CN113429466B - 一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法。包括以下步骤：(1)取黄曲霉强产毒力菌株，制备获得黄曲霉抗原；(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。其可用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法，易操作，实用性强，容易推广应用。

Description

一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法
技术领域
本发明属生物领域，涉及一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法。
背景技术
黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素B1是国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer,IARC)认定的I类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年Web of Science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。然而，迄今国内外仍没有黄曲霉毒素等微生物毒素污染前的分子预警研究范例，难以满足事前预警的迫切需求。
现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。欧盟食品和饲料快速预警系统(Rapid Alert System forFood and Feed，RASFF)利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子不明是根本原因，而缺乏黄曲霉菌株产毒力指示分子的高效发掘方法则成为共性瓶颈难题。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，构建了我国黄曲霉毒素产毒菌株库、菌株产毒力数据库、强产毒菌株蛋白质抗体库，由此发明了用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的抗体库方法，为发掘黄曲霉毒素早期预警分子提供了一种高效的方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法。其用于高效发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子，容易推广应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法，包括以下步骤：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
按上述方案，所述的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
按上述方案，步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株通过常规方法从自然界分离、鉴定获得，或者通过人工改造获得，不少于3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
按上述方案，所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
按上述方案，所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
按上述方案，所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
按上述方案，所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
按上述方案，所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。
按上述方案，所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的Western Blot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
按上述方案，以产毒黄曲霉菌株的细胞裂解液为原料，获得与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即黄曲霉菌株产毒力指示分子，具体可通过蛋白质电泳法或者免疫亲和纯化法获得上述黄曲霉菌株产毒力指示分子。进一步地还可通过质谱等方法鉴定其分子结构。
按上述方案，所述的免疫亲和纯化法是将黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，经常规方法固定到载体材料上，利用其与相应黄曲霉菌株产毒力指示分子特异性免疫反应原理，经常规的上样、淋洗、洗脱流程，从黄曲霉产毒菌株培养物中捕获黄曲霉菌株产毒力指示分子。载体材料可为凝胶或者氨基硅胶微球或者是羧基化磁珠或者是具有类似功效的其他载体材料。
按上述方案，所述的蛋白质电泳法是指常规蛋白质电泳方法。
按上述方案，所述的质谱等方法是常规方法。
