CN105884892B - 一种Bt Cry毒素广谱检测用蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种Bt Cry毒素广谱检测用蛋白及其编码基因与应用，该蛋白DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明提供的蛋白与5种Bt Cry(Cry1Ab、Cry1Ab、Cry1B、Cry1B、Cry1F)毒素均具有较好结合活性，可用于小麦样品Bt毒素广谱性检测；本发明不经动物免疫而获得的Bt Cry毒素广谱检测用单域抗体蛋白，制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产，对开发快速检测试剂盒具有重要的科学及现实意义。

Description

一种Bt Cry毒素广谱检测用蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程抗体和免疫学检测技术领域，特别是一种人源化重链抗体基因改造的BtCry毒素广谱检测用蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
Bt Cry毒素是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)芽孢形成过程中产生的一类伴胞晶体蛋白(Insecticidal crystal protein，ICP)，对鞘翅目、双翅目、鳞翅目等常见的农、林害虫具有特异性毒杀作用。目前已被发现并鉴定的Bt Cry毒素种类已经超过50种，包括Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3A和Cry34/Cry35在内，多达十几种Bt Cry毒素已成功实现商业化开发并推广应用，其转基因农作物涵盖水稻、玉米、小麦、大豆、土豆、棉花、烟草等世界大宗农产品，产生了巨大的经济效益。中国是世界农产品生产和消费大国，转Bt Cry农作物或Bt Cry农作物产品在我国消费市场占有相当比重。
然而，随着Bt Cry毒素制剂和转Bt Cry基因作物及其产品在世界范围内的推广应用，其暴露的生物安全问题和潜在的生物安全风险，也受到越来越多的质疑。有研究表明，转基因在目标生物体对药物产生耐受性、基因跨物种逃逸、微生态生物多样性结构失衡以及伤害非目标生物的免疫系统等方面，可能存在安全隐患。“转Bt基因玉米根际微生物和细菌生理群多样性”(王敏等，生态学杂志，2010年03期)和“转Bt基因玉米对土壤细菌数量多样性的影响”(刘玲等，生态与农村环境学报，2011年03期)分别对室内、室外种植转Bt玉米的土壤进行了细菌数量和多样性分析，结果都发现种植转Bt玉米的与空白对照组相比出现显著差异。“Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis sp.kurstaki HD73bindsto surface proteins in the mouse small intestine”(Vázquez-Padrón等，BiochemBiophys Res Commun，2000年01期)在动物试验发现，当小鼠摄取的Bt内、外毒素达到10mg/kg和100mg/kg时，小鼠的T细胞ANAE阳性率、脾脏指数及巨噬细胞的吞噬功能均出现了明显的抑制反应，随着摄取剂量的增加，这种抑制作用越发明显。试验还发现，当Bt毒素蛋白在动物体内的蓄积系数大于6.24时，可以导致肝脏、肾脏及胃肠道等损伤，在肝脏和肾脏中可以观察到细胞肿胀和空泡样变性异象，并且能看见肾小球血管上皮细胞的病变。长期大剂量使用Bt毒素蛋白，还会导致动物白细胞总数和血红蛋白含量显著性下降，这也说明Bt毒素蛋白具有明显的免疫抑制毒性。
近年来，转基因安全性问题，特别是转基因食用农产品的安全性问题，已经成为社会舆论的热点话题，引起了部分消费者的恐慌，国家有关部门也高度重视转基因农产品安全性问题，2015年农业部重新修订并颁布了新的《转基因管理条例》；2016年，更是将加强农业转基因监管明确纳入中央1号文件，引起社会高度关注。因此，建立一套简单、方便、行之有效的转Bt Cry基因及其产品检测分析方法，是政府监管部门及普通大众需求的必然要求。
目前，应用最广的Bt Cry毒素检测方法，是基于多克隆抗体、单克隆抗体的免疫学检测方法。但传统多克隆抗体、单克隆抗体的制备需要免疫动物获得，不仅过程繁琐，免疫周期长，而且抗体制备量有限，不易保藏，容易退化。近年来，新型基因工程抗体结合噬菌体表面展示及成熟的配套筛选技术成为抗体领域研究的新热点。噬菌体展示抗体因其表型与基因型一致，在获得抗原特异性展示抗体的同时也获得了该抗体基因信息，因此为抗体大量克隆表达以及后期定向改造提供了可能，更为定向获得抗原特异性抗体提供了新路径。本课题组在前期研究中，先后成功从人源单链抗体噬菌体展示库中分别筛选到具有Cry1Ac(“基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定”张留娟等，中国农业科学,2014年09期)、Cry1B(“Rapid Isolation of Single-Chain Antibodies from aHuman Synthetic Phage Display Library for Detection of Bacillus thuringiensis(Bt)Cry1B Toxin”张霄等,Ecotoxicology and Environmental Safety,2012年81期)、Cry1F(“抗Cry1F毒素单链抗体的筛选及初步应用”徐重新等，江苏农业学报，2015年31期)等毒素的特异性单链抗体，并在实际样品中检测应用。Human domain antibody library是由人源重链基因构成的大容量(3×109)噬菌体抗体库，抗体基因和分子量比单链抗体还小，更适合抗体克隆表达和分子定向改造。目前针对Bt Cry毒素的广谱检测用单域抗体(短肽)及相应技术还未见报道。
