CN102936598B - 抗Cry1Ac毒素单链抗体的编码基因及免疫PCR检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗Cry1Ac单链抗体的编码序列及噬菌体单链抗体检测Cry1Ac的免疫PCR方法。本发明从天然噬菌体抗体库中淘选获得单链抗体（scFv），其特征在于此单链抗体的特异性是由其重链、轻链可变区序列中CDR区序列决定。免疫PCR结果显示用荧光检测体系可以对Cry1Ac进行定量检测，检测范围在0.2-100ng/mL之间。本方法快速简单，具有较高的灵敏度，并且避免了传统免疫PCR过程中标记报告DNA分子的步骤，更简化了实验操作，具有潜在的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗Cry1Ac毒素单链抗体的编码基因，以及运用其翻译、表达的活性多肽结合该基因进行免疫PCR检测Cry1Ac毒素的应用。
背景技术
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种在自然界广泛分布的需氧型革兰氏阳性细菌。其分泌的Cry1Ac毒素对鳞翅目害虫的毒杀效果很好，目前已成为广泛使用的生物杀虫剂，随着转基因技术的发展，使其更大规模地用于防治农业害虫。为了满足广大消费者的知情权和选择权，以及出于国际贸易的需要，对于转Bt基因植物环境安全性评价和标识管理的研究急需发展快速有效的检测技术作为支持。
现阶段围绕Bt毒素安全检测监控评价技术已经有了突出的进展。生物测定法、免疫检测法（如：协同凝集反应、酶联免疫吸附、Western-blot、试纸条法、蛋白生物芯片等）、核酸检测法、仪器检测法（如：流式细胞仪、电泳、质谱等）均有研究报道，上述方法在毒素的毒力鉴定和安全检测中发挥了较好的作用。
噬菌体抗体技术是将抗体基因片段与噬菌体外壳蛋白基因拼接后插入到噬菌体载体中，抗体与外壳蛋白氨基端融合展示在噬菌体颗粒表面，并保持独立的空间结构和生物学活性。用噬菌体抗体技术可以制备出单链抗体（Single-chain variable fragments, scFv），该抗体由连接肽将重链可变区和轻链可变区拼接而成，其具有亲代抗体全部特异性，是保持结合能力的最小结构单位，大小为完整IgG分子的1/6。目前，利用噬菌体展示技术筛选制备抗Bt毒素的单链抗体或多肽的研究，已有少量报道。2009年申请人曾在《细胞与分子免疫学杂志》上报导了用Tomlinson抗体库筛选抗Cry1Ac单链抗体的方法，但是该筛选方法容易产生假阳性，且当时筛选出的抗体并未做相关的应用。
1992年Sano首创了免疫-PCR法，其本质是以PCR扩增DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的改良型ELISA方法。传统ELISA用颜色反应来表明阴性或阳性结果或根据颜色深浅判断待测物的含量，而免疫PCR由PCR产物的量来反映抗原分子的量，该方法将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测，因此更为灵敏。而针对Cry1Ac的单链抗体的核酸序列以及利用噬菌体单链抗体进行免疫PCR检测Cry1Ac的方法并未见报道。因此该研究具有较好的理论研究价值和广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于，针对传统单抗、多抗制备需要免疫动物，过程较繁琐，利用噬菌体抗体库技术简化了制备抗体的过程，结合竞争洗脱可以提高筛选效率。本发明提供了一种抗-Cry1Ac单链抗体的基因及运用噬菌体抗体进行免疫PCR检测Cry1Ac的方法，解决了传统抗体进行免疫PCR过程中需要标记DNA报告分子的难题。
本发明的目的是这样实现的：一种抗Cry1Ac毒素的单链抗体的编码基因，其特征在于：所述的单链抗体的编码基因为如下1）、2）、3）所示：
1）其核酸序列是序列表中SEQ ID No.1所示DNA分子；
2）与1）限定的DNA序列杂交并编码所述单链抗体的DNA分子；
3）与序列表中SEQ ID No.1自5’端起第27-821位核酸具有90%以上的同源性且编码所述抗Cry1Ac毒素单链抗体的DNA分子。
本发明所述编码基因翻译的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示及该活性多肽。
本发明所述的活性多肽，是将抗Cry1Ac毒素的单链抗体的编码基因与噬菌粒载体拼接并导入宿主菌培养获得。
一种Cry1Ac毒素的免疫PCR检测方法，其特征在于：检测抗体为权利要求3所述的活性多肽；检测DNA为权利要求1所述的编码核酸序列。
在所述的Cry1Ac毒素的免疫PCR检测方法中：它包括下列步骤：
A、PCR管预处理
采用戊二醛温育法处理聚乙烯PCR管；
B、优化融合型单链抗体添加量；
融合型单链抗体以108 pfu/mL为添加浓度；
C、免疫-PCR步骤
1）加入50 μL包被抗原Cry1Ac；
2）洗涤，加入封闭液；
3）洗涤，加入融合型单链抗体上清液；
4）洗涤；
5）进行PCR检测。
所述的免疫-PCR检测是指定性或定量检测Cry1Ac毒素，其中：定性是UV检测；定量检测是测定荧光值，根据标准曲线计算待测物的含量。
本发明的优点在于：
1)获得抗-Cry1Ac单链抗体的基因及氨基酸序列，传统的抗体制备不易获得抗体的编码序列。
2)首次将融合型单链抗体表现型和基因型统一的特点运用于免疫PCR方法检测Cry1Ac毒素，该方法与传统的ELISA相比，检测信号高；与传统免疫PCR方法相比避免了报告DNA标记的过程，简化了实验步骤，降低了成本。
附图说明
图1是免疫PCR定性检测结果，扩增产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。M为DNA分子量标准，泳道1-7分别为0.5，1，2，4，8，16，32 ng/mL的Cry1Ac对应的扩增产物。
