施例10纯化的FvSG7抗体，加入2.5μl5×十二烷基硫酸钠（SDS）加样缓冲液（250mM Tris-HCl（pH6.8），10%（W/V）SDS（电泳级），0.5%（W/V）溴酚蓝，50%（V/V）甘油，5%（W/V）β-巯基乙醇），充分混匀，水浴煮沸5min，然后置于冰上备用。

2）参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备分离胶和浓缩胶。

3）安装蛋白垂直电泳系统（购自BIO-RAD公司），加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1%（W/V）SDS），取放置在冰上的样品上样。

4）先设置电压80伏电泳20min，再用120伏电压电泳80～120min至溴酚蓝跑至分离胶外。

5）取下凝胶，去掉浓缩胶后用染色液（0.1%（W/V）考马斯亮蓝R-250，25%（V/V）异丙醇，10%（V/V）冰醋酸）染色30min。

6）用脱色液（5%（V/V）甲醇，7.5%（V/V）冰醋酸）脱色3～5次，观察照相。

SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约35kD大小的目的蛋白。

实施例12：表达ELISA检测FvSG7抗体

2）用200μl PBS洗涤3次。

3）在抗原包被的孔及对照孔中分别加入150μl封闭液（含2%（W/V）脱脂奶粉的PBS溶液），37℃水浴封闭2h。

4）用200μl PBS分别洗涤3次，每次3min。

5）在抗原包被孔及其对照孔中分别加入100μl封闭液稀释的含200nM实施例10纯化的FvSG7抗体，37℃反应2h。

6）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

7）每孔加入100μl封闭液稀释（体积比为1：5000）的抗His单克隆抗体（购自天根生化科技（北京）有限公司），37℃反应1.5h。

8）用200μlPBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

9）每孔加入100μl封闭液稀释（体积比为1：5000）的AP标记羊抗鼠IgG抗体（购自Sigma公司），37℃反应1.5h。

10）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次，每次3min。

表达ELISA结果显示，FvSG7抗体对串珠镰刀菌SCWPs具有很强的结合能力，OD_405nm平均读值达到2.331，比阴性对照（0.055）高出42.4倍。

实施例13：免疫荧光检测FvSG7抗体的结合特性

1）按实施例1的步骤1培养串珠镰刀菌孢子。

2）取10⁵孢子液接种于20mlYPG培养基（成分：0.3%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）蛋白胨，2%（W/V）葡萄糖）中，28℃，200r/min振荡避光培养12～16h至大部分孢子萌发。

3）用2MNaOH浸泡盖玻片2h，再用蒸馏水清洗。

4）多聚赖氨酸浸泡盖玻片5min，用蒸馏水清洗。

5）向12孔细胞培养板孔中加入2ml2%（W/V）小牛血清白蛋白（BSA，购自Sigma公司）溶液，37℃保湿封闭2h。

6）用2ml PBS洗涤3次。

7）在细胞培养板孔中放入盖玻片，加入1ml萌发孢子液。

8）细胞培养板在室温条件下，2800r/min离心15min。

9）用2ml PBS洗涤3次。

10）加入500μl实施例10纯化的FvSG7抗体（1μg/ml），37℃保湿反应2h。

11）用2ml PBST和PBS分别洗涤3次。

12）加入500μl1：3000（V/V）稀释的抗His单克隆抗体，37℃保湿反应2h。

13）用2ml PBST和PBS分别洗涤3次。

14）加入500μl1：100（V/V）稀释的Cy3标记羊抗鼠IgG(H+L)抗体（购自美国ProteinTech Group公司），37℃反应1h。

15）用2ml PBST和PBS分别洗涤3次。

16）在载玻片上滴加封片剂，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。

免疫荧光实验结果如图5所示，加入FvSG7抗体反应后，在串珠镰刀菌孢子和菌丝的表面都有很强的荧光亮度（图5b和5f），而对照加入人类绒毛促性腺素特异单链抗体PIPP（Kathuria S,Sriraman R,etal.Efficacy of plant-produced recombinant antibodies against HCG.Hum.Reprod.,2002,17:2054-2061.）与菌丝或孢子反应后，未见任何荧光反应（图5d和5h），说明FvSG7抗体能与串珠镰刀菌孢子和菌丝细胞壁表面的靶抗原特异结合。

