KR20140054905A - 당화혈색소에 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물 - Google Patents

당화혈색소에 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당화혈색소에 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당화혈색소에 특이적 앱타머, 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물, 당뇨 진단용 조성물, 고정화된 고상 담체 및 당화혈색소의 검출방법에 관한 것이다.

Description

당화혈색소에 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물{HbA1c-specific aptamer and composition for detecting of HbA1c comprising thereof}
본 발명은 당화혈색소에 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병은 체 내에 흡수된 포도당이 제대로 이용되지 못하거나 인슐린의 분비량이 부족하여 정상적인 기능을 하지 않는 경우 발생하는 대사질환의 일종으로 당뇨병 발생 시 체내 고혈당 상태가 유지되어 망막병증, 신기능장애, 신경병증 등의 합병증 유발할 뿐만 아니라 고혈압, 허혈성 심장질환, 관상동맥 질환 등의 심혈관계 질환의 합병증을 동반하여 인간의 생명을 치명적으로 위협하는 만성질환이다.
당뇨병은 인슐린 생산능력 감소로 발병하는 1형 인슐린 의존성 당뇨병(Insulin dependent diabetes mellitus, IDDM), 인슐린에 대한 체 내 저항성 및 부적절한 인슐린 분비로 발병하는 2형 인슐린 비의존성 당뇨병(Non insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM), 임신 중일 때만 나타나는 임신성 당뇨병, 합병증에 의해 발생하는 당뇨병으로 구분되지만, 종류와 상관없이 완치가 어려운 진행성 질환으로 지속적인 치료와 관찰이 요구되는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 전 세계적으로 만성질환인 당뇨병의 위험성이 부각되면서 국가적 차원에서의 관리가 이루어지고 있으며, 우리나라도 국민 건강검진 검사에 당뇨병 검사 항목을 포함하여 위험인자 또는 질병을 조기에 발견하여 관리하도록 노력하고 있으나 검사 방법이나 시약이 달라 검사 결과의 정확도가 현저히 떨어지고 있는 실정이다.
사람의 적혈구(Red blood cell)내에는 혈색소(Hemoglobin)라 불리 우는 산소 운반 단백질이 들어있다. 혈액 속에 혈당, 즉 포도당이 상승하면 혈액 내 포도당의 일부가 혈색소에 결합된다. 이렇게 포도당과 결합된 혈색소를 당화혈색소(Glycated hemoglobin)라고 하며, 헤모글로빈 에이원씨(HbA1c)라고도 부른다. 적혈구는 약 120일이라는 일정기간이 지나면 새로운 적혈구로 바뀌기 때문에 당화혈색소는 대체로 2 내지 3개월 동안의 장기적인 혈당치를 나타내게 된다. 이와 같은 특성을 지닌 당화혈색소는 매일 매일 혈액 내 포도당의 양을 측정하는 혈당검사와 비교하여 평균 약 8주간의 혈당치를 반영한다.
따라서 당화혈색소검사는 오래전부터 당뇨병 환자의 혈당관리가 제대로 되고 있는지를 확인 하는데 주로 이용되어 왔다.
종래 알려진 당화혈색소의 측정법으로는 이온교환수지를 이용한 미니컬럼법(Minicolumn), 전기영동법(Electrophoresis), 면역측정법, 고속액체크로마토그래피법(High-performance liquid chromatography, HPLC) 등이 있다.
그러나, 상기 방법들은 기술적으로 복잡할 뿐만 아니라 고가의 분석장비를 요구하며 측정 속도가 느린 단점을 지니고 있다. 또한 당화혈색소 측정을 위해 사용되는 특수한 시약의 대부분은 고가의 수입품을 이용하고 있으며 측정 시약 전용기기의 구매가 요구되기 때문에 막대한 경제적으로 막대한 지출이 요구되고 있는 실정이다. 따라서 효율적으로 당화혈색소를 측정 할 수 있는 고효율 고민감도 검출 시스템 개발이 요구되며, 고성능 당화혈색소 검출 시스템 개발을 위해서는 무엇보다도 당화혈색소를 검출하기 위한 특이적인 물질 발굴 및 기능 분석 연구가 절실히 필요한 실정이다.
한편, 앱타머(Aptamer)는 목적하는 타겟에 대한 높은 친화력과 특이성을 가지고 결합하는 고유한 3차원 입체 구조를 갖는 단일 가닥(single strand) 핵산이다. 앱타머는 단백질 뿐 아니라 유기분자, 무기분자, 탄수화물, 세포 등에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다.