发明内容
针对目前转Bt Cry毒素作物及其毒素制剂监管需求，筛选具有Bt Cry毒素广谱检测用生物蛋白及其在实际样品中的检测应用，本发明是这样实现的：
一种Bt Cry毒素广谱检测用蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一段编码如SEQ ID NO.2所述蛋白的基因序列。
一段编码如SEQ ID NO.2所述蛋白的基因序列，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白在粮食作物Bt Cry毒素广谱检测中的应用。
含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1的重组表达载体、转基因细胞系或重组工程菌。
扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.1基因序列的引物对。
如本发明所述蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)在粮食作物Bt Cry毒素广谱检测中的应用，其具体步骤为：
(1)将粮食作物样品干燥后磨成粉，过100目筛，加入终浓度为0.10mol/L碳酸盐缓冲液和终浓度为0.05％的Tween-20，pH＝9.6；室温振荡4h，以10000g离心10min，取上清液；
(2)取50μl上清液，加入50μl浓度为100μg/ml氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白溶液，37℃孵育过夜，备用；
(3)分别将浓度均为2.5μg/ml的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F包被到96孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜；次日取96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次，每孔加200μl 5％的脱脂奶粉，37℃水浴锅中封闭反应1.5h；取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次；取步骤(3)获得的溶液分别加入到96孔板中，37℃水浴锅中孵育1.5h；取出96孔板，每孔250μl PBST溶液洗板3次；每孔加100μl经1：5 000稀释的Anti-His-[HRP]Antibody二抗，于37℃水浴锅孵育1.5h；取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次；每孔加100μl TMB显色液显色，置于室温20min，每孔加50μl 2M浓硫酸终止显色反应；
(4)取出96孔板在酶标仪上测OD450nm值，将检测结果分别代入以下曲线：
Cry1Ab：y＝-9.0744x2+61.012x+6.588；R2＝0.9619；
Cry1Ac：y＝-9.6051x2+64.641x+8.1001；R2＝0.9571；
Cry1B：y＝-8.3961x2+57.02x+5.8822；R2＝0.9713；
Cry1C：y＝-9.0712x2+61.544x+7.3365；R2＝0.9614；
Cry1F：y＝-9.2767x2+62.491x+7.2897；R2＝0.9591；
根据与标准曲线对应的公式，即通过设计的竞争实验，得出y值，即可算出对应的x值。
本发明从公开的人类抗体重链基因库中，筛选获得一种具有同时识别5种Bt Cry(Cry1Ab、Cry1Ab、Cry1B、Cry1B、Cry1F)毒素的广谱检测用单域抗体，该抗体蛋白经原核系统表达，纯化后蛋白具有5种Bt Cry(Cry1Ab、Cry1Ab、Cry1B、Cry1B、Cry1F)毒素的结合活性，可用于Bt Cry毒素广谱性检测。本发明不经动物免疫而获得的Bt Cry毒素广谱检测用单域抗体蛋白，制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产；同时，本发明作为新型的基因工程改造抗体，对探索拓展具有广谱识别Bt Cry毒素生物活性的新型抗体基因资源，以及开发快速检测试剂盒等具有重要的科学及现实意义。
附图说明
图1为Bt Cry毒素广谱特异性噬菌体富集效果示意图。
图2为F5单域抗体噬菌体广谱结合Bt Cry毒素ELISA检测示意图。
图3为F5单域抗体表达纯化后蛋白SDS-PAGE电泳效果示意图。
图4为F5单域抗体表达纯化后蛋白IC-ELISA法活性测定示意图。
具体实施方式
实施例中所涉及的试剂和培养基配方：
(1)2×TY液体培养基：
