CN108085365A - 一种脱落酸的免疫pcr测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物激素测定领域，提供了一种脱落酸的免疫PCR测定方法，步骤包括：用戊二醛对PCR管/板的内表面进行预处理，用抗脱落酸单抗体包被处理后的PCR管/板表面，合成探针混合物，加入处理后的PCR管/板中，再加入待测脱落酸样品至PCR管/板中进行反应，在实时PCR设备中进行扩增，根据扩增结果，确定脱落酸含量。对比试验表明，利用戊二醛对PCR管/板的内表面进行预处理，可提高20～30％的抗体包被能力，本发明还使用了生物素化ABA多抗、生物素化DNA和亲和素三种物质合成探针混合物，提高了ABA测定的可重复性，本发明的免疫PCR法检测下限可以达到10ng/L，接近液质联用的检测结果，解决了生物体外植物激素难以和生物大分子直接反应的问题。

Description

一种脱落酸的免疫PCR测定方法

技术领域

本发明属于植物激素测定领域，具体涉及一种脱落酸的免疫PCR测定方法。

背景技术

植物激素通常为小分子有机化合物，在植物生长发育中发挥重要作用。几十年来，关于植物激素研究的进展是农业科学技术进步和“绿色革命”的最重要的驱动力。为更好的研究植物激素作用的分子机理，需要研究清楚植物激素的结构、分布以及它们在不同器官、组织和细胞中的极性分布，因此，高灵敏度的植物激素的高通量定量检测是研究植物激素作用的有力手段。植物激素测定包括生物试验法、免疫测定和生物传感器、电化学分析、色谱、质谱和毛细管电泳法等。

植物细胞中的提取物成分极其复杂，此外很多植物的植物激素都是痕量水平，通常鲜重的含量范围是0.1～50ng/g。在复杂的植物提取物中，伴有大量不同化合物的情况下，为了能够定量测定相对含量很低的植物激素，检测方法应当具有很高的选择性和灵敏度。质谱由于具备很好的灵敏度，是过去几十年中用来检测植物激素的主要手段，然而，质谱成本高昂，对操作的要求也很严格，样品的制备步骤还很繁杂，这些因素都限制了质谱法的普及。

从上世纪九十年代开始，免疫聚合酶链反应(Im-PCR)法被用于分子的定量测定中，Im-PCR法可以快速并且特异性地扩大分析物的检测信号，利用免疫测定法和PCR法的优势，可以高效地测定极低含量的目标检测物。对于DNA检测，PCR法效率很高，并且理论上可以检测单个核苷酸序列的复制。根据试验目的，可以进行不同模式的Im-PCR。Im-PCR法的反应类型包括直接反应、间接反应、双抗体夹心反应、间接双抗体夹心反应和竞争型反应。和传统方法如ELISA法、高效液相色谱和免疫荧光法相比，通过使用PCR作为信号放大系统，Im-PCR法的灵敏度增加了100～10000倍。随着技术的发展和定量实时PCR技术的引入，Im-PCR法可以进行高通量的测试。Im-PCR包括RT-Im-PCR，广泛应用于医药和环境领域中如有机分子/有机物(抗体、蛋白质、毒素、核酸和病原体等)的测定。由于植物激素抗原难以与固相吸附，因此Im-PCR法通常不适用于植物激素的痕量检测。

脱落酸(ABA)是一种具有倍半萜结构的植物激素，是平衡植物内源激素和有关生长活性物质代谢的关键因子，具有促进植物平衡吸收水和协调体内代谢的能力，可有效调控植物的根/冠和营养生长与生殖生长，对提高农作物的品质、产量具有重要作用。作为ABA作用机制研究的基础，ABA在痕量植物样品中的定量检测至关重要。最初，根据ABA对光诱导气孔开放的抑制作用，表皮条气孔开放试验被当作一种脱落酸的生物试验法。目前，通过ELISA法测定不同的植物激素的装置已经商业化，最低的检测限可以达到皮克级别。对于ABA的测定，放射免疫性测定法(RIA)在定量测定粗植物提取物中的ABA时具有更低的检测限，然而RIA法需要通过设备测量放射性，关于同位素的操作也需要专门的许可和培训。此外还有一些电化学传感器也用来测定ABA的含量。CN103592291A提供了一种基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法，该法属于化学发光技术，以生物素化脱落酸抗体修饰纳米金为标记物，以磁珠为载体，结合酪胺信号放大技术和PIP-HRP-H₂O₂化学发光体系高灵敏度测定脱落酸，该法成本较低，灵敏度高，然而操作较复杂。CN104297410A提供了一种液质联用检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的分析方法，该法灵敏度高、精密度好，加标回收率高，有效提高了分析效率，然而该法所需的设备价格高昂。