黄曲霉菌株产毒力是衡量菌株产生黄曲霉毒素能力的指标，菌株产毒力越强，表明该菌株在相同时间和培养条件下能够产生黄曲霉毒素的量越多。本发明以碳二亚胺处理产黄曲霉毒素黄曲霉菌株的胞外分泌蛋白质和胞内蛋白质的混合物，获得黄曲霉抗原，使弱免疫原性的小肽类物质随机偶联到大分子蛋白质上，增加产毒黄曲霉抗原的多样性，从而有利于增加抗体库中抗体的多样性；采用这样的抗原免疫动物，构建成抗体库后，采用不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质混合物与抗体库中抗体分别反应，可从上述抗体库的众多黄曲霉抗体中筛选出检测信号与被检测菌株产毒力呈现正相关或者负相关的黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体和对应的蛋白质即为最终获得的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
本发明有益效果在于：
1.本发明提供的用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法可用于有效发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子。
2.易操作，实用性强，容易推广应用。
具体实施方式
实施例1自然界黄曲霉菌株分离、鉴定与产毒力鉴定
从福建、广东、江西、江苏、安徽、湖北、四川、山东、河南、河北、辽宁等花生产地取得花生样品及其相应土壤样品，将这些样品磨碎后，各称取10.0g，分别加入到90mL灭菌水中，用涡旋震荡器充分混匀5min，获得土壤和花生待分离黄曲霉菌株的样品稀释液。
从海南和湖北分别取得霉变的可可豆和霉变的鸡蛋壳样品，将这些样品称取不超过1.0g，分别加入到9mL灭菌水中，用涡旋震荡器充分混匀5min，获得可可豆和鸡蛋壳待分离黄曲霉菌株的样品稀释液。
各取上述系列的样品稀释液50μL，分别加在DG-18培养基平板上，用涂布棒涂布均匀，再放置在恒温培养箱中28±1℃黑暗培养5d，然后从其中挑取长有黄绿色孢子的菌落，再接种到曲霉素琼脂培养基，即AFPA培养基平板上，28±1℃纯化培养3-5天，直至长出单菌落。
将上述长出单菌落的AFPA培养基背面呈亮橘红色的菌株初步鉴定为黄曲霉菌或寄生曲霉菌。然后从AFPA培养基上挑取少许上述橘红色的菌丝块到DG-18培养基上，28±1℃黑暗培养5-7天，直至得到黄绿色孢子，再经常规提取其DNA，最后经常规分子生物学鉴定方法确认黄曲霉菌株。
采用NY/T 2311—2013标准方法对上述确认的黄曲霉菌株进行产毒力鉴定，其中部分鉴定结果见如下表1。
表1从花生、土壤、可可豆、鸡蛋壳等自然界分离获得的黄曲霉菌株产毒力鉴定结果
Figure BDA0003089916690000041
实施例2黄曲霉抗原制备
如下将以随机选取的黄曲霉菌株11和22制备黄曲霉抗原11-22为例，描述混合菌株制备黄曲霉抗原的过程；以随机选取的黄曲霉菌株29制备黄曲霉抗原29为例，描述单个菌株制备黄曲霉抗原的过程。
1、黄曲霉抗原11-22的制备
按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)NaNO3，0.1％(w/v)K2HPO4，0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，0.05％(w/v)KCl，0.001％(w/v)FeSO4，pH6.5。此察氏培养基中加入琼脂，至琼脂最终质量体积浓度为2％，配置获得察氏琼脂培养基。从黄曲霉菌株库中随机选取3株，即上述表1中黄曲霉菌株11和22，分别独立接种在上述察氏琼脂培养基上，28℃培养10天左右，待长满黄绿色孢子时，用生理盐水冲洗并分别收集黄曲霉菌株11、22和29的孢子，分别重悬于含3.7％福尔马林的0.01mol/L pH 7.4常规PBS溶液中，于4℃放置24h，再于4℃4000rpm/min离心10min，去除上清，用生理盐水洗涤6次以去除福尔马林，最后用0.01mol/L pH 7.4常规PBS溶液重悬孢子，并用血球计数板于显微镜下计数备用，从而分别获得了黄曲霉菌株11和22的孢子液。
取上述等量的黄曲霉菌株11和22的孢子，混合后加至10mL上述察氏培养基中，使孢子终浓度为5×105个/mL，于28℃200rpm/min培养5天后，将培养液用灭菌滤纸过滤，收集混合菌丝，获得黄曲霉菌株11和22的混合培养物；收集胞外分泌液，获得胞外分泌蛋白质混合物。
将上述黄曲霉菌株11和22的混合菌丝经灭菌水洗涤3次后，重悬于含3.7％福尔马林的0.01mol/L pH 7.4常规PBS缓冲液中，4℃过夜。随后，用液氮研磨上述混合菌丝，称重混合菌丝粉末，然后转移至约3mL的0.01mol/L pH 7.4常规PBS中，再在高压均质机ATS1500以100bar均质，再用1000bar均质4次，以充分裂解黄曲霉细胞，制得黄曲霉菌株11和22的混合细胞裂解液，从而获得黄曲霉菌株11和22的胞内蛋白质混合物。
再然后将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005g，室温搅拌孵育1h，再于4℃孵育过夜，最终制备得到黄曲霉抗原11-22，分装后，于-20℃冷冻保存备用。
2、黄曲霉抗原29的制备
取上述黄曲霉菌株29的孢子，加至10mL上述察氏培养基中，使孢子终浓度为5×105个/mL，于28℃200rpm/min培养5天后，将培养液用灭菌滤纸过滤，收集菌丝，获得黄曲霉菌株29的混合培养物；收集胞外分泌液，获得胞外分泌蛋白质混合物。