在900ml蒸馏水中加入16g胰蛋白胨，10g酵母提取物和5g NaCl，搅拌混匀，用蒸馏水定容到1L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
(2)2×TY-AG液体培养基：
在2×TY的培养基中加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素和质量比为1％葡萄糖。
(5)TYE固体培养基：
在900ml蒸馏水中加入15g琼脂糖，8g NaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，用蒸馏水定容到1L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
(6)TYE-AG固体培养基：
在TYE固体培养基中加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素和质量比为1％葡萄糖。
(7)PBS溶液
称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，分别加入到蒸馏水中，充分溶解后，定容到1L。
(8)PBST溶液
在PBS溶液中加入体积比为0.05％的吐温-20。
(9)PEG/NaCl溶液：
称取20g PEG 8 000，14.61g NaCl，加80ml去离子水，定容到100ml，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
(10)柠檬酸盐缓冲液(CPBS,底物缓冲液，pH5.5)：
取C6H7O8(柠檬酸)21g，Na2HPO4·12H2O 71.6g，分别加入到蒸馏水中充分溶解后定容到1L。
(11)四甲基联苯胺(TMB)溶液：
称取10mg四甲基联苯胺溶于1ml二甲基亚砜中，避光，置于4℃保存备用。
(12)底物显色溶液：
10ml配方成分：9.875ml CPBS、100μl TMB溶液、25μl体积比为20％H2O2。
(13)LB液体培养基
1L体系：取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，以蒸馏水定容至1L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。(2)LB固体培养基
(14)LB固体培养基
1L体系：取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，15g琼脂粉，以蒸馏水定容至1L置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
(15)IPTG溶液
1ml体系：称取0.238g(1mM)IPTG溶于1ml蒸馏水中，配置成浓度为1mM/ml的母液，于-20℃保存备用。
实施例中所涉及材料来源：
Human domain antibody library、E.coli TG1细菌和辅助噬菌体KM13购于英国SourceBioScience公司；
pET26b载体,E.coli BL21,Anti-M13-[HRP]Antibody,Anti-His-[HRP]Antibody,His-TrapHP亲和纯化柱购于美国GE Healthcare公司；
Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1B、Cry1F购于上海佑隆生物科技有限公司。
实施例中涉及的核苷酸序列：
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2：
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDMISDKAMAWVRQAPGKGLEW
--CDR-H1--
VSGIKDRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
--CDR-H2--
SSYAIRSESVKDADLAFWGQGTLVTVSSAAA
--CDR-H3—；
SEQ ID NO.3：
pR2-F:5'-AGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'；
SEQ ID NO.4：
pR2-R:5'-TCGAGACGGTGACCAGGGT-3'；
SEQ ID NO.5：
pR2-F-Ncol:5'-CATGCCATGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'；
SEQ ID NO.6：
pR2-R-Notl：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCGAGACGGTGACCAGGGT-3'；
SEQ ID NO.7：
pET26b-T7-F：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；
SEQ ID NO.8：
pET26b-T7-R：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。
实施例1筛选Bt Cry毒素广谱检测用单域抗体
