CN114933653A - 一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：进行常规的小鼠免疫、细胞融合、ELISA筛选；抗原偶联芯片；阳性克隆抗体亲和力排序；高亲和力阳性克隆抗体识别表位筛选；稳定株建立及抗体制备；阳性克隆抗体ELISA配对检测，本发明将常规的杂交瘤筛选技术与SPR技术结合，将现有单克隆抗体分别与抗原进行结合，通过SPR技术检测出其中与抗原亲和力较高的数个单克隆抗体，使用棋盘法进行两两配对，构建检测样本，逐个做细胞培养、提取蛋白、纯化后实施ELISA试验，不仅能大大提高筛选通量和高亲和力抗体的成功率，还能够大幅降低工作量、缩短研发时间、降低人力成本及研发费用。

Description

一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法。
背景技术
体外诊断试剂中，基于化学发光、免疫层析、酶联免疫吸附、胶乳增强免疫比浊等方法学的试剂绝大部分核心原料都是检测靶点的配对单克隆抗体。配对单克隆抗体是指可以同时结合在一个抗原分子上的两个单克隆抗体。一个抗原分子拥有多个抗原表位，经过动物免疫后，针对不同的抗原表位会产生不同的抗体，一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原表位。结合抗原上不同表位的两个单克隆抗体，有可能同时结合到抗原分子上。
行业内常规筛选单克隆抗体的方式为杂交瘤方式筛选+酶联免疫吸附法(ELISA)测活。酶联免疫吸附法(ELISA)的原理为，先对待测底物(抗体)进行倍数稀释(1:4、1:16、1:32、1:64、1:128不等)，然后采用抗原-抗体特异识别的免疫反应测定抗体活性：将抗原预先包被至固相载体上，然后与不同稀释比例的待测底物(抗体)进行反应，洗脱掉未能结合的抗体，再加入进行酶标后的抗体，洗脱后加显色剂，通过酶与特定底物产生显色反应半定量检测抗体的含量。
ELISA测活方法的劣势在于：(1)实验操作过程繁琐，耗时较长；(2)半定量及荧光定量的测活方法存在一定误差；(3)检测方法的实施时点较为靠后，单克隆抗体的构建前期无法直接筛选出配对抗体，必须是在实验者已经构建了单克隆抗体菌株、完成蛋白表达、进行纯化之后才能实施检测。举例来说，某客户提供一个抗原，要求制备出配对单克隆抗体进行夹心检测抗原。如按照常规ELISA配对筛选方法，则实验者需至少先筛选出50个阳性克隆的稳定细胞株，进行细胞培养、抗体纯化、纯化后实施ELISA，按照棋盘法进行两两配对，按照工作量估算需要10个人做6-8个月，折合约需1800-2400工作日，且最后的试验结果中可能大部分抗体配对效果都不理想，需要剔除。
表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology，SPR)是利用激发光对金属表面的生物分子进行照射，由于不同质量的生物分子折射率不同，因此发生共振(surface plasmon resonance，SPR)的入射角度(共振角，又称SPR角)各不相同，因而可通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子相互作用的特异信号。目前主要用于DNA-DNA间的生物特异性相互作用、蛋白质折叠机制的研究、微生物细胞的检测、抗体－抗原分子亲和力测定等大分子相互作用的常见领域。
抗体亲和力是指抗体与抗原表位之间的一种非共价结合力，其强弱取决于抗体可变区与抗原表位之间的契合程度，是评价抗体质量的重要指标，反映了抗体与相应抗原之间的结合力度。亲和力越高，抗体与相应的抗原之间的结合程度越高，对抗体的应用具有重要的指导作用。Biacore是基于表面等离子共振(SPR)技术的检测分子互作的经典设备，也是抗体亲和力测定的金标准。
随着科学技术的发展，很多体外诊断项目对检测试剂的灵敏度和精确度的要求越来越高，同时一些表达丰度低的特异性蛋白被开发为生物标志物，这就使得诊断试剂对其核心的单克隆抗体的亲和力提出了更高的要求。在诊断抗体原料的开发中，筛选出高亲和力的抗体意义变得举足轻重。
在常规的配对单克隆抗体制备过程中，需要先进行杂交瘤细胞的融合、筛选、建株，再进行抗体的腹水制备、纯化，获得一定量的阳性抗体后，使用棋盘法进行抗体配对。在诊断抗体原料的开发中，其亲和力的测定又往往被忽视。这个抗体的制备过程周期长，工作量大，而最终能获得的配对抗体少，亲和力不确定，能用于诊断试剂研发与生产的抗体原料更少，使得配对单克隆抗体研发的成功率和效率都非常低，严重影响解决体外诊断核心原料卡脖子技术问题的进程。
因此，提供一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法是目前需要解决的技术问题。
发明内容
为了解决背景技术中提到的技术问题，本发明提供一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
步骤1、进行常规的小鼠免疫、细胞融合、ELISA筛选；
步骤2、抗原偶联芯片；
步骤3、阳性克隆抗体亲和力排序；
步骤4、高亲和力阳性克隆抗体识别表位筛选(配对筛选法或一步法)；