상기 앱타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)으로 알려진 in vitro 선별 과정에 의해 랜덤 시퀀스(randomized sequence) 조합 라이브러리(combinatorial library)에서 선별될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 당화혈색소에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머를 합성 및 선별하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2002-0066792 A 2002년 08월 21일
본 발명의 목적은 당화혈색소(HbA1c)에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머(Aptamer)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 당화혈색소 특이적 앱타머를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 당화혈색소 특이적 앱타머를 포함하는 당뇨 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 당화혈색소에 특이적 앱타머(Aptamer)가 고정화된 고상 담체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 당화혈색소의 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 당화혈색소(HbA1c)에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머(Aptamer)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 상기 당화혈색소 특이적 앱타머를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 상기 당화혈색소 특이적 앱타머를 포함하는 당뇨 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 상기 당화혈색소에 특이적 앱타머(Aptamer)가 고정화된 고상 담체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 당화혈색소의 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 '앱타머(Aaptamer)'란, 인공적으로 합성할 수 있는 특정 분자 인식 물질인 짧은 단일가닥의 올리고뉴클레오티드를 말한다. 앱타머는 단일 염기서열인 DNA나 RNA로 이루어져 있으며, 염기 서열이 만들 수 있는 특이적이 3차원적 구조에 의해 다양한 표적 물질에 대한 특별한 친화력과 특이성을 가진다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
본 발명에서 '앱타머'는 'DNA 앱타머' 또는 'DNA 올리고뉴클레오티드'와 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 10 내지 약 150 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 50 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, post-SELEX 과정을 통해 보다 효율적인 25 내지 35 뉴클레오티드 크기로 modification 되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 '당화혈색소(HbA1c)' 란 포도당과 결합된 혈색소를 의미한다.
본 발명에서 '당화혈색소에 대한 특이적 결합 활성' 이란 상기 정의된 당화혈색소에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 당화혈색소(HbA1c)에 대해 새로운 앱타머를 개발하기 위해 노력한 결과, SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술을 이용하여 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 당화혈색소에 대한 특이적 결합 활성을 보이는 DNA 앱타머를 선별하였고, 상기 DNA 앱타머들의 서열 및 구조를 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)는 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것으로, 상기 서열번호 1 내지 20의 염기서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 바람직하게는 90%의 상동성, 더욱 바람직하게는 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 당화혈색소에 특이적 앱타머에 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 앱타머(Aptamer)는 전형적으로 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타켓 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드, 유기분자, 폴리펩티드, 아미노산, 세표 표면상의 바이오 마커분자, 금속, 각종 이온, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합 할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990).
본 발명에서 'SELEX 방법'이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 물질에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 물질의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566).
본 발명의 일 실시예에 따른 앱타머(Aptamer)는 하기 단계를 통해 선별 될 수 있다.
(1) 단계로, 앱타머 풀(pool)의 준비를 위한 PCR 수행 시, 역방향 프라이머에 바이오틴(Biotin)을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 ssDNA 앱타머만을 선별할 수 있다. 특히 상기 과정의 PCR를 통해 증폭된 앱타머 풀에 가열-냉각 기법 처리를 통해 dsDNA를 ssDNA로 변성(Denaturation)함으로써 ssDNA 확보의 효율성을 높였다. 이를 통해 제조한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성 시킨다.
(2) 단계로, 당화혈색소(HbA1c) 특이적 DNA 앱타머 발굴을 위한 SELEX를 진행하기 위해 표적물질인 당화혈색소를 담체에 고정화 시키는 단계가 요구된다. 따라서 라텍스(Latex) 입자에 당화혈색소(HbA1c)를 결합시키는 실험을 수행한다.
(3) 단계로, 상기 준비한 라텍스 입자에 고정화된 당화혈색소와 ssDNA 앱타머를 서로 접촉하여 반응시킨 후, 결합하지 않은 ssDNA 앱타머를 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA만을 용출시킨다. 이 단계에서 앱타머 특이적 향상을 위해 당화혈색소 자체가 아닌 라텍스 입자와 결합하는 ssDNA를 제거하는 Negative SELEX 단계를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 방법에서는 당화혈색소와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 최대로 용출되는 최적의 SELEX 라운드를 선택하기 위해 용출된 ssDNA를 나노 드롭 방법으로 정량하는 방법을 사용 할 수 있다.