现有的脱落酸测定方法，存在样品制备和操作步骤都复杂、设备昂贵、耗材费用高并且技术要求苛刻等问题，这些因素都限制了测定方法的应用。因此，还需要开发一种简单快速，同时又有很高灵敏度的ABA定量测定方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种脱落酸的免疫PCR测定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种脱落酸的免疫PCR测定方法，包括以下步骤：

(1)用戊二醛对PCR管/板的内表面进行预处理，然后用缓冲液冲洗去除残留的戊二醛；

(2)用抗脱落酸单抗体包被步骤(1)处理后的PCR管/板表面，包被完成后使用蛋白液封闭；

(3)合成探针混合物，加入步骤(2)处理后的PCR管/板中；

(4)加入待测脱落酸样品至步骤(3)中的PCR管/板，反应后移除管/板中液体；

(5)加入特异性引物、PCR试剂盒混合物和水到步骤(4)处理的PCR管/板中，在实时PCR设备中进行扩增；

(6)根据PCR扩增的结果，确定脱落酸含量。

优选地，步骤(1)所述戊二醛的浓度为0.5％～1.2％。

优选地，步骤(1)所述的缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。

优选地，步骤(2)所述的蛋白液为1％的牛血清白蛋白。

优选地，步骤(3)所述探针混合物的合成原料包含生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素。

优选地，所述的合成原料中，生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素的配比为(1-5)：(1-5)：(1-3)。

进一步优选地，所述的合成原料中，生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素的最佳配比为1：1：1。

优选地，所述的探针混合物的合成方法为：将生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素按照配比在磷酸缓冲盐溶液中混合，4℃孵育2小时后，通过超滤法提纯，即得探针混合物。

进一步优选地，所述超滤法的条件为：离心力5000g，离心时间15分钟，4℃，超滤离心管的截流分子量为100k。

超滤完成后，用磷酸缓冲盐溶液冲洗超滤膜三次，并将超滤管中的溶液在4℃下以5000g力离心15分钟，然后将超滤管中的溶液移入2mL离心管保存于-20℃的环境中。

优选地，步骤(5)所述特异性引物为正向5′-CCGGTTCCCAACGATCAAG-3′和反向5′-AA C C G C T T T T T T G C A C A A C A T-3′。

优选地，步骤(5)所述的实时PCR设备为美国安捷伦Mx3000P实时荧光定量PCR仪。

优选地，步骤(5)所述的扩增程序为：95℃条件下预变性10min，95℃预变性30s，扩增循环40次，56℃退火30s后，72℃延伸10s。

本发明的有益效果

1、利用戊二醛对PCR管/板的内表面进行预处理，可以明显提高ABA抗体与PCR管/板的结合能力，单位面积可结合更多的ABA抗体，对比试验表明，利用戊二醛处理可提高20～30％的抗体包被能力；

2、本发明提供的方法对ABA具有很高的特异性，只需将植物提取物经过简单的处理，就能快速准确地分析粗纯化样品中的ABA含量，操作简单方便，与液质联用法相比，后者需要对待测试样进行繁杂的处理；

3、本发明使用生物素化ABA多抗、生物素化DNA和亲和素三种物质合成探针混合物，大大提高了ABA测定的可重复性，对比试验表明，利用预合成的探针混合物开展ABA测定，数据偏差降低，可以针对多种植物组织，同步精确的测定96孔板中的ABA含量，实现了高通量ABA的测定，工作效率高；

