CN106199019B - 一种用于检测冠心病的基因芯片及其试剂盒 - Google Patents

一种用于检测冠心病的基因芯片及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测冠心病的基因芯片及其试剂盒，其含有适配子。所述试剂盒能够快速的检测人脂蛋白a，通过检测所述酶的量，可以用来鉴定样本是否为冠心病。本发明的试剂盒采用芯片的方式进行检测，芯片检测具有检测效率高，灵敏度好，应用范围广发的效果，可以大面积推广使用。

Description

一种用于检测冠心病的基因芯片及其试剂盒
技术领域
本发明涉及冠心病诊断分析检测产品，具体的说是基因检测芯片，更具体的说是适用于与冠心病检测的芯片及其试剂盒。
技术背景
随着经济和社会的发展，心血管疾病尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病；Coronary Artery Disease；CAD)的发病率正在逐年上升。对于发达国家，还有大多数的发展中国家来讲，CAD已经成为成年人发病和死亡的主要原因。近年来，对于CAD的流行趋势以及越来越严峻的不良预后的现状，各国卫生组织均给予了高度的关注。在中国，由于改革开放，物质生活条件的提高，人均寿命逐渐延长，相应的，心血管疾病尤其是冠心病的发病率逐年升高，有人预计，到本世纪的20年代，冠心病有可能会成为威胁人类健康的首位疾病。近年来对冠心病的诊断方法和治疗措施有了重大的突破，尤其是近年来抗血小板药物、抗凝药物、溶栓药物的更新换代，以及经皮冠状动脉介入治疗(PCI)措施的日益普及，使大多数的冠心病患者的临床结局发生了巨大改善。
大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。从基础到临床，人们对此进行了大量的研究，并在冠心病的危险因素和冠心病发生的病理生理学方面积累了大量的知识，但是关于冠心病与心肌梗死发生的确切遗传分子机制却知之甚少，对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定受试者的冠心病遗传易感性，一直缺乏全面系统有效的识别方法。
Yaling Han等人于2008年就发现MMP-I基因的-519A/G连锁不平衡-340C/T分析AT单倍型显著增加ACS风险，同时又发现CX37基因的C1019T C(CC/CT)型携带者是北方汉族人CAD的独立风险因子。随后Fang Pei等人于2009年发现IL-18基因的-607C/A位点可能为北方汉族人AMI的基因风险因子。Xiaolin Zhang等人于2010年发现IL-17A基因中rs8193037位点与CAD风险联系显著，G型(GG/GA)能增加AMI病人中的IL-17A基因表达。次年XiaolinZhang等人又发现IL-8基因-251A/T位点为汉族人ACS独立风险因子对冠心病有显著影响。而这些SNP位点的突变率在中国人群中分布均比较广，所以对这些易感基因位点进行基因检测对冠心病的早期预防具有很大的意义。但目前测定这些SNP位点的方法主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，测序，序列特异性引物PCR，荧光定量PCR等方法，不仅操作繁琐，检测周期长，通量小不能同时检测那么多SNP位点，波动大，而且影响检测结果的因素多，不易控制，难以满足临床检验的要求，使临床至今还无法开展有关冠心病易感基因的检测。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、CDNA克隆、PCR产物等)有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验。就可高通量获得所有待检基因的信息。Lp(a)是一种特殊脂蛋白颗粒，主要由LDL成分和载脂蛋白a组成。其颗粒大小与遗传因素有关，Lp(a)与溶解纤维蛋白的纤溶酶原具有同源性，干扰纤溶酶原在纤溶过程中的作用，参与动脉粥样硬化形成和发展的整个过程，是动脉粥样硬化和血栓形成的独立危险因素。动脉粥样硬化风险社区研究提示:高Lp(a)血症(Lp(a)≥0.3g/L)者患缺血性脑卒中的风险比低Lp(a)者(Lp(a)<0.lg/L)高79％。Barbara等对429名I型糖尿病病人进行长达6年的前瞻性研究，结果表明高Lp(a)血症(Lp(a)^0.3g/L)是冠心病的独立危险因素。高Lp(a)血症的糖尿病患者与血Lp(a)正常(Lp(a)<0.3g/L)的糖尿病患者相比，其患冠心病的风险是后者的2倍(HR＝2.23,95％Cl:1.28-3.87，P＝0.004)。
CN 104374927 B中公开了一种定量检测脂蛋白a的检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含Lp-a抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的Lp-a抗体采用荧光微球标记。但是该试剂盒需要使用Lp-a抗体，制备复杂，成本较高。而SELEX技术(系统进化指数富集技术)是90年代初研制的一种新的组合化学技术，其利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列一般长度在 左右，文库容量在1O15之间，由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA或DNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、小肽，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适配子具有许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b.具有比抗体更高的亲和性和特异性；c.便于标记，在不同部位有选择性的标记；d.稳定性好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子在临床检测及诊断中具有良好的应用前景。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种与脂蛋白a结合力更强、稳定性好、精确性高、重复性好的适配子。