상기 본 발명의 방법에서 최적 SELEX 라운드 중 당화혈색소와 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여, 최적 SELEX 라운드 선별과 마찬가지로 최적 라운드에서 확보한 앱타머 서열 각각을 모두 확보하여 동일한 농도의 ssDNA로 제작 후 SELEX를 진행한 뒤 나노 드롭(Nano-drop)을 이용하여 용리된 앱타머 농도를 측정함으로써 최적 당화혈색소 특이적 DNA 앱타머를 선별하였다.
상기 선별된 당화혈색소 특이적 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 20에 나타낸 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 내지 20의 앱타머 중 가장 특이성이 높았던 상위 6개의 서열번호 4, 6, 11, 12, 14, 16의 2차 구조는 도 4에 도시화된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 '검출'은 앱타머를 이용하여 앱타머에 결합된 당화혈색소를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 포함하는 당뇨 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 앱타머는 생체 또는 생물학적 시료에서 당화혈색소의 존재 여부를 확인하여 당화혈색소에 관련된 질환의 진단에 유용할 수 있다.
본 명세서에서 '진단' 이란 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적상, 진단은 당뇨병의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.
본 발명에 따른 앱타머는 표적에 대한 특이성이 뛰어나고 결합력이 높으므로 이를 활용하여 대상 시료의 당뇨병 발명 유무를 진단할 할 수 있다. 본 발명의 진단용 조성물에는 앱타머의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)가 고정화된 고상 담체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 고상 담체는 예컨대 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼, 다공질재를 들 수 있다. 기판은 DNA 칩이나 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다.
상기 수지로서는, 예컨대 아가로스(agarose) 입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스(Sepharose), 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지도 포함된다.
본 발명의 고상 담체는, 예컨대 당화혈색소(HbA1c)의 검출, 정량에 유용할 수 있다.
본 발명의 앱타머는, 자체 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이나 소정의 관능기를 본 발명의 앱타머에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 상기 소정의 관능기는, 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 관능기가 도입된 앱타머를 포함할 수 있다.
본 발명의 고상 담체는, 예컨대 당뇨 진단에 유용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고상 담체는 당화혈색소에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 칩 상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 형태 일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판 상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘(Streptavidin)으로 개질하고, DNA 앱타머의 5’말단은 바이오티닐화(Biotinylation)시킨 후, DNA 앱타머의 바이오틴과 지지체의 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예로, 본 발명의 앱타머는 당화혈색소에 특이적으로 결합하므로 혈액 시료를 대상으로 한 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료의 당화혈색소(HbA1c) 존재 여부를 검출하는 방법으로서,
(a) 당화혈색소(HbA1c)를 포함하는 생물학적 시료와 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 당화혈색소(HbA1c)를 확인하는 단계;
를 포함하는 당화혈색소의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 시료는 당화혈색소의 존재 여부는 또는 발현이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 혈액을 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 당화혈색소와 결합하는 능력이 매우 뛰어나므로 앱타머와 당화혈색소를 함유할 것으로 예상되는 혈액 시료를 접촉시켜 당화혈색소를 검출할 수 있다. 상기 앱타머에 결합된 당화혈색소의 검출은 앱타머와 당화혈색소 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초할 수 있다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(Fluorescein), Cy3 또는 Cy5, 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 바이오틴(Biotin)으로 표지되거나 1차 아민(Primary amine)으로 변형된 뉴클레오티드를 포함 할 수 있다.
상기 검출방법을 통하여, 당뇨 의심 환자의 당화혈색소의 유무를 확인함으로써 실제 당뇨 발생 여부 또는 당뇨 치료 환자의 예후를 미리 예측할 수 있으며, 이러한 예측을 바탕으로 환자의 예후 치료에 활용할 수 있다.
본 발명의 당화혈색소(HbA1c)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 당화혈색소에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 이를 이용한 조성물 및 키트 등을 이용하여 당뇨 환자의 혈액 내 당화혈색소를 검출하여 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 유용한 정보를 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA와 열-냉각기법과 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과를 나타낸 것이고,
(레인 M: 100bp DNA size 마커; 레인 1: PCR 기법을 이용하여 증폭된 dsDNA; 레인 2: 열-냉각기법과 스트렙트아비딘 아가로스 레진 처리 후 회수된 ssDNA)
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 당화혈색소(HbA1c) 결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정 중 각 라운드에서 회수된 당화혈색소 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노 드롭을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 당화혈색소(HbA1c)결합 DNA 앱타머를 스트렙트아비딘이 코팅된 Sensor chip SA의 표면에 고정시킨 후, 당화혈색소를 결합시키는 과정을 나타낸 도면이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 당화혈색소(HbA1c) 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서, 최종적으로 선별된 6개의 당화혈색소 결합 DNA 앱타머 후보군 HbA1c-4, HbA1c-6, HbA1c-11, HbA1c-12, HbA1c-14, 및 HbA1c-16의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예 및 시험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] DNA 앱타머 풀의 준비
(1) 프라이머 및 DNA 앱타머 풀의 합성
당화혈색소(HbA1c)에 특이적으로 결합하는 HbA1c 특이적 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 40개의 연속 랜덤 뉴클레오타이드를 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1의 비율로 가지는 서열을 포함하는 76 bp의 주형 DNA(서열번호 21: 5’-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3’)와 이를 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 바이오니아(Bioneer, Korea)에 주문 제작하였다.
