CN108196045B - 杂交瘤细胞株、抗孔雀石绿单克隆抗体和孔雀石绿检测方法及应用和产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种杂交瘤细胞株、抗孔雀石绿单克隆抗体和孔雀石绿检测方法及应用和产品。本发明提供的产生抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo‑A4，保藏号为CGMCC No.14890，该杂交瘤细胞株可以分泌大量的抗孔雀石绿单克隆抗体，细胞稳定性和持续性好，分泌的单克隆抗体特异性好。本发明提供的抗孔雀石绿单克隆抗体效价高，特异性好，成本较低，用生物素标记后可以大幅度提高检测灵敏度。本发明提供的孔雀石绿检测方法，检测成本较低，灵敏度高。本发明提供的孔雀石绿检测产品，包括试剂盒或试纸，生产成本低，操作简便，可快速准确得到结果，可以有效性的实现现场检测。

Description

杂交瘤细胞株、抗孔雀石绿单克隆抗体和孔雀石绿检测方法 及应用和产品
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种杂交瘤细胞株、抗孔雀石绿单克隆抗体和孔雀石绿检测方法及应用和产品。
背景技术
孔雀石绿又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，属三苯甲烷类染料，曾被广泛用于预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿在水产品体内会产生高残留，人食用后易引起致癌、致畸和致突变等副作用。欧盟、美国以及部分东亚国家已经禁止孔雀石绿用作渔类的抗真菌药物，我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。但由于孔雀石绿价格低廉、防治鱼病效果好，同时又缺乏灵敏、便利的孔雀石绿检测手段，使得孔雀石绿在水产养殖、水产品运输及贮存过程中仍被广泛滥用，严重威胁人类健康，因此检测孔雀石绿残留具有十分重要的意义。
目前，孔雀石绿的检测方法主要有液/质联用分析法(LC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫学方法等。LC-MS和HPLC法具有准确、重复性好、适用于定量检测等优点，是检测孔雀石绿的最终鉴定方法，但由于其需要昂贵的设备，操作繁琐及专业的操作人员，难以满足基层进行现场快速筛查的要求。国外已有高灵敏、商品化的孔雀石绿ELISA检测试剂盒出售，如美国的Bio Scientific和Beacon公司，但总体价格昂贵，导致检测成本居高难下。所以现有技术中，缺乏效价高、特异性强的抗孔雀石绿的单克隆抗体，也缺乏快速、灵敏度高和特异性好的检测孔雀石绿的检测方法和产品。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种产生抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4，本发明的第二目的在于提供一种上述杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4分泌的抗孔雀石绿单克隆抗体，以缓解现有技术中缺乏效价高，特异性强，制备快速和成本较低的抗孔雀石绿单克隆抗体问题；
本发明的第三个目的在于提供一种孔雀石绿的检测方法，本发明的第四个目的在于提供上述杂交瘤细胞株或抗孔雀石绿单克隆抗体在检测孔雀石绿中的应用，本发明的第五个目的在于提供上述杂交瘤细胞株或抗孔雀石绿单克隆抗体在制备孔雀石绿检测产品中的应用，以缓解现有技术中孔雀石绿的检测方法复杂，检测成本高，不能生产生活用的问题；
本发明的第六个目的在于提供一种孔雀石绿检测产品，本发明的第七个目的在于提供一种孔雀石绿检测试剂盒，本发明的第八个目的在于提供一种孔雀石绿检测试纸，以缓解现有技术中相关检测产品生产成本高，应用范围较窄，不能大批量检测的问题；
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种产生抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株 HAmJ0416 Eo-A4，其保藏号为CGMCC No.14890。
本发明还提供了一种上述杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4分泌的抗孔雀石绿单克隆抗体，所述抗孔雀石绿单克隆抗体的亚型包括IgG1重链和 kappa轻链。
进一步地，所述抗孔雀石绿单克隆抗体经过标记物标记。
进一步地，所述标记物为生物素。
本发明还提供了一种孔雀石绿的检测方法，所述检测方法包括：用检测抗原包被酶标板，经过BSA封闭后加入不同浓度的上述抗孔雀石绿单克隆抗体与孔雀石绿标准品进行反应，最后加入终止液用酶标仪检测或进行显色反应检测得到结果。
本发明还提供了上述的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4或上述的抗孔雀石绿单克隆抗体在检测孔雀石绿中的应用。
本发明还提供了上述的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4或上述的抗孔雀石绿单克隆抗体在制备孔雀石绿检测产品中的应用。