将上述黄曲霉菌株29的菌丝经灭菌水洗涤3次后，重悬于含3.7％福尔马林的0.01mol/L pH 7.4常规PBS缓冲液中，4℃过夜。随后，用液氮研磨上述菌丝，称重菌丝粉末，然后转移至约3mL的0.01mol/L pH 7.4常规PBS中，再在高压均质机ATS1500以100bar均质，再用1000bar均质4次，以充分裂解黄曲霉细胞，制得黄曲霉菌株29的细胞裂解液，从而获得黄曲霉菌株29的胞内蛋白质混合物。
再然后将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.1g，室温搅拌孵育1h，再于4℃孵育过夜，最终制备得到黄曲霉抗原29，分装后，于-20℃冷冻保存备用。
实施例3黄曲霉抗体库制备：
如下将以黄曲霉抗原11-22免疫羊驼为例，描述黄曲霉纳米抗体库构建过程，以黄曲霉抗原29免疫BALB/c为例，描述黄曲霉单克隆抗体库构建过程
1、黄曲霉纳米抗体库的构建
将上述黄曲霉抗原11-22和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总RNA、合成cDNA、VHH基因的扩增、VHH基因片段的回收、VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5E(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献CN103866401A的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因库。
将上述黄曲霉抗原11-22按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，参考专利文献CN103866401A的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2-4次淘选，再用黄曲霉抗原11-22和间接非竞争ELISA鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，获得的所有噬菌体阳性克隆即构成了黄曲霉纳米抗体库。
2、黄曲霉单克隆抗体库的构建
将上述黄曲霉抗原29和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式BALB/c鼠，之后每隔2-4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规ELISA流程监测免疫效果，至BALB/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献CN103849604A的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
参考专利文献CN103849604A的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述黄曲霉抗原29按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争ELISA程序鉴定每一单克隆抗体，从中获得的所有阳性单克隆抗体即构成了黄曲霉单克隆抗体库。
实施例4黄曲霉菌株产毒力指示分子的发掘
以下仅为2个具体的实施例，方法经适当变通后也可以达到类似的效果。
1、利用纳米抗体库发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子
根据黄曲霉菌株产毒力由弱到强，从上述表1中选择了黄曲霉菌株04、13、19、26、30为几株代表性菌株，作为被检测菌株，按照上述黄曲霉抗原制备方法，依次制备得到黄曲霉菌株04、13、19、26、30的蛋白质合并溶液。
将上述5株黄曲霉菌的蛋白质合并溶液均调为0.8mg/mL，依次加入到96孔酶标板，每孔100μL，另在同一酶标板上包被1％OVA和3％BSA作为对照，4℃包被过夜。
将上述包被液去除，用常规PBST洗涤3次后，加入5％(W/V)脱脂奶粉封闭液300μL，于37℃封闭2h。
去除上述封闭液，用常规PBST洗涤3次后，每孔加入200nmol/L上述黄曲霉纳米抗体库中的系列纳米抗体溶液100μL，37℃温浴反应1h。
去除上述纳米抗体反应液，用常规PBST洗涤3次后，每孔加入100μL商品化的鼠抗HA标签抗体(1:5000)，37℃温浴反应1h。所述HA标签是指氨基酸序列为YPYDVPDYA的小肽。
去除上述鼠抗HA标签抗体反应液，用常规PBST洗涤3次后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(1:10000)，37℃温浴反应1h。
去除上述辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体反应液，用常规PBST洗涤6次后，加入100μL常规TMB显色液，37℃反应15min，酶标仪测定OD450nm值，即获得系列纳米抗体与5株黄曲霉菌的蛋白质合并溶液免疫反应后的检测信号。
上述检测信号数据中，从众多黄曲霉纳米抗体中至少发现其中≥1个纳米抗体的检测信号与上述5株被检测黄曲霉菌株产毒力呈现正相关，将其中2个这样的纳米抗体分别命名为NbPO08、NbPO59，NbPO08识别的黄曲霉蛋白质命名为YJPO08，NbPO59识别的黄曲霉蛋白质命名为YJPO59，此YJPO08和YJPO59即为发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
采用Western Blot等方法可以得到同样的效果。
2、利用上述单克隆抗体库发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子