实施例14：FvSG7-AP融合蛋白表达载体构建、原核表达和纯化

1）FvSG7抗体基因通过SOE-PCR扩增在3’端加上218连接肽（Whitlow M,Bell BA,etal.An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolyticstability.Protein.Eng.,1993,6:989-995.），然后利用SfiI和NotI内切酶（购自NEB公司，按照该酶的说明书操作）酶切后直接连接到pDAP2/S载体（Kerschbaumer RJ,Hirschl S,et al.Single-chain Fv fusion proteins suitable as coating and detecting reagents in a double antibodysandwich Enzyme-linked immunosorbent assay.Anal.Biochem.,1997,249:219-227.）中，得到含有FvSG7-AP融合蛋白基因的重组质粒，电转化到E.coliXL1-Blue MRF’感受态细胞（方法见实施例6步骤2）中，挑取单克隆培养后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，得到含有重组质粒DNA的重组大肠杆菌。

2）FvSG7-AP融合蛋白的表达和纯化按实施例10的方法操作，但步骤3诱导表达为16℃诱导表达20h。

FvSG7-AP融合蛋白表达纯化后，SDS-PAGE电泳检测结果如图6所示，可见约80kD大小的目的蛋白。

实施例15：FvSG7-AP融合蛋白活性检测

1）在ELISA板孔中加入100μl抗原SCWPs（20μg/ml），37℃温育2h。

2）用200μl PBS洗涤3次。

3）加入150μl封闭液，37℃封闭2h，同时封闭空白孔作对照。

4）用200μl PBS洗涤3次。

5）每孔加入100μl封闭液稀释的实施例14纯化的FvSG7-AP融合蛋白（200nM），37℃温育2h。

6）用200μl PBST和PBS分别洗涤3次。

ELISA结果显示，FvSG7-AP融合蛋白对串珠镰刀菌SCWPs仍保持很强的结合能力，OD_405nm平均读值达到2.304，比阴性对照（0.052）高出44.3倍。

实施例16：ELISA分析FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白的结合特性

1）选取23个镰刀菌和其它真菌菌株（见表1），按实施例1的步骤1培养真菌孢子。

2）取10⁷/ml孢子液接种于2ml YPG培养基中，28℃，200r/min振荡避光培养12～16h至大部分孢子萌发。

3）在ELISA板孔中加入100μl真菌萌发孢子液，37℃水浴包被2h。

4）分别用FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白检测。

①FvSG7抗体检测：按实施例12步骤2～12操作。

②FvSG7-AP融合蛋白检测：按实施例15步骤2～7操作。

ELISA结果见表1，结果表明FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白对镰刀菌都具有很高的亲和力，而与其它真菌无交叉反应，说明FvSG7-AP融合蛋白保留了FvSG7抗体的亲和力和特异性。

表1ELISA检测分析FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白的亲和力和特异性

注：实验中每一个样品设置3个重复，显色反应后计算平均值，其中<0.1OD_405nm

标记为“-”；0.1-0.8OD_405nm标记为“+”；0.801-1.6OD_405nm标记为“++”；>1.601

OD_405nm标记为“+++”。

实施例17：Western blot分析FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白的结合特性

1）参照实施例11的操作步骤1～4，SDS-PAGE电泳实施例1提取的SCWPs蛋白。

2）用BIO-RAD公司SD Semi-Dry Transfer Cell半干转印装置将凝胶中的蛋白转印到尼龙膜上，于200mA恒定电流转膜25min。

3）转印结束后，将尼龙膜转移到含有杂交封闭液（5%（W/V）脱脂奶粉，20mM Tris-HCl（pH8.0），150mM NaCl）的杂交盒中，室温平缓摇动15～20min后，37℃静置2h或4℃过夜。

4）倒掉封闭液，加入10mlTBST（20mMTris-HCl（pH8.0），150mMNaCl，0.1%（V/V）Tween20）洗涤3次，每次5min。

5）FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白检测。

①FvSG7抗体检测：加入10ml含50nM的实施例10纯化的FvSG7抗体，室温平缓摇动2h倒掉，用10ml TBST缓冲液洗涤3次，每次5min；然后加入10ml经TBST稀释（体积比为1：5000）的抗His单克隆抗体，室温平缓摇动2h后倒掉，用10mlTBST缓冲液洗涤3次，每次5min；再加入10ml经TBST缓冲液稀释（体积比为1：5000）的AP标记羊抗鼠IgG抗体，室温平缓摇动2h后倒掉。

