CN105348371B - 用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体。用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联后作为免疫原，免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体。该抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，而不能与小麦光腥黑粉菌产生抗原抗体反应，因此能够用于鉴别田间难以区分的小麦矮腥黑穗病和小麦光腥黑穗病。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗体，属于植物病害防治领域。
背景技术
由小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetida(Wallr.)Liro,TFL)引起的小麦光腥黑粉病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，在我国北方麦区发生较多，是北京市补充农业植物检疫性有害生物。此病菌孢子含量超过0.6％即可引起严重中毒现象，人畜食后重者可引起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状(Goats,1999；Hoffman,1982)，严重影响小麦品质及商业价值。
小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn，TCK)引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。
小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌的田间侵染症状以及孢子形态和颜色十分相似，在田间观察时很难区分。目前，常用的鉴别方法是PCR反应或显微镜检测，但这两种方法都需要用到仪器，只能在实验室内进行，并且PCR反应耗时长，工序复杂。因此，需要研发一种简便、快速、准确的方法来鉴别小麦光腥黑粉菌和小麦矮腥黑粉菌，从而采取相应的防治措施，控制病害的进一步发展。
发明内容
为满足上述领域的需求，本发明提供一种抗体，该抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，从而将小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌区别开来。
本发明请求保护的技术方案如下：
一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原6mg，用1mL DMF溶解，得到溶液A；取15mg EDC和NHS，用0.2mL PH5.0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B；称取牛血清白蛋白BSA 50mg，使之充分溶解在3.8mL PH 7.2的0.1M PBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4℃下，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
一种用于免疫方法鉴别小麦矮腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，具体步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原4mg，用1mL DMF溶解，得到溶液A；取2.5％的戊二醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL0.1MCB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼氢化钠还原反应2小时，然后在4℃下，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑的多克隆抗体，其采用以下步骤制备而得：
(1)以权利要求2所述的免疫原免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；
(2)对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体；
所述免疫包括多次，初次免疫0.2mg/次/只，第二次开始0.1mg/次/只。
筛选产生高效价全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，进行竞争抑制检测试验。
用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、包板：将待测样品的孢子用抗原稀释液稀释200倍，混匀并加入酶标板，每孔各100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：每孔加入150ul封闭液进行封闭，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将权利要求4所述的多克隆抗体稀释9000倍，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体，每孔100ul，37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取OD值；
若OD值大小为1.8～2.0，则待测样品为小麦矮腥黑粉菌。
本发明提供的抗原蛋白，其氨基酸序列来自小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的共有蛋白序列。采用所述抗原蛋白免疫实验动物，获得的抗体能够特异识别小麦矮腥黑粉菌，而不能与小麦光腥黑粉菌产生抗原抗体反应，因此能够用于鉴别田间难以区分的小麦矮腥黑穗病和小麦光腥黑穗病。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，操作十分简便，能够快速、准确地判断待测样品是小麦矮腥黑粉菌。只需取疑似小麦矮腥黑粉菌的孢子与本发明抗体在适当的反应条件下进行反应，如果出现抗原抗体反应，则该样品是小麦矮腥黑粉菌，如果不能发生抗原抗体反应，则该样品是小麦光腥黑粉菌。整个过程无需仪器，技术人员可以携带相关试剂和耗材，在野外就能完成两种黑粉菌的鉴别。
附图说明
图1.多克隆抗体的制备流程图，
免疫时间安排：如表1所示，初次免疫15天后进行第二次免疫，15天后进行第三次免疫，7天后第一次采血检测，7天后进行第四次免疫，7天后第二次采血检测，7天后进行第五次免疫，7天后第三次采血检测，以此类推，每组均完成至少6次免疫与4次采血检测。其中，E004组的实验兔子免疫效果较好，为本次实验的优选组，其免疫时间安排如表2所示。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何形式限制本发明的保护范围。