进一步地，所述产品的形式包括试剂盒或试纸。
本发明还提供了一种孔雀石绿检测试剂盒，包括上述的抗孔雀石绿单克隆抗体。
本发明还提供了一种孔雀石绿检测试纸，包括上述的抗孔雀石绿单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的产生抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4，该杂交瘤细胞株可以分泌大量的抗孔雀石单克隆抗体，细胞稳定性和持续性好，分泌的单克隆抗体效价高，特异性好，可以用于相关技术领域；本发明提供的抗孔雀石绿单克隆抗体效价高，特异性好，结构稳定，成本较低，可以用于检测孔雀石绿等相关技术领域；本发明提供的孔雀石绿检测方法，检测成本较低，方法快速，检测结果准确，灵敏度高；本发明提供的孔雀石绿检测产品，包括试剂盒或试纸，生产成本低，操作简便，可快速、准确得到结果，不需要昂贵的仪器设备，可以有效性的实现现场检测，可应用于社会生产实践中。
附图说明
图1为本发明实施例1合成抗原的SDS-PAGE电泳图，其中M：蛋白分子量标准；1：BSA；2:孔雀石绿-BSA；
图2为本发明实施例8中间接竞争ELISA检测方法检测抗孔雀石绿单克隆抗体的标准曲线图；
图3为本发明实施例8中间接竞争ELISA检测方法检测生物素标记抗孔雀石绿单克隆抗体的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4，于2017年11月30日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.14890。该杂交瘤细胞株可以分泌大量的抗孔雀石单克隆抗体，细胞稳 定性和持续性好，分泌的单克隆抗体效价高，特异性好，可以用于相关技术领域。
本发明还提供了一种上述杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4分泌的抗孔雀石绿单克隆抗体，该抗孔雀石绿单克隆抗体的亚型包括IgG1重链和kappa 轻链。
本发明提供的抗孔雀石绿单克隆抗体效价高，特异性好，结构稳定，成本较低，可以用于检测孔雀石绿等相关技术领域。利用双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)对抗孔雀石绿单克隆抗体的亚型进一步鉴定，结果发现抗孔雀石绿单克隆抗体的亚型包括IgG1重链和kappa轻链。
在一个优选的实施方式中，抗孔雀石绿单克隆抗体经过标记物标记。根据标记物的种类不同，可以用不同的检测原理对所述抗体进行检测和监控，提高实验的灵敏度和准确度，扩大所述抗体的应用范围，标记物可以为放射性核素、荧光物质、酶和酶作用底物、化学发光剂、量子点或胶体金。
在一个优选地实施方式中，标记物为生物素。生物素(biotin，B)广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量 244.31Da。生物素分子有两个环状结构，其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物—活化生物素。活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质，核酸，多糖，脂类等。
本发明还提供了一种孔雀石绿的检测方法，检测包括：用检测抗原包被酶标板，经过BSA封闭后加入不同浓度的上述抗孔雀石绿单克隆抗体与孔雀石绿标准品进行反应，最后加入终止液用酶标仪检测或进行显色反应检测得到结果。本发明提供的孔雀石绿检测方法，检测成本较低，方法快速，检测结果准确，灵敏度高，特别是间接竞争ELISA检测方法可以准确、快速的检测孔雀石绿。
本发明还提供了上述的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4或上述的抗孔雀石绿单克隆抗体在检测孔雀石绿中的应用。
本发明还提供了上述的杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4或上述的抗孔雀石绿单克隆抗体在制备孔雀石绿检测产品中的应用。
在一个优选地实施方式中，产品的形式包括试剂盒或试纸。
本发明还提供了一种孔雀石绿检测试剂盒，包括上述的抗孔雀石绿单克隆抗体。
本发明还提供了一种孔雀石绿检测试纸，包括上述的抗孔雀石绿单克隆抗体。
本发明提供的孔雀石绿检测产品，包括试剂盒或试纸，生产成本低，操作简便，可快速、准确得到结果，不需要昂贵的仪器设备，可以有效性的实现现场检测，达到快速且灵敏地检测水产品和饲料等产品中的孔雀石绿药物残留的效果，可应用于社会生产实践中。
为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1免疫原及检测抗原的制备
孔雀石绿为小分子抗原，单独用于免疫不足以引起充分的免疫反应。 BSA(BovineSerum ALbumin)即牛血清白蛋白，是比较稳定的可溶性白蛋白，其分子量约67KDa，大约有30-35个主要氨基可用于与连接剂发生共轭反应，使其成为一种比较常用的弱抗原化合物载体蛋白。本研究将孔雀石绿与BSA偶联作为一个整体来激起免疫反应以及后期的检测抗原。
试剂：BSA，5mM的EDTA，Sulfo-SMCC，DMSO，1×PBS。