②FvSG7-AP融合蛋白检测：加入10ml含50nM的实施例14纯化的FvSG7-AP抗体，室温平缓摇动2h倒掉。

6）分别用10ml TBST和TBS（20mM Tris-HCl（pH8.0），150mM NaCl）洗涤5次，每次5min。

7）分别用BCIP/NBT显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司，按照试剂盒说明书操作）显色10～20min后，用蒸馏水终止反应，观察照相。

Western blot分析结果如图7所示，FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白结合相同的串珠镰刀菌细胞壁成分，说明构建表达的FvSG7-AP融合蛋白很好的保留了单链抗体和AP蛋白的活性和功能。

实施例18：表面等离子共振（SPR）分析FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白的结合特性

1）按照BIAcore3000（瑞典GE Healthcare公司）的操作手册安装芯片，设定工作温度为25℃，注入运行缓冲液（PBS，pH7.4），流速10μl/min，初始化传感芯片3～4次，2～3min后得到稳定基线。

2）注入活化试剂（EDC/NHSS，1:1，V/V）7min活化芯片。

3）注入溶于乙酸（pH4.5）的抗原样品（50μg/ml）5min，使其与活化的芯片表面结合。

4）注入乙醇胺溶液（1M，pH8.5）7min，使未结合蛋白的活化位点失活。

5）注入PBS缓冲液，使基线稳定5min。

6）注入不同浓度的FvSG7抗体或FvSG7-AP融合蛋白5min，流速30μl/min。

7）注入100mM甘氨酸溶液（pH2.0），再生芯片。

8）利用BIAcore evaluation version4.1和IGOR Pro（version6.0.3.1,WaveMetrics,Inc）软件拟合分析SPR实时监测的曲线，得到动力学参数。

SPR分析结果如图8所示，测定的动力学参数见表2。FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白对串珠镰刀菌都有很高的亲和力，而且FvSG7-AP的亲和力比FvSG7抗体提高了4倍。

表2SPR测定FvSG7抗体及FvSG7-AP的动力学常数

注：k_a，结合常数；k_d，解离常数；K_D，动力学常数（K_D=k_d/k_a）

实施例19：FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白的最低检测限测定

1）在160ml Czapek培养基中接种1ml串珠镰刀菌孢子液（按实施例1步骤1制备），30℃，225r/min振荡避光培养5～7d。

2）用2层灭菌纱布过滤培养液，并用500ml灭菌水洗涤3次后冷冻干燥12h。

3）在研钵中加入液氮充分研磨菌丝，研磨后的菌丝加入PBS缓冲液至浓度为100mg/ml。

4）菌丝溶液梯度稀释至10^-3、10^-2、10^-1、1、10、10²、10³μg/ml，分别加入ELISA板，37℃水浴包被2h。

4）分别用FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白检测。

①FvSG7抗体检测：按实施例12步骤2～12操作。

②FvSG7-AP融合蛋白检测：按实施例15步骤2～7操作。

检测结果如图9所示，结果表明FvSG7抗体和FvSG7-AP融合蛋白对串珠镰刀菌菌丝的最低检测限均达到10^-2μg/ml，后者在高浓度菌丝时的OD_405nm读值更高一些，说明其保持单链抗体相当的检测能力。

实施例20：FvSG7-AP融合蛋白的最低定量限测定

取健康玉米粒粉碎，称取0.1mg玉米粉，加入10ml含0.05%（V/V）Tween-20的PBS缓冲液悬浮。将按实施例19步骤1～3所述方法制备的菌丝悬浮液（100mg/ml）加入玉米粉悬浮液混合，使菌丝量占总量的10^-3，10^-2，10^-1，1，10，10²，10³mg/g，包被ELISA板，按实施例15步骤2～7操作测定scFv-AP的最低定量限。

检测结果如图10所示，FvSG7-AP融合蛋白的最低定量限达到10^-3mg/g（即10^-2μg/ml），而且菌丝含量与OD_405nm吸收值满足对数函数关系y=0.106ln(x)+0.541（R²=0.858），说明FvSG7-AP融合蛋白可用于快速方便地评估粮食或饲料中污染的菌丝量。