(1)取Human domain antibody library菌液500μl加入到200ml 2×TY-AG液体培养基中，37℃恒温培养到OD600为0.4。取50ml菌液，加入50μl滴度为～1012pfu/ml辅助噬菌体KM13进行超感染，于37℃孵育30min后，以3300g离心10min，弃上清液，用100ml 2×TY-AKG液体培养基重悬沉淀，30℃培养过夜。次日3300g离心30min，收集上清液并加入25ml PEG/NaCl溶液，冰浴1h，以3300g离心30min，用5ml PBS重悬沉淀。重悬液以11600g离心10min，上清液即为扩增的噬菌体抗体库。
(2)取步骤1获得的扩增的噬菌体抗体库进行5轮淘筛：第1轮筛选，将4ml浓度为100μg/ml的Cry1Ab毒素包被在细胞培养瓶底部，4℃过夜；次日，用1ml PBS清洗细胞培养瓶3次，然后加入混匀的1ml步骤(1)获得扩增的噬菌体抗体库与4ml 3％的MPBS溶液，在室温下缓慢摇动1h，再静置1h，倾去培养瓶中液体；用1ml PBST溶液洗瓶20次，加入1ml浓度为10mg/ml的胰蛋白酶(Trypsin)洗脱特异性结合的噬菌体抗体，洗脱液即为第1轮淘筛的噬菌体抗体；第2、3、4、5轮筛选的包被抗原分别为等量的浓度为100μg/ml的Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F毒素，所使用的噬菌体抗体为前一轮筛选获得的噬菌体抗体，筛选方法与第1轮相同，各轮富集效果如图1所示；
取第5轮筛选的噬菌体抗体20μl侵染1ml处于对数生长期的E.coli TG1细菌，37℃孵育1h后，涂布于TYE-AG固体培养基上，37℃培养过夜；次日，随机挑取单菌落，接种到含100μl/孔2×TY-AG液体培养基的96孔板中，37℃培养过夜；次日从板孔中吸出2.5μl菌液转接到新的含100μl/孔2×TY-AG液体培养基的96孔板中，37℃孵育1.5h；每孔加入25μl滴度为～1012pfu/ml的KM13辅助噬菌体，30℃孵育1.5h，1800g离心10min，用150μl 2×TY-AK液体培养基重悬沉淀后30℃培养过夜；次日以1800g离心30min，分别取上清液用于ELISA分析。
(3)取总浓度为2.5μg/ml的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1B、Cry1F毒素混合物(按质量比1:1:1:1:1混匀)加入到96孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜；次日，每孔分别加入100μl步骤(2)获得的上清液，阴性对照加100μl 2×TY-AK液体培养基，37℃水浴1.2h；每孔用250μl PBST洗板后，每孔加入100μl 1:5000稀释的Anti-M13-[HRP]Antibody，37℃孵育1.5h；每孔加入100μl底物显色溶液，室温下反应10～20min至出现蓝色，最后每孔加入50μl浓度为2M的H2SO4快速终止反应，用酶标仪测定OD450值。
其中溶液OD450值/阴性对照OD450值大于2.1的，判断为阳性，与该溶液对应的步骤(2)中的上清液即为筛选到的含有广谱结合Bt Cry毒素的噬菌体单域抗体的上清液。
(4)取浓度均为2.5μg/ml的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1B、Cry1F毒素分别加入到96孔板中，100μl/孔，4℃过夜；次日，每孔分别加入100μl经步骤(3)鉴定为阳性克隆菌的上清液，阴性对照加100μl 2×TY-AK液体培养基，37℃水浴1.2h，每孔用250μl PBST洗板后，每孔加入100μl 1:5000稀释的Anti-M13-[HRP]Antibody，37℃孵育1.5h。每孔加入100μl底物显色溶液，室温下反应15～20min至出现蓝色，最后每孔加入50μl浓度为2M的H2SO4快速终止反应，用酶标仪测定OD450值。以此评价步骤(3)中筛选到的阳性克隆噬菌体单域抗体分别对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F毒素的结合活性，即溶液OD450值/阴性对照OD450值大于2.1的，判断为阳性，而与该溶液对应的步骤(2)中的上清液即为筛选到的含有广谱结合Bt Cry毒素的噬菌体单域抗体的上清液。
通过上述筛选，申请人筛选到一种对5种Bt Cry(Cry1Ab、Cry1Ab、Cry1B、Cry1B、Cry1F)毒素均具有结合活性的单域抗体，将其自命名为F5，其所对应步骤(2)的上清液对5种Bt Cry毒素结合的ELISA检测效果如附图2所示。
以Sanger测序法，分别设计上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4，测定单域抗体F5核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该核苷酸翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2单域抗体F5表达及活性测定
(1)基因克隆
以实施例1中筛选到的F5单克隆噬菌体菌液(对数生长期，OD600值为0.4)为模板，分别设计上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6(下划线为酶切位点和保护碱基)，进行PCR扩增：