상기에서 N40은 40개의 뉴클레오티드를 가지는 랜덤 시퀀스이다.
상기 프라이머는 정방향 프라이머(서열번호 22): 5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’, 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머(서열번호 23): 5’-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3’).
(2) PCR 기법을 활용한 DNA 앱타머 풀의 증폭
합성한 프라이머 및 40개의 연속 랜덤 서열을 가지는 임의의 DNA 라이브러리를 PCR(Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. 76 bp의 DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 5 ㎕ , 각 2.5 mM dNTP mixture 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 라이브러리 1 - 2 ㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.3 ㎕(1 unit/㎕)와 증류수 34.7 35.7 ㎕로 구성하였다.
PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 3 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 젤을 이용하여 정확한 크기인 76 bp에서 밴드가 나타나는지 확인하였다. 상기 밴드가 확인된 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 DNA 앱타머 풀을 회수하였다.
(3) 가열-냉각기법을 활용한 ssDNA 제작
상기 (2)의 PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 풀 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성(Denaturation)하였다.
실험 방법을 구체적으로 표현하자면 상기 (2)에서 획득한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각시켜 ssDNA를 제작하였다.
(4) ssDNA의 선별 및 회수
가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 바이오틴이 결합되어 있는 ssDNA와 프라이머를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 (3)에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙트아비딘 아가로스 레진(Streptavidin agarose resin) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI(Phenol : chloroform : isoamyalcohol = 25 : 24 : 1)용액을 처리한 후 4℃, 13,000 rpm 조건으로 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다.
상기 회수된 상층액의 1/100 부피의 tRNA(Sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(Sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 ­70℃의 초저온 냉동고(Deep freezer)에 1시간 이상 반응하였다.
그 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 20분간 수행하여 ssDNA를 침전시키고 상층을 제거한 후에 85℃ Heat block에서 건조시킨 후 증류수 50 ㎕에 녹였다. 회수한 DNA 중 3 ㎕를 취하여 2% 아가로스 젤을 이용하여 밴드가 나타나는지 확인하였다.
그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 정확한 크기의 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] SELEX 기법을 이용한 당화혈색소(HbA1c)와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
(1) SELEX 에 이용되는 각 용액의 조성
당화혈색소(HbA1c)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위해 사용한 용액의 이름과 조성은 다음과 같다. 즉, 1X 앱타머 선별 용액: 1X PBS(pH 7.2), 2X 앱타머 선별 용액: 2X PBS(pH 7.2), DNA 앱타머 용출 용액: 1X PBS(pH 7.2).
(2) SELEX 에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작
상기 실시예 1에서 설명된 방법을 통해 제작 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성 시킨 후, 상온에서 서서히 2시간 동안 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 유도하였다.
(3) 당화혈색소 ( HbA1c ) 특이적 DNA 앱타머 선별을 위한 HbA1c 결합 라텍스( Latex ) 입자 제작 및 SELEX 방법을 이용한 당화혈색소 결합 DNA 앱타머의 선별
HbA1c 결합 라텍스 입자를 제작하기 위해 먼저, 약 200 nm 크기의 라텍스 입자 50 ㎕에 1X PBS buffer 150 ㎕를 첨가 후 와류교반(vortexing)하였다. 그 후 원심분리를 통하여 1X PBS buffer를 제거하였다. 상기의 과정을 2회 수행 후, 준비된 라텍스 입자에 1X PBS buffer로 희석한 0.2 mg/㎕의 HbA1c 200 ㎕를 첨가하여, 4℃에서 1시간 이상 반응시켜 라텍스 입자와 HbA1c와의 결합을 유도 하였다.
그 후, 원심분리를 통해 라텍스 입자와 결합하지 않은 잔여 HbA1c를 제거하고 200 ㎕의 1X PBS를 사용하여 라텍스 입자를 3회 세척하여 HbA1c 결합 라텍스 입자를 제작하였다.