图2是免疫PCR荧光定量测定Cry1Ac的曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
实施例1. 抗-Cry1Ac单链抗体的筛选
本发明在亲和筛选过程中，所用的人源半合成抗体库（Tomlinson J）含有的单链抗体基因是被插入在噬菌粒pIT2中，单链抗体表达时与pⅢ蛋白一起融合表达在噬菌体衣壳蛋白上，为融合型单链抗体。
将4 mL 100 μg/mL无关蛋白包被细胞培养瓶的底部4 ℃过夜。次日用2%MPBS封闭后加入噬菌体抗体库溶液，室温孵育2 h，将上清液转移至包被有Cry1Ac并封闭好的细胞培养瓶中，室温孵育2 h，用含0.5% Tween-20的PBS洗去未结合或结合活性不高的重组噬菌体（第1轮洗10次，以后每轮增加10次）。结合力较高的先加入200 μL 100 μg/mL的Cry1Ac溶液，洗脱30 min（逐轮降低洗脱浓度，每一轮减少25 μg/mL）；之后用胰蛋白酶洗脱10 min。洗脱后侵染处于对数生长期的TG1细胞，取10μL梯度稀释测定cfu。剩余的用2×TY-AG培养，经M13超感染，2×TY-AKG培养过夜。次日离心回收上清，用PEG/NaCl沉淀，得到重组噬菌体抗体次级库。重复三次。
实施例2. 阳性克隆鉴定及序列测定
从第三轮和第四轮筛选的计数平板中随机挑取单菌落分别接种至200 μL/孔 2×TY-AG培养基的96微孔板中，37 ℃下250 rpm培养过夜，次日从每孔中吸取2 μL菌液对应转接至加有200 μL/孔 2×TY-AG培养基的96微孔板中，37 ℃，250 rpm条件下培养2 h。重新接种的微孔板培养2 h后，加入25 μL 2×TY-AG培养基添加109 pfu辅助噬菌体，继续于37 ℃ 250 rpm培养1 h，最后于1 800 g条件下离心10 min，弃去上清。菌体沉淀则重新悬浮至200 μL 2×TY-AK培养基中，并于30 ℃、250 rpm条件下培养过夜。次日，于1800 g条件下离心10 min后取上清液按照如下操作进行Phage-ELISA：
LMB3：CAGGAA ACAGCT ATGAC
pHEN：CTA TGC GGC CCC ATT CA
结合ELISA鉴定和测序结果选取结合率最高的一株阳性克隆。单链抗体编码基因如序列表中SEQ ID No.1所示，序列如下：
AATTCTATTT CAAGGAGACA GTCATAATGA AATACCTATT GCCTACGGCA GCCGCTGGAT 60
TGTTATTACT CGCGGCCCAG CCGGCCATGG CCGAGGTGCA GCTGTTGGAG TCTGGGGGAG 120
HCDR1
GCTTGGTACA GCCTGGGGGG TCCCTGAGAC TCTCCTGTGC AGCCTCTGGA TTCACCTTTA 180
GCAGCTATGC CATGAGCTGG GTCCGCCAGG CTCCAGGGAA GGGGCTGGAG TGGGTCTCAA 240
HCDR2
CTATTGGTAA TGCTGGTTAT AGTACATATT ACGCAGACTC CGTGAAGGGC AGGTTCACCA 300
TCTCCAGAGA CAATTCCAAG AACACGCTGT ATCTGCAAAT GAACAGCCTG AGAGCCGAGG 360
HCDR3
ACACGGCCGT ATATTACTGT GCGAAAGGTG CTGCTTCTTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA 420
Linker
CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCAGC GGCGGTGGCG 480
GGTCGACGGA CATCCAGATG ACCCAGTCTC CATCCTCCCT GTCTGCATCT GTAGGAGACA 540
LCDR1
GAGTCACCAT CACTTGCCGG GCAAGTCAGA GCATTAGCAG CTATTTAAAT TGGTATCAGC 600
LCDR2
AGAAACCAGG GAAAGCCCCT AAGCTCCTGA TCTATGCTGC ATCCACTTTG CAAAGTGGGG 660
TCCCATCAAG GTTCAGTGGC AGTGGATCTG GGACAGATTT CACTCTCACC ATCAGCAGTC 720
LCDR3
TGCAACCTGA AGATTTTGCA ACTTACTACT GTCAACAGGC TGCTAGTTCT CCTACTACGT 780
(His)6
TCGGCCAAGG GACCAAGATG GAAATCAAAC GGGCGGCCGC ACATCATCAT CACCATCACG 840
GGGCCGCAGA ACA 853
该序列自第3位至第851位为编码单链抗体的核酸序列。重链可变区为27-440位，其中HCDR1区为168-191位，HCDR2区为243-269位，HCDR3区为384-394位，连接肽为441-485位，轻链可变区为486-821位，其中LCDR1区为555-587位，LCDR2区为633-653位，LCDR3区为732-758位，组氨酸标签为822-839位。所述与第27-821位核酸具有90%以上的同源性且编码所述抗Cry1Ac毒素单链抗体的DNA分子，是指在重链可变区和/或轻链可变区中的CDR1和/或CDR2和/或CDR3，6个CDR区中每个都不能超过15个核酸的取代和/或缺失和/或添加和/或多个CDR区中核酸的取代和/或缺失和/或添加个数累积不超过15个。其翻译的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
Phe Tyr Phe Lys Glu Thr Val Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