PCR反应体系(20μl)：2×Trq Mix，10μl；10μM的上游引物1μl、10μM的下游引物1μl、菌液模板(108cfu/ml)1μl；ddH2O补足至20μl；
反应条件：95℃10min,(94℃1min，56℃1min，72℃1min)×35个循环,72℃10min。将反应获得的单域抗体基因经PCR产物纯化试剂盒纯化(步骤参见Sigma公司PCR产物纯化试剂盒说明书)，获得扩增纯化的F5单域抗体基因，于-20℃中保存备用；另取含有pET26b质粒的E.coli BL21菌种，在LB液体培养基(含终浓度为50μg/ml卡那霉素)中培养至对数生长期，然后提取质粒(步骤参照Sigma公司质粒提取试剂盒说明书)于-20℃中保存备用。分别将上述扩增纯化的F5单域抗体基因和提取的pET26b质粒以NotI和NcoI酶进行双酶切过夜(20μl体系：10×NEB Buffer 2μl，100×BSA 0.2μl，扩增的基因/质粒载体10μl，NotI和NcoI各1μl，最后以蒸馏水补齐至20μl；置于37℃水浴锅中酶切过夜)，次日，将该体系置于80℃热失活25min(NotI和NcoI酶80℃20min即可热失活)，然后进行酶连反应(20μl体系，酶切载体4μl、酶切基因10μl、10×T4ligBuffer 2μl、T4ligase 1μl,最后以蒸馏水补齐至20μl)，置体系于16℃冰箱中酶连过夜。然后将酶连体系化转到BL21感受态细胞中，菌液涂布在LB固体培养基上(含终浓度为50μg/ml卡那霉素)，培养过夜后，挑单菌落做PCR和测序鉴定(引物均为上游SEQ ID NO.7、下游SEQ ID NO.8)，具体化转步骤参照徐重新硕士毕业论文“人源化苏云金芽孢杆菌Bt(Cry1B)毒素蛋白单链抗体的筛选、表达及生物学活性测定”第3章35页操作，利用PCR扩增和序列比对分析双重鉴定，含F5基因条带大小基因片段和相同核酸序列，即为阳性克隆。
(2)抗体可溶性表达及纯化
取步骤(1)中鉴定为阳性的单菌落(即含有实施例1中F5完整的基因片段)，在LB液体培养基(含终浓度为50μg/ml卡那霉素)中25℃250rpm震荡培养至OD600nm为0.6，然后加入IPTG(终浓度为0.8mM)诱导表达12h；次日，取菌液，以3300g离心20min，收集沉淀细胞，用细胞破碎仪破碎细胞，然后5000g离心20min取上清液，过His-Trap HPaffinitychromatography纯化收集抗体蛋白(纯化方法参照论文“人源化抗Cry1B毒蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定”徐重新等，南京农业大学学报，2013年3期)。以SDS-PAGE鉴定蛋白纯度(约20kDa)，以超微量分光光度计测得收集纯化蛋白浓度为351.6ug/ml。
对上述蛋白进行电泳检测，结果如图3所示，图3中，M：蛋白marker；1:表达上清液；2：破碎后细胞上清液；3：纯化后蛋白。
(3)间接竞争酶连免疫分析法(IC-ELISA)测定抗体活性
测定IC-ELISA法测定纯化后单域抗体(F5)对5种Bt Cry毒素的结合活性，具体方法如下所示：
将步骤(2)中纯化的抗体蛋白定容至100μg/ml，取50μl蛋白溶液与50μl不同浓度的Bt Cry毒素标准品(母液为1mg/ml，用CBS缓冲液依次配置浓度为：0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0和5.0μg/ml)混匀后，置于水浴锅中，37℃孵育过夜；与此同时，将5种Bt Cry毒素标准品母液分别用CBS缓冲液稀释到2.5μg/ml，然后每孔100μl包被到96孔板中，于4℃包被过夜。次日取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次，每孔加200μl 5％的脱脂奶粉，置于37℃水浴锅中，封闭反应1.5h；取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次；取抗体蛋白与各浓度的Bt Cry毒素标准品混合液分别加入到96孔板中，在37℃水浴锅中孵育1.5h；取出96孔板，再次以每孔250μl PBST溶液洗板3次；每孔加100μl经1：5 000稀释的Anti-His-[HRP]Antibody二抗，于37℃水浴锅孵育1.5h。取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次；每孔加100μl TMB显色液显色，置于室温20min，每孔加50μl 2M浓硫酸终止显色反应。
取出96孔板在酶标仪上测OD450nm值，以纯化的抗体蛋白(Cry1B浓度为0％)反应孔为阳性值，以抗体蛋白(含Bt Cry毒素各浓度梯度)反应孔为反应值，计算抑制率(抑制率I％＝(阳性值-反应值)/阳性值×100％)。绘制抗体蛋白与5种Bt Cry毒素间接竞争性结合抑制曲线(如图4所示)，计算各自抑制中浓度(IC50)、最低检测限(IC10)值以及线性检测范围等评价抗体活性的关键数据如表1所示：
表1 IC-ELISA法测定F5单域抗体对5种Bt(Cry)毒素的重要评价指标
从附图4结合表1中对应评价参数可以看出，制备的F5单域抗体对5种Bt Cry毒素的检测灵敏度均达到ng级(29-74ng/ml)，几乎接近已报道的传统抗Bt Cry毒素多克隆抗体和单克隆抗体，且方法R2>95％，说明相关性性较好。