小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)：本发明所有的小麦矮腥黑粉菌菌株为现有文献L.GAO et al.Development of a SCAR Maker by inter-simplesequence repeat for dignoisis of Dwarf Bunt of Wheat and Detection ofTilletia controversa Kühn.Folia Microbiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GAO etal.AnISSR-based Approach for the Molecular Detection and Diagnosis of DwarfBunt of Wheat,Caused by Tilletia controversaKu¨hn.J Phytopathol159:155–158(2011)，为其中材料与方法部分记载的Dr Blair Goates所提供的TCK菌株。
小麦光腥黑粉菌：本发明所使用的小麦光腥黑粉菌为现有文献《小麦光腥黑穗菌萌发的超微结构研究》，西北农业大学学报，1999，03期(3):110-112所记载的菌株。
上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
以下实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以通过本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1.用于鉴别TCK和TFL的多克隆抗体制备
试剂与溶液：
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(北京勤邦生物技术有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，0.02M，pH7.2)，包被液(磷酸盐缓冲液，0.05M，pH7.4)，反应稀释液(PBS1，0.03M，pH7.4+0.05％吐温20)，洗涤工作液(用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释)；封闭液(在0.02mol/L PBS1中加入0.05％BSA)，底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化氢，B液为四甲基联苯胺；终止液(2mol/L H2SO4)，酶标二抗(北京勤邦生物技术有限公司)。
小麦矮腥黑粉菌悬液1*105孢子/ml
主要仪器设备：
真空冷冻干燥机，电热恒温培养箱，ProteinA/G柱，电泳槽、电泳仪，酶标板，酶标仪，低温高速离心机，ProteinA层析柱等。
实验动物：新西兰大耳兔，购自中国军事医学科学院。
1、多肽合成
利用ITRAQ分析小麦矮腥黑粉菌(TCK)和小麦光腥黑粉菌(TFL)的蛋白质，得到TCK和TFL的共有蛋白序列(SEQ ID NO：2)，其氨基酸序列为：
APGHRDFIKNMITGTSQADCAILIIAGGTGEFEAGISKDGQTREHALLAFTLGVRQLIVAVNKMDTTKYSEERFHEIVKETSNFIKKVGFNPKSVAFVPISGWHGDNMIEPTANMPWYKGWEKETKAGKSSGKTLLDAIDAIEPPSRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGIIKAGMVVTFAPSNVTTEVKSVEMHHEQLVEGNPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCSDSKNDPAMEAASFIAQVIVMNHPGQIGAGYAPVLDCHTAHIACKFAELVEKIDRRSGKSIEDAPKFIKSGDAAMVKMIPTKPMCVEAFNVYPPLGRFAVRDM
根据上述共有蛋白序列设计获得多条多肽，筛选获得能够区分小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的抗原蛋白(SEQ ID NO：1)，其多肽序列为：EPPSRPTDKPLRLC。由北京勤邦生物技术有限公司对上述抗原蛋白进行化学合成，获得半抗原。
2、多抗制备
半抗原偶联：取步骤1合成的的半抗原6mg，用1mL DMF溶解，得到溶液A；取15mgEDC和NHS，用0.2mL PH5.0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B；称取牛血清白蛋白BSA 50mg，使之充分溶解在3.8mL PH 7.2的0.1M PBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4℃下，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
将上述偶联后的半抗原作为免疫原，与弗氏完全佐剂按1:1体积比混匀后对实验兔子进行初次免疫，以后每次免疫采用弗氏不完全佐剂与免疫原按1:1体积比混匀后进行。共制备了4个免疫原，分别进行免疫。
免疫剂量：初次免疫0.2mg/次/只，第二次开始0.1mg/次/只。
免疫方式：皮下多点注射。
免疫动物：新西兰大耳兔，每组2只，4组，共使用8只。免疫时间安排：如表1所示，初次免疫15天后进行第二次免疫，15天后进行第三次免疫，7天后第一次采血检测，7天后进行第四次免疫，7天后第二次采血检测，7天后进行第五次免疫，7天后第三次采血检测，以此类推，每组均完成至少6次免疫与4次采血检测。其中，E001组的实验兔子免疫效果较好，为本次实验的优选组，其免疫时间安排如表2所示。
表1免疫时间安排进程表
表2优选组免疫时间进程表
注M：免疫，1M：第一次免疫，以此类推；C:采血，1C:第一次采血，以此类推。
采血检测项目：每次采血检测的项目主要是多抗纯化前后的效价及其与天然抗原的反应情况。
检测方法：间接竞争法
1)主要试剂
酶标二抗(北京勤邦生物技术有限公司)，洗涤液，抗体稀释液(磷酸盐缓冲液)，抗原稀释液(CB液)，底物A/B液，封闭液；
2)主要耗材
96孔酶标板(厦门怡佳美)
3)实验操作步骤
a、包板：多肽包被原
(制备方法：取步骤1获得的半抗原4mg，用1mL DMF溶解，得到溶液A；取2.5％的戊二醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL 0.1M CB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼氢化钠还原反应2小时，然后在4℃下，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。)