4、针对痕量植物激素样品的测试，本发明的免疫PCR法检测下限可以达到10ng/L，与液质联用的检测灵敏度相当；

5、本发明提供的免疫PCR法，解决了生物体外植物激素难以和生物大分子直接反应的问题。

附图说明

图1为免疫PCR的操作流程图。

图2为不同类型PCR管/板的均匀性测试结果示意图，其中**表示差别非常显著(p<0.01,n＝3)，*表示差别显著(0.05>p>0.01，n＝-3)，N表示无差别。

图3为经戊二醛处理的PCR管与未经戊二醛处理的对比PCR管的包被效率示意图。

图4为冲洗缓冲液中的抗体数量示意图，其中，x表示冲洗次数，TBS表示三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，PBS表示磷酸盐缓冲生理盐水，PBST表示加吐温的磷酸盐缓冲生理盐水。

图5为ABA和单克隆抗体间结合饱和度随孵育时间的变化示意图。

图6超滤后流出液中未结合的生物素化DNA的百分含量示意图，热力图左侧和上方的数据表示与未结合的亲和素的摩尔质量比。

图7为不同ABA浓度条件下的逆转录免疫PCR放大曲线，其中，7A为琼脂糖凝胶中的PCR产物显示图；7B为DNA带的相对密度；7C为不同循环次数的荧光起始拷贝量；7D为CT值示意图。

具体实施方式

实施例1

为了便于免疫PCR的高通量定量分析，本实施例比较了不同类型常用的聚丙烯(PP)PCR管的均匀性。

具体方法为通过向不同类型的聚丙烯(PP)PCR管中加入了一定量的水，并观察水线高度以验证PCR管的均匀性，结果如图2所示。

在免疫PCR中，固化探针混合物(即DNA模板)在PCR管表面的一致性和稳定性是PCR程序运行前分析物定量准确的决定性因素。因此，在进行ABA单克隆抗体包被前，需要选择优质的PCR管/板、高性能的交联剂以及适合的洗涤缓冲液。从图2可以看出，普通的PCR管和八联管的内表面偏差较高，不适合用于免疫PCR的高通量定量分析，而QRT-PCR八联管和而QRT-PCR96孔管显示出良好的均匀性，可以用于免疫PCR的高通量定量分析。

实施例2

本实施例比较了戊二醛预处理对PCR管/板和ABA抗体间结合能力的影响。

具体试验步骤包括：

(1)用戊二醛对PCR管/板进行预处理：使用向PCR管/板中滴入0.8％的戊二醛100μL，室温下浸润2小时，然后将戊二醛移出后用PBS冲洗PCR管/板3次；

(2)ABA单克隆抗体包被：然后将10μL浓度为20μg的ABA单克隆抗体加入到PCR管/板的底部4℃孵育2小时，然后将单克隆抗体溶液移出并用缓冲洗涤液冲洗3次，所用的缓冲洗涤液分别为TBS(Tris缓冲液，pH7.5)，PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)，PBST(磷酸盐缓冲盐水和吐温，pH 7.5)和超纯水，冲洗后向每个管/孔中加入100μL浓度为1％的牛血清蛋白，4℃孵育1小时，用PBS缓冲溶液对PCR管/板冲洗五次封闭吸附点；

(3)测定未包被的抗体含量；

(4)用Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物(货号500-0006)结合用户手册来测定单克隆抗体洗涤液中的蛋白质含量。