将上述5株黄曲霉菌的蛋白质合并溶液均调为1.0mg/mL，依次加入到96孔酶标板，每孔100μL，另在同一板上包被1％OVA和3％BSA作为对照，4℃包被过夜。
将上述包被液去除，用常规PBST洗涤3次后，加入5％(W/V)脱脂奶粉封闭液300μL，于37℃封闭2h。
去除上述封闭液，用常规PBST洗涤3次后，每孔加入2μg/mL上述黄曲霉单克隆抗体库中的系列单克隆抗体溶液100μL，37℃温浴反应1h。
去除上述单克隆抗体反应液，用常规PBST洗涤3次后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(1:8000)，37℃温浴反应1h。
去除上述辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体反应液，用常规PBST洗涤6次后，加入100μL常规TMB显色液，37℃反应15min，酶标仪测定OD450nm值，即获得系列单克隆抗体与5株黄曲霉抗原免疫反应后的检测信号。
上述检测信号数据中，从众多黄曲霉抗体中至少发现其中≥1个单克隆抗体的检测信号与上述被检测菌株产毒力呈现正相关，将其中4个这样的单克隆抗体分别命名为mAbP3F3、mAbP2E1、mAbP5G1，它们识别的黄曲霉蛋白质依次命名为YJP3F3、YJP2E1、YJP5G1，此YJP3F3、YJP2E1、YJP5G1即为发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
采用Western Blot等方法可以得到同样的效果。
实施例5黄曲霉菌株产毒力指示分子的捕获与鉴定
参考专利文献CN103869065A的方法流程，利用上述抗体NbPO08、NbPO59、mAbP3F3、mAbP2E1、mAbP5G1、mAbP1A7替代文献中抗体，依次制备获得黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08、YJPO59、YJP3F3、YJP2E1、YJP5G1的免疫亲和柱。
利用强产毒力的黄曲霉菌株制备细胞裂解液，以上述表1中黄曲霉菌株30为例，将上述黄曲霉菌株30的细胞裂解液经灭菌纱布过滤后，将滤液依次上样超过50mL到上述免疫亲和柱，用足量常规PBS淋洗后，再用3个1mL pH 2.2的甘氨酸缓冲液洗脱，同一亲和柱的3次洗脱液合并后调节pH接近7.0，超滤离心方法去除水和各种离子，最后再用纯水或常规PBS溶液复溶留存在超滤离心管内的蛋白质，即可分别获得免疫亲和纯化后的黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08、YJPO59、YJP3F3、YJP2E1、YJP5G1。
通过常规的蛋白质质谱方法鉴定上述纯化后黄曲霉菌株产毒力指示分子，结果表明黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08中至少含有QQVSGK肽段，YJPO59中至少含有AVAVGR肽段，YJP3F3中至少含有GAGSSG肽段，YJP2E1中至少含有QYQASG肽段，YJP5G1中至少含有AASGGS肽段。
实施例6黄曲霉菌株产毒力指示分子的实用性
如下仅以YJPO08为例，描述黄曲霉菌株产毒力指示分子可用于鉴别黄曲霉菌株产毒力、监测农产品中是否含有强产毒力黄曲霉菌株、评估农产品中是否含有强产毒力黄曲霉菌株等实际用途。
要利用黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08，首先要建立其检测方法，如下仅以建立ELISA方法为例，能够达到类似效果的方法也是可以的。
利用YJPO08直接作为抗原，采用常规的多克隆抗体制备方法与流程获得YJPO08兔多克隆抗体。
利用上述纳米抗体NbPO08和上述多克隆抗体，通过如下操作步骤建立YJPO08的ELISA标准曲线：(1)加入100μL纳米抗体NbPO08(1.0μg/mL)至ELISA板孔中，4℃包被过夜；(2)去除上述包被液，用常规PBST洗板3次后，再加入封闭液即含5％(W/V)脱脂奶粉的常规PBS溶液300μL，37℃封闭2h；(3)去除上述封闭液，用常规PBST洗板3次，将YJPO08配制成系列浓度黄曲霉菌裂解液梯度稀释至10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1μg/mL，分别加入ELISA板，37℃反应1h；(4)去除反应后的裂解液，用常规PBST洗板3次，每孔加入100μL上述多克隆抗体(1μg/mL)，37℃反应1h；(5)去除上述多克隆抗体反应液，用常规PBST洗板3次，再每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1:10000)，37℃反应1h；(6)去除上述辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应液，用常规PBST洗板6次，再每孔加入100μL常规TMB显色液，37℃反应15min后，再用酶标仪测定OD450 nm值；(7)根据上述测定结果，采用常规模拟方式，建立黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08的ELISA标准曲线，可用于定量检测YJPO08。
1、用于鉴别黄曲霉菌株产毒力