本发明目的之二在于提供一种与人脂蛋白a具有特异性的适配子所构成的生物芯片。
本发明目的之三在于提供一种试剂盒，所述试剂盒其含有上述的检测芯片。
本发明目的是这样实现的：一种与人脂蛋白a具有特异性的适配子，其特征在于：他具有SEQ ID No.1-SEQ ID No.25的序列之一。
一种由与人脂蛋白a具有特异性的适配子构成的的生物芯片，包括玻璃基底(1)，玻璃基底(1)上依次附着有金膜(2)、连接层(3)和表面基质(4)，所述金膜(2)的流池包被有SEQ ID No.1-SEQ ID No.25序列的适配子。
上述金膜⑵在包被适配子前,先预处理，即在1.0mol/L NaOH中浸泡清洗20min，取出后用去离子水清洗3次,然后放入Piranha溶液中处理15min,取出后立即投入无水乙醇中浸泡5min,氮气吹干。
上述适配子包被在金膜(2)上之前，先预处理，即先将适配子溶解到PBS缓冲液，95℃变性3min,迅速冰浴2min,随后巯基法进行固定。
人脂蛋白a适配子经过以下方法制备筛选得到：
构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物：构建ssDNA文库，两端为固定序列，中间35个核苷酸为随机序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一个：5’-TTGACAGTGGGTACAAGTTT-N36-ACATGAAAGTGATGAGGCAT-3’。
上游引物为5，-TTGACAGTGGGTACAAGTTT-3’，下游引物为5’-ATGCCTCATCACTTTCATGT-3’。下游引物序列5’端需用生物素标记。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。
双链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增及回收；
单链DNA文库的PCR扩增及回收；
采用SELEX筛选，将纯化后的目的基因PCR产物与克隆载体pMD18-Tsimplevector连接，测序。
适配子包被生物芯片
我们在表面基质上包被亲和性最强的适配子，然后结合SPR生物传感器进行检测。
有益效果：本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒能够快速的检测人脂蛋白a，通过检测所述酶的量，可以用来鉴定样本是否为冠心病。本发明的试剂盒采用芯片的方式进行检测，芯片检测具有检测效率高，灵敏度好，应用范围广发的效果，可以大面积推广使用。
具体实施方式：
实施例1适配子的获得
脂蛋白a(Lpa)重组蛋白，为市场上购买获得；货号：YB842Hu01，商家：上海钰博生物科技有限公司。
构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物：构建ssDNA文库，两端为固定序列，中间35个核苷酸为随机序列，其中N代表A，T，C，G中的任意一个：5’-TTGACAGTGGGTACAAGTTT-N36-ACATGAAAGTGATGAGGCAT-3’。
上游引物为5，-TTGACAGTGGGTACAAGTTT-3’，下游引物为5’-ATGCCTCATCACTTTCATGT-3’。下游引物序列5’端需用生物素标记。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。
(1)利用引物1、引物2扩增单链DNA文库：采用不对称PCR，引物1/引物2浓度比100：1，扩增条件为：94℃预变性:3min，然后94℃变性35s，65℃退火50s，72℃延伸lmin，循环33次，最后72℃延伸10min。将获得的产物(主要为ssDNA)于95℃作用3min，于冰中2min，室温放置l0min，即为ssDNA文库。
(2)反筛与筛选
1OOpmol随机ssDNA文库和5nmol(tRNA+鲑鱼精DNA)加入10μl BSA反筛，在100μ1结合缓冲液中室温孵育1h；然后转移液体，与人脂蛋白a 25℃结合l.5h，用冲洗缓冲液洗8次，洗去未结合的ssDNA，再加洗脱缓冲液于80℃作用lOmin，洗脱下与人脂蛋白a结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。将ssDNA溶解于20μ1TE缓冲液中，用作扩增的模板，进行下一轮筛选，重复筛选18轮。
(3)测定亲和性
将第18轮得到的ssDNA文库经过不对称PCR扩增获得生物素标记的ssDNA文库，将纯化获得的人脂蛋白a蛋白用碳酸盐(pH9.6)缓冲液稀释至10μg/ml包被酶联板，4℃过夜，PBST(PBS+Tween)洗涤3次，3min/次；3％BSA 37℃封闭1小时，PBST洗涤3次,3min/次；用SELEX binding buffer稀释的第18轮生物素标记的ssDNA 0.05μg/孔，同时加入不同浓度梯度的人脂蛋白a蛋白，37℃温育60min，PBST洗涤4次，3min/次；1：2000稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶37℃孵育30min，PBST洗涤4次，3min/次；加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37℃显色15min；2mol/L浓硫酸终止反应，酶标仪于450nm处测定A值。A值为0.160.回收产物连接，20轮后，将筛选产物连接到PMD18-T simplevector(TaKaRa公司)。参考TaKaRa公司pMD18_Tsimple vector的产品说明，将纯化后的目的基因PCR产物与克隆载体pMD18-Tsimplevector连接，目的基因片段与载体片段反应体系如下：