实施例21：FvSG7-AP融合蛋白检测田间赤霉病材料

1）从全国各地收集自然发病的小麦（11份）和玉米（22份）材料。

2）用镰刀菌接种花期小麦（13份）和玉米（2份），并收集接种发病材料。

3）在研钵中加入液氮充分研磨收集的材料，称取0.2g研磨后的材料加入1ml PBS悬浮。

4）样品加热处理检测抗原的稳定性，即取一部分研磨后的材料在加入PBS缓冲液前100℃烘烤10min或加入PBS后100℃煮沸10min。

5）室温条件下，50r/min翻转混匀30min。

6）样品悬浮液静置10min或6000r/min离心5min后，取上清包被ELISA板检测，相同处理的健康玉米和小麦材料作为对照。

7）用FvSG7-AP融合蛋白按实施例15步骤2～7操作检测。

检测结果显示，FvSG7-AP融合蛋白能很好的检测镰刀菌污染的材料。对于经过热处理（100℃烘烤或煮沸10min）的发病材料，FvSG7-AP融合蛋白仍能有效检测，说明其结合的抗原SCWPs具有很高的热稳定性。因此，重组大肠杆菌表达纯化的FvSG7-AP融合蛋白能用于镰刀菌的检测，包括田间材料、饲料、粮食或加工过的食品中镰刀菌污染情况的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用

<130> 镰刀菌特异单链抗体及制备方法和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 1

atggctgccg tgacgttgga cgagtccggg ggcggcctcc agacgcccgg aggagcgctc 60

agcctcgtct gcgaggcctc cggcttcacc ttcagcagtt atggcatgaa ctgggtgcga 120

caggcgccca gcaaggggct ggaattcgtc gcaggtatta gaaatgatgg tagtaggaca 180

aactacgggg cggcggtgaa gggccgtgcc accatctcga gggacaacgg gcagagtaca 240

gtgaggctgc agctgaacaa cctcagggct gaggacaccg gcacctacta ctgcgccaaa 300

agtggttatg ctggtagtgc tactgataat atcgacaaat ggggccacgg gaccgaggtc 360

atcgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggcg 420

ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggagaaa ccgtcaagat cacctgctcc 480

ggggccaaca actatggctg gttccagcag aagtcacctg gcagtgcccc tgtcactgtg 540

acctattaca acgacaagag accctcggac atcccttcac gattctccgg ttctggatcc 600

ggctccacaa acacattaac catcactggg gtccgagccg aggacgaggc tgtctatttc 660

tgtggtgcct gggacaccac ttatgtcggt atgtttgggg ccgggacaac cctgaccgtc 720

ctaggccagc ccgtcgacgc ggccgcagaa caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat 780

catcaccatc accatcacgg ggccgcatag 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 2

Met Ala Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Ser Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Phe Val Ala Gly Ile Arg Asn Asp Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Gly Ala

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr

65 70 75 80

Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Tyr Ala Gly Ser Ala Thr Asp Asn Ile Asp

100 105 110

Lys Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Thr Gln Pro

130 135 140

Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser

145 150 155 160

Gly Ala Asn Asn Tyr Gly Trp Phe Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala

165 170 175

Pro Val Thr Val Thr Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ala Trp

210 215 220

Asp Thr Thr Tyr Val Gly Met Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Gly Gln Pro Val Asp Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu

245 250 255

Glu Asp Leu Asn His His His His His His Gly Ala Ala

260 265

<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 3

atggctgccg tgacgttgga cgagtccggg ggcggcctcc agacgcccgg aggagcgctc 60

agcctcgtct gcgaggcctc cggcttcacc ttcagcagtt atggcatgaa ctgggtgcga 120

caggcgccca gcaaggggct ggaattcgtc gcaggtatta gaaatgatgg tagtaggaca 180

aactacgggg cggcggtgaa gggccgtgcc accatctcga gggacaacgg gcagagtaca 240

gtgaggctgc agctgaacaa cctcagggct gaggacaccg gcacctacta ctgcgccaaa 300

agtggttatg ctggtagtgc tactgataat atcgacaaat ggggccacgg gaccgaggtc 360

atcgtctcct ca 372

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 4

Met Ala Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Ser Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Phe Val Ala Gly Ile Arg Asn Asp Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Gly Ala

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr

65 70 75 80

Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Tyr Ala Gly Ser Ala Thr Asp Asn Ile Asp