상기 제작된 HbA1c 결합 라텍스 입자에 상온에서 식혀 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 200 ㎕를 넣고, 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 이후 HbA1c에 특이적으로 결합하지 않는 ssDNA 앱타머 풀을 제거하기 위해, 200 ㎕의 1X 앱타머 선별 용액를 첨가하여 파이펫팅한 후에 원심분리(4℃, 13,000 rpm)를 15분간 수행하여 HbA1c 결합 라텍스 입자를 침전시키고 상층액을 제거하였다.
상기의 과정을 3회 반복하여 HbA1c에 비특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머 풀을 제거하였다. 이 후에 침전물에 DNA 앱타머 용출 용액 200 ㎕를 첨가하였다. 그 후, 85℃로 예열된 Heat block에 5분간 반응시킨 후 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행하여 HbA1c 결합 라텍스 입자를 침전시키고, HbA1c 특이적 DNA 앱타머가 용리되었을 상층은 새 튜브에 옮겨 HbA1c에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군을 회수하였다.
상기 회수된 용액 내 존재하는 DNA 앱타머를 제외한 잔여 HbA1c를 제거하기 위하여, 용출용액에 동일한 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(pH 4.5)와 3배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰고, 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 이를 통하여 HbA1c와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수 할 수 있었으며, 회수된 DNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50℃의 증류수에 녹였다.
(4) 네가티브 선별( Negative SELEX )을 통한 비특이적 DNA 앱타머 제거
HbA1c가 아닌 라텍스 입자와 결합한 DNA 앱타머를 제거하기 위하여, SELEX 6회와 7회 사이에 HbA1c가 고정되어있지 않은 라텍스 입자를 대상으로 Negative SELEX(NS)를 수행하였다. 1X 앱타머 선별 용액을 이용하여 라텍스 입자를 3회 세척 후, 구조를 형성 시킨 ssDNA를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
그 후 라텍스 입자에 결합하지 않고 용출되어 나온 ssDNA 용액을 7회 SELEX에 이용하였다. HbA1c 특이적 DNA 앱타머 발굴을 위한 SELEX는 총 10회까지 진행하였으며, SELEX 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 양과 반응시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 HbA1c와 더욱더 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 수득하고자 하였다.
[ 실시예 3] 당화혈색소 ( HbA1c )와 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 라운드 선별
(1) 나노 드롭( Nano drop )을 이용한 각 라운드의 친화성 확인
SELEX를 10회 까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 HbA1c와의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여, 각 라운드에서 용리된 ssDNA 농도를 나노 드롭을 이용하여 측정하였다.
나노 드롭을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정하였다. 그 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, 네카티브 선별 이후에 8 라운드의 농도가 643.8 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드와 10 라운드의 농도는 각각 490.7 ng/㎕와 353.4 ng/㎕로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인 할 수 있었다.
상기 결과를 통해 네가티브 선별 이후, 당화혈색소(HbA1c)와 가장 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 풀은 8 라운드 풀임을 확인 할 수 있었다.
(2) 실시간( Real time ) PCR 기법을 이용한 최적 라운드 확인
SELEX를 10회 까지 마친 후, SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행 하였다. 초기 앱타머 풀과 네가티브 선별 이후인 7 라운드, 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각가의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 가열-냉각기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 0, 7, 8, 9, 10 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀을 동일한 농도로 준비하여 상기 실시예 2의 (3)과 동일한 방법으로 처리하여 표적물질 당화혈색소(HbA1c)와 결합 후 회수된 ssDNA을 확보하였다.
상기 획득된 각 ssDNA들은 각각 100, 10-1, 10-2로 희석하여 실시간 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 94℃에서 5분 변성 이후, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 30주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장 시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다.
그 결과 하기 표 1에서도 확인할 수 있듯이, 실시간 PCR의 C(t) 값은 각 라운드별로 각각 6.63, 4.82, 9.15, 9.98인 것을 확인할 수 있었고, 이는 나노 드롭을 이용하여 확인한 각 라운드에서 회수된 앱타머 농도 측정 결과와도 일치하는 것으로 확인할 수 있었다. 또한, 나노 드롭 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 8 라운드의 앱타머 풀이 당화혈색소(HbA1c)와 결합 효율이 가장 높은 것을 확인 할 수 있었다.
7R (1×10-2) 8R (1×10-2) 9R (1×10-2) 10R (1×10-2)
Efficiency(%) 60.27 58.86 52.39 46.45
C(t) 6.63 4.82 9.15 9.98
[ 실시예 4] 당화혈색소 ( HbA1c )와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 확보
상기 실시예 3의 결과에서, 나노 도롭과 실시간 PCR을 통하여 당화혈색소(HbA1c)와 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단되는 8 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머(서열번호 24): 5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’와 역방향 프라이머(서열번호 25):5’-AGATTGCACTTACTATCT-3’를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다.