使用相同的未经戊二醛处理的PCR管/板作为试验对照。

在免疫PCR中，固化探针混合物(即DNA模板)在PCR管表面的一致性和稳定性是PCR程序运行前分析物定量准确的决定性因素。与聚苯乙烯ELISA板/微孔板相比，因为96孔板对蛋白质/抗体有很好的亲和性，因此96孔板被广泛应用于ELISA法中。然而，由于微孔反应板在PCR设备中的热稳定性欠佳，在运行PCR中，需要额外的步骤将DNA标记从抗原-抗体复合物中分离，然后转移到另一个板中进行扩增，因此微孔反应板并不适用于PCR技术。与聚苯乙烯ELISA板/微孔板相比，常用的PCR管/板是用聚乙烯或聚丙烯制成的，对蛋白质/抗体的结合能力和稳定性更低，会影响Im-PCR的灵敏度和可重复性。因此，在进行ABA单克隆抗体包被前，除了需要选择高性能的交联剂以及适合的洗涤缓冲液，更需要选择合适的PCR管/板，为达到更高的McAb利用效率，在抗体包被前用交联剂对PCR管/板进行包埋也是一种有效的手段。戊二醛作为一种有效的交联剂，在和羟基有机物的交联中具有化学、生物学和热力学的稳定性，可用于预处理聚乙烯或聚丙烯管，以提高羟基有机物的结合特性。同时，由于戊二醛在水性和油性溶剂中都有更高的溶解性，通过正常的轻度盐碱漂洗(如PBS，TBS，PBST甚至超纯水)或有机溶剂(如甲醇、氯仿和乙醚)，就可以把多余的戊二醛洗净。

图3为经戊二醛处理的PCR管/板与未经戊二醛处理的对比PCR管/板的包被效率示意图。从图3可以看出，经戊二醛处理的PCR管/板中，未包被的单克隆抗体含量明显低于未经戊二醛处理的PCR管/板，同时，对于经戊二醛处理的PCR管/板，未包被的单克隆抗体含量在两小时内便趋于稳定，说明了抗体的包被在此时间内已经迅速达到了饱和，说明经戊二醛处理的PCR管的抗体结合效率明显高于未经处理的PCR管/板。

图4为冲洗缓冲液中的抗体数量示意图，从图4可以看出，通过和不同的温和缓冲液的清洗能力进行比较，由于非电离水和吐温会将部分结合的单克隆抗体从包埋的PCR管上洗提，因此发现在前两次洗涤中，超纯水和PBST的清洗液里抗体数量更多，TBS和PBS的洗涤能力无显著差异，但PBS更加适合用于洗涤未包埋的抗体。无论选用哪种洗涤缓冲液，经过戊二醛预处理的抗体包埋PCR管洗涤缓冲液中的总蛋白含量，明显低于未经戊二醛处理的PCR管，说明戊二醛是一种更好的PCR管/板预处理剂和稳定剂。

本实施例的试验结果表明，利用戊二醛预处理PCR管或PCR板的内表面，可以明显提高ABA抗体与PCR管或PCR板的结合能力，单位面积可结合更多的ABA抗体，对比试验表明，利用戊二醛处理可提高20％～30％的抗体包被能力。

实施例3

基于本发明的免疫PCR法，使用实时免疫PCR法(RT-Im-PCR)测定了拟南芥和水稻的八个不同组织中的ABA含量，每个组织在96孔板中进行了12次重复试验，流程如图1所示。

具体试验步骤为：

(1)植物材料与取样：

用70％酒精和5％次氯酸钠对拟南芥和水稻种子表面进行消毒，之后清洗3次，避光培育48小时后，在4℃条件下同时开始发芽。拟南芥和水稻种子在0.4％(w/v)植物凝聚固化的MS培养基中培养。将拟南芥和水稻幼苗垂直放置在生长室中，分别在22℃和32℃下，光照16小时后无光8小时。为了收集茎和花，将十日育龄的拟南芥幼苗移入盆中进入成熟期。将约100mg新鲜植物组织收集2ml离心管内，并迅速在液氮中冷冻保存。

(2)脱落酸提取：

先将植物组织在液氮中研磨，然后用1毫升80％的甲醇在4℃避光条件下提取ABA，4小时后，以12000g的离心力离心去除固体杂质。进行真空冷冻浓缩后，再将样品重新溶解在超纯水中，制备得到的粗样品可直接用于RT-Im-PCR法测定ABA。对于液质联用法，需要先用C18色谱柱对粗样品进一步纯化后才能进行测试。