35 40 45
HCDR1
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
50 55 60
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr
65 70 75 80
HCDR2
Ile Gly Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
85 90 95
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
100 105 110
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
115 120 125
HCDR3
Gly Ala Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Linker
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165 170 175
LCDR1
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
180 185 190
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
195 200 205
LCDR2
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
225 230 235 240
LCDR3
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ala Ser Ser
245 250 255
Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg Ala Ala
260 265 270
(His)6
Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu
275 280
该序列中，重链可变区为9-146位，其中HCDR1区为56-63位，HCDR2区为81-87位，HCDR3区为128-134位，连接肽为147-161位，轻链可变区为162-273位，其中LCDR1区为185-195位，LCDR2区为211-218位，LCDR3区为250-258位。组氨酸标签为274-279位。
实施例3. 免疫PCR方法检测Cry1Ac
1）65 ℃下用0.8%戊二醛处理PCR管2 h后风干。其中加入50 μL包被抗原Cry1Ac，用CBS稀释为0.5-32 ng/mL 4 ℃过夜。
2）PBST（0.05%Tween20）洗涤3遍，加入150μL封闭液（3%MPBS， 0.1%SDS）37℃温育2 h。
3）PBST（0.05%Tween20）洗涤3遍。加入108 pfu/mL的噬菌体抗体上清液100 μL，37 ℃温育1 h。
4）用PBST（0.05%Tween20）洗涤5遍，用超纯水再洗涤4遍。按以下PCR步骤加入引物和反应体系，进行PCR实验。其中引物为FAM-LMB3和pHEN。
| 菌液（模板） | 2 μL |
| MgCl2（25 mM） | 2 μL |
| 10×缓冲液 | 5 μL |
| dNTP 混合物（10 mM） | 1 μL |
| FAM-LMB3（100 μM） | 0.1 μL |
| pHEN（100 μM） | 0.1 μL |
| Taq（5 U/μL） | 0.5 μL |
| 无菌水 | 37.5 μL |
| 总体积 | 50 μL |
PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35轮循环；最后于72 ℃延伸10 min。分别在PBST洗涤液中加入0.05% Tween20，在封闭液加入0.1% SDS，抑制假阳性结果的出现。
实施例4. 结果鉴定
1）对于PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳和荧光分析两种方法进行鉴定，确定该方法的灵敏度。电泳检测取2μL产物上样，电泳25 min，UV检测。图1中1 ng/mL时有隐约的条带，从2 ng/mL开始条带较为明显。
2） PCR产物经产物回收后，去除未反应的引物，加入黑色96孔板中用多功能微孔板测定仪检测，激发波长485 nm，发射波长535 nm。以无关单链抗体上清液为阴性对照。如图2所示，无关抗体的荧光信号接近背景信号，而抗Cry1Ac单链抗体为检测抗体最低检测范围在0.2-100 ng/mL之间。
以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要本领域的技术人员，依据本领域的基本常识，在本发明权利要求启示下，采用相同或类似的技术方案，都属于本发明的保护范畴。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 抗Cry1Ac毒素单链抗体的编码基因及免疫PCR检测方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 853
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aattctattt caaggagaca gtcataatga aatacctatt gcctacggca gccgctggat 60
tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccgaggtgca gctgttggag tctgggggag 120
gcttggtaca gcctgggggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttta 180