耗材：15mL进口离心管，1.5mL EP管，移液器吸头，透析袋。
设备：电子分析天平，移液枪，磁力搅拌器，4℃冰箱，-20℃冰箱，透析夹。
样品：孔雀石绿小分子。
抗原的制备：
步骤a)：将20mg BSA溶于2mL 5mM的EDTA水溶液中。
步骤b)：称取5mg Sulfo-SMCC完全溶于50μL DMSO中，之后加入150μL 1×PBS，混合均匀。
步骤c)：将Sulfo-SMCC溶液逐滴加入到BSA溶液中，边加边轻轻摇晃，室温放置1h。
步骤d)：将上述活化好的BSA溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2 L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h。
步骤e)：更换新的1×PBS透析2h，重复一次。将活化透析好的BSA 置于15mL进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存。
步骤f)：称取1mg孔雀石绿小分子，溶于50μL的DMSO中，再加 150μL的1×PBS，快速混匀，随后加入100μL上述活化好的BSA溶液，4℃冰箱过夜或室温下反应2h。
步骤g)：将上述交联好的BSA-孔雀石绿交联复合物于1.5mL EP管中，加1×PBS至1mL，标记好项目号、浓度和日期，待免疫、检测备用。
抗原的检测：将交联BSA的孔雀石绿、孔雀石绿小分子以及牛血清蛋白进行SDS-PAGE检测。结果：如图1所示，交联了BSA的孔雀石绿其分子量略高于未交联的牛血清蛋白。
实施例2小鼠免疫
用偶联BSA的孔雀石绿免疫8周龄BALB/c雌性小鼠：取抗原100μ g/只，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹部皮下多点注射入小鼠体内，注射量为0.2mL/只。间隔3周，取抗原50ug/只，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后第二次皮下多点注射入小鼠体内，注射量为0.2mL/只。之后每间隔2周，用与第二次等量的乳化抗原腹腔注射免疫小鼠。四次免疫过后，每只小鼠眼眶采血0.2mL用于检测免疫效价。将效价高和灵敏度高的小鼠用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
实施例3制备杂交瘤细胞株
取上述免疫合格的免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0,ATCC) 按7:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀后，1:500rpm/min 离心3min后去除培养基，将混匀后的细胞在37℃水浴中加入1mL PEG(分子量1500)融合剂，融合1min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后 1 500rpm/min离心3min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96 孔细胞板中，放置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
细胞培养箱中培养3天后，用HAT培养基换液一次，第7天用HT培养基加液，等到融合细胞覆盖孔底5％-20％时，以孔雀石绿-BSA为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获189个阳性孔。对189个孔进行特异性分析，筛选出12个呈特异性的细胞株，进行有限稀释法克隆，获得1株能较好的分泌抗孔雀石绿特异性单抗的杂交瘤细胞株HAmJ0416Eo-A4。经4个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
间接ELISA方法
试剂：GAM-HRP(华安生物:HA1006)、TMB底物(Sigma:T2885)、 Tris(上海生工：A501492)、甘氨酸(上海生工：GB0235)、BSA(上海生工：A500023-0100)、吐温-20(上海生工：A600560)NaHCO3(上海生工： A610482-0500)；Na2CO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4 2H2O、柠檬酸、丙三醇、DMSO、浓硫酸购自杭州双木化工；双氧水、EDTA购自上海生工，国产分析纯。
耗材：酶标板(杭州生友)。
设备：全自动洗板机(Rayto：RT-3900)、电热恒温培养箱(上海森信： DRP-9162型)、酶标仪器(Bio-Rad:Model 680)。
间接ELISA操作
步骤a)：包被：孔雀石绿-BSA用包被缓冲液稀释至1μg/mL，50μ l/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，4℃包被过夜。
步骤b)：封闭：甩干孔中液体，100μl/well的量往酶标板中加入1％ BSA，放入37℃电热恒温培养箱中恒温封闭1h。