用抗原稀释液稀释至质量体积比1:1000倍，小麦矮腥黑粉菌悬液用抗原稀释液稀释200倍，分别加入酶标板，每孔100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：加入封闭液进行封闭，每孔150ul，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将步骤2获得的多克隆抗体稀释一定倍数(多肽包被原：按照10万倍稀释，黑粉菌：按照9K倍稀释)，分别加入酶标板，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：每孔加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体100ul，37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm。
采血检测结果：
本实验严格按照免疫流程进行免疫，并完成抗体效价及其与天然抗原结合情况等指标的检测，表3列出了优选组兔子(E001组)的血清检测结果。
表3优选组血清检测结果
注：K表示“千”，W表示“万”，E001表示取自优选组兔子的抗体，E005表示包被原，黑粉菌表示小麦矮腥黑粉菌。E001-1W表示优选组抗体稀释1万倍，黑粉菌-200×表示小麦矮腥黑粉菌稀释200倍。
E001组在第七次采血之后对抗体效价进行检测，检测结果显示，血清效价较高，对多肽包被原的效价为10万，OD值2.6，对小麦矮腥黑粉菌的效价为9K，OD值为2.7，对小麦光腥黑粉菌不显色(表1、表2)。血清检测验证后，可以达到后期实验要求，因此采集了该组的全血并进行抗体纯化。采全血后直接进行抗体效价及抑制检测，纯化多抗后再次进行效价及抑制检测，对比纯化前后的抗体效价及抑制检测数据，结果显示，纯化后抗体效价较高，达到1.2W，OD值显色1.8左右，抑制效果显著(表3)。
表1血清对多肽包被原的检测结果
表2血清对小麦矮腥黑粉菌的检测结果
实施例2.采用本发明抗体鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌
以实验室保存的小麦矮腥黑粉菌孢子和小麦光腥黑粉菌孢子作为抗原，分别与实施例1获得的纯化抗体进行反应，以抗体封闭液作为阴性对照，步骤如下：
a、包板：将实施例1中的多肽包被原用抗原稀释液稀释质量体积比1:1000倍，小麦矮腥黑粉菌用抗原稀释液稀释200倍，分别加入酶标板，每孔100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：加入封闭液进行封闭，每孔150ul，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将实施例1制备的多抗稀释一定浓度(多肽包被原：按照质量体积比1:10万倍稀释，黑粉菌悬液：按照9K倍稀释)，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：每孔加入HRP标记的羊抗兔抗体100ul、37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取的OD值如果在1.8～2.0之间，则发生了抗原抗体反应。
结果如表3所示，纯化后抗体对多肽包被原和小麦矮腥黑粉菌均反应，其中与多肽包被原的反应较强，抗体效价10万，OD值1.9左右；与小麦矮腥黑粉菌反应效价1.2万，OD值1.8左右，与小麦光腥黑粉菌和阴性对照不反应。因此，该抗体可以区分作为小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌特异性抗体。
表3 E001多抗纯化后检测结果
Claims (7)
1.一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn)和小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetida(Wallr.)Liro)的多克隆抗体的半抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种用于制备鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原6mg，用1mL DMF溶解，得到溶液A；取EDC和NHS各15mg，用0.2mL PH5.0MES充分溶解后，加入溶液A中，室温下搅拌24h，即可得到反应液B；称取牛血清白蛋白BSA 50mg，使之充分溶解在3.8mL PH 7.2的0.1M PBS中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，在4℃下，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
3.一种用于免疫方法鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，对权利要求1所述的半抗原进行改造和偶联，具体步骤如下：
取权利要求1所述的半抗原4mg，用1mL DMF溶解，得到溶液A；取2.5％的戊二醛200ul，加入A溶液，反应30min即可得到反应液B；称取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL 0.1MCB中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌16h，再加入硼氢化钠还原反应2小时，然后在4℃下，用0.01mol/L PBS透析3天，每天换3次透析液；分装，保存于-20℃备用。
4.用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的多克隆抗体，其采用以下步骤制备而得：
(1)以权利要求2所述的免疫原免疫家兔，筛选产生高效价全血的家兔；
(2)对选中的家兔采取全血，分离纯化获得多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的多克隆抗体，其特征在于，所述免疫包括多次，初次免疫0.2mg/次/只，第二次开始0.1mg/次/只。
6.根据权利要求4所述的多克隆抗体，其特征在于，筛选产生高效价全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，进行竞争抑制检测试验。
7.用于鉴别小麦矮腥黑粉菌和小麦光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、包板：将待测样品的孢子用抗原稀释液稀释200倍，混匀并加入酶标板，每孔各100ul，37℃孵育2小时，洗板一次，拍干；
b、封闭：每孔加入150ul封闭液进行封闭，37℃孵育2小时，弃液，拍干，备用；
c、加抗体：用抗体稀释液将权利要求4所述的多克隆抗体稀释9000倍，每孔各加入50ul，37℃孵育30分钟；
d、洗涤：洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
e、加酶标二抗：加入稀释1000倍的HRP标记的羊抗兔抗体，每孔100ul，37℃孵育30分钟；
f、洗涤；洗板3-5次，每次间隔30秒，拍干；
g、显色：加入等量A/B底物显色液，每孔100ul，37℃孵育15分钟；
h、终止：加入终止液终止反应；
i、读数：所使用酶标仪的波长为450nm/630nm，读取OD值；
若OD值大小为1.8～2.0，则待测样品为小麦矮腥黑粉菌。
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