100 105 110

Lys Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 5

gcgctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacccaggag aaaccgtcaa gatcacctgc 60

tccggggcca acaactatgg ctggttccag cagaagtcac ctggcagtgc ccctgtcact 120

gtgacctatt acaacgacaa gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggttctgga 180

tccggctcca caaacacatt aaccatcact ggggtccgag ccgaggacga ggctgtctat 240

ttctgtggtg cctgggacac cacttatgtc ggtatgtttg gggccgggac aaccctgacc 300

gtcctaggcc agccc 315

<210> 6

<211> 105

<212> PRT

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 6

Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val

1 5 10 15

Lys Ile Thr Cys Ser Gly Ala Asn Asn Tyr Gly Trp Phe Gln Gln Lys

20 25 30

Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Thr Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg

35 40 45

Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr

50 55 60

Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr

65 70 75 80

Phe Cys Gly Ala Trp Asp Thr Thr Tyr Val Gly Met Phe Gly Ala Gly

85 90 95

Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105

<210> 7

<211> 2172

<212> DNA

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 7

atggctgccg tgacgttgga cgagtccggg ggcggcctcc agacgcccgg aggagcgctc 60

agcctcgtct gcgaggcctc cggcttcacc ttcagcagtt atggcatgaa ctgggtgcga 120

caggcgccca gcaaggggct ggaattcgtc gcaggtatta gaaatgatgg tagtaggaca 180

aactacgggg cggcggtgaa gggccgtgcc accatctcga gggacaacgg gcagagtaca 240

gtgaggctgc agctgaacaa cctcagggct gaggacaccg gcacctacta ctgcgccaaa 300

agtggttatg ctggtagtgc tactgataat atcgacaaat ggggccacgg gaccgaggtc 360

atcgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggcg 420

ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggagaaa ccgtcaagat cacctgctcc 480