gcagctatgc catgagctgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggtctcaa 240
ctattggtaa tgctggttat agtacatatt acgcagactc cgtgaagggc aggttcacca 300
tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg agagccgagg 360
acacggccgt atattactgt gcgaaaggtg ctgcttcttt tgactactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcgagc ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg 480
ggtcgacgga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca 540
gagtcaccat cacttgccgg gcaagtcaga gcattagcag ctatttaaat tggtatcagc 600
agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctatgctgc atccactttg caaagtgggg 660
tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc 720
tgcaacctga agattttgca acttactact gtcaacaggc tgctagttct cctactacgt 780
tcggccaagg gaccaagatg gaaatcaaac gggcggccgc acatcatcat caccatcacg 840
gggccgcaga aca 853
<210> 2
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Tyr Phe Lys Glu Thr Val Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
35 40 45
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
50 55 60
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr
65 70 75 80
Ile Gly Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
85 90 95
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
100 105 110
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
115 120 125
Gly Ala Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165 170 175
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
180 185 190
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
225 230 235 240
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ala Ser Ser
245 250 255
Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg Ala Ala
260 265 270
Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu
275 280
Claims (5)
1.一种抗Cry1Ac毒素的单链抗体的编码基因，其特征在于：其核酸序列是序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子。
2.一种活性多肽，其氨基酸序列为根据权利要求1所述编码基因翻译的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求2所述的活性多肽，是将权利要求1的编码基因与噬菌粒载体拼接并导入表达宿主菌培养获得。
4.一种Cry1Ac毒素的免疫PCR检测方法，其特征在于：检测抗体为权利要求3所述的活性多肽；检测DNA为权利要求1所述的编码基因，其包括下列步骤：
A、PCR管预处理
采用戊二醛温育法处理聚乙烯PCR管；
B、优化融合型单链抗体添加量；
融合型单链抗体以108 pfu/mL为添加浓度；
C、免疫-PCR步骤
1）加入50 μL包被抗原Cry1Ac；
2）洗涤，加入封闭液；
3）洗涤，加入融合型单链抗体上清液；
4）洗涤；
5）进行PCR检测。
5.根据权利要求4所述的Cry1Ac毒素的免疫PCR检测方法，其特征在于：免疫-PCR检测是指定性或定量检测，其中：定性检测是：琼脂糖凝胶电泳检测取2μL产物上样，电泳25 min，UV检测；定量检测是：在上游引物5’修饰FAM荧光基团，经PCR扩增，回收产物在黑色96孔板中用多功能微孔板测定仪检测，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm。
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-
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