实施例3 Bt Cry毒素在小麦样品中的添加回收试验
实施例中小麦样品(宁麦13)由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供。
将供试小麦干燥后磨成粉，过100目筛，按1g/管分装，4℃保存备用。取4管小麦样品，加入Cry1Ab毒素，使其终浓度分别为300ng/g、600ng/g、1000ng/g，充分混匀后，室温静置2h，获得样品混合液；再取试管，每管加入1ml样品提取液(即样品混合液中加入终浓度为0.10mol/L碳酸盐缓冲液和终浓度为0.05％的Tween-20，pH值为9.6)，室温振荡4h，以10000g离心10min，取上清液作为Cry1Ab毒素样品梯度浓度提取液保存待用；以相同方法分别制备Cry1Ac、Cry1B、Cry1C和Cry1F毒素样品梯度浓度提取液备用。
分别取各毒素样品梯度浓度提取液，按实施例2中建立的标准曲线方法对应测定5种Bt Cry毒素，同一天每个样品测3次，连续测3天，所得结果如表2所示：
表2.IC-TRFIA法测定5种Bt Cry毒素在小麦中的添加回收使用结果
由表2可见，以标准偏差(RSD)和变异系数(CV)评价精密度，以回收率评价准确度(回收率＝检测值/理论值×100％)，结果批內、批间的回收率为81.2％～100.8％，稳定性为2.5％～9.4％(添加回收试验默认值一般为回收率在80％～110％，稳定性在<12％说明方法效果较好)，说明筛选制备的针对Bt Cry毒素广谱检测的F5单域抗体实用性和适用性均较好，具有广阔的应用潜力。
实施例4 Bt Cry毒素在稻米样品中的添加回收试验
实施例中稻米样品(南粳46)由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供。
将供试稻米干燥后磨成粉，过100目筛，按1g/管分装，4℃保存备用。取4管小麦样品，加入Cry1Ab毒素，使其终浓度分别为300ng/g、600ng/g、1000ng/g，充分混匀后，室温静置2h；每管加入1ml样品提取液(含终浓度为0.10mol/L碳酸盐缓冲液和终浓度为0.05％的Tween-20的混合液，pH值为9.6)，室温振荡4h，以10000g离心10min，取上清液作为Cry1Ab毒素样品梯度浓度提取液保存待用；以相同方法分别制备Cry1Ac、Cry1B、Cry1C和Cry1F毒素样品梯度浓度提取液备用。
分别取各毒素样品梯度浓度提取液，按实施例2中建立的标准曲线方法对应测定5种Bt Cry毒素，同一天每个样品测3次，连续测3天，所得结果如表2所示：
表3.IC-TRFIA法测定5种Bt Cry毒素在稻米中的添加回收使用结果
由表2可见，以标准偏差(RSD)和变异系数(CV)评价精密度，以回收率评价准确度(回收率＝检测值/理论值×100％)，结果批內、批间的回收率为82.2％～97.1％，稳定性为4.0％～10.5％(添加回收试验默认值一般为回收率在80％～110％，稳定性在<12％说明方法效果较好)，说明筛选制备的针对Bt Cry毒素广谱检测的F5单域抗体实用性和适用性均较好，具有广阔的应用潜力。
实施例5盲样(空白样品)检测试验
实施例中小麦样品(宁麦13)和稻米样品(南粳46)由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供。
将供试小麦干燥后磨成粉，过100目筛，按1g/管分装，4℃保存备用；加入含终浓度为0.10mol/L碳酸盐缓冲液和终浓度为0.05％的Tween-20的混合液，pH值为9.6，制备获得样品提取液；每管加入1ml样品提取液，室温振荡4h，以10000g离心10min，取上清液作为提取液保存待用；以相同方法分别制备稻米样品梯度浓度提取液备用。
分别取各样品提取液，按实施例2中建立的标准曲线方法对应测定5种Bt Cry毒素，同一天每个样品测3次，连续测3天，所得结果均未显示检出对应Bt Cry毒素成分，这与“宁麦13”小麦样品和“南粳46”稻米样品不含Bt毒素成分相符。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种Bt Cry毒素广谱检测用蛋白及其编码基因与应用
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggccc aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtccctg 60
cgtctct cctgtgcagc ctccggagat atgattagcg ataaggctat ggcctgggtccgc 120
caggctc cagggaaggg tctagagtgg gtatcaggca ttaaggaccg tgacggtagcaca 180
tactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct cccgtgacaa ttccaagaacacg 240
ctgtatc tgcaaatgaa cagcctgcgt gccgaggaca ccgcggtata ttattgcgcgagt 300
tcgtatg cgattaggtc ggagtctgtt aaggacgcgg acttggcgtt ttggggtcaggga 360