(3)PCR管/板的预处理与ABA单克隆抗体包被：

先用戊二醛对PCR管/板进行预处理，再将ABA单克隆抗体固定在经过戊二醛预处理的PCR板/管的内表面，如图1A所示，具体方法如实施例2。

(4)生物素化DNA的扩增与纯化

通过正向引物(biotin-5′-TATGCAGTGCTGCCATAACCATGA-3')和反向引物(5′-ATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTT-3′)，以pUC19为模板，由PCR扩增得到生物素化双链核苷酸序列(250bp)。反应混合物的总量为100μL，包括10μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTP(5μmol/L)，2μL引物(10μmol/L)，2.5U Taq聚合酶，和10pg模板pUCDNA，超纯水补齐100μL。PCR的运行条件为94℃孵育4min，94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应20s，循环30次。用生物素标记的PCR产物在1.5％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中进行分析，之后用琼脂糖凝胶DNA提纯试剂盒进行纯化。为得到更加优质的生物素化DNA，用高效液相质谱来进一步纯化生物素化DNA。

(5)探针混合物的制备

为了便于构建免疫PCR反应体系，需要预先制备好探针混合物，探针混合物通过生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和链霉亲和素合成，如图1B所示，将生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素按照配比在磷酸缓冲盐溶液中混合，4℃孵育2小时后，通过超滤法提纯，即得探针混合物。超滤法的条件为：离心力5000g，离心时间15分钟，4℃，超滤离心管的截流分子量为100k。超滤完成后，用磷酸缓冲盐溶液冲洗超滤膜三次，并将超滤管中的溶液在4℃下以5000g力离心15分钟，然后将超滤管中的溶液移入2mL离心管保存于-20℃的环境中。生物素化ABA多抗、生物素化DNA和亲和素的最佳摩尔质量配比为1:1:1。

(6)RT-Im-PCR体系的构建

将步骤(2)中制备得到的1μL ABA式样，步骤(5)中制备得到的1μL探针混合物和8μL双蒸水加入单克隆抗体包被的PCR管/板中，4℃下孵育2小时后，为了除去未连接的探针混合物，用PBS冲洗3次，最终制得10μL的RT-Im-PCR体系。

(7)RT-Im-PCR的程序运行

将探针混合物和适量的ABA样品加入抗体包埋的PCR管内进行免疫反应，然后冲洗PCR管除去过量探针混合物，制备PCR混合物，运行RT-Im-PCR程序，如图1C所示。

程序为：95℃条件下预变性10min，95℃预变性30s，扩增循环40次，56℃退火30s后，72℃延伸10s。

(8)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳实验，如图7A，没有观察到PCR产物的非特异性带，通过Image J软件计算得到DNA带的相对密度。ABA浓度与DNA密度间的线性关系为y＝15.04x+14.2，决定系数(R2)为0.9863，如图7B所示。通过SYBR green法在QRTPCR设备上进行Im-PCR试验，图7C的扩增曲线表示该方法可以应用于ABA的量化。CT值会随着ABA浓度的降低而增加，随后，通过ABA标准溶液浓度和平均CT值之间的关系绘制标准曲线，如图7D，ABA的标准曲线在10ng/L和40ng/L的范围内呈线性关系，线性回归方程为y＝-0.118x+25.365，决定系数R2为0.9763。检测限(LOD)为10ng/L，实际上，RT-Im-PCR混合液中仅含有2.5fg的ABA，当使用2.5ng/L的标准ABA溶液时结果仍显示出良好的可重复性。RT-Im-PCR的检测灵敏度接近质谱联用，平均回收率为96.9％，接近LC-MS/MS的98.1％。

采用氘标记的ABA作为内部标准，基于发明提供的免疫PCR法，将RT-Im-PCR法和液质联用法的测定进行比较，如表1所示，可以看出经两种方法测定得到的ABA含量数据偏差很小，验证了免疫PCR法所得数据的可靠性。

表1拟南芥和水稻中不同组织中的ABA含量

在免疫PCR中，由于未结合的分析物会随着洗涤缓冲液被一起洗掉，样品中过量的分析物/抗原是无法检测的。因此，样品中过高的分析物浓度会导致精确率的降低。为筛选在20μL免疫PCR系统中ABA添加量的上限，本实施例还使用了ABA标准样品来测定ABA McAb(约400ng)的结合饱和程度。具体步骤为：首先制备McAb包被的PCR管，然后将含有2ng ABA的20μL PBS加入PCR管中，混合液保存在4℃的无光环境中，每隔半小时将ABA溶液移出，通过HPLC-MS/MS测定移出液中的ABA浓度，结果如图5。