pMD18-T/PCR产物/连接缓冲液：1μl/9μ1/10μl 16℃连接过夜，连接产物的转化：
A、将目的基因片段与pMD18-T simple vector的连接产物20μl加入含有100μI的E.coli DH5a感受态细胞的EP管中，冰浴30min
B、放入42℃水浴热休克lmin，快速将管取出冰浴2min
C、每管加SOC培养液600μl，37℃摇床，150rpm，培养60min，使细菌复苏并表达质
粒编码的抗生素性标记基因。
D、将适当体积已转化的感受态细胞涂布于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。
E、倒置平板，于37℃恒温培养，12-16小时后出现菌落，随机挑取几个菌落PCR鉴定。
F、随机挑取110个单克隆加入盛有600μl LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的1.5ml EP管中，37℃摇床，200rpm，培养过夜。次日加入600μl(等量)80％高压灭菌甘油，密封管口，于-70摄氏度保存菌种。
重组质粒的提取，采用质粒提取试剂盒快速提取。
PCR鉴定：
以提取质粒为模板，加入引物1与引物2进行PCR扩增反应，产物电泳。
适体亲和性检测
将挑取的单个克隆经过不对称PCR扩增后得到ssDNA，将此ssDNA与包被好的1μg/孔蛋白结合，酶联法测定其亲和性。
亲和性如下表所示。
测序
挑取单克隆送测序公司测序
所述适配子的序列如SEQ ID NO：1-25所示。
采用本领域常用的Kd测量方法，测得本申请25个序列的Kd解离常数如下：
实施例3适配子包被生物芯片
我们在表面基质上包被亲和性最强的适配子SEQ ID NO：1-25，然后结合SPR生物传感器进行检测，具体方法如下：
生物芯片表面预处理将表面基质镀有链霉亲和素的金膜电极的生物芯片放入1.0mol/LNaOH中浸泡清洗20min，取出后用去离子水清洗3次，然后将生物芯片放入Piranha溶液中处理15min,取出后立即将其投入无水乙醇中浸泡5min,氮气吹干备用。
适配子预处理：PBS缓冲液溶解，95℃变性3min，迅速冰浴2min，随后巯基法进行固定。
巯基法探针固定：经过变性处理的生物素化的适配子覆盖经预处理的芯片表面基质，使适配子牢固的固定在生物芯片上，适配子采用最佳浓度1.0umol/L,2h后PBS缓冲液清洗3次，0.02％BSA封闭约lh，PBS缓冲液清洗。
生物芯片制作完成后，再将包被好适配子的生物芯片载入SPR传感器中，通入过量的蛋白，使其与芯片上的适配子进行反应，最后记录实验结果如下：
根据检测结果，我们可以得出流池1(阴性对照)的角度差为-5.3，流池2-26(检测流池)的角度差依次为：330.5、335.6、336.0、335.8、335.9、336.1、335.4、336.2、336.1、335.8、335.7、335.6、336.0、335.4、336.4、335.0、335.8、335.7、335.3、336.2、336.1、335.9、336.0、336.7、335.8。两者间有显著差异(P<O.01)。说明通过SPR生物传感器能够对人人脂蛋白a进行定量的分析。
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析
分别采用人载脂蛋白ApoA I、人载脂蛋白B、BSA、人血清淀粉样蛋白A1、人血清白蛋白，与25条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与人甘油三磷酸脱氢酶结合保持结合活性。
将所述的适配子，取0.5ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置8周。通过RT-PCR检测，发现8周的放置其结构稳定，没有被降解。说明适配子具有较强的稳定性。
序列表
〈110〉朱继平
〈120〉一种用于检测冠心病的基因芯片及其试剂盒
〈160〉25
〈210〉1
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
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〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉Lp-a-24
TTGACAGTGGGTACAAGTTTTCCTATTACTTTTCTACCAACTCCTTTTCCTTCTTACATGAAAGTGATGAGGCAT
〈210〉25
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉Lp-a-25
TTGACAGTGGGTACAAGTTTTATCCACTCTCTCAACTCTAACTACAACTCCTCTCACATGAAAGTGATGAGGCAT

Claims (3)

1.一种基因芯片，其含有适配子，所述适配子序列为SEQ ID No.1-SEQ ID No.25的序列之一。
2.一种试剂盒，其中含有权利要求1所述的基因芯片。
3.根据权利要求1所述基因芯片或权利要求2所述的试剂盒用于制备冠心病诊断试剂中的应用。
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