步骤5、稳定株建立及抗体制备；
步骤6、阳性克隆抗体ELISA配对检测。
进一步地，ELISA筛选具体操作为：
将抗原包被至酶标板中，对融合后的细胞上清进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆，对阳性克隆进行一次全换液，次日吸取阳性克隆上清进行SPR检测。
进一步地，抗原偶联芯片和阳性克隆抗体亲和力排序具体操作如下：
使用HEPES缓冲液作为运行缓冲液，将CM5芯片放于Biacore仪器的芯片仓，使用氨基偶联试剂盒将抗原偶联至CM5芯片表面，偶联后的PCT抗原作为配体，阳性克隆上清作为分析物，对抗原与不同阳性克隆上清的亲和力进行排序。
进一步地，步骤4具体操作步骤为：
对抗体识别表位竞争性分析然后筛选出高亲和力阳性克隆抗体，将步骤3中的细胞培养上清进行配对组合，分别流过CM5芯片表面，观察结合信号变化，保留两个上清信号值都有明显上升的组合(表示两个克隆识别抗原的不同表位)，剔除两个上清只有一次信号值明显上升的组合(表示两个克隆识别抗原的相同或相近表位)，得到可配对克隆组。
进一步地，步骤5具体操作步骤为：
步骤S1、将步骤4中可配对克隆组的阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，此为分泌蛋白单克隆抗体的杂交瘤稳定细胞株；
步骤S2、采用无血清发酵培养分泌蛋白单克隆抗体的杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，将获得单克隆抗体进行保存命名，名称与对应杂交瘤细胞株保持一致。
进一步地，步骤6具体操作步骤为：
采用简易过碘酸钠法将单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联，偶联后抗体以“细胞株编号-HRP”命名，将未标记抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的抗原加入酶标板中37℃孵育，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的抗原，在酶标板加入HRP标记后的抗体作为检测抗体，37℃孵育，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的标记抗体，在酶标板加入TMB显色液37℃孵育，在酶标板加入2M的硫酸终止液，用酶标仪测定OD450读数，选择阳性孔，记录对应的抗体对，然后进行灵敏度检测，得到高亲和力配对单克隆抗体。
进一步地，抗原为PCT抗原或PG I抗原。
本发明的有益效果：
本发明将常规的杂交瘤筛选技术与SPR技术结合起来，首先将杂交瘤细胞上清中单克隆抗体分别与抗原进行结合，通过SPR技术检测出其中与抗原亲和力较高的数个杂交瘤克隆，其次对抗体识别抗原表位进行筛选，获得识别表位不同的杂交瘤克隆，最后做细胞培养、抗体纯化、纯化后实施ELISA试验，不仅能大大提高筛选通量和高亲和力抗体的成功率，还能够大幅降低工作量(降为原来的3％-5％的工作量)、缩短研发时间、降低人力成本及研发费用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中Biacore检测传感图；
图2为本发明实施例1中Biacore亲和力检测结果图；
图3为本发明实施例1抗体识别表位竞争性分析结果图；
图4为本发明实施例2抗体识别表位竞争性分析结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：PCT配对单抗的筛选
a.动物免疫：用PCT抗原免疫Bal b/c小鼠，每只Bal b/c小鼠每次免疫50ug，免疫3次，每次间隔时间两周。
b.细胞融合：第三次免疫后1周，取小鼠脾脏，将脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合；融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液。
c.ELISA初步筛选：将PCT抗原包被至酶标板中，对融合后的细胞上清进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆，对阳性克隆进行一次全换液，次日吸取阳性克隆上清进行SPR检测；
d.阳性克隆抗体亲和力排序：使用HEPES缓冲液作为运行缓冲液，将CM5芯片放于Biacore仪器的芯片仓，使用氨基偶联试剂盒将PCT抗原偶联至CM5芯片表面，偶联后的PCT抗原作为配体，阳性克隆上清作为分析物，对PCT抗原与不同阳性克隆上清的亲和力进行排序，Biacore检测传感图及亲和力结果如图1和图2所示，阳性克隆亲和力排序结果：由高到低如表1所示：
表1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
94C5 62F3 19E5 67D5 7A10 29G2 17F7 21E3 63F11
10 11 12 13 14 15 16 17 18
48C8 78B5 7E1 83C10 97B11 28H6 83B9 77H11 56D2