상기 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터(10 ng/㎕) 1 ㎕와 PCR 산물(20 ng/㎕) 4 ㎕, 6X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열 충격(heat shock)을 가한 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 여기에 900 ㎕의 SOC (2 트립톤, 0.5 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코오스) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal(50 ㎍/ml), IPTG(5 ㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 52개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 결정하였으며(Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 중복되지 않는 당화혈색소(HbA1c)결합 DNA 앱타머 20개를 확보할 수 있었다.
하기 표 2는 당화혈색소(HbA1c) 결합 DNA 앱타머 선별 SELEX 기법을 이용하여 획득한 HbA1c 결합 DNA 앱타머 후보군 20개에 대한 서열을 구체적으로 나타낸 것이다.
클론명칭 서열번호 선별된 서열 서열크기
(bp)
HbA1c-1 1 ATCCGGCTGGCCTCTTTCAGTTAAGTTTCCCTAGCTGTTA 40
HbA1c-2 2 GTGGTTACAATATGGGCCTATTACAGCCTGTGTGTGTTCG 40
HbA1c-3 3 CGGCACTGGGAAATACTTACATGAGCGCTATCTAAAGTC 39
HbA1c-4 4 CATGGCCAGGTTGATCGGTGCTAATGTGTCCGTAACCGAG 40
HbA1c-5 5 CGCGCCAGTTGTCAGTCGGGGTTTATACCGTACCGATTAG 40
HbA1c-6 6 TCAAACCAAAATGCGCTCAGTGCCACATGTCAGGCTATTA 40
HbA1c-7 7 GCGAGAATGGGGCAGTCTACTCGCTCCCAAGGAGCACCTT 40
HbA1c-8 8 CGTGCGGTGATCTCGGTTTTTGGCTTGTGTATTTCGTGCT 40
HbA1c-9 9 TCAGAGACCGGAGGCCATTCTTAGTGGAGGAGTTGCGTTT 40
HbA1c-10 10 CGGTATAAGTTCCTGAAACGAGTTACATATAGAAGACACA 40
HbA1c-11 11 CGCGTAGACGTGGACATCGCCATACGTTTACTGTTGCGGA 40
HbA1c-12 12 GTCGCGGGACAACGTAACATTTAACTGTGCTCGCAGGACC 40
HbA1c-13 13 AGGTAAATGGTCGAGTTACGTCCTCTTCAATAAGAACTAT 40
HbA1c-14 14 GTACCAGGTGAGGGCTGTACATTACTCATGACTTGTATCC 40
HbA1c-15 15 CGCAAGCACGTGTACATGTTGGACCTTCTTTCTTGTGGT 39
HbA1c-16 16 CGTTGCGACCAGGGCATGGCTCAGCAGATACTCTCAGTTG 40
HbA1c-17 17 GCTGAAGAGCGGCCAAAGGCGGGCCTTTTCTCTTTGACA 39
HbA1c-18 18 GCAAAACGTTACCAGGGCAGACGGAGGTCTAGCTAATACG 40
HbA1c-19 19 CAAATCGACCGTCGTTCGAGAAACCGGTTTCCTGAGTCCT 40
HbA1c-20 20 CCATGCCGCACCCGTTTCTCAGGAATATGATTGGTAATTA 40
[ 실시예 5] 농도 측정 기반의 당화혈색소 ( HbA1c ) 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화도 테스트
당화혈색소(HbA1c)와 실시예 4에서 획득한 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여, 상기 실시예 3의 1에서와 동일한 방법으로 각 후보군에 대한 정량적 농도 측정을 통해 후보군의 친화도 테스트 실험을 실시하였다.
먼저 HbA1c와 친화력이 높을 것으로 판단되는 8 라운드에서 획득한 20개의 HbA1c 결합 DNA 앱타머 후보군들의 HbA1c와의 결합 효율을 확인하기 위하여, 각 후보군의 농도를 동일하게 하여 HbA1c 결합 라텍스 입자와 1시간 동안 반응시켰다. 이 후, HbA1c 결합 라텍스 입자에서 용리한 20개의 HbA1c 결합 DNA 앱타머 후보군 각각을 나노 드롭을 이용하여 농도를 측정하였다.