accctgg tcaccgtctc gagcgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggatctg 420
aattcgg ccgca 432
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Ile Ser
20 25 30
Asp Lys Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Gly Ile Lys Asp Arg Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ser Ser Tyr Ala Ile Arg Ser Glu Ser Val Lys Asp Ala
100 105 110
Asp Leu Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ala Ala
130
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aggtgcagct gttggagtct g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcgagacggt gaccagggt 19
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
catgccatgg aggtgcagct gttggagtct g 31
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ataagaatgc ggccgctcga gacggtgacc agggt 35
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
taatacgact cactataggg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (7)

1.一种Bt Cry毒素广谱检测用蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的DNA序列如SEQ IDNO.1所示。
4.如权利要求1所述蛋白在粮食作物Bt Cry毒素广谱检测中的应用；
所述Bt Cry毒素为Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F。
5.含有如权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组工程菌。
6.扩增如权利要求2或3所述编码基因的引物对。
7.根据权利要求4所示的应用，其特征在于，具体检测步骤如下：
（1）将粮食作物样品干燥后磨成粉，过100目筛，加入终浓度为0.10 mol /L碳酸盐缓冲液和终浓度为0.05 %的Tween-20，pH=9.6；室温振荡4 h ，以10000 g 离心10 min，取上清液；
（2）取50μl上清液，加入50μl浓度为100μg/ml氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白溶液，37 ℃孵育过夜，备用；
（3）分别将浓度均为2.5μg/ml的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F包被到96 孔板中，100μl/孔，4℃包被过夜；次日取96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次，每孔加200μl5 %的脱脂奶粉，37℃水浴锅中封闭反应1.5 h；取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次；取步骤（2）获得的蛋白溶液分别加入到96孔板中，37℃水浴锅中孵育1.5 h；取出96孔板，每孔250μl PBST溶液洗板3次；每孔加100μl经1：5 000稀释的Anti-His-[HRP]Antibody二抗，于37 ℃水浴锅孵育1.5 h；取出96孔板，每孔用250μl PBST溶液洗板3次；每孔加100μl TMB显色液显色，置于室温20 min，每孔加50μl 2M浓硫酸终止显色反应；
（4）取出96孔板在酶标仪上测OD450 nm值，将检测结果分别代入以下曲线：
Cry1Ab：y = -9.0744 x 2 + 61.012 x + 6.588 ; R 2 = 0.9619；
Cry1Ac：y = -9.6051 x 2 + 64.641 x + 8.1001; R 2 = 0.9571；
Cry1B：y = -8.3961 x 2 + 57.02 x + 5.8822 ; R 2 = 0.9713；
Cry1C：y = -9.0712 x 2 + 61.544 x + 7.3365; R 2 = 0.9614；
Cry1F：y = -9.2767 x 2 + 62.491 x + 7.2897; R 2 = 0.9591；
计算所得到的x值，即为样品中对应毒素的浓度。
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