e.抗体识别表位竞争性分析(配对筛选法)：将步骤d中的细胞培养上清进行配对组合，分别流过CM5芯片表面，观察结合信号变化，保留两个上清信号值都有明显上升的组合(表示两个克隆识别PCT抗原的不同表位)，剔除两个上清只有一次信号值明显上升的组合(表示两个克隆识别PCT抗原的相同或相近表位)。分析结果如图3所示，并且最终获得预测可配对克隆16组，统计如下表2所示：
表2
克隆1 克隆2 克隆1 克隆2
7A10 7E1 28H6 63F11
7A10 97B11 29G2 78B5
7E1 83B9 48C8 83C10
17F7 83B9 62F3 94C5
19E5 21E3 62F3 83B9
19E5 94C5 67D5 94C5
21E3 29G2 77H11 97B11
21E3 48C8 78B5 97B11
f.稳定细胞株建立：将步骤“d”的阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，此为分泌PCT蛋白单克隆抗体的杂交瘤稳定细胞株；
g.单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养上述稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，获得单克隆抗体名称与对应杂交瘤细胞株保持一致；
h.ELISA配对筛选：采用简易过碘酸钠法将单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，偶联后抗体以“细胞株编号-HRP”命名，将未标记抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的PCT(5ng/ml)加入酶标板中37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的PCT，在酶标板加入HRP标记后的抗体作为检测抗体，37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的标记抗体，在酶标板加入100ul的TMB显色液37℃孵育5分钟，在酶标板加入50ul的2M的硫酸终止液，用酶标仪测定OD450读数，选择阳性孔，记录对应的抗体对，配对结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003686120270000071
Figure BDA0003686120270000081
由表3ELISA配对结果可以看出，18株抗体相互配对共有32对配对结果为阳性，其中25对均属于步骤“e”中的16个组中，可见步骤“e”中预测阳性抗体对覆盖范围为78％。
j.灵敏度检测：将步骤“h”中32个抗体对，按不同抗原浓度进行夹心检测，以检测出最低抗原浓度定位检测灵敏度，结果表4所示：
表4
Figure BDA0003686120270000082
Figure BDA0003686120270000091
由表4可以看出，亲和力最高的5个克隆(94C5、62F3、19E5、67D5、7A10)，在高灵敏度抗体对中占有较高的比例。
实施例2：PG I配对单抗的筛选
a.动物免疫：用PG I抗原免疫Bal b/c小鼠，每只Bal b/c小鼠每次免疫50ug，免疫3次，每次间隔时间两周。
b.细胞融合：第三次免疫后1周，取小鼠脾脏，将脾细胞分离成单细胞悬液，与处于对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:1比例混合，采用细胞融合仪进行细胞融合；融合后细胞铺板至96孔细胞培养板中，添加HAT筛选试剂，培养5天后进行一次全换液。
c.ELISA初步筛选：将PG I抗原包被至酶标板中，对融合后的细胞上清进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆，对阳性克隆进行一次全换液，次日吸取阳性克隆上清进行SPR检测。
d.阳性克隆抗体亲和力排序：使用HEPES缓冲液作为运行缓冲液，将CM5芯片放于Biacore仪器的芯片仓，使用氨基偶联试剂盒将PG I抗原偶联至CM5芯片表面，偶联后的PGI抗原作为配体，阳性克隆上清作为分析物，对PG I抗原与不同阳性克隆上清的亲和力进行排序，阳性克隆亲和力排序结果如表5所示(由高到低)：
表5
1 2 3 4 5 6 7 8 9
34F10 6E2 1A5 35B6 1F3 22C2 26B3 30D9 25B5
10 11 12 13 14 15 16 17 18
24C6 29B10 31D2 4A5 36F5 30C5 2E10 6A8 36C9
e.抗体识别表位竞争性分析(一步法)：将步骤d中的细胞培养上清进行配对组合，分别流过CM5芯片表面，观察结合信号变化，保留两个上清信号值都有明显上升的组合(表示两个克隆识别PG I抗原的不同表位)，剔除两个上清只有一次信号值明显上升的组合(表示两个克隆识别PG I抗原的相同或相近表位)，如图4所示，最终获得5个明显不同表位的克隆(1F3、6E2、29B10、31D2、34F10)；