步骤c)：加样：甩干孔中液体，将融合后的杂交瘤细胞上清50μl/well 的量加入到酶标板,以IV血清作为阳性对照。盖好盖子，放入37℃恒温培养箱孵育30min。
步骤d)：加入二抗：甩干一抗混合液，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液(1×TBST)，洗涤酶标板2次。1％BSA将GAM-HRP稀释至工作浓度(1:3000)，50μl/well的量加入到酶标板中，盖好盖子，放入 37℃恒温培养箱孵育30min。
步骤e)：显色、终止并读数：弃去孔中液体，按180μl/well的量往酶标板中加入洗涤液，洗涤酶标板3次；于各反应孔中加入100μl新配制的TMB显色底物，37℃恒温孵育5min；随后加入90μl/well的终止液终止反应，并在酶标仪上测定450nm处的OD值。
有限稀释法克隆
1)取出阳性孔内的细胞进行计数。
2)用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。
3)如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。
4)加入一定数量的饲养细胞，经过2～3天后，可观察到有集落生长的孔，并标记单克隆。7-10天左右可以检测。
5)根据检测的阳性结果再次进行克隆化。
实施例4抗孔雀石绿单克隆抗体亚型鉴定
将细胞上清与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG3、IgM抗体进行双抗夹心酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)，结果发现杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4分泌的抗孔雀石绿单抗抗体亚型为IgG1重链和kappa轻链。实验结果如下：
Figure BDA0001523186180000101
实施例5采集和纯化抗孔雀石绿单克隆抗体
8周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射0.3mL降植烷，7-10天后腹腔注入约1×106个杂交瘤细胞，7-10天后可见小鼠腹部明显膨大，用采血针头采集腹水，10 000rpm/min离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水，接着将收集的单克隆抗体腹水进行纯化，得到抗孔雀石绿单克隆抗体。
纯化方法：
试剂：1×PBS(pH7.4)、0.2M甘氨酸(pH 2.7)、1M碳酸氢钠、20％乙醇、1M NaCl。
耗材：1.5mL离心管、50mL离心管、50mL注射器、pH试纸(1-14)、封口膜、8000-14000Da透析袋(夹子)。
设备：双道微量注射泵、电脑核酸蛋白检测仪、4℃冰箱、核酸蛋白测定仪。
样品：待纯化腹水。
腹水纯化步骤：
步骤a)：将Protein G柱用20mL 1×PBS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗。
步骤b)：取待纯化的腹水6mL于6个1.5mL离心管(各1mL)中， 12000rpm，离心5min。取上清于50mL离心管中，用1×PBS稀释至15mL。
步骤c)：将稀释过的腹水样品以40mL/h流速上样，重复一次。
步骤d)用40mL 1×PBS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗柱子，连接蛋白检测仪，在电脑上开启图谱收集器，编辑收集样品的信息(项目号，克隆号)并开始。待图谱基线跑至平稳，将柱子转至装有甘氨酸溶液(pH 2.7,0.2M)的注射器上，以40mL/h的速度洗脱抗体，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。
步骤e)：在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至 7.5，并于纯化记录本上记录洗脱峰的最高峰值。
步骤f)：抗体收集完后，调节pH值至7.5，并于纯化记录本上记录洗脱的抗体体积，将收集到的抗体于2L 1×PBS中透析，透析好的抗体取到原50mL离心管中，在核酸蛋白测定仪上测定抗体的浓度，4℃冰箱保存。
实施例6抗孔雀石绿单克隆抗体效价的测定
以孔雀石绿-BSA为抗原，用间接ELISA方法检测单抗抗体的效价，阳性结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于 2.1为阳性，分析结果表明单抗抗体的效价达6.4ng/mL。实验基本信息和结果如下表。
Figure BDA0001523186180000111
Figure BDA0001523186180000121
实施例7生物素标记抗孔雀石单抗隆抗体的制备和效价的测定
纯化后的抗孔雀石绿单克隆抗体用0.1moL/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0) 稀释至1mg/mL，之后用0.1moL/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)对抗体充分透析，然后用NHSB进行生物素标记最后用PBS充分透析，除去游离的生物素。最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/L BSA，将结合产物置4℃，避光保存，置-20℃保存备用。