ggggccaaca actatggctg gttccagcag aagtcacctg gcagtgcccc tgtcactgtg 540

acctattaca acgacaagag accctcggac atcccttcac gattctccgg ttctggatcc 600

ggctccacaa acacattaac catcactggg gtccgagccg aggacgaggc tgtctatttc 660

tgtggtgcct gggacaccac ttatgtcggt atgtttgggg ccgggacaac cctgaccgtc 720

ctaggccagc ccggctccac ctcaggctcc ggtaaacctg gctcagggga gggatcaact 780

aagggcgcgg ccgcagcccg ggcaccagaa atgcctgttc tggaaaaccg ggctgctcag 840

ggcgatatta ctgcacccgg cggtgctcgc cgtttaacgg gtgatcagac tgccgctctg 900

cgtgattctc ttagcgataa acctgcaaaa aatattattt tgctgattgg cgatgggatg 960

ggggactcgg aaattactgc cgcacgtaat tatgccgaag gtgcgggcgg cttttttaaa 1020

ggtatagatg ccttaccgct taccgggcaa tacactcact atgcgctgaa taaaaaaacc 1080

ggcaaaccgg actacgtcac ctcctcggct gcatcagcaa ccgcctggtc aaccggtgtc 1140

aaaacctata acggcgcgct gggcgtcgat attcacgaaa aagatcaccc aacgattctg 1200

gaaatggcaa aagccgcagg tctggcgacc ggtaacgttt ctaccgcaga gttgcaggat 1260

gccacgcccg ctgcgctggt ggcacatgtg acctcgcgca aatgctacgg tccgagcgcg 1320

accagtgaaa aatgtccggg taacgctctg gaaaaaggcg gaaaaggatc gattaccgaa 1380

cagctgctta acgctcgtgc cgacgttacg cttggcggcg gcgcaaaaac ctttgctgaa 1440

acggcaaccg ctggtgaatg gcagggaaaa acgctgcgtg aacaggcaca ggcgcgtggt 1500

tatcagttgg tgagcgatgc tgcctcactg aattcggtga cggaagcgaa tcagcaaaaa 1560

cccctgcttg gcctgtttgc tgacggcaat atgccagtgc gctggctagg accgaaagca 1620

acgtaccatg gcaatatcga taagcccgca gtcacctgta cgccaaatcc gcaacgtaat 1680

gacagtgtac caaccctggc gcagatgacc gacaaagcca ttgaattgtt gagtaaaaat 1740

gagaaaggct ttttcctgca agttgaaggt gcgtcaatcg ataaacagga tcatgctgcg 1800

aatccttgtg ggcaaattgg cgagacggtc gatctcgatg aagccgtaca acgggcgctg 1860

gaattcgcta aaaaggaggg taacacgctg gtcatagtca ccgctgatca cgcccacgcc 1920

agccagattg ttgcgccgga taccaaagct ccgggcctca cccaggcgct aaataccaaa 1980

gatggcgcag tgatggtgat gagttacggg aactccgaag aggattcaca agaacatacc 2040

ggcagtcagt tgcgtattgc ggcgtatggc ccgcatgccg ccaatgttgt tggactgacc 2100

gaccagaccg atctcttcta caccatgaaa gccgctctgg gggatatcgc acaccatcac 2160

catcaccatt aa 2172

<210> 8

<211> 723

<212> PRT

<213> 来亨母鸡（Gallus domesticus）

<400> 8

Met Ala Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ala Leu Ser Leu Val Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Ser Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Phe Val Ala Gly Ile Arg Asn Asp Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Gly Ala

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr

65 70 75 80

Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Ser Gly Tyr Ala Gly Ser Ala Thr Asp Asn Ile Asp

100 105 110

Lys Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Leu Thr Gln Pro

130 135 140

Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser

145 150 155 160

Gly Ala Asn Asn Tyr Gly Trp Phe Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala

165 170 175

Pro Val Thr Val Thr Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ala Trp

210 215 220

Asp Thr Thr Tyr Val Gly Met Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Gly Gln Pro Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

245 250 255

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Ala Ala Ala Ala Arg Ala Pro Glu Met Pro

260 265 270

Val Leu Glu Asn Arg Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr Ala Pro Gly Gly

275 280 285

Ala Arg Arg Leu Thr Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ser Leu

290 295 300

Ser Asp Lys Pro Ala Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met

305 310 315 320

Gly Asp Ser Glu Ile Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly

325 330 335

Gly Phe Phe Lys Gly Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr

340 345 350

His Tyr Ala Leu Asn Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Ser

355 360 365

Ser Ala Ala Ser Ala Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn

370 375 380

Gly Ala Leu Gly Val Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu

385 390 395 400

Glu Met Ala Lys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala

405 410 415

Glu Leu Gln Asp Ala Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser

420 425 430

Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Ser Ala Thr Ser Glu Lys Cys Pro Gly Asn

435 440 445

Ala Leu Glu Lys Gly Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn

450 455 460

Ala Arg Ala Asp Val Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu

465 470 475 480

Thr Ala Thr Ala Gly Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gln Ala

485 490 495

Gln Ala Arg Gly Tyr Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser

500 505 510

Val Thr Glu Ala Asn Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp

515 520 525

Gly Asn Met Pro Val Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly

530 535 540

Asn Ile Asp Lys Pro Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn

545 550 555 560

Asp Ser Val Pro Thr Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu

565 570 575

Leu Ser Lys Asn Glu Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser

580 585 590

Ile Asp Lys Gln Asp His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu

595 600 605

Thr Val Asp Leu Asp Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys

610 615 620

Lys Glu Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala

625 630 635 640

Ser Gln Ile Val Ala Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala

645 650 655

Leu Asn Thr Lys Asp Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser

660 665 670

Glu Glu Asp Ser Gln Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala

675 680 685

Tyr Gly Pro His Ala Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp

690 695 700

Leu Phe Tyr Thr Met Lys Ala Ala Leu Gly Asp Ile Ala His His His

705 710 715 720

His His His

Claims

1.一种镰刀菌特异单链抗体基因，其特征在于：基因FvSG7，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的一种镰刀菌特异单链抗体基因，其特征在于：该基因编码的单链抗体的重链可变区V_H所对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；该基因编码的单链抗体的轻链可变区V_L所对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示。

3.一种镰刀菌特异单链抗体，其特征在于：FvSG7抗体，其序列为SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求3所述的一种镰刀菌特异单链抗体，其特征在于：其重链可变区V_H由124个氨基酸组成，序列为SEQ ID NO：4所示；轻链可变区V_L由105个氨基酸组成，其序列为SEQID NO：6所示。

5.一种镰刀菌特异单链抗体重组基因，其特征在于：基因FvSG7-AP，其序列为SEQ ID NO：7所示。

6.一种镰刀菌特异单链抗体融合蛋白，其特征在于：FvSG7-AP融合蛋白，其序列为SEQ IDNO：8所示。

7.权利要求3所述的一种镰刀菌特异单链抗体在非疾病诊断的镰刀菌检测中的应用。

8.权利要求6所述的一种镰刀菌特异单链抗体融合蛋白在非疾病诊断的镰刀菌检测中的应用。