나노 드롭을 활용하여 HbA1c 결합 라텍스 입자로부터 용리된 각 후보군의 농도를 측정한 결과, 각 HbA1c 결합 DNA 앱타머 후보군 중 서열번호 6에 해당하는 앱타머의 농도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 상기의 결과는 서열번호 6에 해당하는 앱타머가 가장 HbA1c와의 결합력이 좋다는 것을 확인한 결과이다.
하기 표 3은 나노 드롭기반 농도 측정을 통해 HbA1c 결합 DNA 앱타머 후보군 20개 중 결합력이 가장 높은 상위 6개의 HbA1c 결합 DNA 앱타머 후보의 정량적 친화도 테스트 결과를 구체적으로 나타낸 것이다.
클론명칭 서열번호 회수된 DNA 앱타머 농도(ng/㎕)
HbA1c-4 4 1605.6
HbA1c-6 6 2108.2
HbA1c-11 11 1288.6
HbA1c-12 12 1510.1
HbA1c-14 14 1399.2
HbA1c-16 16 1845.9
[ 실시예 6] SPR 기법을 이용한 당화혈색소(HbA1c)와 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 정량적 친화도 테스트
(1) SPR(Surface plasmon resonance) 측정을 위한 DNA 앱타머의 준비
상기 실시예 1에 제시된 방법을 이용하되 PCR 시료 중 10 pM 정방향 프라이머와 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 대신 10 pM 바이오티닐화된 정방향 프라이머와 변형되지 않은 순수 역방향 프라이머를 첨가한 시료를 이용하여 PCR을 진행하였다. 이후 과정은 실시예 1에 따라 진행하여 PCR 정제를 수행하였다. 기 확보한 PCR 시료는 ssDNA를 제작하기 위하여 비대칭 PCR을 사용하였다. 비대칭 PCR의 반응 조성으로는 10X PCR 완충용액 10 ㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 8 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 정방향 프라이머 10 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, 주형 DNA 라이브러리 10 ㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.5 ㎕(1 unit/㎕)와 증류수 60.5 ㎕로 구성하였다.
PCR 반응조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 이 후에 통상적으로 당업계에서 사용하는 PCI 및 에탄올 침전법을 이용하여 순수 DNA 앱타머를 확보하였다.
(2) ssDNA 앱타머의 구조 제작
상기 (1)에서 확보한 ssDNA는 나노 드롭을 활용하여 농도를 측정한 후, 준비된 각 DNA 앱타머 후보군과 동일한 부피의 2X 앱타머 선별 용액을 첨가하여 85℃에서 5분간 가열하고 상온에서 1시간 이상 천천히 냉각하였다. 그 후 구조가 형성된 DNA 앱타머 후보군은 최종 농도가 25 uM이 되도록 1X 앱타머 선별 용액에 희석하여 준비하였다.
(3) Sensor chip SA에 DNA 앱타머 고정
GE healthcare에서 제공한 protocol에 제시된 방법에 의하여 Gold 판막 위에 덱스트란 (Dextran)으로 고정된 스트렙트아비딘을 활성화하였다. 활성화시킨 Sensor chip SA의 표면에 DNA 앱타머를 고정시키기 위해 먼저, Start sensogram을 수행하였다. 그 후에 유속을 10 ㎕/min으로 지정하였다. Sensor chip SA의 4개 채널 중에서 1번은 검사용으로 앱타머를 붙이지 않았고 2,3,4번의 채널에만 각각의 선별된 앱타머를 결합시켰다. DNA 앱타머의 결합조건으로는 유속 10 ㎕/min으로 1분간 접종하는 일련의 과정을 각각 3회 반복 수행하였다. 그 후에 10분간 유속을 10 ㎕/min으로 HBS-EP buffer를 흘려주어 결합된 ssDNA 앱타머가 안정화되도록 하였다.
(4) 당화혈색소(HbA1c)의 결합
1X 앱타머 선별 용액에 현탁된 당화혈색소 1 ㎕을 튜브에 옮긴 후, Sensor chip SA 위에 유속 5 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하였다. 이 과정동안 1번 채널과 2, 3, 4채널의 Sensogram 비교, 분석을 통하여 결합력을 확인하였다. 이 후에 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주는 일련의 과정을 2회 반복 수행하여 결합된 HbA1c와 ssDNA 앱타머를 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 ssDNA 앱타머를 3회 결합시켰다. 도 3을 참고한다.
상기 과정을 통해 하기 표 4의 결과를 얻을 수 있었도, 최종 서열번호 6을 최적의 당화혈색소(HbA1c)결합 DNA 앱타머로 선별하였다.