以孔雀石绿-BSA为抗原，用间接ELISA方法检测生物素标记抗孔雀石绿单抗隆抗体效价，阳性结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性，分析结果表明标记后的抗体效价达 1:312500倍稀释，当生物素标记抗孔雀石绿单抗隆抗体浓度为1mg/mL时，效价可达3.125×105。实验基本信息和结果如下表。
Figure BDA0001523186180000122
实施例8间接竞争ELISA检测方法的建立和分析
当检测抗原以1ug/ml的定量浓度包被时(50ul/well)，根据常规间接 ELISA试验确定纯化抗体以及生物素标记抗体的最适工作浓度(吸光度为介于1.0～1.2之间)，试验得出纯化抗体的最适检测浓度为16ng/ml；生物素标记的抗体按照1:20 000倍稀释使用为最适的工作浓度。实验基本信息和数据如下：
Figure BDA0001523186180000131
Figure BDA0001523186180000141
间接竞争ELISA的建立：将孔雀石绿-BSA作为检测抗原，4℃包被酶标板过夜(100ng/孔)。PBST洗涤后，采用1％BSA37℃封闭酶标板1h(200 μl/孔)。用0.01mol/L PBS将抗孔雀石绿单克隆抗体以及生物素标记抗孔雀石单克隆抗体按最适工作浓度进行稀释，然后与等体积倍比稀释的孔雀石绿标准品混合，室温静置10min；取100μl混合物加入酶标板，37℃反应 1h。带有生物素标记的标记组用PBST洗涤三次后，每孔加入100μl显色液，37℃避光反应5min，加入终止液，90μl/孔，酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度，判定结果；抗孔雀石绿单克隆抗体的实验组在PBST 洗涤后，再加入100μl/孔羊抗鼠-HRP溶液，37℃反应30min后再进行显色反应。实验基本信息和统计结果如下表所示，抗孔雀石绿单克隆抗体的标准曲线如图2所示，生物素标记抗孔雀石绿单克隆抗体的标准曲线如图3 所示。实验结果表明：直接以抗孔雀石绿单克隆抗体为核心建立的间接竞争ELISA其检测灵敏度达0.612ng/mL，而生物素标记抗孔雀石绿单克隆抗体的检测灵敏度可达0.358ng/mL。
Figure BDA0001523186180000151
以上实验结果可以得出，杂交瘤细胞株HAmJ0416 Eo-A4可以稳定并大量的分泌抗孔雀石绿单克隆抗体，纯化得到的抗孔雀石绿单克隆抗体效价可达6.4ng/mL，生物素标记过的抗孔雀石绿单克隆抗体效价可达3.125 ×105，本发明建立的间接竞争ELISA检测方法中利用抗孔雀石绿单克隆抗体的检测方法实验灵敏度可达0.612ng/mL，而利用生物素标记抗孔雀石绿单克隆抗体的检测灵敏度可达0.358ng/mL。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种产生抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株HAmJ0416Eo-A4，其特征在于，保藏号为CGMCC No.14890。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株HAmJ0416Eo-A4分泌的抗孔雀石绿单克隆抗体，其特征在于，所述抗孔雀石绿单克隆抗体的亚型包括IgG1重链和kappa轻链。
3.根据权利要求2所述的抗孔雀石绿单克隆抗体，其特征在于，所述抗孔雀石绿单克隆抗体经过标记物标记。
4.根据权利要求3所述的抗孔雀石绿单克隆抗体，其特征在于，所述标记物为生物素。
5.一种孔雀石绿的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：用检测抗原包被酶标板，经过BSA封闭后加入不同浓度的权利要求2-4任一项所述的抗孔雀石绿单克隆抗体与孔雀石绿标准品进行反应，最后加入终止液用酶标仪检测或进行显色反应检测得到结果。
6.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株HAmJ0416Eo-A4或权利要求2-4任一项所述的抗孔雀石绿单克隆抗体在检测孔雀石绿中的应用。
7.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株HAmJ0416Eo-A4或权利要求2-4任一项所述的抗孔雀石绿单克隆抗体在制备孔雀石绿检测产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品的形式包括试剂盒或试纸。
9.一种孔雀石绿检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2-4任一项所述的抗孔雀石绿单克隆抗体。
10.一种孔雀石绿检测试纸，其特征在于，包括权利要求2-4任一项所述的抗孔雀石绿单克隆抗体。
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