f.稳定细胞株建立：将步骤“d”中的阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，此为分泌PG I蛋白单克隆抗体的杂交瘤稳定细胞株；
g.单克隆抗体生产：采用无血清发酵培养上述稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，获得单克隆抗体名称与对应杂交瘤细胞株保持一致；
h.ELISA配对筛选：采用简易过碘酸钠法将单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，偶联后抗体以“细胞株编号-HRP”命名，将未标记抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的PG I(5ng/ml)加入酶标板中37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的PG I，在酶标板加入HRP标记后的抗体作为检测抗体，37℃孵育30分钟，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的标记抗体，在酶标板加入100ul的TMB显色液37℃孵育5分钟，在酶标板加入50ul的2M的硫酸终止液，用酶标仪测定OD450读数，选择阳性孔，记录对应的抗体对，配对结果如表6所示：
表6
Figure BDA0003686120270000111
Figure BDA0003686120270000121
由表6ELISA配对结果可以看出，18株抗体相互配对共有20对配对结果为阳性，其中14对均属于步骤“e”中的5个不同表位克隆，可见步骤“e”中预测阳性抗体对覆盖范围为70％。
j.灵敏度检测：将步骤“h”中21个抗体对，按不同抗原浓度进行夹心检测，以检测出最低抗原浓度定位检测灵敏度，结果如7所示：
表7
Figure BDA0003686120270000122
Figure BDA0003686120270000131
由表7可以看出，亲和力最高的5个克隆(1F3、6E2、29B10、31D2、34F10)，在高灵敏度抗体对中占有较高的比例。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、进行小鼠免疫、细胞融合、ELISA筛选；
步骤2、抗原偶联芯片；
步骤3、阳性克隆抗体亲和力排序；
步骤4、高亲和力阳性克隆抗体识别表位筛选；
步骤5、稳定株建立及抗体制备；
步骤6、阳性克隆抗体ELISA配对检测；
所述ELISA筛选具体操作为：
将抗原包被至酶标板中，对融合后的细胞上清进行间接ELISA筛选，保留阳性克隆，对阳性克隆进行一次全换液，次日吸取阳性克隆上清进行SPR检测。
2.根据权利要求1所述的一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，其特征在于，抗原偶联芯片和阳性克隆抗体亲和力排序具体操作如下：
使用HEPES缓冲液作为运行缓冲液，将CM5芯片放于Biacore仪器的芯片仓，使用氨基偶联试剂盒将抗原偶联至CM5芯片表面，偶联后的抗原作为配体，阳性克隆上清作为分析物，对抗原与阳性克隆上清的亲和力进行排序。
3.根据权利要求2所述的一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤4具体操作步骤为：
将步骤3中的细胞培养上清进行配对组合，分别流过CM5芯片表面，观察结合信号变化，保留两个上清信号值都有上升的组合，剔除两个上清只有一次信号值上升的组合，得到可配对克隆组。
4.根据权利要求3所述的一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤5具体操作步骤为：
步骤S1、将步骤4中可配对克隆组的阳性克隆进行亚克隆，直至阳性检出率为100％，扩大培养并冻存保种，此为分泌蛋白单克隆抗体的杂交瘤稳定细胞株；
步骤S2、采用无血清发酵培养分泌蛋白单克隆抗体的杂交瘤稳定细胞株，收集细胞培养上清，利用Prontein A亲和纯化单克隆抗体，将获得单克隆抗体进行保存命名，名称与对应杂交瘤细胞株保持一致。
5.根据权利要求1所述的一种高效筛选高亲和力配对单克隆抗体的方法，其特征在于，步骤6具体操作步骤为：
将单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联，偶联后抗体以“细胞株编号-HRP”命名，将未标记抗体包被至酶标板中作为捕获抗体，将稀释后的抗原加入酶标板中37℃孵育，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的抗原，在酶标板加入HRP标记后的抗体作为检测抗体，37℃孵育，用PBST洗涤缓冲液洗去未结合的标记抗体，在酶标板加入TMB显色液37℃孵育，在酶标板加入2M的硫酸终止液，用酶标仪测定OD450读数，选择阳性孔，记录对应的抗体对，然后进行灵敏度检测，得到高亲和力配对单克隆抗体。
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