클론명칭 서열번호 Kd (M)
HbA1c-4 4 7.59e-7±0.56
HbA1c-6 6 3.76e-9±0.87
HbA1c-11 11 1.36e-6±0.94
HbA1c-12 12 3.97e-6±0.65
HbA1c-14 14 6.95e-6±0.74
HbA1c-16 16 5.09e-8±0.83
[ 실시예 7] SPR 분석을 통하여 획득한 최적 당화혈색소 ( HbA1c ) 결합 DNA 앱타머의 구조 결정
상기 SPR 분석을 통하여 획득한 당화혈색소(HbA1c) 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA m-fold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었고 그 결과는 도 4에 나타내었다.
그 결과, 스템 루프(stem loop) 및 다양한 개수의 짧은 스템(short stem)을 포함하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation SejongBio.Inc. <120> HbA1c-specific aptamer and composition for detecting of HbA1c comprising thereof <130> APC-12-0009 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-1 <400> 1 atccggctgg cctctttcag ttaagtttcc ctagctgtta 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-2 <400> 2 gtggttacaa tatgggccta ttacagcctg tgtgtgttcg 40 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> HbA1c-3 <400> 3 cggcactggg aaatacttac atgagcgcta tctaaagtc 39 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-4 <400> 4 catggccagg ttgatcggtg ctaatgtgtc cgtaaccgag 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-5 <400> 5 cgcgccagtt gtcagtcggg gtttataccg taccgattag 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-6 <400> 6 tcaaaccaaa atgcgctcag tgccacatgt caggctatta 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-7 <400> 7 gcgagaatgg ggcagtctac tcgctcccaa ggagcacctt 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-8 <400> 8 cgtgcggtga tctcggtttt tggcttgtgt atttcgtgct 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-9 <400> 9 tcagagaccg gaggccattc ttagtggagg agttgcgttt 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-10 <400> 10 cggtataagt tcctgaaacg agttacatat agaagacaca 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-11 <400> 11 cgcgtagacg tggacatcgc catacgttta ctgttgcgga 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-12 <400> 12 gtcgcgggac aacgtaacat ttaactgtgc tcgcaggacc 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-13 <400> 13 aggtaaatgg tcgagttacg tcctcttcaa taagaactat 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-14 <400> 14 gtaccaggtg agggctgtac attactcatg acttgtatcc 40 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> HbA1c-15 <400> 15 cgcaagcacg tgtacatgtt ggaccttctt tcttgtggt 39 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-16 <400> 16 cgttgcgacc agggcatggc tcagcagata ctctcagttg 40 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> HbA1c-17 <400> 17 gctgaagagc ggccaaaggc gggccttttc tctttgaca 39 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-18 <400> 18 gcaaaacgtt accagggcag acggaggtct agctaatacg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-19 <400> 19 caaatcgacc gtcgttcgag aaaccggttt cctgagtcct 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> HbA1c-20 <400> 20 ccatgccgca cccgtttctc aggaatatga ttggtaatta 40 <210> 21 <211> 76 <212> DNA <213> DNA template <400> 21 ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60 atagtaagtg caatct 76 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> forward primer <400> 22 ataccagctt attcaatt 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> reverse primer <400> 23 agattgcact tactatct 18

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer).
  2. 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물.
  3. 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 포함하는 당뇨 진단용 조성물.
  4. 서열번호 1 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)가 고정화된 고상 담체.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 고상 담체는 기판, 또는 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼, 또는 다공질재인 것을 특징으로 하는 고상 담체.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 기판은 DNA 칩 또는 단백질 칩에 사용되는 기판인 고상 담체.
  7. 제 5항 내지 제 6항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
    상기 고상 담체는 당화혈색소(HbA1c) 검출 및 정량용인 것을 특징으로 하는 고상 담체.
  8. 제 5항 내지 제 6항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
    상기 고상 담체는 당뇨 진단용인 것을 특징으로 하는 고상 담체.
  9. 당뇨의 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료의 당화혈색소(HbA1c) 존재 여부를 검출하는 방법으로서,
    (a) 당화혈색소(HbA1c)를 포함하는 생물학적 시료와 서열번호 1 내지 20 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당화혈색소(HbA1c)에 특이적 앱타머(Aptamer)를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 DNA 앱타머에 결합된 당화혈색소(HbA1c)를 확인하는 단계;
    를 포함하는 당화혈색소의 검출방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 검출방법.
KR1020120120969A 2012-10-30 2012-10-30 당화혈색소에 특이적 앱타머 및 이를 포함하는 당화혈색소 검출용 조성물 KR20140054905A (ko)

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