为了提高探针混合物的稳定性，本实施例采用了生物素-亲和素系统。ABA PcAb抗体和DNA事先进行了生物素化处理，抗生物素蛋白作为交联剂。抗生物素蛋白包含四个重复的亚基，在某种程度上对于生物素相当于是一种四价的结合糖蛋白。本实施例测定了生物素化PcAb和生物素化DNA摩尔质量比对二者间结合的影响，具体为反应溶液含有1fmol的亲和素与不同含量的生物素化PcAb和生物素化DNA，通过超滤法将游离的生物素化DNA分离，通过PCR测定流出液中的DNA含量，结果如图6所示。生物素化ABA多抗、生物素化DNA和亲和素的最佳摩尔质量配比为1:1:1。

本实施例提供的免疫PCR法，检测限达到了10ng/L，可以高通量重复性地就检测亚飞克级的ABA，灵敏度和回收率与液质联用非常接近，此外，与液质联用相比，重要的改进是免疫PCR可以用于测定粗样品中的ABA含量。

配制预制好的探针混合物的目的是为了节省体系配制时间、标准化实验操作流程、便于进行高通量的免疫PCR分析，减少因不同时间做的免疫PCR引起的数据偏差，提高可重复性。

表2不同探针混合物制备方法下所测定ABA中含量

植物组织	预制探针混合物方法测定值	非预制探针混合物方法
			拟南芥叶子	35.4±0.8	34.6±1.8
拟南芥花	55.6±1.3	55.7±3.5
			拟南芥种子	289.2±1.9	276.9±11.9

以上实施例中所用的ABA PcAb和McAb的合成、引物和PcAb的生物素化在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。DNA聚合酶和TransStart Green qPCR试剂盒购于北京全式金生物技术公司。标准ABA样品购于捷克的Olchemim公司。牛血清白蛋白(BSA)和链霉亲和素购于美国Sigma公司。戊二醛和其它化学试剂为分析纯，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。洗涤缓冲液包括：TBS(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，pH 7.5)、PBS(磷酸盐缓冲生理盐水，pH 7.4)和PBST(磷酸盐缓冲生理盐水加吐温，pH 7.5)。包被缓冲液为50mmol/L的碳酸盐(pH 9.5)。

Claims (9)

1.一种脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用戊二醛对PCR管/板的内表面进行预处理，然后用缓冲液冲洗去除残留的戊二醛；

(2)用抗脱落酸单抗体包被步骤(1)处理后的PCR管/板表面，包被完成后使用蛋白液封闭；

(3)合成探针混合物，加入步骤(2)处理后的PCR管/板中；

(4)加入待测脱落酸样品至步骤(3)中的PCR管/板，反应后移除管/板中液体；

(5)加入特异性引物、PCR试剂盒混合物和水到步骤(4)处理的PCR管/板中，在实时PCR设备中进行扩增；

(6)根据PCR扩增的结果，确定脱落酸含量。

2.根据权利要求1所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，步骤(1)所述戊二醛的浓度为0.5％～1.2％。

3.根据权利要求1所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，步骤(1)所述的缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。

4.根据权利要求1所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，步骤(2)所述的蛋白液为1％的牛血清白蛋白。

5.根据权利要求1所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，步骤(3)所述探针混合物的合成原料包含生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素。

6.根据权利要求5所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，所述的合成原料中，生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素的配比为(1-5)：(1-5)：(1-3)，最佳配比为1：1：1。

7.根据权利要求1或5所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，所述的探针混合物的合成方法为：将生物素化多克隆抗体、生物素化DNA和亲和素按照配比在磷酸缓冲盐溶液中混合，4℃孵育2小时后，通过超滤法提纯，即得探针混合物。

8.根据权利要求7所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，所述超滤法的试验条件为：离心力5000g，离心时间15分钟，4℃，超滤离心管的截流分子量为100k。

9.根据权利要求1所述的脱落酸的免疫PCR测定方法，其特征在于，步骤(5)所述特异性引物为正向5′-CCGGTTCCCAACGATCAAG-3′和反向5′-AACCGCTTTTTTGCACAACAT-3′。