利用NY/T 2311—2013标准方法，随机测定了40株黄曲霉菌株的产毒力；用于测定产毒力的同一培养物经上述ELISA标准曲线测定了YJPO08含量，测定结果表明，上述40株菌株中90％的菌株产毒力与YJPO08含量呈现正相关，并且有效鉴定出7株强产毒力黄曲霉菌株，这些鉴定结果表明，黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08可以用于鉴别黄曲霉菌株产毒力，结果准确可靠，方法实用性强。
2、用于监测农作物土壤中黄曲霉群体的相对致毒力
以花生土壤为例，从辽宁阜新、河南正阳、湖北襄阳、江西丰城等花生产区取得10份花生土壤样品，各称取10.0g土壤加入90mL灭菌水中，分别制成土壤稀释液，置于室温下摇床震荡至充分混匀后，取其中50μL，加在30mL的察氏培养基中，28℃恒温摇床震荡培养1d后，取样检测黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08的含量，剩余部分继续在上述察氏培养基中28℃恒温摇床震荡培养5d，再取样测定黄曲霉毒素含量。
上述测定结果显示，10个土壤样品之间比较，培养12h后YJPO08含量与培养5d后黄曲霉毒素含量呈现显著正相关，例如：辽宁阜新土壤样品培养1d后YJPO08含量最低，其培养5d后黄曲霉毒素含量也是最低，表明辽宁阜新土壤样品中黄曲霉群体的相对致毒力最低；某地土壤样品培养1d后YJPO08含量最高，其培养5d后黄曲霉毒素含量也是最高，表明该地土壤样品中黄曲霉群体的相对致毒力最强。上述结果表明，黄曲霉菌株产毒力指示分子可以用于有效监测农作物土壤中黄曲霉群体的相对致毒力，结果准确可靠。
3、用于评估农产品中黄曲霉毒素发生风险与早期预警
以花生、玉米、大米为例，利用了26份花生样品、4份玉米样品和3份大米样品，经粉碎后各称取10.0g土壤加入90mL灭菌水中，分别制成样品稀释液，置于室温下摇床震荡至充分混匀后，取其中50μL，加在30mL的察氏培养基中，28℃恒温摇床震荡培养1d后，取样检测黄曲霉菌株产毒力指示分子YJPO08的含量和黄曲霉毒素含量，剩余部分继续在上述察氏培养基中28℃恒温摇床震荡培养5天，再取样测定黄曲霉毒素含量。
上述测定结果显示，培养1d后，黄曲霉毒素含量水平均在1ppb以下，样品间相差不大，而33样品中的YJPO08含量则有高有低，其中4个花生样品和1个玉米样品的YJPO08含量明显突出的高，被认定为高风险样品，可以予以早期预警。事实上，这5个被认定为高风险的样品继续培养5d后，黄曲霉毒素含量全部超出20ppb，超过了GB2761中规定的国家最大允许限量标准。上述结果表明，黄曲霉菌株产毒力指示分子可以用于有效评估农产品中黄曲霉毒素发生风险与早期预警，为农产品黄曲霉毒素实施早防早控提供关键支撑。

Claims (9)

1.一种用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原，所述的黄曲霉强产毒力菌株的产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg；
(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号，所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经NY/T 2311—2013标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次；
(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体或单克隆抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
2.根据权利要求1所述的所述的方法，其特征在于：步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得。
3.根据权利要求1所述的所述的方法，其特征在于：所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
4.根据权利要求1所述的所述的方法，其特征在于：所述的碳二亚胺的用量为每1.0mL合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
5.根据权利要求1所述的所述的方法，其特征在于：所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
6.根据权利要求1所述的所述的方法，其特征在于：所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的WesternBlot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
7.根据权利要求6所述的所述的方法，其特征在于：所述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
8.根据权利要求6所述的所述的方法，其特征在于：所述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
9.根据权利要求1所述的所述的方法，其特征在于：以产毒黄曲霉菌株的细胞裂解液为原料，获得与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即黄曲霉菌株产毒力指示分子，具体可通过蛋白质电泳法或者免疫亲和纯化法获得上述黄曲霉菌株产毒力指示分子。
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